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BIOTECNOLOGA Y BIOINGENIERA

FERMENTACIN ALCOHOLICA: EVALUACION DE LA CAPACIDAD


FERMENTATIVA Y APROVECHAMIENTO DE CO2 EN LEVADURA

1. RESUMEN:

Se evalu la capacidad fermentativa del microorganismo Saccharomyces cerevisiae, en


base al rendimiento y la eficiencia experimental en la produccin de alcohol. Se utiliz
soluciones de sacarosa (5,15 y 20 Brix). Conjuntamente se prepararon una solucin
levadura ente 0.5 1% p/p. Se tom el valor de los pesos y los grados Brix de cada una
de las soluciones en el tiempo 0, luego tomar peso cada doce horas (temp. Ambiente).
Encontrar la prdida de peso y cantidad de glucosa consumida (Brix) para el caso de
soluciones de sacarosa, siendo glucosa consumida por fermentacin (X) y glucosa
consumida por respiracin (Y). Se obtuvieron valores de rendimiento de 51.11% en la
produccin de etanol, del mismo modo se encontr una eficiencia de 102.22%.

2. INTRODUCCIN:

La fermentacin es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso


de oxidacin incompleta, tpico de los organismos anaerbicos. Se realiza, pues, sin la
intervencin del oxgeno.

El proceso de fermentacin no slo incluye la desasimilacin anaerbica como la


formacin de alcohol, butanol-acetona, cido lctico, etc. sino tambin la produccin
industrial de vinagre, cido ctrico, enzimas, penicilina, etc. Todos estos productos son
el resultado de procesos microbianos y se llaman productos de fermentacin.

Durante la fermentacin, la energa obtenida procede, igual que en la respiracin


aerobia, de las reacciones de xido-reduccin habidas durante el catabolismo de la
glucosa (gluclisis), pero en la fermentacin las coenzimas reducidas no ceden sus
electrones a una cadena cuyo aceptor final es el oxgeno, sino que los ceden
directamente a un compuesto orgnico que se reduce y es el producto caracterstico de
cada fermentacin.

Inculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la industria de las


bebidas alcohlicas, sin embargo, es preferible utilizar cepas autctonas, las cuales
estn adaptadas a los medios de fermentacin de cada rea. Dentro de la fermentacin
la especie Saccharomyces cerevisiae es la principal responsable de la fermentacin
alcohlica, as como de la produccin de la mayora de los compuestos aromticos.
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Algunos de los criterios de seleccin de las cepas se basan en su capacidad fermentativa,


medida como produccin de etanol, acidez y consumo de azcares.

La presente practica se evalu la capacidad fermentativa del microorganismo


Saccharomyces cerevisiae, en base al rendimiento y la eficiencia experimental en la
produccin de alcohol, utilizando soluciones de sacarosa (5,15 y 20 Brix).

3. MARCO TEORICO

La fermentacin alcohlica tiene como objetivo biolgico proporcionar energa


anaerbica a las levaduras en ausencia de oxgeno, para ello disocian las molculas de
glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2
como desechos consecuencia de la fermentacin. Una de las importantes caractersticas
de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de
oxgeno (O2), mximo durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la
fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico (Pederson, 1971).

A. FERMENTACIN:

Son cambios qumicos en las sustancias orgnicas producidos por la accin de las
enzimas. Esta definicin general incluye prcticamente todas las reacciones qumicas de
importancia fisiolgica. El tipo de fermentacin ms importante es la fermentacin
alcohlica, en donde la accin de la cimasa segregada por la levadura convierte los
azcares simples, como la glucosa y la fructosa, en alcohol etlico y dixido de carbono.

La fermentacin es la etapa principal del proceso, no solo porque en ella se produce el


etanol, sino porque se reproduce la masa fundamental de microorganismos y adems
por formarse aqu los productos secundarios.

La fermentacin no involucra O2, (es anaerobia) y convierte el pirvico en cido lctico


o en alcohol etlico (etanol), que son molculas an bastante ricas en energa. Como la
degradacin de la glucosa es incompleta, se libera mucha menos energa con la
fermentacin que a travs de la respiracin celular.

La fermentacin complementa la gliclisis y hace posible producir ATP continuamente


en la ausencia del oxgeno. Por la oxidacin del NADH producido en la gliclisis, la
fermentacin regenera el NAD+, el cual interviene otra vez en para producir ms ATP.

Se puede ver que la fermentacin alcohlica es desde el punto de vista energtico una
reaccin exotrmica, se libera una cierta cantidad de energa.
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La preparacin de las levaduras especiales es uno de los problemas de la industria de


fermentacin, ya que ciertas levaduras debidamente elegidas son las que comunican el
sabor especial a las diferentes bebidas.

