Identificacin y Jornada sobre Posibilidades de la

Espectrometra de Masas
Cuantificacin de en Laboratorios de Investigacin.
El poder del anlisis comparativo de
Protenas muestras en Alimentacin,
mediante LC/MS. Protemica y Metabolmica.

Organizado por:
Miguel Angel Martnez
e Inmaculada lvarez
ICTAN-CSIC
Madrid,
5 de Julio del 2012
10:30-11:15

PCiTAL - UDL

Isidro Masana
Especialista Productos LC/MS
Agilent Technologies
Pgina 1
Identificacin y
Cuantificacin
de Protenas
mediante
LC/MS.
Programa:

1.- Introduccin a la Protemica.

2.- Identificacin de Protenas mediante
espectrometra de masas.
3.- Cuantificacin de Protenas mediante LC/MS.
4.- Conclusiones.

Pgina 2
Identificacin y
Cuantificacin
de Protenas
mediante
LC/MS.
Programa:

1.- Introduccin a la Protemica.

2.- Identificacin de Protenas mediante
espectrometra de masas.
3.- Cuantificacin de Protenas mediante LC/MS.
4.- Conclusiones.

Pgina 3
Introduccin a la PROTEMICA
Metabolitos versus Protenas
Metabolitos:
Molculas de pequeo tamao (<1500 Dalton), subproducto de la
actividad enzimtica del organismo; presentan una gran variedad de
estructuras y propiedades.
Molculas en general relativamente estables: aminocidos, azucares, cidos
orgnicos, lpidos, ..
En LC/MS-ESI: proporcionan espectros de masas simples
(mayoritariamente iones con 1 sola carga).
Protenas:
Molculas de gran tamao y de gran complejidad con
mltiples isoformas (variantes).
Su actividad biolgica puede variar enormemente segn sus diferentes
isoformas/modificaciones post-traduccionales (PMTs).
HSA
Molculas delicadas (muy influenciadas por el entorno).
En LC/MS-ESI: proporcionan complejos espectros de masas (iones con
mltiples cargas).
Mayoritariamente suele trabajarse con las protenas digeridas enzimticamente.
Pgina 4
 LC/MS(ESI)-TOF: Deteccin de Modificaciones
Post-traduccionales de la Protena Ubiquitina : Nativa,
Oxidada y Nitrada Nativa
8565.0 (MW=8564.8, error=0.2Da)
LC/MS8.5e5TOF/QTOF
779.6231 8.0e5
proporciona mayor
Espectro
7.5e5
exactitud7.0e5de masa que
m/z=[M+z(H+)]/z MALDI/TOF
6.5e5 TOF-TOF Deconvolucionado
6.0e5

5.5e5
Oxidada

Intensity, cps
783.7070 5.0e5

4.5e5 8580.9 (MW=8564.8+16=8580.8,

781.0724 4.0e5 error=0.1 Da)
11+ 3.5e5
Nitrada
R=9500 779.6231 3.0e5
9.8e4
9.5e4 2.5e5
8610.0 (MW=8564.8 + 44.9 = 8609.7,
9.0e4 error=0.3Da)
2.0e5
8.5e4 12+ 10+
8.0e4 857.4844 1.5e5
7.5e4 714.7356
Intensity, counts

1.0e5 8625.5103
7.0e4
9+ 5.0e4
6.5e4 8661.0309
6.0e4 952.6469 8+ 0
5.5e4
1071.6001
8460 8480 8500 8520 8540 8560 8580 8600 8620 8640 8660 8680 8700 8720 8740 8760 uma
5.0e4
4.5e4
Espectro Sin Masa, u.m.a.
4.0e4
3.5e4 Deconvolucionar TIC of Ubiquitina Modificada TIC de Ubiquitina Nativa
3.0e4 13+ 11+ 779.62 779.60
2.5e4 7+
659.8231 1224.4784 783.70
2.0e4
1.5e4 1077.2206 Tratada con
1.0e4 726.7246 785.1398 peroxinitrito 381.30
1230.9185
5000.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
0.0
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 m/z
Pgina 5
El Reto de la Protemica: Protenas Minoritarias
En suero y plasma humano las concentraciones de protenas se estiman en un rango de 12 ordenes de
magnitud. El n distintas protenas se estima en > 4 millones. Rango tpico detectable hoy en da
rutinariamente para protenas poco abundantes: 100pg/ml ~ 1-2 femto (10-15) mol

