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Cap.

12 Qumica Orgnica 2010 II _ UNALM

Aminocidos y
protenas
Duodcima prctica de Lab. Qumica Orgnica

Los ensayos que se realizaron en esta prctica son: reaccin de ninhidrina para identificar la
presencia de aminocidos libres, reaccin xantoproteica, prueba de Millon para identificar restos
fenlicos, prueba para aminocidos azufrados y la reaccin de Biuret.

Autor: Eltsyn Jozsef Uchuypoma


AMINOCIDOS Y PROTENAS

1. Introduccin

La protena, como su nombre indica, han sido consideradas durante muchos aos como
el componente primario de la materia viviente. Hasta mucho mas tarde no se reconoci la
gran importancia de los cidos nucleicos y han constituido materia de discusin a lo largo
de las ltimas dcadas. El principio bsico de la estructura de las protenas es bastante
simple. Consisten en largas cadenas de aminocidos enlazados unos a otro mediante
enlace pptidos. No obstante aparecen complicaciones:1) procedentes de la presencia de
alrededor de veinte tipos diferentes de radicales de aminocidos en las cadenas pptidas;
2) procedentes de la larga longitud de estas cadenas.

En este informe se discuten algunas reacciones de coloracin: reaccin con ninhidrina,


reaccin xantoproteica, Prueba de Millon, Prueba para aminocidos azufrados y la
reaccin de Biuret. As tambin se realiza la desnaturalizacin de protenas. Y finalmente
la precipitacin de la albumina con iones.

2. Objetivo

Identificar a qu tipo de aminocido o protena pertenece la muestra problema.


Realizar las reacciones de coloracin: (reaccin ninhidrina, xantoproteica, de
Millon, para aminocidos azufrados y de Biuret).
Realizar la desnaturalizacin de la albumina.
Ensayar la precipitacin de protenas mediante cationes e iones.

3. Metodologa

A. Reaccin con Ninhidrina. (presencia de aminocidos libres)

Materiales/Solventes:

Triptfano
Glicina
Cistena
Albumina
Tirosina
Muestra problema
Solucin de ninhidrina
Procedimiento:

I. Para realizar el ensayo con ninhidrina, primero a 6 tubos de ensayo agregar 1


mL de: triptfano, glicina, cistena, albumina, tirosina y MP.
II. Agregar a cada uno de los tubos 3 gotas de la solucin de ninhidrina al 0,3%.
III. Calentar unos 3 minutos en b.m. y observar. Se considera positiva la reaccin
positiva si la solucin toma un color azul purpura.

Muestras a ensayar Color antes de la reaccin Cambio de coloracin


Triptfano Translcido Violeta
Glicina Translcido Azul purpura
Cistena Translcido Translcido
Albumina Blanco lechoso Purpura suave
Tirosina Translcido Translcido
MP Translcido Blanco plomizo

MINICONCLUSION: la cistena y la tirosina no presenta grupos amino libres. La


albumina si presenta aminocidos libres.
B. Reaccin Xantoproteica (presencia de aminocidos aromticos)

Materiales/Solventes:
Triptfano
Glicina
Cistena
Albumina
Tirosina
Muestra problema
Solucin de acido ntrico concentrado.

Procedimiento:
I. Colocar en 6 tubos de prueba 1 mL de la muestra a ensayar.
II. Aadir a los tubos de ensayo 1 mL de acido ntrico concentrado.
III. Llevar a bao mara durante 3 minutos.
IV. Agregar 1 mL de hidrxido de sodio al 20% a cada uno de los tubos.
Observar y anotar.

Muestras a ensayar Color antes de calentar Cambio de coloracin


Triptfano Amarillo amarillo naranja
Glicina Translcido Translcido
Cistena Translcido Translcido
Albumina Blanco lechoso Amarillo
Tirosina Translcido Amarillo
MP Blanco lechoso Amarillo suave
MINICONCLUSION: la reaccin xantoproteica nos indica si el aminocido presenta anillos
aromticos y si la reaccin es positiva presenta una coloracin amarilla. Entonces el
triptfano y la tirosina, presentan un anillo aromtico en su estructura. La albumina y la
MP presenta aminocidos aromticos.