Un clculo realizado sobre la reaccin qumica muestra que el etanol resultante es casi
un51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria alcanzan el 7%.

Figura 01. Proceso de fermentacin

1. Clasificacin de las reacciones de fermentacin segn el consumo de oxgeno:

La fermentacin alcohlica es un proceso complejo donde intervienen un gran nmero


de enzimas producidas por diversas clases de microorganismos.

Se distinguen por lo tanto dos fases:

Fase aerobia: es una fase de crecimiento en la cual la glucosa pasa a dixido de


carbono.

Fase anaerobia: es la fase de produccin de etanol; la glucosa pasa a etanol y


dixido de carbono.

Incluso en la fase anaerobia ser necesaria una cierta presencia de oxgeno, ya que las
levaduras lo necesitan para producir sus esteroles y sus cidos grasos insaturados de
membrana.
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2. Clasificacin de las reacciones de fermentacin segn el agente

Fermentacin microbiana. Promovidas o catalizadas por microorganismos. La


reproduccin de los microorganismos conlleva a que la reaccin tenga un
comportamiento auto cataltico siendo la concentracin de los microorganismos
variable.

Dentro de este tipo de reaccin hay 2 clases bien definidas:

Cultivos de tejidos o macroorganismos (clulas vegetales y animales).


Reactores microbianos en s (cultivo de microorganismos).

Reacciones enzimticas. Catalizadas por enzimas, el agente cataltico no se


reproduce y cuando se opera discontinuamente este permanece constante.

3. Etapas del proceso de fermentacin:

La preparacin del inoculo


La seleccin del medio de cultivo
La produccin de la biomasa o de los metabolitos de inters

B. FERMENTACIN ALCOHLICA

Es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire, originado por la


actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla
general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el
almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol,
dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los
propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico.

La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa


anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para
ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir,
produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin. Una de
las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes
completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta
razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico.

La finalidad de la fermentacin etlica (desde una perspectiva microbiana) es la


obtencin de energa para la supervivencia de los organismos unicelulares anaerbicos.
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C. LEVADURAS

Las levaduras son los microbios que realizan la fermentacin, transformando el mosto
azucarado en el vino que es lquido con alcohol y sin azcar. Las levaduras son cuerpos
unicelulares (generalmente de forma esfrica) de un tamao que ronda los 2 a 4 m.
Son lo que se denominan: organismos anaerbicos facultativos, es decir que pueden

desarrollar sus funciones biolgicas sin oxgeno. Se puede decir que el 96% de la
produccin de etanol la llevan a cabo hongos microscpicos, diferentes especies de
levaduras, entre las que se encuentran principalmente Saccharomycescerevisiae,
Kluyveromycesfragilis, Torulaspora y Zymomonasmobilis. Los microorganismos
responsables de la fermentacin son de tres tipos: bacterias, mohos y levaduras. Los
azcares empleados en la fermentacin suelen ser: dextrosa, maltosa, sacarosa y lactosa
(azcar de la leche). Los microorganismos 'atacan' especficamente a cada una de los
hidratos de carbono, siendo la maltosa la ms afectada por las levaduras.

D. GLUCOLISIS

El gluclisis es la primera etapa de la fermentacin, lo mismo que en la respiracin


celular, y al igual que sta necesita de enzimas para su completo funcionamiento.

La glucolisis (ciclo de Embden Meyerhof) no utiliza O2. La fase inicial del catabolismo de
los hidratos de carbono catabolismo de los hidratos de es gluclisis, proceso que ocurre
en el citoplasma tanto de clulas aerbicas como anaerbicas. Durante la gluclisis una
molcula de glucosa rinde dos molculas de cido pirvico o piruvato, es decir una
molcula de seis tomos de carbono se escinde en dos de tres.

Se puede estructurar en 2 etapas:

1. Pasar de Glucosa a Fructosa-1,6-difosfato. Es una fase de alteracin qumica para


dejar la molcula til para la clula.

2. Pasar de Fructosa-1,6-difosfato a dihidroxiacetona y gliceraldehido.

Figura 02. Proceso de glucolisis


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4. MATERIALES Y METODOS:
4.1. MATERIALES:

FIG. 03: Muestra de levadura


Saccharomyces cerevisiae FIG. 04: Sustrato: azcar

FIG. 05: Matraz 500 ml


correctamente sellado, con FIG. 06. Agua destilada
sistema de salida de CO2

4.2. EQUIPOS:

Fig. 07: Balanza analtica


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4.3. METODOLOGA:

Pesar tres matraces de 500 ml y rotulados.


Preparar tres soluciones de sacarosa al 5%, 15% y 20 %
Luego de esto verter las soluciones preparadas en los matraces de 500ml
Introducir en cada solucin levadura ente 0.5 1% p/p. Si son 250 de solucin,
agregar 2.5g de levadura.
Tomar peso y los grados Brix de cada una de las soluciones en el tiempo 0, luego
tomar peso cada doce horas (temp. Ambiente).
Encontrar la prdida de peso y cantidad de glucosa consumida (Brix) para el caso
de soluciones de sacarosa se tendr que realizar una conversin a glucosa.
Determinar el peso del CO2 formado (A+B), glucosa consumida por fermentacin
(X) y glucosa consumida por respiracin (Y).
Determinar el rendimiento experimental de la capacidad fermentativa de las
levaduras con la siguiente frmula:
()
(%) =
()

Calcular finalmente la eficiencia de la capacidad fermentativa de las levaduras con


la siguiente frmula:

(%) =

5. RESULTADO Y DISCUSION:

Se trabajaron con 3 balones de 250 ml, del cual se trabaj con 200 ml a 3 diferentes
concentraciones de grados Brix (5, 15 y 20 %), se us el 2% p/p de levadura para cada
concentracin, donde se obtuvieron los siguientes pesos cada 12 horas:

TABLA 01: Pesos a las 12 horas


Peso (Gramos)
BRIX
0 Horas 12 Horas 24 Horas 36 Horas
5% 331.35 329.30 327.59 327.33
15% 327.70 325.21 323.47 320.81
20% 316.76 314.02 310.13 307.36
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Segn Caon, et al (1988); las levaduras llevan a cabo la respiracin anaerbica en


presencia de oxgeno y respiracin anaerobia en ausencia de oxgeno, en dicha
fermentacin se produce bixido de carbono y alcohol etlico, a la vez estas levaduras
para metabolizarlas se usarn varias soluciones de carbohidrato para metabolizarlas. En
nuestra prctica en las tablas 1 nos demuestran que los comportamientos de la
fermentacin son comunes en donde la cantidad de azcar es representada por los
Brix, los cuales estos vemos que van disminuyendo durante el tiempo de fermentacin,
por lo que la levadura necesitar un sustrato para que pueda producir su alcohol yCO2
(carbohidratos).

TABLA 02: diferencia de peso respecto a la hora inicial (hora cero):

Diferencia de Peso (Gramos)


BRIX
0 Horas 12 Horas 24 Horas 36 Horas
5% 0 2.05 3.76 4.02
15% 0 2.49 4.23 6.89
20% 0 2.74 6.63 9.40

Segn Casas (1999), si las soluciones de sacarosa donde se va a realizar la fermentacin


estn muy concentradas, las levaduras expuestas en ellas no fermentarn, por lo que se
tendra que bajar la concentracin de slidos de la sacarosa y glucosa. En nuestra
prctica esto se puede observar que nosotros trabajamos con concentracin del 5, 10 y
20% de sacarosa y glucosa.

Formulacin anaerobia:

[ () + + ]

2*180 2*92 2*88

Entonces para el clculo de glucosa consumido y alcohol producido se hace lo


siguiente:

[ () + + ]
Glucosa Consumida:

2*180 2*88
x Cantidad
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Alcohol obtenido:

2*92 2*88
x Cantidad

TABLA 03: Cantidad de glucosa consumida cada 12 horas y en el tiempo cero:

BRIX Glucosa Consumida (Gramos)


0 Horas 12 Horas 24 Horas 36 Horas
5% 0 4.19 7.69 8.22
15% 0 5.09 8.65 14.09
20% 0 5.60 13.56 19.23

TABLA 04: Cantidad de alcohol obtenido cada 12 horas y en el tiempo cero:

Alcohol Obtenido (Gramos)


BRIX
0 Horas 12 Horas 24 Horas 36 Horas
5% 0 2.14 3.93 4.20
15% 0 2.60 4.42 7.20
20% 0 2.86 6.93 9.83

Segn Gooding (1997), un incremento en la concentracin de etanol supone un


obstculo a medida que pase la fermentacin lo cual ser un obstculo para el
crecimiento y desarrollo microbiano por los efectos negativos, disminuyendo su calidad
y selectividad, por lo que las levaduras en un medio con alta concentracin alcohlica
pierden propiedades funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimas con alta
concentracin alcohlica. En la prctica en la obtencin del etanol se realiz en 3
concentraciones de sustrato del 5 %, 15 y 20 % de sacarosa.

En las Tablas 3 y 4 se presentan los datos obtenidos de la produccin del etanol por lo
que podemos decir que a un mayor contenido de sustratos va a implicar una mayor
produccin de etanol.