1 MARS:
- Alta abundancia
addresses Levels 1- 2
2 2D-PAGE
LC - MS mRP column
3
+
4
Nivel Mass Spec:
- Moderada abundancia
5 addresses Levels 3 - 7
6 Tissue
Para llegar a estos Biomarkers
7
niveles se debern - Baja abundancia
8 eliminar las protenas de
9 niveles de concentracin Tpicas protenas de
muy superior inters
10 Citokinas - Muy baja abundancia
11
12

Nmero de Protenas
Para la identificacin de protenas minoritarias ser clave eliminar previamente las de mayor
concentracin y poder separar la enorme cantidad de pptidos/ protenas presentes en una muestra

Pgina 6
 Tpicas Estrategias para Fraccionar y
Separar Protenas 2A.- Fraccionar Proteinas
1.-Separar Proteinas Mayoritarias por ELECTROFORESIS
(tpico por Inmunoafinidad)
H H
L HL L
H
LLLHH
H HLH
1-D Slab Gel MW (KDa)
Extraccin Muestra
Separar/
1D SDS-PAGE
Clulas
Medios acondicionados
H
H H

H
H

H
H
H
Fraccionar
Tejidos Protena 2-D Slab Gel MW (KDa)
Fluidos biolgicos
LLLL 2D SDS-PAGE
LL L
Hu-14
Column HH HH
pI pI
HHHH

3.- Separar Protenas Digeridas Agilent

(->pptidos) por CROMATOGRAFIA
MONO o MULTIDIMENSIONAL Off-Gel Electroforesis

1 Dimen.: p.e. SCX 2B.- Fraccionar Protenas

2 Dimensin: p.e. RP por CROMATOGRAFIA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

100

mA U

80
mRP-C18
60

40

20

0 10 20 30 40 50 min

Pgina 7
Anlisis de Protenas Minoritarias suele
utilizar: nano-LC/MS

HPLC-Chip/MS: Tecnologa
Microfludica:

-Sensibilidad
- Robustez y Facilidad de Uso.
- Mejor Resolucin Cromatogrfica
- Capacidad de Automatizacin:
- Preconcentracin selectiva Fosfopptidos.
- Caracterizacin N-glicosilaciones en mABs o protenas glicosiladas
Pgina 8
HPLC-Chip SEProt 2009 Pg. 8
Alternativa a Escala Analtica Geles 1D: Bioanalizador
Agilent Lab-on-a-Chip para Anlisis de Protenas
Mayoritarias, ADN y Contaje Clulas

Tpico 10-150 muestras/da 14-200kDa; 10% resol. tam.; 40-4000ng/l

Muy fcil Comparacin de

multiples muestras

45 segundos !!!

1.- 6 l muestra (desnaturalizada)

2.- 6 l ladder (desnaturalizado)
3.- 12 l Mezcla gel/tinte
Tamao y
4.- 12 l solucin de destincin Concentracin
en formato digital
10 muestras/Chip / 30min * Tambin Ensayos con Clulas

Bioanalizador reemplaza a 1D-SDS-PAGE

Determina tamao y nivel de expresin
Pgina 9
Automatizacin Preparacin Muestra: Agilent Bravo
General Ab Capture Immunoprecipitation DIY Captures Protein Digestion Sample Clean Up
Protein A Protein A Streptavidin Trypsin Reverse Phase

Protein A for general Ab capture and Immunoprecipitation

Used in all of the targeted workflows protein purification and
characterization.
Streptavidin for Ab, antigen, protein/peptide, small
molecule capture
Anything that can be biotinylated can be immobilized
Trypsin for rapid, on-column digestion
Protein characterization workflows Peptide mapping, Oxidation
analysis.
Reverse Phase for sample clean up before LCMS
Protein characterization workflows Peptide mapping, Oxidation
analysis.

Pgina 10
Identificacin y
Cuantificacin
de Protenas
mediante
LC/MS.
Programa:

1.- Introduccin a la Protemica.

2.- Identificacin de Protenas mediante
espectrometra de masas.
3.- Cuantificacin de Protenas mediante LC/MS.
4.- Conclusiones.