C. Prueba de Millon (Presencia de restos fenlicos)

Materiales/Solventes:

Triptfano
Glicina
Cistena
Albumina
Tirosina
Muestra problema
Reactivo de Millon

Procedimiento:

I. En cada uno de seis tubos de ensayo agregar 1 mL de: triptfano,


glicina, cistena, albumina, tirosina y MP.
II. A todos los tubos agregar 3 gotas del reactivo de Millon.
III. Calentar por unos minutos y observar.
Muestras a ensayar Color antes de calentar Cambio de coloracin
Triptfano Amarillo Amarillo
Glicina Translucido Translucido
Cistena Blanquecino dos fases Blanqueci
Albumina Blanquecino Un rojo pero muy suave
Tirosina Translcido Rojo
MP Blanquecino Un rosado suave

MINICONCLUSION: esta prueba nos indica si presenta restos fenlicos o no,


identificamos que el nico aminocido que presenta un fenol en su estructura es la
Tirosina. Adems identificamos que la albumina y la MP presenta tirosina en su secuencia
de aminocidos.

D. Prueba para aminocidos azufrados.


Materiales/Solventes:

Triptfano
Glicina
Cistena
Albumina
Tirosina
Muestra problema
Solucin de NaOH al 40%
Acetato de plomo al 10%

Procedimiento:
I. En cada uno de seis tubos de ensayo agregar 1 mL de: triptfano,
glicina, cistena, albumina, tirosina y MP.
II. Adicionar a todos los tubos 8 gotas de NaOH al 40% y llevar a bao
mara.
III. Aadir 5 gotas de acetato de plomo al 10%. Observar si existe algn
cambio de color.
Muestras a ensayar Color antes de la reaccin Cambio de coloracin
Triptfano Translcido Translucido
Glicina Translcido Translucido
Cistena Translcido Marrn suave
Albumina Blanco lechoso Marrn intenso
Tirosina Translcido Translucido
MP Translcido Marrn dbil

MINICONCLUSION: La cistena, es un aminocido azufrado; la albumina y la MP


presenta aminocidos azufrados.

E. Reaccin de Biuret (presencia de enlaces peptidicos)

Materiales/Solventes:

Albumina
Glicina
Muestra problema
Solucin de NaOH
Sulfato de cobre CuSO4

Procedimiento:
I. En cada uno de 3 tubos de ensayo agregar 1 mL de: glicina, albumina,
y MP.
II. Aadir 20 gotas de NaOH al 10%.
III. Luego adicionar 2 gotas de CuSO4. Observar el color que se forma.
Muestras a ensayar Color antes de la reaccin Cambio de coloracin
Glicina Translcido Celeste
Albumina Blanco lechoso Violeta
MP Translcido Violeta

MINICONCLUSION: las protenas y pptidos que contienen por lo menos 3 unidades de


aminocidos dan coloracin violeta. La albumina y la MP dan una coloracin violeta, eso
evidencia que presentan ms de 3 aminocidos unidos con enlaces peptidicos.

F. Desnaturalizacin de la albumina:

Materiales/Solventes:

Albumina
Etanol
Acido clorhdrico HCl
Acido ntrico HNO3
Hidrxido de sodio NaOH al 40%
Procedimiento:

I. En cada uno de 5 tubos de ensayo agregar 1 mL de albumina.


II. El primer tubo se lleva a bao mara.
III. Al segundo tubo se adiciona 4 mL de alcohol etlico.
IV. Al tercer tubo se adiciona unas gotas de acido clorhdrico concentrado.
V. Al cuarto tubo se agrega una gotas de acido ntrico.
VI. Al quinto tubo se adiciona 4 mL de hidrxido de sodio al 40%.
VII. Anotar en que tubos se forma coagulacin.

Albumina Alcohol etlico HCl HNO3 NaOH al 40%


con
Reaccin + - + + +

MINICONCLUSION: la desnaturalizacin de la albumina se da con agentes


desnaturalizantes como el calor, HCl, HNO3 y NaOH.

