Actividad hipolipmica y antioxidante del extracto de la

pulpa de fruto de Tamarindus indica L. en hmsters con

hipercolesterolemia.
Resumen:
Los cambios en la dieta reduciran significativamente los factores de riesgo de
enfermedades cardiovasculares (CVD), incluyendo al colesterol y la aterosclerosis. El
presente estudio est dirigido a los efectos del extracto crudo de la pulpa del fruto de
Tamarindus indica L. sobre los niveles sricos lipdicos y lesiones prematuras
aterosclerticas en hmster hipercolesterolmicos in vivo, y la accin antioxidante, in
vitro. Los animales fueron alimentados durante 10 semanas en ambas dietas comida
normal y dieta aterosclerognica y concomitantemente recibieron de bebida agua o
extracto de T. Indica L. El tratamiento de los hmsters hipercolesterolmicos con los
extracto de la pulpa de T. Indica L (5%) lleg a una disminucin de los niveles sricos
de colesterol total (50%), colesterol no HDL (73%) y triglicridos (60%), y al
incremento de las lipoprotenas de alta densidad (HDL), niveles de colesterol (61%). In
Vitro, los extractos presentaron una habilidad para eliminar los radicales [libres], as
valorando los radiales 2,2-difenil-1-picrilhidracil (DPPH) y superoxido mediante
ensayos, y determin el descenso de la peroxidacin lipdica en el suero, valorado
mediante los ensayos con sustancias reactivas al cido tiobarbiturico. (TBARS). In vivo,
mejor los sistemas de defensa antioxidante, mediante las actividades de las enzimas
superoxido dismutasa, catalasa y glutatin peroxidasa. Al mismo tiempo estos
resultados indican el potencial de los extractos de tamarindo en disminuir el riesgo de
aterosclerosis en humanos.

Abreviaturas:
LDL, Lipoproteina de baja densidad.
oxLDL Lipoprotena oxidada de baja densidad.
HDL Lipoproteina de alta densidad.
VLDL Lipoproteina de muy baja densidad.
IDL Lipoproteina de densidad intermedia.
DMSO Dimetil sulfxido
CAT Catalasa.
SOD Superoxido dismutasa
GPx glutatin peroxidasa
TBARS Sustancias reactivas al cido barbitrico
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidracil.
EDTA cido Etilendiaminotetraactico.
NBT Nitro azul tetrazolium
AST Aspartato aminotransferasa.
ALT Alanina amonotransferasa
GSH Glutation
GR Glutation reductasa
t-BuOOH tert-butilhidro peroxide.
MDA Malondialdehido.
1. Introduccin

Enfermedades cardiovasculares son la mayor causa de mortalidad global, responsable

de aproximadamente 17 millones de muertes anualmente. (Smith et al., 2004); la
aterosclerosis en particular es el principal contribuyente de infartos cerebral y de miocardio. Los
niveles elevados en el plasma de (LDL) lipoproteina de baja densidad, colesterol y triglicridos,
junto con niveles reducidos de (HDL) lipoprotena de alta densidad, son asociados
frecuentemente al incremento del riesgo de enfermedades coronarias del corazn. (Smith et al.,
2004).
La aterosclerosis representa un estado intenso de estrs oxidativo, caracterizado por la
oxidacin de lpidos y protenas (Stocker and Keaney, 2004). Muchos estudios indican
que la oxidacin de LDL es un evento anterior de este proceso. Ciertamente, oxLDL es
citotxico para una variedad de clulas vasculares (Morel et al., 1983), induce la sntesis de la
protena 1 monocito quimiotcticas, (Rajavashisth et al., 1990), recluta clulas inflamatorias
(Navab et al., 1991), y estimula la produccin de autoanticuerpos (Salonen et al., 1992).

Materiales vegetales han sido largamente usados como medicinas tradicionales para el
tratamiento de una amplia variedad de dolencias y enfermedades. Dietas ricas en
vegetales y frutas puede reducir notablemente la [frecuencia] de enfermedades
cardiovasculares, (Howard and Kritchevsky, 1997; Hung et al., 2003; Mozaffarian et al.,
2003; Katsube et al., 2004), mediante la inhibicin de la oxidacin de LDL (Gorinstein
et al., 1999; Marniemi et al., 2000; Landbo y Meyer, 2001; Southon, 2001; Shafiee et
al., 2003; Nicolle et al., 2004).

El tamarindo (Tamarindus indica L.) es una planta arbrea que pertenece a la familia
Leguminosae y caesalpinaceae, es originaria del frica tropical y se ha ambientado en
Amrica del Norte y del Sur desde Florida hasta Brasil e incluso es cultivada en la
China subtropical, India, Pakistn, Indochina, Filipinas, Java y Espaa. Inicialmente los
frutos presentan una coloracin marrn rojiza que cambia a negro o marrn oscuro, en
la madurez alcanzan mayor fragancia y son ms agrios. Los frutos de T. indica L. son
usados como condimento en los alimentos y como jugos. Su fruta se aprecia como un
excelente digestivo, carminativo, laxante, expectorante y como tnico sanguneo.
(Komutarin et al., 2004). Otras partes de la planta presentan actividades: antioxidante
(Tsuda et al., 1994), antihepatotxica (Joyeux et al., 1995), antiinflamatoria (Rimbau et
al., 1999), antimutagnica (Ramos et al., 2003) y antidiabtica . El potencial anti-
aterosclertico del tamarindo no ha sido previamente investigado. En el presente estudio
caracterizaremos los extractos de los frutos del tamarindo mediante la evaluacin del
potencial anti-aterosclertico in vivo, y la accin antioxidante in vitro.

2. Materiales y mtodos.

2.1 Preparacin de los extractos de fruto de T. indica

Aproximadamente, 100 g de la pulpa del fruto fueron colocados en un matraz cnico y

macerados por tres das in 400 ml de alcohol al 70% a 4 C. El extracto obtenido fue
filtrado mediante un colador y luego llegado al rota-vapor hasta obtener la total
evaporacin de todo el alcohol. En todos los experimentos el extracto fue diluido in
agua.
2.2 Caracterizacin qumica de los extractos del fruto de T. indica

2.2.1 Anlisis HPLC

El anlisis HPLC fue realizado en un aparato Shimadzu LC-6AD con un clasificador

Diode Detector (SPD-M10 Avp, Shimadzu), acoplado con un auto injector (SIL-10AF,
Shimadzu) y utilizando el software CLASS-VP 6.14. Una columna Shim-pack ODS (5
lm, 4.6/250 mm; Shimadzu) fue utilizada unida a su respectiva columna de seguridad,
usando la siguiente elucin propuesta:
0-10 min: 2% B (isocratica),
10-90 min: 2-20 % B (gradiente lineal)
90-120 min: 20-100 % B (gradiente lineal);

Solventes:
A=cido actico acuoso 2% (v/v)
B=MeCN 2% cido actico (v/v)
Flujo: 1ml/min
Deteccin de UV entre 190 y 450 nm.

2.2.2 Fenoles totales

El total de derivados fenlicos solubles fue determinado de acuerdo al mtodo de Folin-

Ciocalteau (Singleton and Rossi, 1965), usando una reaccin media conteniendo 50 l
de muestra, blanco y como estndar cido glico, respectivamente, 50 l de cido
actico 7% (v/v), 50 l de reactivo FolinCiocalteau, 50 l de carbonato de sodio al 35
% (p/v) y 800 l de agua destilada. Despus de mezclar la reaccin fue incubada
durante 90 min. a temperatura ambiente en oscuras. La absorbancia de la luz fue medida
a 725 nm en un espectrmetro Beckman DU-70 y el total de contenido de fenoles fue
expresado como equivalentes de cido glico por mg de extracto.

2.2.3 Azcares totales

Los azcares totales en el extracto crudo fueron determinados de acuerdo a Dubois et al.
(1956) mediante el mtodo de fenol sulfrico. La reaccin de la mezcla que contena
respectivamente, 500 l de muestra, blanco y glucosa como estndar, 500 l de una
solucin de fenol acuosa 5% (p/v) y 2.5 ml de cido sulfrico concentrado. Despus de
la mezcla y el enfriado fue medida la absorbancia a 490 nm para determinar el
contenido de hexosas.

2.2.4 Flavonoides totales

Los Flavonoides totales presentes en el extracto crudo fueron determinados en el
contenido medio de 200 l de muestra, blanco y quercetina como estndar, 60 l de
cido actico glacial, 1 ml de pireno:agua:solucin de cloruro de aluminio al 12 %
(17:80:3), 1.24 ml de DMSO:H 2O (1:1). El producto de la reaccin fue
espectrofotomtricamente determinado a 420 nm (Costa, 1972).
2.3. Determinacin de la actividad antioxidante in vitro del extracto crudo

2.3.1. Inhibicin de la peroxidacin lipidica inducida por el sistema Fe 2+/citrato

La peroxidacin lipdica total en el suero fue determinada por la medida de sustancias

reactivas al cido barbitrico (TBARS), seguido del mtodo de fluorescencia descrito
por Yagi (1998), usando como ondas estimulantes 515 nm y 553 nm respectivamente.
De inmediato, fue agregado 250 l de suero concentrado a una mezcla reaccin
conteniendo 125 mmol/l KCl y 50 mmol/l Hepes-KOH (pH 7.4), y encubado a 37 C
por 6 horas sin la adicin de extracto (control), o en presencia de 2,5 y 5 % (p/v) de
extracto respectivamente, adicionalmente 5 min al inicio de la reaccin de oxidacin. La
peroxidacin fue inducida por la adicin de 50 mol/l Fe(NH 4)2(SO4)2/2 mmol/l de
citrato de sodio. 40 l fueron tomados a tiempo cero y cada hora desde la incubacin de
la mezcla. Lpidos y protenas fueron precipitadas con adicin de HSO 4 12N y
fosfotungstico 10 % (p/v) y centrifugada a 1900 g por 10 min, lo aglomerado fue re-
suspendido en agua y cido tiobarbiturico al 1% (p/v). Se mantuvo la mezcla a 95 C
por 1 h, enfrindose, y el producto de la reaccin extrado con butanol y medido en un
fluorometro F4500, usando tetrametoxipropano como estndar. Los resultados fueron
obtenidos de tres diferentes experimentos realizados por triplicado.

2.3.2. Ensayo con 2-difenil-1-picrilhidracil (DPPH).

En diferentes concentraciones del extracto fueron medidos su habilidad donadora de

hidrgeno o eliminadora de radicales, usando el radical estable 2-difenil-1-picrilhidracil
(DPPH),de acuerdo con Parejo et al. (2002). La reaccin de mezcla que contena 1.5 ml
de solucin metanlica de DPPH (0.2 mg/ml) ms 0.75 ml del extracto crudo a
diferentes concentraciones (metanol para el control) fue incubada a 37 C por 20 min, y
la absorbancia fue medida espectrofotomtricamente a 517 nm. El porcentaje de DPPH
decolorado de la muestra fue luego calculado. Hidroxitolueno butilado (BHT 1mg/ml)
fue usado como un control positivo.

2.3.3. Actividad de eliminacin anin superxido

La actividad de eliminacin del anin superxido del extracto de T. indica fue

determinada de acuerdo a Parejo et al. (2002), por la medida de los radicales superxido
generados in vitro por el sistema xantina/xantina oxidasa. La mezcla reactante a un
volumen final de 1 ml, conteniendo 50 mmol/l de fosfato de sodio como buffer (pH
7.5), EDTA (0.05 mmol/l), xantina (0.2 mmol/l), NBT (1 mmol/l), y 0.1 ml de extracto
crudo a diferentes concentraciones fue incubada a 25 C, por 10 min. La reaccin fue
iniciada por la adicin de xantina oxidasa (1 U/l) y llevada a 25 C, por 20 min.
Despus de este periodo, la reaccin se detuvo con la adiccin de CuCl (50 mol/l), y la
absorbancia fue medida a 560 nm. Los resultados fueron expresados como el porcentaje
de inhibicin de la reduccin de NBT en relacin con la mezcla reactante sin la muestra
(slo buffer). Hidroxitolueno butilado (BHT 1mg/ml) fue usado como un control
positivo.
2.4. Dietas y animales de experimentacin

24 hmster machos Golden Syrian de pesos entre 100 y 130 g fueron divididos
aleatoriamente en 4 grupos, y aclimatados dos semanas en jaulas de colonias (6
hmsters por jaula) a 252 C y bajo un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad.
Grupo 1 fue alimentado con una dieta estndar (Control normal),
Grupo 2 fue alimentado con una dieta estndar y extracto de tamarindo.
Grupo 3 fue alimentado con una dieta estndar ms colesterol 1% (Control
hipercolesterolmico),
Y el Grupo 4 fue alimentado con una dieta estndar ms colesterol 1% y extracto de
tamarindo. Los alimentos y lquidos que ingresaron fueron monitoreados diariamente en
todos los grupos. El agua de los grupos 2 y 4 fue reemplazada por extracto al 5% de
tamarindo completamente re-suspendidos en agua por una periodo de 10 semanas.
La dosis de T, indica usada en el estudio (5%) fue elegida basndose el estudio
concentracin-respuesta, que determinado la actividad antioxidante del extracto con
respecto al proceso de peroxidacin lipidica. Adems 5% es la concentracin
generalmente presentada en el jugo consumido por la poblacin humana.

2.5. Medida del peso corporal y los parmetros bioqumicos

Los animales fueron anestesiados usando una cmara de CO2 y las muestras de sangre
obtenidas [fueron] por puncin cardaca; el peso corporal de cada hmster fue
determinado antes y despus del tratamiento. Los niveles de AST, ALT, glucosa,
colesterol total srico, lipoprotena de alta densidad (HDL) colesterol y triglicridos de
cada animal fueron determinados en triplicado usando un Super Sistema Autoanalizador
Abbott VP (Abbott, Irving, TX) conjuntamente con kits enzimticos comerciales
(Labtest, Montes Claros, MG, Brazil). La medida de HDL colesterol en suero fue
llevado a cabo despus de la precipitacin del contenido de lipoprotenas apo-B, con
sulfato dextrano y cloruro de magnesio (Warnick et al., 1982). Los resultados fueron
expresados como colesterol no-HDL (VLDL + IDL + LDL) en lugar de colesterol LDL,
debido a que la ecuacin de Friedewald (Friedewald et al., 1972) no es aplicable a los
hmsters. Es as que la concentracin de la lipoprotena colesterol (no-HDL) fue
calculada por la resta de las concentraciones del total de colesterol srico menos HDL
colesterol.

2.6. Preparacin de la muestra de tejidos

Los hgados fueron rpidamente extrados, lavados en una solucin fra de NaCl 0.15
mol/l, secados sobre papel filtro, pesados y homogenizados en 9 ml de buffer helado de
fosfato de potasio. Despus de la homogenizacin en PotterElvehjen, los
homogenizados fueron centrifugados a 13,000g por 4 min a 4C y ensayados los
sobrenadantes.

2.7. Determinacin de los niveles de TBARS en suero e hgado.

Los niveles de TBARS fueron determinados como se describi anteriormente (seccin

2.3.1) en sueros e hgados homogenizados de hmsters.
2.8. Ensayo con enzimas antioxidantes en suero e hgado.

2.8.1. Glutation Peroxidasa (GPx)

La actividad GPx fue medida espectrofotomtricamente a 340 nm usando una tcnica

basada en el procedimiento Floh and Gnzler (1984). En el cual la formacin de GSH
es seguida por la medida de la oxidacin de la forma reducida de la nicotinamida
adenida fosfato (NADP+). La concentracin final en la mezcla reactante, en buffer de
0,1 mol/l de fosfato de potasio (pH 7.0) fue 0.2 mmol/l NADPH, 1 mmol/l cido
dietilenetriaminopentaacetico, 1.5 mmol/l de glutatin reducido (GSH) y 7.3 x 10 6 U/ml
glutatin reductasa (GR). La reaccin fue iniciada con 0.12 mmol/l de tert-butil
hidroperoxido (t-BuOOH). La actividad GPx es expresada como mol min-1 g-1 o ml-1.

2.8.2. Superoxido dismutasa (SOD)

La actividad SOD fue medida como describe Paoletti and Mocali (1972). Muestras (25
l) fueron agregadas al recipiente de la mezcla reactante como concentracin final 100
mmol/l de dietanolamina como buffer (pH 7.4), 0.14 mmol/l NADPH, 2.27/1.14
mmol/l EDTA/MnCl2 (pH 7.0). La oxidacin de NADPH fue iniciada con la adiccin de
1 mmol/l de -mercaptoetanol. La medicin de la oxidacin fue medida
espectrofotomtricamente a 340 nm. Una curva estndar para la actividad SOD fue
construida usando SOD eritrocitos de vacuno (Sigma, St Louis, MO, USA). Una unidad
de la actividad de SOD fue definida como la cantidad de enzima requerida para inhibir
la oxidacin de NADPH al 50%, La actividad SOD fue expresada en unidades por
gramo de tejido o ml de suero.

2.8.3. Catalasa (CAT)

La actividad de la catalasa fue estimada siguiendo el mtodo de Aebi (1984). La

reaccin fue iniciada por la adiccin de de 20 l de muestra en 2 ml de 30 mmol/l de
perxido de hidrgeno (H2O2) en 50 mmol/l de fosfato de potasio como buffer (pH 7.0).
Las unidades de la enzima fueron expresadas como mmol/l de H 2O2 consumido por
min-g o ml.

2.9. Anlisis de vasos sanguneos aislados e histopatologa.

Despus de 10 semanas de tratamiento, los animales fueron eutanizados usando una

cmara de CO2 y fueron tomadas las muestras de suero mediante la puncin cardaca
para los parmetros bioqumicos. La aorta torxica fue retirada y enjuagada en solucin
salina 0.9%, fijado en formalina tamponada al 10%, tratada para su deshidratacin y
sumergida en parafina. Fue cortada en secciones transversales de 5 micrones sobre
lminas [portaobjetos], montados, rehidratados y teidos con Harris hematoxylin/ eosin
(H&E).

2.10. Anlisis estadstico.

Los datos fueron analizados utilizando el software GraphPad Prism V.4 (GraphPad
Software, Inc., San Diego, CA). La significancia estadstica de diferencias entre los
datos medios fue determinado por la utilizacin del anlisis de varianza one way
(ANOVA). Seguido de una prueba de post hoc por prueba de Turkey. Un valor de
P<0.05 fue considerado como estadsticamente significante. Los resultados fueron
dados como media desviacin estndar, n=6. Para los anlisis de correlacin fue
empleado la prueba de correlacin Carl Pearson Moment.
3. Resultados

3.1. Actividad antioxidante in vitro de los extractos de T. indica L.

Como una caracterizacin qumica inicial del extracto fue realizada un cromatograma
HPLC-UV. Un espectro UV fue obtenido para cada pico observado en el cromatograma.

Todos los espectros mostraron el mismo patrn de absorcin, con dos bandas de
absorcin mxima alrededor de 230 y 290 nm, con excepcin del pico a 12.15 min, que
incluye a una sola banda de absorcin a 282 nm. Estos datos sugieren la predominancia
de componentes tales como Flavonoides que normalmente tiene lugar como metabolito
secundario en plantas por las caractersticas de absorcin de las bandas A y B (Fig. 1).

Fig. 1 Anlisis en HPLC-UV para los extractos de tamarindo

El extracto crudo de tamarindo fue

encontrado ser muy rico en azcares
(70.25 8.56 mg/ml), polifenoles
(34.02 2.11 nmol/ml), y Flavonoides
(35.51 5.61 g/ml), los dos ltimos
agentes antioxidantes muy bien
conocidos. Los ensayos para
cuantificar estos componentes fueron
todos hechos por triplicados en tres
extractos preparados
independientemente.

Las actividades de eliminacin de

radiales DPPH y superxido estn
presentes en el extracto en una manera
dependiente de la dosis, con la
correlacin de Pearson de 0.89 (Fig.
2). Los resultados de ambas
actividades eliminatorias del extracto
fueron comparadas con el compuesto
de referencia BHT (no mostrado).
BHT present 61.65% 0.3 and
Extracto de Tamarindo (mg/dL)
Fig. 2 Curvas de Concentracin respuesta para la
eliminacin de radicales libres por el extracto crudo de
T.indica L.. Los datos son expresados como porcentaje de
eliminacin de radicales di fenil picril hidracil (DPPH) y
superxido generados por la xantina/sistema xantina
oxidasa. Valores son media desviacin estndar de tres
ensayos diferentes.
80.29% 0.2 de actividad de eliminacin contra DPPH y superxido respectivamente.
Mientras que el extracto, a la concentracin de 1 mg/ml, present 7.31% 0.5 y 42.01%
3.5 de actividad de eliminacin respectivamente (Fig. 2).

La peroxidacin de lpidos mediados por Fe2+/Citrato en el suero de los animales

evaluado como TBARS, fue inhibida aproximadamente en 50% en presencia de 2,5%
de extracto crudo de tamarindo. En presencia de 5% de extracto la inhibicin fue casi
completa. (Fig. 3)

Control positivo
Extracto bruto 2.5%
Extracto bruto 5%
Control negativo

Tiempo de incubacin (h)

Fig. 3. Curva de concentracin para los niveles de peroxidacin de lpidos (concentracin de TBARS ) en
el suero de los hmsters inducida por Fe(NH4)2(SO4)2/citrato en buffer Hepes-KOH a pH 7.4 expuesto al
extracto crudo de T. indica L. (EB). Los valores son media desviacin estndar de tres ensayos
diferentes. El control positivo fue corrido en ausencia del antioxidante y el control negativo fue corrido en
la ausencia de Fe2+/Citrato.

3.2. Consumo de la Dieta y tasa de crecimiento de los hmsters

La tabla 1 muestra que en el consumo de comida y fluidos por los animales de

experimentacin no se observa diferencias entre los grupos. Pero debera ser notorio que
los animales consumieron menos extracto de tamarindo que el agua que se les
proporcion. Los animales fueron pesados al inicio y al final del tratamiento.
Incrementos similares de peso corporal fueron observados en todos los grupos
experimentales.

3.3. Parmetros bioqumicos de los Hmsters

Los niveles sricos de AST y ALT fueron [medidos] para evaluar la funcin heptica.
Como puede observarse en la tabla 2, no se detectaron alteraciones en los grupos de
animales tratados con dieta de colesterol con y sin extracto de tamarindo durante 10
semanas, cuando fueron comparados con el grupo control (tabla 2).
Los niveles en ayuno de glucosa en el suero para el control de los animales fueron sin el
rango normal, pero los niveles de glucosa del grupo tratado con 5% de extracto
tamarindo (SC + E) mostraron un descenso significante cuando son comparados con el
control normal (SC + W) (Tabla 2).

Como lo esperado, el colesterol total srico [estuvo] claramente incrementado en el

grupo tratado con una dieta rica en colesterol por 10 semanas (CC + W), cuando se le
compara con el control (SC + W). El tratamiento de cualquiera de los grupos control
(SC + E) o hipercolesterolmico (CC + E) con extracto de tamarindo result con el
descenso significante en los niveles sricos de colesterol total, cuando son comparados
con sus respectivos controles (SC + W y CC + W). Similar respuesta fue tambin
observada para los niveles sricos de colesterol no-HDL. Adems, el tratamiento de
ambos grupos con extractos de tamarindo (SC + E y CC + E) result en un descenso
sustancial de los niveles sricos de HDL cuando son comparados con sus controles (SC
+ W and CC + W, respectivamente) (tabla 2)

Los triglicridos sricos tambin disminuyeron en el grupo control que fue alimentado
con la dieta rica en colesterol (CC + W), cuando son comparados con el control normal
(SC + W). Por otro lado, ambos grupos control (SC + E) y (CC + E) mostraron un
descenso significante de los niveles de triglicridos despus del tratamiento con el
extracto de tamarindo (tabla 2)

3.4. Peroxidacin de los lpidos sricos in vivo

La evaluacin de los productos de la peroxidacin lipdica mostraron que los niveles de

TBARS en el suero fueron significantemente aumentados en el grupo control que se le
administro una dieta rica en colesterol. En contraste, tratamiento de ambos grupos
control e hipercolesterolmico con extracto de tamarindo condujo a una disminucin
significante de TBARS (Fig. 4)

3.5. Estado antioxidante en suero e hgado de los animales de experimentacin.

Suero Hgado
La dieta rica en colesterol mostr
una disminucin significante en la
actividad de GPx en el suero, pero
no en el hgado. Notablemente, el
tratamiento en ambos grupos
control e hipercolesterolmico con
extracto de tamarindo caus un
incremento significante en la
actividad de GPx en ambos suero e
hgado (Fig.4)

La actividad de CAT en ambos en

suero e hgado no fue
significativamente afectada por la
dieta de colesterol. Sin embargo, el
tratamiento del grupo control con el
extracto de tamarindo, condujo al
incremento en la actividad de CAT
en suero e hgado. (Fig. 4)

La actividad de SOD en suero e

hgado disminuyeron en l grupo
control que tenia dieta rica en
colesterol. El tratamiento con el
extracto de tamarindo resulto en un
incremento de la actividad de SOD
en el suero e hgado del grupo
control, pero no en el grupo
hipercolesterolemico.

3.6. Anlisis Histolgico

La aorta de todos los animales

tratados con la dieta de colesterol
(6/6) mostraron un buen desarrollo
y lesin madura con acumulacin
de lpidos (Fig 5B flecha blanca).
Por otro lado, todos los animales
alimentados con dieta rica en
colesterol y tratamiento con extracto Fig. 4 Niveles de las actividades de TBARS y las enzimas antioxidantes
de tamarindo (6/6) mostraron una en el suero e hgado de los hmsters tratados con la dieta de colesterol
reduccin del rea de lesin con (1% p/p) y de un grupo colesterolmico tratado con el extracto de
baja acumulacin gotitas lipdicas tamarindo. Los datos son expresadoa en medias desviacin estandr,
(Fig 5C flecha negra). No fueron n=6, ensayos en triplicado. P< 0.05. Comparado conbla misma dieta (SC
observadas diferencias histolgicas +dieta
W o CC + W) sin la administracin del extracto; comparados con la
normal (SC + W). SC: Grupo control; SCE: Grupo control +
extracto; CC: Grupo hipercolesterolmico; CCE: Grupo
hipercolesterolmico + extracto.
entre las aortas de los grupos control (SC + W) (Fig. 5A) y el grupo tratado con el
extracto de tamarindo (SC + E) (no mostrado)

Fig. 5 Microfotografas de los arcos articos preparados y teidos con H&E. (A) Control, (B) 1% de
colesterol + agua, (C) 1% de colesterol + extracto de tamarindo. B-flecha negra muestra una lesin bien
desarrollada y madura con acumulacin de lpidos, y la flecha blanca muestra una invasin profunda de la
envoltura del vaso. C-flecha negra muestra una reduccin del rea lesionada con una baja acumulacin de
gotitas de lpidos.

4. Discusin

Es bien establecido que los niveles elevados de lpidos en la sangre constituyen un

mayor factor de riesgo para la aterosclerosis (Castelli et al., 1986). La bsqueda de
nuevas drogas capaces de reducir y/o regular los niveles de colesterol y triglicridos
sricos ha ganado impulso a travs de los aos, resultando en numerosos reportes sobre
significativas actividades de agentes naturales (Jahromi et al., 1993). Aunque los
extractos planeados son potenciales candidatos, estos generalmente contienen una alta
cantidad de mezclas complejas de diferentes componentes mostrando distintas
propiedades de polaridad, antioxidantes y pro-oxidantes y algunas veces presentan
acciones sinrgicas respecto a los componentes individualmente.

En vista de la anterior evidencia de que muchos extractos de frutos son xitosos en la

prevencin de la aterosclerosis, evaluamos los efectos del extracto de la pulpa del fruto
de T. indica L. sobre los lpidos del suero de hmsters, as como tambin sus actividades
antioxidantes. El estrs oxidativo se origina de la perturbacin del balance entre la
produccin de especies oxgeno reactivas (ROS) y la eficiencia de los mecanismos de
defensa antioxidante. (Halliwell and Gutteridge,1999). Los lpidos son muy susceptibles
al ataque de radicales libres, [entonces] aparecen especies LDL oxidadas que
contribuyen a la patologa aterosclertica en las paredes arteriales. En los ltimos aos,
muchos componentes de los vegetales y frutos p.ej. alimentos ricos en antioxidantes
naturales como los polifenoles, han sido usados para prevenir la formacin de oxLDL.
Una relacin inversa entre la formacin de oxLDL y los contenidos de
polifenol/Flavonoides han sido reportados (Aviram and Fuhrman, 1998). En vista del
alto contenido de estos componentes del extracto crudo de tamarindo, evaluamos sus
propiedades antioxidantes in vitro y encontramos actividades de eliminacin de radiales
DPPH y superxido. Adems, los extractos de tamarindo fueron capaces de reducir los
niveles de TBARS in vitro, sugiriendo su potencial promotor protector contra la
peroxidacin lipdica. Estos resultados corroboran las propiedades referidas
anteriormente de la semilla de tamarindo, que fue atribuida a la (-)epicatequina y dos -
dicetona. (Tsuda et al., 1994).

Una dieta hipercolesterolmica cambia in vivo el estado antioxidante de la sangre por el

incremento de la generacin de oxigeno radicales libres, que ejercen sus efectos
citotxicos a causa de la peroxidacin lipdica (Prasad and Kalra, 1993). Adems ha
sido reportado un incremento de los niveles de TBARS en animales alimentados con
una dieta alta en colesterol. (Prasad and Kalra, 1993; Dhuley, 1999; Shunkla et al.,
2004). Consecuentemente, tambin hemos observado incremento en los niveles sricos
de TBARS en los hmsters hipercolesterolmicos.

La aterosclerosis es una enfermedad progresiva que involucra a las arterias de mediano

y gran tamao. Es un factor comn de muchas dolencias cardacas, pero puede afectar
diferentes rganos. Adems, los casos de efectos antioxidantes no son especficos
orgnicamente, por eso, evaluamos estos efectos en el hgado, que es el modelo
experimental ms comn para este tipo de estudios (ver por ejemplo: Frei and Higdon,
2003; Hatipoglu et al., 2004; Sun et al., 2004; Auger et al., 2005). Fue reportado que
durante un estrs oxidativo moderado, los tejidos responden activando los mecanismos
antioxidantes. (Halliwell, 1994) y a niveles de estrs oxidativo altos, generalmente,
deprimen las defensas antioxidantes. Al igual que anteriores reportes (Daniel et al.,
1998; Mary et al., 2002), observamos una disminucin de la actividad antioxidante de
las enzimas SOD, CAT y GPx en animales con una dieta alta en colesterol, comparados
con los de una dieta normal. Esta disminucin podra estar asociada a la produccin de
aldehidos insaturados durante la peroxidacin lipdica. Estos componentes poseen la
habilidad de aumentar el estrs oxidativo promoviendo el consumo celular de glutatin
e inactivando a la glutatin peroxidasa dependiente de selenio. (Kinter and Roberts,
1996). Adems, la reaccin de estos productos con aminocidos residuos de protenas
podra causar modificaciones oxidativas de las enzimas antioxidantes (Bosch-Morell et
al., 1999) y otros productos resultantes de los cidos grasos poliinsaturados dainos
podran causar una descomposicin proteca (Esterbauer et al., 1991).

Recientemente fue demostrado que el anin superxido, alcoxi, peroxil y otros radicales
podran inactivar la catalasa reduciendo la efectividad de la clulas para protegerse del
estrago de los radicales libres (Mayo et al., 2003). De este modo, aunque la
administracin de extracto de tamarindo a los hmsters no suprimi la peroxidacin
lipdica en el hgado, este significativamente aument la actividad de las enzimas
antioxidantes en los grupos con una dieta normal. Estos efectos podra deberse al efecto
antioxidante protector y/o a significativos efectos de disminucin lipdica de los
constituyentes presentes en los extractos de la planta de tamarindo.

En suero, los extractos de tamarindo previenen los incrementos inducidos por la dieta de
los indicadores de la peroxidacin lipdica (TBARS). Mientras que la actividad de GPx
fue revertida por el extracto en el grupo hipercolesterolemico. En este contexto, la
capacidad de los extractos del tamarindo de suprimir la peroxidacin lipdica podra
deberse a la actividad anti radical libre de sus componentes fenlicos, sabiendo que
actan como limpiadores de radicales y/o para incrementar la actividad antioxidante de
las enzimas y/o disminuir los sustratos lipdicos disponibles.

Considerando los marcadores endgenos afines al estrs (SOD, GPx, CAT), nuestros
resultados sugieren que el extracto de tamarindo podra mejorar la eficiencia de la
conversin de los radicales superxido a perxido de hidrgeno a una actividad
aumentada de SOD en el grupo de dieta normal seguido de la desactivacin del
perxido de hidrgeno por la glutatin peroxidasa. La observacin de que la actividad
de la catalasa fue igual despus de la administracin del extracto, no indicara una
discrepancia con otras especies, por otro lado, reactivas de eliminacin de estado
antioxidante. (Skottova et al., 2004). Incremento en la actividad de la catalasa es
considerado como indicador de los niveles excesivo de perxido de hidrogeno cuando la
capacidad detoxificante del sistema glutatin se vuelve insuficiente.

A fin de impedir el posible dao del hgado por la dieta hipercolesterolemica o por el
tratamiento con el extracto de tamarindo, evaluamos la actividad de la transaminasas
sricas. Los niveles de AST y ALT continan siendo pruebas tiles para la deteccin de
dao celular heptico, debido a que ambas se hallan presentes en altas concentraciones
en los hepatocitos. Estas enzimas fugan dentro de la circulacin cuando los hepatocitos
o sus membranas celulares estn daadas (Kew, 2000). Ha sido reportado que un
tratamiento con altas concentraciones de colesterol podran causar dao al hgado
(Bolkent et al., 2004). Nuestros resultado muestran que 1% del colesterol no condujeron
a un incremento significativo de ninguno de los dos niveles sricos de ALT ni AST.
Adems, los hmsters tratados con el extracto de tamarindo no presentaron alguna
alteracin en los niveles sricos de AST y ALT.

Adems de la actividad antioxidante, los extractos de tamarindo mostraron una

significativa actividad hipolipmica, disminuyendo el colesterol total, triglicridos y el
colesterol no-HDL en el suero. Una baja en los triglicridos y colesterol sricos fueron
asociados con el contenido de epicatequinas (Chan et al., 1999). Notablemente, los
niveles de HDL aumentaron cerca del 50%, en ambos grupos, normal e
hipercolesterolemicos, tratados con extracto de de tamarindo. El colesterol HDL es un
factor de riesgo negativo independiente para la enfermedad coronaria arterial, en la
actualidad representa solo el factor protector contra aterosclerosis. Este efecto de HDL
es ampliamente atribuido a su accin central en el transporte opuesto de colesterol, un
proceso por el cual el exceso de colesterol celular es ocupado y procesado por las
particular de HDL para el ulterior reparto al hgado para su metabolismo.

Para resumir, los extracto de tamarindo fueron capaces de reducir el colesterol total,
triglicridos, el colesterol no-HDL y de incrementar el colesterol HDL en el suero. El
extracto tambin inhibe la aterosclerosis en la aorta de los animales alimentados con
dieta rica en colesterol, aparentemente por medio del mejoramiento del sistema de
defensa antioxidante. Adems, estos datos sugieren que el extracto de tamarindo tiene el
potencial de controlar el riesgo de desarrollar aterosclerosis en humanos.
Agradecimientos

Agradecemos a A. Zanardo Filho and N.M.F. Rodrigues por su excelente asistencia

tecnica. Estamos agradecidos al Dr. Norberto P. Lopes y al estudiante de PhD Leonardo
Gobbo Neto por los anlisis HPLC. A Flavia Martinello es una PhD por recibirse de la
Fundao de Amparo Pesquisa (FAPESP 02/03174-5). S.A. Uyemura es una
compaero del Conselho de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq
475276/01-9).

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