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Tabla 2. Factores principales que afectan la tasa de migracin del ADN en geles de agarosa
Factores Principales
1. Tamao molecular del ADN
2. Concentracin de agarosa
3. Concentracin de ADN
4. Voltaje aplicado
5. Direccin del campo aplicado
6. Composicin de bases y temperatura
7. Composicin del amortiguador de electroforesis
8. Presencia de agentes intercalantes*
*Factor a considerar solo con el uso de agentes intercalantes durante la preparacin del gel.
Esta claro que todas las bases solo pierde un protn arriba de pH 12
estn sin carga en el rango fisiolgico mientras que los grupos hidrxilo
5< pH >9. Lo mismo es cierto para las aislados ionizan solo arriba de pH 15.
pentosas, donde la ribosa 2,3-diol Los fosfatos de nucletidos pierden
un protn a pH 1 y un segundo protn
(en el caso de monosteres) a pH 7. Determinacin cuantitativa de la
Este patrn de equilibrio de protones cantidad de ADN mediante el uso de
se muestra para AMP a travs de un marcador de peso molecular.
todo el rango de pH (vase
diapositiva 5).
Hiptesis:
Extraccin de ADN
Material y Equipo
1 Rata cepa Wister 2 Pipetas de 5 ml y 1 Pipeta de 1 Estuche de diseccin
plstico
Agua destilada* 2 Vasos de precipitado (250 ml) 1 Mortero y pistilo
Etanol* 1 Varilla de vidrio 1 Centrifuga
Detergente lquido* 2 Probeta (50 y 100 ml) 1 Balanza
NaCl grado reactivo 2-12 Tubos para centrifugar 1 Refrigerador
*No se precisan cantidades, ya que se tendr en exceso (con respecto a lo que se utilizar) dicho material
para su incondicional disposicin. (vase Extraccin-Imgenes, imagen 1)
Procedimiento
1. Obtencin del hgado de la rata Busc y tom el hgado para efectuar la
extraccin, y se almacen otros tejidos (corazn,
msculo y rin) para una siguiente extraccin (en
caso de que no funcione la extraccin que se va a
efectuar).
6. Pipetear o decantar cuidadosamente la fase En esta fase se contena los fragmentos de ADN.
clara (acuosa) a un vaso de precipitado limpio Se evito tomar o decantar parte de la fase
y medir su volumen. orgnica.
Material y Equipo
Agua embotellada o destilada* 1 Micropipeta de 0.2-10 L
NaCl grado reactivo* 1 Caja de puntas para micropipeta
NaOH grado reactivo* 1 Vasos de precipitado**
Solucin TBE 10x (1 L) 1 Probeta**
Solucin TAE 10x (1 L) 1 Parrilla elctrica
Agarosa (40 gr) 1 Lmpara U.V.
1 Marcador de peso molecular (10 L) 1 pHmetro
Colorante de carga (50L) 1 Termmetro
Bromuro de etidio (1 L, 50 mg/ml) 1 Balanza**
1 Centrifuga**
Guantes de ltex (16 piezas) 1 Fuente de poder
1 Peine 1 Caja electrofortica
*No se precisan cantidades, ya que se tendr en exceso (con respecto a lo que se utilizar) dicho material
para su incondicional disposicin.
** Este equipo o material ya esta disponible.
Potente mutagnico, poco txico. Manejado solo por una persona autorizada del laboratorio.
Procedimiento
1. A) Material para la construccin de la fuente 1 Cable con clavija
de poder 2 Caimanes (pinzas)
B) Diseo de la fuente de poder 1 Transformador
(vase diapositiva 6) 1 Capacitor
4 Diodos rectificadores
1 Caja con switch y fusible
1 Tablilla para circuitos
1 Base de plstico
1 Cautin, soldadura de plomo-estao, etc.
3. Preparacin de las soluciones para la Solucin amortiguadora TAE (pH 8): solucin
electroforesis: conductora baja en sales y amortiguadora de
Solucin TAE 1x: cambios en el pH de la solucin.
Tris-acetato 0.04 M
EDTA 0.001 M Solucin TBE: se preparar la solucin a pH 6
para tener condiciones cidas durante el
Solucin TBE 0.5x: corrimiento electrofortico.
Tris-borato 0.045 M
EDTA 0.001 M Solucin NaOH: Se prepar fresca para su
posterior utilizacin. La solucin se prepar a pH
Solucin NaOH 1x: alcalino para observar su efecto sobre la
NaOH 50mN muestra de ADN.
EDTA 1mM
Las soluciones no deben de incrementar
demasiado la concentracin de solutos
disueltos, evitando el sobre-calentamiento del
gel y su consecuente fundido.
6. Colocacin de la muestra y del marcador de Utilizar una pipeta pasteur para colocar cada
referencia en un pozo dentro del gel de manera una de las muestras.
independiente.
7. Realizacin del corrimiento electrofortico Colocar adecuadamente las terminales (+ y )
para que la muestra migre de () a (+) a lo largo
del gel. Condiciones: 65-68 Volts (5 V/cm), 60
mA, durante 1-1.5 horas; dependiendo de la
resolucin deseada.
9. Tincin con bromuro de etidio Hay que usar guantes durante el manejo del
bromuro de etidio (potente mutagnico), esta
sustancia es un agente intercalante y el
complejo ADN-Bromuro de etidio fluorece en la
regin del U.V.