Pgina 11
Estrategias de Identificacin de Protenas:
Bottom-Up Approach
Protena
intacta
Se digieren enzimticamente las protenas y
se determina el peso molecular y la
secuencia de sus fragmentos peptdicos
tripsina
Bsquedas de los datos de MS (m/z iones)
frente a Bases de Datos de Protenas.
Trabaja con
Protena
DIGERIDA

Bottom-Up Approach

Pgina 12
Identificacin mediante Bases de Datos de Protenas.
m/z del pptido: da informacin de
Mezcla Protenas Digerida los AAS presentes (no de su
Cromatograma 100 amol Pptidos secuencia)
Intensidad
Intensity Espectro de Masas
X 105
BPC (cromatograma no selectivo) X 104 [Glu] Fibrinopptido B 769.0
1.0

0.8 1.0 ADSGEGDFLAEGGVR MS1

0.6 MS: TOF o Quad
0.5
0.4

0.2
0.0
Masa Exacta x104 y7 Espectro MS/MS automtico
Motor Bsqueda 0.8 645.3
y8
Masa+Fragmentos
y6 758.5
m/z 769
0.6
y5 Da informaciny de la secuencia AAS
y3
574.2 y9 11
0.4 b10
Nivel Expresin sin marcaje
isotpico (diferencial de SPMill) 0.2 b4 445.2
675.9 905.7 963.5
1077.7

331.7
0.0

Auto-MS/MS: Q-TOF, TRAP o QqQ

Protenas
identificadas
Agilent
Spectrum Mill

Pgina 13
Secuenciacin de Pptidos mediante MS/MS:
Los espectros de MS/MS de iones con 2 o ms cargas proporcionan
una excelente informacin estructural para la secuenciacin de un
pptido
Suelen perder H2O
Series xx , yx, zx mantienen intacto C-terminal
x3 y3 z3 x2 y2 z2 x1 y1 z1
N-terminal +2H +2H +2H
C-terminal
R1 O R2 O R3 O R4 O

NH2 C C N C C N C C N C C OH
H H H H H H H
+2H +2H +2H
a1 b1 c1 a2 b2 c2 a3 b3 c3
series ax, bx, cx mantienen intacto N-terminal
Suelen perder NH3

series yx-, bx- corresponden a una rotura del enlace pptidico (CO-N). La ms probable CID
series ax-, xx- corresponden a una rotura del enlace pptidico (C-C0)
series cx-, zx- corresponden a una rotura del enlace pptidico (N-C). La ms probable ETD

Pgina 14
 Bases de Datos de Protenas
Se basan en las protenas que pueden ser codificadas
por la secuencia del genoma del organismo estudiado.
Se complementan con la adicin de secuencias
complementarias.
En los ribosomas se leen los nucletidos del mRNA A: Adenina, U: Uracilo, G: Guanina C: Citosina
en secuencias de 3 bases (triplete denominado codn)
que definen el aminocido que se adicionar a la cadena de la protena. Hay 64 codones
diferentes, 1 de ellos (AUG generar metionina) define el inicio de la sntesis de una protena,
y 3 de ellos (UAA - UGA - UAG) definen el fin de su sntesis.
Contienen la secuencia de aminocidos de las protenas (p.e.: MTEYKLVVVGAGGVGK)
Bases de Datos (BD) /webs de dominio pblico:
Swiss-Prot : http://www.expasy.org/sprot/ (Creada en 1986 por Amos Bairoch en su tesis doctoral y desarrollada
por el Instituto Suizo de Bioinformtica y el Instituto Europeo de Bioinformtica. La caracterstica principal de Swiss-
Prot es que las protenas que se encuentran almacenadas en esta base de datos tienen un alto nivel de anotacin. Esto
significa que se conoce su estructura tridimensional, la funcin, las modificaciones post-traduccionales, variantes, etc)

NCBInr: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/ (National

Center for Biotechnology Information (NCBI) es parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos)

Web European Bioinformatics Institute (EBI): http://www.ebi.ac.uk/Databases/

Otras BD Proteinas: dbEST, OWL, MSDB, IPI,

Pgina 15
Motores de Bsqueda para Identificacin Protenas
Se encargarn de comparar datos (valores de m/z) procedentes del Espectros
de Masas experimentales con los datos contenidos en la BD Proteinas.
EN MS/MS Aplicar fragmentacin in silico (/tericamente) a las secuencias
de la BD los tratamientos a los que ha sido sometida la muestra en el
laboratorio:
Reduccin (DTT) de los puentes disulfuro (romperlos) y alquilacin (IAA) para prevenir su re-formacin.
Digestin enzimtica; habitualmente con TRIPSINA. Proteasa que corta a la protena en los residuos /K-,/R-,\P de
Lisina (K) y Arginina (R), excepto si estn seguidos de Prolina (P) en la direccin del C terminal. Suele proporcionar
pptidos entre 6 y 20 AAS
(ideales para secuenciacin por MS).