G. Precipitacin de protenas mediante cationes.

Materiales/Solventes:
Agua
Albumina
Acido clorhdrico
Hidrxido de sodio
Solucin de CuSO4
Procedimiento:
I. Agregar a 6 tubos las siguientes soluciones:
a. 3 mL de H2O
b. 3 mL de albumina
c. 3 mL de H2O + 3 gotas de HCl
d. 3 mL de albumina + 3 gotas de HCl
e. 3 mL de H2O + 3 gotas de NaOH
f. 3 mL de albumina + 3 gotas de NaOH
II. Importante: observar que se formaron 3 parejas de tubos. Los ensayos
sin albumina son necesarios para observar si el efecto observado en
los tubos de prueba con albumina se debe a la precipitacin de la
protena o es el hidrxido metlico el que esta precipitando.
III. Adicionar 20 gotas de sulfato de cobre (CuCO4) al 10%.
IV. Hacer las comparaciones por parejas. Anotar los tubos donde se formo
precipitados.
Tubo de prueba Formacin de p.p. Reaccin
a No No hubo formacin de p.p.
pero si cambio de color.
b No Solo se evidencia un
cambio de color (celeste).
c No No hay formacin de p.p.
pero si hay cambio de color.
d No Cambia de color (azul
caribeo)
e Si Hay precipitacin del agua
f Si Se precipita la protena y
hay cambio de color.

MINICONCLUSIN: Los tubos a, c y me son aquellos tubos de comparacin y no


presentan albumina. El tubo a esta en medio neutro, el tubo c en medio acido y el tubo f
en medio alcalino. De lo experimentado en el tubo e y f hay formacin de precipitado.
Entonces la precipitacin de albumina mediante CuSO4 se da solo en medio bsico.

H. Precipitacin de protenas mediante aniones.

Materiales/Solventes:

Albumina
Acido clorhdrico
Hidrxido de sodio
Solucin de ferricianuro

Procedimiento:

I. Agregar a 3 tubos las siguientes soluciones:

a. 3 mL de albumina
b. 3 mL de albumina + 3 gotas de HCl
c. 3 mL de albumina + 3 gotas de NaOH

II. A todos los tubos adicionar 2 gotas de ferricianuro.


III. Agitar y observar el tubo que presenta precipitacin.
Tubo de prueba Formacin de p.p. Reaccin
a Si Cambio a un color amarillo
dbil.
b Si Presenta una coloracin
celeste verdoso suave
c No Color amarillo y dos fases.

MINICONCLUSIN: Los tubos a y b forman precipitado cuando reacciona el ferricianuro


con la albumina en medio neutro y en medio acido respectivamente. Cosa que no ocurre
en medio acido (albumina con HCl).

4. Conclusiones

la reaccin xantoproteica nos indica si el aminocido presenta anillos aromticos y si la


reaccin es positiva presenta una coloracin amarilla. Entonces el triptfano y la
tirosina, presentan un anillo aromtico en su estructura. La albumina y la MP presenta
aminocidos aromticos.
La prueba de Millon nos indica si presenta restos fenlicos o no, identificamos que el
nico aminocido que presenta un fenol en su estructura es la Tirosina. Adems
identificamos que la albumina y la MP presentan tirosina en su secuencia de
aminocidos.
La muestra problema (5-P) es una albumina. La cistena, es un aminocido azufrado;
la albumina y la MP presenta aminocidos azufrados.
las protenas y pptidos que contienen por lo menos 3 unidades de aminocidos dan
coloracin violeta. La albumina y la MP dan una coloracin violeta, eso evidencia que
presentan ms de 3 aminocidos unidos con enlaces peptidicos.
la desnaturalizacin de la albumina se da con agentes desnaturalizantes como el calor,
HCl, HNO3 y NaOH.
5. Bibliografa

Keese R., Mller R.K., Toube T.P. Mtodos de laboratorio para Qumica
Orgnica. 1 edicin. Editorial Limusa. Mxico DF. 1990
Durst H.D. Qumica Orgnica Experimental. Editorial Revert. Espaa 1985.
Morrison Robert. Qumica Orgnica. 5 edicin. Addison Wesley
Iberoamericana. Estados Unidos. 1990.
Rodney Boyer. Conceptos en Bioqumica. International Thomson Editores.
Mxico. 2000.
Carey Francis. Qumica Orgnica. 3 edicin. editorial Mc Graw Hill. Espaa.
1999.
Holum John. Fundamentos de Qumica General, Orgnica y Bioqumica para
ciencias de la salud. Editorial Limusa. Mxico. 1999.
Solomons Graham. Qumica Orgnica. 2 edicin. Editorial Limusa Wiley.
Mxico. 2000.
Haurowitz Felix. Qumica y funciones de las protenas. Ediciones Omega.
Barcelona Espaa. 1969.