Calculo del Rendimiento experimental:


()
(%) = 100
()
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TABLA 05: Resultado del rendimiento experimental de etanol:

Rendimiento Experimental (%)


BRIX
0 Horas 12 Horas 24 Horas 36 Horas
5% 0 51.11% 51.11% 51.11%
15% 0 51.11% 51.11% 51.11%
20% 0 51.11% 51.11% 51.11%

Obtuvimos un rendimiento experimental del 51.11%

Segn Jeffries (2005), a nivel industrial el contenido de alcohol producido por las
levaduras debe estar entre 51% de rendimiento. En nuestra prctica vemos que
obtuvimos un rendimiento de 51.11%, por lo que vemos que no coincide con lo expuesto
por el autor, por lo que podemos decir que puede deberse al tipo de levadura que
utilizamos.Algunos autores han informado que la deficiencia de nitrgeno reduce la
concentracin de biomasa y puede conducir a una fermentacin estancada o lenta
(Dombek & Ingram, 1986)

Segn Navarro (1986), la Saccharomyces cerevisiae para producir etanol de sustrato del
5, 10 y 20 %, obtenidas en 24 Y 48 horas de fermentacin, por lo que su rendimiento fue
de 51.11% de etanol producido por cada gramo de substrato consumido.

Calculo de la eficiencia:


(%) = 100

Como se sabe el rendimiento terico para la obtencin de alcohol a partir de la glucosa


es del 50%. Entonces:
.
(%) = = . %

Para aumentar la eficiencia en la produccin de alcohol, una mejora potencial sera el


uso de una alta concentracin de azcar para la fermentacin para producir altos niveles
de etanol. Sin embargo, la prdida de la viabilidad de la levadura es un problema serio
en fermentacin usando altas concentraciones de azcar. (Limtong S, et al., 2007)
inform una disminucin en la produccin de etanol a concentraciones de azcar
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superiores al 10%. Atribuyeron la disminucin de la produccin de etanol a diversos


factores, incluida la alta presin osmtica y la alta temperatura.

Segn (Munroe, 1994) la levadura consume todo el oxgeno disuelto de los medios
usualmente en las primeras horas de la fermentacin. Bajo esta condicin aerbica
inicial, la ruta Meyer hofe Parnas (o va glucoltica) cataboliza las hexosas en cido
pirvico.

Si la cepa de levadura no es tolerante al etanol, algunas enzimas clave en la ruta


glucoltica de las clulas de levadura, como la hexoquinasa y la ADH, pueden verse
afectadas por el etanol, y el etanol tambin puede afectar la absorcin de nutrientes y
potencial de membrana celular al disminuir la actividad de la ATPasa de la membrana
plasmtica (Kourkoutas, et al., 2004).

(Bai, et al., 2008) nos platea que, la floculacin de levadura era una propiedad de gran
importancia para la industria del etanol, ya que afectaba la productividad de la
fermentacin y la calidad del producto adems de la eliminacin y recuperacin de la
levadura.

6. CONCLUSIONES

Se evalu la capacidad fermentativa del microorganismo Saccharomyces cerevisiae

Se lleg a evaluar la prdida de peso y cantidad de sacarosa consumida por la


levadura Saccharomyces cerevisiae en distintas concentraciones (5,15 y 20 Brix).

El valor del rendimiento experimental de la levadura en diferentes concentraciones


de sacarosa, el cual fue 51.11%.

Se determin la eficiencia de la levadura Saccharomycescerevisae a diferentes


concentraciones de sustrato (glucosa), encontrndose una eficiencia de 102.22%.

7. RECOMENDACIONES

Tapar bien los balones para que se d la fermentacin en ausencia de oxgeno sino
se producir menos alcohol y esto influir en el rendimiento.

Es recomendable realizar un estudio para optimizar la produccin de etanol,


modificando las condiciones de fermentacin, mediante adicin del sustrato a
diferentes concentraciones, suplementos nutricionales y reciclado de clulas y
utilizacin de diferentes cepas que sean tolerantes al etanol.
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La fermentacin alcohlica aparte de ser un proceso relativamente barato para la


obtencin de alcohol, es poco susceptible a contaminacin y posee altos
rendimientos. Es por ello que se recomienda buscar un sustrato ms barato
proveniente de un desecho o residuo para evitar gastar mucho en sacarosa.

8. BIBLIOGRAFA

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ANEXOS

FIG. 08: Pesado de sustrato FIG. 09: Muestra de sustrato y


levadura Saccharomyces
cerevisiae

FIG. 10: Inoculacin del


FIG. 11: Agitacin y
microorganismo al medio de
homogenizacin del medio de
solucin azucarada
fermentacin

FIG. 13: medios de fermentacin


a diferentes concentraciones de
FIG. 12: Calculo de prdida de sustrato
peso (sacarosa consumida)