Contrasta las masas
tericas con las
experimentales (m/z)
procedentes de los
espectros de MS o MS/MS.
Ejemplos: Spectrum Mill, Mascot , Sequest, Profound,

Pgina 16
Tipos y Modos de Bsqueda de Protenas
Tipos de Bsqueda:
PMF Search (Peptide Mass Fingerprint).
Trabaja en modo MS. Disponer de masa exacta es casi imprescindible.
Comparar las masas monoisotpicas de los pptidos con las de la BD.
Se requieren al menos 5-6 pptidos para poder identificar una protena.
MS/MS Search
Trabaja en modo MS/MS. La masa exacta ayuda mucho pero no es imprescindible.
El motor realiza una fragmentacin in silico de los pptidos de la BD
Comparar la masa monoisotpica del pptido (calculado a partir de la masa y carga in
precursor) y la de los fragmentos (residuos) obtenidos del espectro de MS/MS.
Con 2-3 pptidos suele ser suficiente para identificar una protena por MS/MS.

Modos de Bsqueda
Modo Identidad: se compara con las secuencias de protenas nativas (sin PMTs
- no modificadas).
Modo Homologa: se compara con las secuencias de Truncated sequence:
posibles modificaciones o mutaciones de las protenas
Deletion sequence:
nativas (PMTs modificadas/ isoformas).

Pgina 17
 Agilent Spectrum Mill: Extraccin de Datos
Inteligente y Validacin Automtica de Resultados

File_1.d Bsqueda
LC-2D Mltiples ficheros

en Base de
File_2.d
Extraccin Datos High scoring
match
File_3.d
Raw Espectros Medium
. MS/MS MS/MS scoring match
Filtrados
spectra con Filtros de Slo se someten a
.
Calidad bsqueda espectros Lowmatch
scoring

. MS/MS de
Evita Falsos
pptidos Calidad de la
Positivos
File_n.d Identificacin
Agiliza la
Filtrado Espectros: revisin de
- Relacin S/N (en MS y MS/MS)
resultados
- Sequence Tag Length en espectros de MS/MS: se deben
detectar las prdidas de al menos 2 residuos (AAS)

Pgina 18
 Spectrum Mill: Bsquedas en Modos Identidad y
Homologa mediante proceso Iterativo
Revisin Datos y Bsquedas adicionales iterativas para asignar el mayor n
posible de espectros MS/MS de pptidos a protenas (nativas o modificadas)

High
Miles espectros

scoring Matches Crea fichero con todas las

match Validated
protenas correctamente
MS/MS

Medium Validacin identificadas

scoring
match 1 Auto Procesado Inicial
Matches
Low 2 Manual Not
Procesados Adicionales
scoring
match Validated

Revisin Manual de
los Espectros

Bsquedas Iterativas en Base de

Datos*: 1 modo Identidad: nativas
2 modo homologa: modificadas
Buenos Espectros Espectros MS/MS NO
Una bsqueda por HOMOLOGA permitir identificar posibles asignados a Protenas:
modificaciones post-traduccionales, y sustituciones de Sherenga
aminocidos con respecto a las entradas en la base de datos. Se De Novo
suele empezar buscando modificaciones de las protenas ya identificadas Sequencing
(nativas y PMTs suelen coexistir)

Pgina 19
Sherenga De Novo Sequencing para Secuenciar
Pptidos por su espectro de MS/MS
Secuencia del Pptido

Poderosa
Secuenciacin de
Novo para secuenciar
Secuencia propuesta y los pptidos trpticos
alternativas
no asignados a
ninguna protena de la
base de datos
Pgina 20
 Ejemplo Resumen de Protenas Identificadas

El color proporciona informacin del

Promedio Intensidad nivel de expresin (semi-cuantificacin)
Espectral Pptidos
Identificados ( -expres.) Blanco Amarillo Naranja Rojo
Granate - Marrn (+expresada)

Protenas
Identificadas
*

Parmetros para Filtrar y Clasificar

los resultados mostrados
(0 para mostrarlo todo)
* Scores > 20 indican identificacin con buena calidad

Pgina 21
 Ejemplo de Spectrum Mill Scoring Overview

Points
subtracted for
unidentified
peak

y++ 12
2.8%

Score
Y++ , y+++, y 1.50 7 x 1.50 = 10.50
b ions 0.50 1 x .50 = 0.50 12.00 - .028 = 11.97
a ions 0.25 0 x 0.25 = 0.00 Note: Not all counted ion
types shown in table.
b- NH3 , y- NH3 0.25 0 x 0.25 = 0.00 El valor de las asignaciones
b-H2 O, y-H2 O 0.25 4 x 0.25 = 1.00 depende del tipo de instrumento.
Se calcula con los 25 iones
Total positive 12.00 ms intensos.

Otros motores de bsqueda utilizan scores puramente estadsticos (p value).

Pgina 22
Posibilidad de Contrastar Fiabilidad Identificacin por
Comparacin con Bsquedas MS/MS en Modo Reverso
Para valorar la fiabilidad de la
Identificacin, para todos los
candidatos que pasen el filtro del
in precursor se calcula tambin
el factor de similitud con respecto
de la bsqueda frente al reverso
de la secuencia interna de
aminocidos del pptido
candidato.
Por ejemplo:
Candidato: SAMPLER
Busq. Reversa: SELPMAR
Cuanto mayor sea la diferencia
entre ambas bsquedas ms
fiable ser la identificacin.

Pgina 23
Localizacin de PMTs con Agilent Spectrum Mill: representacin
Asignacin de Iones a Fragmentos de la Secuencia del Pptido y sus
Modificaciones con respecto a la protena identificada en la base de datos

modificaciones

Los smbolos: / | \ indican los fragmentos que se han identificado en el masas.

Sus colores indican a que tipo de residuo corresponde:
Rojo: iones y (carga en grupo amino fragmento lado C-terminal)
Azul: iones b (carga en grupo CO fragmento lado N-terminal)
.....
Modification: indica las puntos de modificacin del pptido. Los AAS modificados se
indican con su letra en minscula
p.e. puntos de fosforilacin: t en Thr / s: en Ser / y: en Tyr
Para evitar identificaciones duplicadas SpectrumMill agrupa
todas las protenas homologas (modificadas mutadas-...)
como 1 sola protena (la forma nativa y sus modificaciones
- PMTs- suelen coexistir).

Pgina 24
Identificacin y
Cuantificacin
de Protenas
mediante
LC/MS.
Programa:

1.- Introduccin a la Protemica.

2.- Identificacin de Protenas mediante
espectrometra de masas.
3.- Cuantificacin de Protenas mediante LC/MS.
4.- Conclusiones.

Pgina 25
 Cuantificacin Relativa Multiplexada de Protenas
mediante LC/MS con Etiquetado Isotpico
La estructura semejante de los pptidos permite etiquetar
X muestras con distintas etiquetas isotpicas para poder
analizarlas conjuntamente y cuantificarlas relativamente con
1 solo anlisis (multiplexado).
Tcnicas de cuantificacin relativa:
Por metabolizacin SILAC (MS),
Etiquetado antes digestin: ICAT (C13, D) (MS) (ver ejemplo en aptdo. 3)

Despus de la digestin: iTRAQ (MS/MS), O 16/18 (MS),..

HPLC-Chip/QTOF

ITRAQ plex8:
Mta 1 Mta 2 Mta 3 Mta 4 Mta 8
Pep-NH2 Pep-NH2 Pep-NH2 Pep-NH2 Pep-NH2

Balance
184 186 187 188 192 masa MS/MS
305

plex 4
Reporter
121 119 118 117 113 Ion
* Agilent Spectrum Mill software. Permite cuantificar relativamente con cualquier tipo de etiquetado

Pgina 26
Expresin Diferencial mediante Etiquetado ICAT
a nivel de Pptidos y Protenas
Label with
Healthy sample
light ICAT
protein mixture
tag Combine Affinity LC/MS/MS of
and digest separation ICAT tagged
protein of Cys-containing
mixture peptides peptides
Label with
Diseased sample
heavy
protein mixture
ICAT tag

Modo Pptido

Modo Protena

Pgina 27
 Spectrum Mill: Comparacin Label Free de Expresin de
Protenas Identificadas: Luido Synovial de 33 Candidatos
Artritis Reumatoide Erosiva No-Erosiva Para facilitar su lectura aqu slo se

Posibles candidatos
muestran 10 de los 33 candidatos

a Biomarcadores
Liao, H. et al, Arthritis & Rheumatism, (2004) vol. 50 pp. 3792-3803
Pgina 28
Cuantificacin Absoluta de
Protenas mediante: LC-
ICP/MS

Al cuantificar a nivel atmico, la tcnica de

ICP/MS (ICP/Q & ICP/QqQ) permite la cuantificacin absoluta a partir
de tomos procedentes de patrones de molculas/pptidos distintos a
los de inters para cuantificar.
Cuantificacin de Mtalo-protenas mediante LC-ICP/MS:
Ejemplo: Determination of Ceruloplasmin in Human Serum by Immunoaffinity
Chromatography and Size-Exclusion Chromatography-ICP-MS. Nota Aplicacin 5989-
5304EN
Cuantificacin de protenas mediante LC-ICP/QqQ a partir de pptidos
con P o S.
La elevada sensibilidad de la tcnica ICP/QqQ permite cuantificar bajos niveles de
fosfopptidos y pptidos con azufre.

Pgina 29
Pgina 30
 Cuantificacin Especfica con SISCAPA*: Pre-concentracin de
Pptidos Target y Simplificacin de la Muestra
An automated protocol has
been developed implementing
SISCAPA immunoaffinity
10nL plasma enrichment of biomarker
peptides prior to quantitation
by mass spectrometry. In this
protocol, magnetic beads
coated with anti-peptide
antibodies bind specific
target peptides from tryptic
digests of samples such as
plasma and serum, after
which the beads are washed
to remove unbound peptides,
and the bound, purified
peptides are eluted in small
volumes for injection into an
LC/MS/MS system. Internal
standards (stable isotope-
labeled versions of the same
peptides) allow accurate
quantitation. The Agilent
Bravo implementation allows
10L plasma SISCAPA processing of 96
samples in less than 30
minutes.

* SISCAPA: Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies

Leigh Anderson -Leigh Anderson Anderson Forschung Group Washington. (Padre SISCAPA trabaja con Agilent QqQs)

Pgina 31
Patrones para Cuantificacin Absoluta?: Sntesis de
Protenas mediante Clulas Competentes para
Expresin de Protenas.
Agilent ofrece:
kits para hacer mutagnesis y clonaje para la previa sntesis de la misma.
Vectores y clulas para expresin de protenas dependiendo de la
naturaleza de la mismas (txicas,
con alto contenido en Codon bias? General protein Toxic proteins?
GC o AT). expression

GC-rich AT-rich
genome genome
BL-21 (DE3) BL-21 BL-21-Gold
(DE3) pLysS (DE3) pLysS
BL21- BL21-
CodonPlus CodonPlus
(DE3)-RP (DE3)-RIL
Increased Transformation Tightest control
Efficiency
-OR-
BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL
BL-21-Gold (DE3) BL-21 BL-21-Gold
Tightest Control
BL21(DE3)pLysS cells are ideal for use with T7 promoter-based
expression systems (e.g., pRSET, pCRT7, and pET).
BL21(DE3)pLysS E. coli carry both the DE3 lysogen and the plasmid
BL21-CodonPlus- BL21-CodonPlus- pLysS. pLysS constitutively expresses low levels of T7 lysozyme,
RP RIL which reduces basal expression of recombinant genes by inhibiting
basal levels of T7 RNA polymerase.

Pgina 32
Identificacin y
Cuantificacin
de Protenas
mediante
LC/MS.
Programa:

1.- Introduccin a la Protemica.

2.- Identificacin de Protenas mediante
espectrometra de masas.
3.- Cuantificacin de Protenas mediante LC/MS.
4.- Conclusiones.

Pgina 33
Conclusiones

Una adecuada preparacin y simplificacin

de la muestra mediante adecuadas
estrategias de eliminar protenas
mayoritarios y una buena separacin de
las minoritarias es clave para el xito del
anlisis de proteomas.
LC/MS/MS (y a poder ser con masa exacta), combinado con potentes
motores de bsqueda, permitir identificar protenas en muestras
complejas, a partir de los espectros de MS/MS de pptidos procedentes
de su digestin enzimtica (habitualmente con tripsina).
El etiquetado isotpico multiplexado, permitir a partir de 1 nica
inyeccin, cuantificar relativamente diversas muestras
simultneamente (de 2 a 8), mediante LC/MS o LC/MS/MS.

Pgina 34
www.proteomics-lab.com

Pgina 35
Preguntas?

www.metabolomics-lab.com
www.proteomics-lab.com
Estamos a su disposicin en:
http://www.chem.agilent.com/es
customercare_spain@agilent.com
Tel. 901.11.6890

Isidro Masana
Especialista de Productos LC-CE/MS
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