CUESTIONARIO

1. Cul es el grupo responsable de la reaccin positiva con la reaccin


xantoproteica? La seroalbumina dar positiva la reaccin.

El grupo responsable es el anillo aromtico que presenta el aminocido. Caracterstico


del triptfano que se precipita a partir de sus disoluciones en acido sulfrico al aadir
sulfato mercrico. La fenilalanina, al igual que otros compuestos tambin presenta un
anillo aromtico. La tirosina presenta una intensa absorcin y da lugar a una serie de
reacciones coloreadas.

Fenilalanina, Phe, F Tirosina, Tyr, Y Triptfano, Trp, W

La secuencia de aminocidos de la seroalbumina contiene un total de 17 puentes di


sulfuro, un tiol libre (Cys 34) y un nico triptfano (Trp 214). Debido a la presencia del
triptfano la prueba xantoproteica con la seroalbumina dar positiva.
2. La albumina de hubo contiene aminocidos azufrados?

La albumina presenta 609 aminocidos en su secuencia con slo 585 aminocidos en


el producto final observado en la sangre. Debido a la presencia de los grupos SH de la
cistena y la metionina; la albumina da positivo en la Prueba para aminocidos
azufrados.

3. Cul o cules de los siguientes aminocidos dan reaccin positiva con


el reactivo de Milln?

La reaccin de Millon para determinar la presencia de restos fenlicos


( tirosina). Para ello, se procede a la mezcla de los reactivo de Millon a la sustancia, y
lo lleva a una cierta temperatura (alrededor de 50 C). En este momento un color rojo
ladrillo aparece si la presencia de tirosina.

Entonces de los siguientes aminocidos: triptfano, tirosina, histidina, fenilalanina,


metionina y glicina. El nico que dar positivo con la prueba de Millon es la tirosina.

4. con que prueba reconocera usted los enlaces peptidicos de una


protena?

Con la prueba de Biuret: El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado


formado por la condensacin de dos molculas de rea con eliminacin de amonaco.
Esta reaccin est dada por aquellas sustancias cuyas molculas contienen dos
grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a travs de un solo tomo de
carbono o nitrgeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solucin acuosa
alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin
de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. Esta ltima
reaccin provoca un cambio de coloracin: violeta prpura o violeta rosado. Debe
Sealarse que el color depende de la naturaleza de las protenas; protenas y pptidos
dan un color rosado; la gelatina da un color azul.

5. Si se tiene una solucin neutra de protena y se le aade algunos mL de


soda al 10%. Indicar si se precipita la protena al aadir unos mL de:

La precipitacin con iones se debe a que algunos cationes de metales pesados y


algunos aniones causan la precipitacin de la protena. Los cationes reaccionan con
las protenas cuando se encuentran en su forma aninica o bsica dando sales con los
iones carboxilato de protena. Los aniones formaran sales con las protenas cuando
estas se encuentren en su forma catinica o acida.

Ahora tenemos una protena en un medio neutro y se le aade soda (NaOH). Entonces
el medio de la protena cambia de neutro a bsico.

a. Ferricianuro de potasio: (K4[Fe(CN)6] 3 H2O) No forma precipitado, porque el


ferricianuro para reaccionar necesita de una protena en su forma catinica o acida.
b. Sulfato de cobre (II): (CuSO4 ) Si forma hay precipitacin de la protena. Por el sulfato
reacciona con la protena en su forma aninica o bsica.

6. Explique a que se debe la desnaturalizacin de las protenas.

Una protena se desnaturaliza cuando pierde si estructura secundaria, terciaria o


cuaternaria. La desnaturalizacin es la desorganizacin de la forma molecular
completa de una protena. Esta puede presentarse como un desdoblamiento o
desenrolla miento de las hlices o como separacin de subunidades. La efectividad de
un agente desnaturalizante depende del tipo de protena.
La primera teora sobre desnaturalizacin razonable fue enunciada por Wu. En esta
teora se supuso que la desnaturalizacin consiste en una reorganizacin de las
cadenas pptidas en la molcula de la protena debido a la rotura de ciertos enlaces
dbiles, mediante agentes de desnaturalizacin (calor, detergentes, disolventes
orgnicos, cidos y bases fuertes, radiacin UV, solucin de urea, radiacin por
microondas, etc.); los enlaces dbiles mencionados mantendran juntas las cadenas.
Aplicando los conceptos de Wu se puede decir con seguridad que la desnaturalizacin
consiste en una alteracin de la conformacin de cadenas.

7. Por qu el acido ntrico produce una coloracin amarilla cuando se pone


en contacto con un pedazo de cabello o piel?

La queratina es una protena con estructura helicoidal, muy rica en azufre, que
constituye el componente principal de las capas ms externas de la epidermis de
los vertebrados y se encuentra en el cabello. El colgeno es una molcula
proteica que forma fibras, las fibras colgenos. Estas se encuentran en todos
los animales pluricelulares. Son secretadas por las clulas del tejido conjuntivo como
los fibroblastos, as como por otros tipos celulares. Es el componente ms abundante
de la piel y de los huesos. El acido ntrico produce una coloracin amarilla debido a la
presencia de aminocidos aromticos de la queratina y el colgeno.

8. Cmo separara usted una mezcla de aminocidos?

Mediante la electroforesis: Las protenas son molculas cuya carga neta depende del
contenido de una serie de aminocidos (fundamentalmente acido glutamico, acido aspartico,
lisina, arginina e histidina) y del grado de ionizacin de estos al pH considerado.
La separacin depende de la densidad de carga de las molculas y, as, cuanto mayor sea la
densidad, mayor ser la velocidad de migracin en un campo elctrico hacia el polo que
determine su carga neta.
La primera etapa del proceso es la aplicacin de la muestra. En papel o acetato de celulosa,
esto se puede efectuar de forma puntual (permite el anlisis de varias muestras
simultneamente en pequeas cantidades) o longitudinalmente (permite el estudio de una sola
muestra pero en mayor cantidad). La muestra se aplica disuelta en el tampn de electroforesis,
del que est impregnado el soporte y que se encuentra en los reservorios de la cubeta, y se
deposita en una pequea zona, lo ms estrecha posible, en el centro o en un extremo del
soporte (si se conoce cul va a ser la direccin de desplazamiento de la misma) y de forma
perpendicular a la direccin del campo elctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del
papel, ya que all el campo elctrico no es homogneo y se distorsionan las bandas segn
avanzan.
En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta de dimetro
adecuado y se elimina esa porcin por succin. La perforacin puede ser cilndrica o rectangular,
dependiendo del nmero y cantidad de muestra a analizar y la muestra se deposita en el orificio
practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el tampn esta embebido en el soporte
(agarosa).
La electroforesis termina cuando se haya producido la mxima separacin de los componentes
de la muestra, pero sin sobrepasar los lmites del soporte.

9. Aplicacin de la reaccin de un aminocido con la ninhidrina en


cromatografa. Haga la ecuacin.

Todos los aminocidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dixido
de carbono, amonaco y un aldehdo que contiene un tomo de
Carbono menos que el compuesto original. Esta reaccin da lugar a la formacin de un
producto color azul o prpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar
el aminocido). En el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino
libre, sino un grupo imino, la
Coloracin final es amarilla. El amonaco, la mayora de los polipptidos y las protenas
pueden desarrollar coloracin en esta reaccin, pero a diferencia de los aminocidos,
no liberan CO2. Recuerde que la coloracin azulada o violeta ser proporcional a la
concentracin del aminocido.
La reaccin entre un aminocido y la ninhidrina es la siguiente: