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Extracción, Fraccionamiento y Aislamiento de Compuestos Activos

Ana Lourenço, Luciane Cruz Lopes y Arturo San Feliciano
Universidade Nova de Lisboa, Portugal. Universidade Metodista de Piracicaba, Brasil.
Universidad de Salamanca. España.

Contenidos:
2.1. Introducción
2.2. Extracción del Material Vegetal
2.3. Ensaios Fitoquímicos
2.4. Fraccionamiento Preliminar de los Extractos
2.5. Isolamento e Purificação de Compostos Naturais
2.6. Caracterização fitoquímica dos extratos de Cissus sulcicaulis

2.1. Introducción

Los extractos de especies vegetales, sean medicinales, con otro tipo de aplicación o inútiles,
contienen centenares de componentes, mayoritariamente inactivos, cuando no tóxicos o causantes
de perturbaciones en el paciente a corto, medio o largo plazo.
La aplicación de las metodologías físicas y químicas que se describen o mencionan en este
capítulo, persigue el conocimiento más completo posible de las cualidades terapéuticas de la
especie en estudio y tiene como finalidad principal, sobre la base del fraccionamiento biodirigido
de los extractos, conseguir el aislamiento e identificación de las sustancias responsables de su
bioactividad y el objetivo último, de poder confirmar la actividad y utilidad de los principios
activos una vez purificados.
La complejidad mencionada de los extractos, unida a la necesidad de aislar y purificar los
compuestos bioactivos que contienen, sobre los cuales residen las cualidades terapéuticas útiles de
la especie, obligan a considerar de forma fundamental y prioritaria los aspectos y variables
relacionados con la extracción, los fraccionamientos que se pueden efectuar y las técnicas de
aislamiento y purificación que pueden aplicarse, para simplificar esas etapas que, aún hoy,
constituyen el cuello de botella en el trabajo fitoquímico y farmacológico sobre especies
medicinales.

2.2. Extracción del material vegetal

Una vez seleccionada y recolectada la especie a estudiar y después de haber llevado a cabo
adecuadamente las operaciones que se contemplan en el capítulo anterior, se dispondrá de una

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cantidad apropiada de material vegetal seco, que puede triturarse en mayor o menor grado, según
el caso, y que posteriormente ha de someterse a la acción del disolvente oportuno, en las
condiciones y con la duración adecuadas, para conseguir la extracción más completa posible de las
sustancias bioactivas presentes en el vegetal.

El objetivo de la primera extracción se centra en la obtención de una pequeña porción de extracto,

en cantidad suficiente, que permita, por un lado, la realización de los bioensayos preliminares
programados, tendentes a demostrar la presencia de sustancias bioactivas en él y, por otro,
disponer de materia para obtener cromatogramas (CF) en diversas condiciones de elución,
espectros de Infrarrojo (IR) y de Resonancia Magnética Nuclear de protón (RMN), que sirvan para
caracterizar suficientemente el extracto y proporcionar información sobre su probable
composición; dejando siempre una tercera porción de extracto testigo, para realizar comparaciones
cromatográficas y espectroscópicas con extractos de la misma especie, que puedan obtenerse en
otra época o lugar, por motivo de escalado o para facilitar estudios posteriores más extensos y
profundos.

Para las especies vegetales a estudiar en el proyecto CYTED - X.10, de búsqueda de agentes
naturales útiles en patologías gastrointestinales, se consideró la posibilidad de realizar dos tipos de
extractos globales, un extracto acuoso o un extracto alcohólico (etanol del 80%), que se
prepararían según los protocolos que se describen más adelante.
No se recomienda la extracción metanólica, por la capacidad de este disolvente de reaccionar con
metabolitos inestables o reactivos y por la menor facilidad de detectar la formación de posibles
artefactos, debido a que un numero considerable de compuestos naturales contienen grupos
metoxilo que podrían cuyo origen podria dar lugar a confusiones. Los restos etoxilo, en cambio,
son perfectamente detectables y diferenciables como artefactos. El isopropanol, que no provoca
transformaciones de los metabolitos secundarios, podría utilizarse como alternativa de agente
extractor si no existe disponibilidad de etanol. El n-butanol y el terc-butanol, tampoco provocan
transformaciones, si bien no son recomendables como disolventes para la primera extracción, por
las dificultades para eliminarlos posteriormente por evaporación o destilación a baja temperatura.

Eventualmente, supuesta la existencia de información fitoquímica previa sobre la especie en

estudio, indicadora de la presencia de compuestos de una determinada naturaleza estructural, entre
los posibles componentes bioactivos de la especie (alcaloides, esteroides, etc), podría ser
recomendable la extracción con otros disolventes y, en su caso, cabría tener que diseñar y aplicar
procedimientos de extracción selectiva, que permitieran obtener lo más directamente posible las
fracciones bioactivas.

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También es de consideración en muchos casos, la conveniencia de efectuar, previa a la extracción,
una maceración del material vegetal en n-hexano, comúnmente conocida como “desengrasado”, a
temperatura ambiente o un poco superior, para evitar la presencia en el extracto de, al menos, una
parte de los materiales lipídicos que constituyen las ceras epicuticulares o las grasa o aceites
propias del vegetal. Esta operación no debe de efectuarse en caliente (> 50º C) o a ebullición,
porque además de que podrían deteriorarse algunas sustancias no muy estables, también podrían
extraerse componentes no tan apolares como las ceras, de naturaleza terpénica o aromática, que
pudieran ser bioactivos.

En el caso de tratarse de una planta medicinal, con uso tradicional reconocido, debería de seguirse
la pauta de extracción correspondiente a la información etnomedicinal disponible sobre ella;
tratando de reproducir, lo más aproximadamente que se pueda, las condiciones del uso tradicional.
Así, para especies cuyo uso se lleve a cabo en forma de infusión, se tenderá a preparar extractos
acuosos o acuoso-alcohólicos; mientras que en el caso de esencias, resinas o exudados, será
recomendable la extracción con disolventes orgánicos de menor polaridad.

2.2.1. Desengrasado (G).

Se efectúa con antelación a la extracción acuosa o alcohólica. El material vegetal bien seco y
triturado, se mantiene en maceración con n-hexano, tres veces, a razón de 20 volúmenes de
diclorometano (DCM) por unidad de masa de droga, manteniendo en agitación, durante al menos 6
horas cada vez, a temperatura no mayor de 40ºC. Se reúnen filtrando las tres porciones de extracto.
La destilación del disolvente conduce a una masa cérea o viscosa amarillenta o verdosa (G),
generalmente descartable para los estudios de bioactividad; cuya caracterización puede realizarse
mediante cromatografía gaseosa (CG), asociada o no a sistemas de espectrometría de masas (CG-
EM).

2.2.2. Preparación de Extractos con Diclorometano (ED).

El material vegetal seco y triturado, se mantiene en maceración con diclorometano, tres veces, a
razón de 20 volúmenes de disolvente por unidad de masa de droga, manteniendo en agitación,
durante al menos 6 horas cada vez, a temperatura ambiente o menor de 30ºC. Se reúnen filtrando
las tres porciones de extracto. La destilación del disolvente conduce a una masa cérea o viscosa,
generalmente oscura (ED), que contiene compuestos de polaridad baja (si no se ha efectuado un
desengrasado previo) y media; cuya caracterización puede realizarse mediante cromatografía
gaseosa (CG), asociada o no a sistemas de espectrometría de masas (CG-EM). El rendimiento

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2.2.3. Preparación de Extractos Etanólicos. (EE, Etanol del 80%).
Se extrae el material vegetal, tres veces, a razón de 10 volúmenes de EtOH (del 80 % v/v), por
unidad de masa de droga vegetal seca y molida, manteniendo en agitación, durante al menos 6
horas cada vez, a temperatura ambiente (20-30ºC). Se reúnen las tres porciones. La eliminación de
la mayor parte del disolvente se efectúa mediante destilación aceotrópica del etanol a presión
reducida; asegurando la eliminación prácticamente completa del etanol, prolongando lo necesario
la destilación y/o aumentando la depresión cuanto sea posible. No se deben sobrepasar los 60ºC.

2.4.4. Preparación de Extractos Acuosos Liofilizados (L).

Tomar unos 100g de material vegetal seco y molido. Añadir 2 L de agua. Calentar a 70ºC durante
30 minutos, manteniendo el conjunto en agitación constante o agitando suficientemente cada 5-10
minutos. Filtrar y lavar el residuo con agua (2 x 100 mL), reuniendo las tres disoluciones.
Concentrar hasta 1/3 del volumen en rotavapor, a presión reducida, manteniendo la temperatura
como máximo entre 60 y 70ºC. Liofilizar. El producto resultante debe de ser soluble en agua y,
dependiendo de la especie y de la parte del vegetal extraída, se estima que se obtendrán entre 5 y
10 g de producto liofilizado (L).

2.2.5. Caracterización Preliminar de los Extractos

Para tratar de definir en cada etapa del proceso el mejor camino a seguir hasta conseguir el
aislamiento y purificación de los principios activos, se recomienda utilizar algunas técnicas
fitoquímicas e instrumentales, que puedan informar sobre la naturaleza y composición de los
extractos y fracciones que se estén analizando y puedan permitir detectar la presencia de algunos
tipos de metabolitos, como terpenoides, flavonoides, saponinas, etc...
Como herramienta fitoquímica se utiliza un conjunto de técnicas muy bien establecidas, que están
basadas en reacciones coloreadas, selectivas o específicas y que, mediante reactivos de diverso tipo,
aplicados generalmente de forma directa sobre el extracto o sus fracciones o sobre placas
cromatográficas desarrolladas, proporcionan información sobre la presencia de distintos grupos de
metabolitos, alcaloides, saponinas, etc, en el extracto o permiten establecer la naturaleza de los
metabolitos ya separados sobre la placa. Este tipo de herramienta, se analiza de forma
pormenorizada en el apartado 2.3.
Otro grupo de herramientas muy útiles se basan en la aplicación de técnicas espectroscópicas
generalmente disponibles en los laboratorios modernos. Resulta muy conveniente obtener
1
espectros de infrarrojo IR (neto) y de RMN H (preferentemente en CDCl3 o DMSO-d6) del
extracto o la fracción, para tratar de detectar y estimar particularmente la presencia y proporción de
componentes lineales y de otros tipos de metabolitos secundarios definidos.
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La estimación de la presencia de componentes lineales se consigue directamente, mediante
observación simple de la intensidad y proporción de las absorciones hacia 720 cm-1 (IR) y 1,25
ppm (RMN 1H).

La estimación de componentes funcionalizados se puede llevar a cabo también mediante la

observación del espectro de IR, a través de las absorciones que aparezcan en las regiones de 3500-
3000 cm-1 (funciones NH y OH, olefinas y sistemas aromáticos), 1800-1500 cm-1 (carbonilos,
carboxilos e insaturaciones) y 1100-800 cm-1 (éteres e insaturaciones); complementándola con la
observación del espectro de RMN 1H, en las zonas 13-8 ppm (H puente, aldehídos, amidas), 8-6
ppm (aromáticos y olefínicos conjugados), 6-3 ppm (olefínicos, alcoholes, ésteres, grupos metoxilo,
azúcares,…) y 3-0,5 (metilos) ppm.

Para poder apreciar la presencia de componentes funcionalizados en el espectro de protón, suele ser
imprescindible incrementar notablemente la amplitud del registro ordinario, en 10/100/1000 veces.
De esa manera, se pueden detectar compuestos (agrupaciones estructurales) con muy baja
abundancia relativa en el extracto o en la fracción analizada.

2.3. Ensaios Fitoquímicos

Tanto no screening cromatográfico prévio de extractos vegetais como na sequência de isolamento
e purificação de compostos é imprescindível a revelação das placas de cromatografia (TLC – Thin
Layer Chromatography) com reagentes específicos para grupos funcionais ou subestruturas dos
vários metabolitos. As reacções que ocorrem entre um determinado reagente e as nossas moléculas
são muitas vezes específicas apenas para uma determinada funcionalidade ou engloba uma gama
restrita de funcionalidades moleculares semelhantes. Em qualquer dos casos a utilização destes
reagentes é passo indispensável numa sequência de estudo cromatográfico.
Em seguida está listada uma série de reveladores1 (sprays) que se utilizam na identificação das
estruturas mais importantes e que nos propomos estudar: açúcares, alcalóides, compostos
fenólicos, metabolitos de cadeias carbonadas longas (ie. ácidos gordos, ceras, alcanos,
triglicéridos), péptidos e terpenóides. A listagem que se apresenta não pretende ser exaustiva. Há
que ter em atenção que existem descritos outros reagentes específicos para os vários tipos
estruturais para além dos que se apresentam. O primeiro revelador descrito em cada caso será o
mais indicado. Os restantes estão descritos para que haja maior probabilidade de os reagentes
necessários já existirem no laboratório.

2.3.1. Açúcares
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 1. α-Naftol - ácido sulfúrico
Solução: Misturar 10,5 mL de uma solução 15% em α-naftol em etanol com 6,5 mL de
H2SO4 98%, 40,5 mL de etanol e 4 mL de H2O.
Tratamento: Aquecimento a 100ºC durante 3 a 6 min.
Os açúcares relam-se como manchas castanhas.

2. o-Aminodifenilo - ácido fosfórico

Solução: Dissolver 0,3g de o-aminodifenilo em 5 mL de ácido fosfórico 85% em 95 mL
de etanol.
Tratamento: Aquecimento a 110ºC durante 15 a 20 min.
Os açúcares relam-se como manchas castanhas.
3. Fenol - ácido sulfúrico
Solução: Dissolver 3g de fenol e 5 mL de H2SO4 97% em 95 mL de etanol.
Tratamento: Aquecimento a 110ºC durante 10 a 15 min.
Os açúcares relam-se como manchas castanhas.
4. KMnO4 alcalino
Solução: Dissolver 0,5 g de KMnO4 em 100 mL da NaOH 1M.
Tratamento: Aquecimento a 100ºC.
Perda da coloração violeta própria do KMnO4 sobre as manchas dos compostos que
reagiram.
5. Timol - ácido sulfúrico
Solução: Dissolver 0,5 g de timol em 95 mL de etanol. Juntar, lentamente, 5 mL de
H2SO4 97%.
Tratamento: Aquecimento a 120ºC durante 15 a 20 min.
Os açúcares revelam-se como manchas rosa.

6. Ureia - ácido clorídrico

Solução: Dissolver 5 g de ureia em 20 mL de ácido clorídrico 2M e adicionar 100 mL de
etanol.
Tratamento: Aquecimento a 100ºC.
As cetoses e oligossacáridos que contenham cetoses tornam-se azúis.

2.3.2. Alcalóides
1. Reagente de Dragendorff
Solução A: Dissolver 1,7 g de nitrato de bismuto(III) em 80 mL de uma solução aquosa
contendo 20 g de ácido tartárico.
Solução B: Dissolver 16 g de iodeto de potássio em 40 mL de H2O.
Solução stock: Juntar volumes iguais de a e b. Esta solução stock é estável por vários
meses quando guardada no frigorífico.
Solução spray: Dissolver 10 g de ácido tartárico em 50 mL de H2O e juntar 10 mL da
solução stock.
Os alcalóides revelam com coloração laranja.

2. Iodo – iodeto de potássio acídico

Solução: Dissolver 1 g de iodo e 10 g de iodeto de potássio em 50 mL de H2O e dicionar
2 mL de ácido acético. Perfazer o volume a 100 mL com H2O.
Os alcalóides revelam com coloração laranja.

3. Borotetrafenilo de sódio

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 Solução A: Solução 1% de borotetrafenilo de sódio em etil metil cetona, saturada com
H2O.
Solução B: Solução 0,015% de quercetina em metanol.
Tratamento: Aplicar a solução a e deixar secar à temperatura ambiente. Aplicar a solução b
e deixar secar à temperatura ambiente.
Os alcalóides revelam com coloração de laranja a vermelha sob radiação UV (366nm).

2.3.3. Compostos fenólicos

1. Ácido p-toluenosulfónico
Solução: Solução 20% de ácido p-toluenosulfónico em clorofórmio.
Tratamento: Aquecimento a 100ºC durante alguns minutos. Visualizar sob radiação UV
(366nm).
Revela flavonóides, catechinas e ainda esteróides.

2. Cloreto de alumínio
Solução: Solução 1% de cloreto de alumínio em etanol.
Fluorescência amarela sob radiação UV (254nm) para flavonóides.

3. Cloreto de antimónio (III)

Solução: Solução 10% de cloreto de antimónio (III) em clorofórmio.
Fluorescência sob radiação UV (254nm) para flavonóides.

4. Sulfato de cobre (II) – citrato de sódio

Solução: Dissolver 1,3 g de sulfato de cobre (II), 17,3 g de citrato de sódio e 10 g de
carbonato de sódio anidro em H2O e perfazer o volume a 100 mL.
Fluorescência sob radiação UV (366nm) para coumarinas com grupos o-dihidroxi.
Compostos sem grupos o-dihidroxi mantêm ou exibem fluorescência mais forte, muitas
vezes mudando de cor.

5. Hidróxido de potássio
Solução: Solução 5% de hidróxido de potássio em metanol.
Após secagem à temperatua ambiente visualizar as manchas sob radiação UV (366nm).
São reveladas coumarinas e glicosídeos de antraquinonas.

2.3.5. Metabolitos de cadeias carbonadas longas (ácidos gordos, ceras, alcanos, triglicéridos)
1. Ácido molibdofosfórico
Solução: Solução 10% de ácido molibdofosfórico em etanol.
Tratamento: Aquecer a 100ºC até ao aparecimento de coloração azul.
(Este reagente está também referido no ponto 1. dos reveladores de terpenóides).

2. N-bromosuccinimida - fluresceína
Solução A: Dissolver 0,01 g de N-bromosuccinimida em 100 mL de ácido acético.
Solução B: Dissolver 0,01 g de fluoresceína em 100 mL de etanol.
Tratamento: Aplicar sucessivamente as soluções a e b sem aquecimento.
Visualizar sob radiação UV (366nm).

3. α-Ciclodextrina
Solução: Solução 30% de α-ciclodextrina em etanol.
Tratamento: Secar à temperatura ambiente e colocar numa câmara de iodo.

4. Fluoresceína
Solução: Solução 0,01% de fluoresceína em etanol.

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 Tratamento: Secar com aquecimento ligeiro e colocar sob vapor de água.

5. Rodamina 6G
Solução: Dissolver 0,001 g de rodamina 6G em 100 mL de acetona.
Visualizar sob radiação UV (366nm).

6. Azul de bromotimol
Solução: Dissolver 0,04g de azul de bromotimol em 100 mL de solução de hidróxido de
sódio 0,01M.

7. Difenilamina
Solução: Misturar 20 mL de solução etanólica 10% de difenilanina, 100 mL de HCl e 80
mL de ácido acético glacial.
Revela glicolípidos com coloração azul esverdeado.

2.3.6. Péptidos
1. Ninidrina
Solução: Solução 10% de ninidrina em etanol.
Revela péptidos e α-aminoácidos com cor violeta ou rosada.

2.3.7. Terpenóides
1. Ácido molibdofosfórico
Solução: Solução 10% de ácido molibdofosfórico em etanol.
Tratamento: Aquecer a 100ºC até ao aparecimento de coloração azul.
(Este reagente já foi referido no ponto 1. dos reveladores de Metabolitos de cadeias
carbonadas longas).

2. Cloreto de antimónio (III) – ácido acético

Solução: Dissolver 20 g de tricloreto de antimónio (III) numa mistura de 20 mL de ácido
acético e 60 mL de clorofórmio.
Tratamento: Aquecimento a 100ºC durante 5 min. Os diterpenos podem mostrar
coloração laranja ou violeta.
Revela esteróides e diterpenos.

3. Ácido clorosulfónico – ácido acético

Solução: Dissolver 5 mL de ácido clorosulfónico em 10 mL de ácido acético com
arrefecimento.
Tratamento: Aquecimento a 130ºC durante 5 a 10 min.
Visualizar sob radiação UV (366nm).
Revela triterpenos, esteróis e esteróides.

4. p-Fenilenediamina – ácido ftálico

Solução: Dissolver 0,9 g de p-fenilenediamina e 1,6 g de ácido ftálico em 100mL de 1-
butanol, saturado com H2O.
Tratamento: Aquecimento a 100-110ºC.
As manchas revelam de amarelo a laranja.
Indicado para 3-cetoesteróides.

5. Ácido pícrico – ácido perclórico

Solução: Dissolver 0,1 g de ácido pícrico numa mistura de 36 mL de ácido acético e 6 mL
de ácido perclórico 70%.
Tratamento: Aquecimento a 70-80ºC durante 3 a 5 min.
As manchas revelam laranja.

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 Indicado para ∆5-3β-hidroxiesteróides.

6. Hidróxido de sódio
Solução: Solução 10% de hidróxido de sódio 60% em metanol.
Tratamento: Aquecimento a 80ºC durante 10 min.
As manchas revelam laranja.
Indicado para ∆4-3β-cetoesteróides que revelam fluorescência amarela sob radiação UV
(366nm).

7. Ácido trifluoroacético
Solução: Solução 1% de ácido trifluoroacético em clorofórmio.
Tratamento: Aquecimento a 120ºC durante 5min.
Para esteróides.

8. Vanilina – ácido fosfórico

Solução: Dissolver 1 g de vanilina em 100 mL de ácido fosfórico 50%.
Tratamento: Aquecimento a 120ºC durante 10-20 min.
Para esteróides.

Bibliografia
1. Dyeing Reagents for Thin Layer and Paper Chromatography, E. Merck, Darmstadt, 1978.

2.4. Fraccionamiento Preliminar de los Extractos

Cuando se pretende realizar un estudio puramente analítico/identificativo de los extractos y de sus

componentes, las técnicas y metodologías a aplicar son bastante diferentes de aquellas que han de
utilizarse cuando se pretende manejar cantidades sustanciales de productos.
En el primer caso, la aplicación directa de técnicas cromatográficas de media o alta resolución,
integradas preferentemente con sistemas de recolección de muestras y de identificación espectral
automatizada, resuelven en gran extensión y con facilidad la investigación.
El segundo caso, es aquel en el que se hace necesario disponer de cantidades suficientes de los
productos, porque se planea llevar a cabo, por ejemplo, ensayos in vivo y se pretende llegar hasta el
aislamiento y determinación estructural del componente activo, que suele no ser mayoritario y,
además, se desea confirmar su actividad. Se hace necesario en estos casos, extraer cantidades
importantes de material vegetal y manejar volúmenes considerables de disolventes y, sobre todo,
alcanzar una mayor eficacia en las separaciones y purificaciones.
Una estrategia que ayuda a paliar las dificultades del manejo masivo de materiales y disolventes,
consiste en realizar fraccionamientos preliminares, que permitan seleccionar, y separar del resto
inútil, la parte de mayor interés para la bioactividad que se quiere evaluar.
En general, existen dos tipos de fraccionamiento, unos, basados en la solubilidad selectiva de los
distintos componentes de los extractos en disolventes apropiados y otros, basados en la distinta

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naturaleza, acida, neutra o básica de los componentes, que se llevan a cabo, principalmente, en
disolución y mediante extracciones líquido/líquido.

2.4.1. Fraccionamientos basados en la solubilidad diferencial

Un extracto genérico, obtenido de una planta medicinal u otro organismo, puede contener más de
un centenar de sustancias. Tratar de identificarlas y separarlas en cantidades macroscópicas y
manejables, constituye una tarea ardua. Los extractos obtenidos con disolventes muy poco polares,
como el n-hexano o éter de petróleo, suelen presentar un contenido homogéneo, que se complica en
los obtenidos con disolventes clorados o de polaridad media y mucho más cuando el agente
extractor es un alcohol, como metanol o etanol o mezclas alcohol-agua.
En los casos de extractos de polaridad media o alta es aconsejable efectuar un fraccionamiento por
solubilidad. Este fraccionamiento puede llevarse a cabo por el método clásico de reparto de
componentes entre dos disolventes suficientemente poco miscibles, uno de los cuales generalmente
es agua, lo que da lugar a la formación de interfases difíciles de resolver. El otro método, que
ordinariamente no utiliza agua, se basa en la solubilización parcial o la insolubilización parcial de
los constituyentes del extracto. La solubilización parcial, se basa en el uso sucesivo de disolventes
de polaridad creciente, mientras que la insolubilización parcial se basa en el uso sucesivo de
disolventes de polaridad decreciente.
En el caso de extractos secos sólidos, pulverulentos o triturables (liofilizados y extractos acuosos
secos) puede aplicarse la modalidad de solubilización parcial creciente, que funcionaría
aproximadamente como una extracción líquido/sólido y permitiría obtener sucesivamente
fracciones de polaridad creciente.
En el caso de extractos viscosos (alcohólicos), parece más apropiada la modalidad de
insolubilización parcial decreciente. En ella el extracto, sin terminar de evaporar el disolvente, se
diluye, lentamente y agitando, con cantidades progresivas de un disolvente de menor polaridad,
separándose las partes solubles de las insolubles (solubles selectivamente en el disolvente de
extracción original) cuando se haya producido la decantación completa y, al menos la fase superior
haya alcanzado la transparencia total.
Es importante tomar en consideración que las sustancias del propio extracto actúan como
disolventes unas de otras y que las separaciones, si se efectúan en una sola etapa, pueden resultar
no demasiado selectivas. En general se hace necesario, por un lado, efectuar la redisolución y
reprecipitación repetida y por otro, que las proporciones disolvente/extracto sean suficientemente
grandes (30-40 veces) para alcanzar la eficacia deseada.
En el esquema siguiente se presenta un modelo simplificado del segundo tipo de fraccionamiento
basado en la solubilidad (polaridad) de los componentes de un extracto alcohólico-acuoso. Las
diluciones que se mencionan en el esquema, conviene que alcancen hasta un volumen 30-40 veces
superior al de partida.

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Esquema simplificado de fraccionamiento de un extracto por insolubilización parcial

Extracto
(etanólico-acuoso 30%)
Concentración
Dilución con etanol

Insoluble Soluble en etanol

(parte acuosa)
Concentración
Dilución con n-butanol

insoluble Soluble en n-butanol

(parte etanólica)
Concentración
Dilución con DCM

insoluble Soluble en DCM

(parte butanólica)
Concentración
Dilución con n-hexano

insoluble Soluble en n-hexano

(parte diclorometánica)
Evaporación

(Parte hexánica)

También conviene considerar, que una vez realizada una experiencia inicial y en el supuesto de que
se hubiera localizado la fracción bioactiva en alguna de las partes definidas, se podría eliminar
alguna etapa y, previsiblemente, simplificar el esquema anterior para efectuar de forma más eficaz
su escalado productivo.

2.4.2. Descerado
Las ceras epicuticulares de las hojas y el resto de los lípidos contenidos en los extractos de
vegetales, contienen sustancias lineales o poco ramificadas de muy diversa naturaleza (neutras,
acidas), polaridad (hidrocarburos, cetonas, alcoholes, ácidos, ésteres) y tamaño (desde C6 hasta C40
y polímeros estólidos) que, además, se presentan en forma de series homólogas. Por estas causas, se
puede asegurar, con toda probabilidad, que en cualquier extracto, existirán alguna o algunas
sustancias lineales, con una capacidad de adsorción/reparto sobre el soporte cromatográfico y con
una retención cromatográfica prácticamente equivalentes a las de los metabolitos secundarios de
mayor interés que se desea aislar. Consecuentemente, la presencia de componentes lineales produce
la aparición de los típicos “regueros continuos” en las placas cromatográficas y puede llegar a

11
complicar considerablemente los procesos de separación y purificación de los componentes
bioactivos del extracto.
La proporción de componentes lineales en un extracto o fracción puede ser muy variable y está
condicionada en primer lugar por el disolvente y las condiciones de extracción utilizados y,
particularmente, por el desengrasado del material vegetal, en el caso de que se hubiera realizado
antes de la extracción principal. Un extracto diclorometánico (ED), que haya sido obtenido sin un
desengrasado previo con n-hexano, es seguro que precisará una o varias operaciones de descerado;
mientras que uno metanólico o etanólico-acuoso, que se hayan mantenido suficientemente
enfriados, < 4º C, durante una noche, quedará desprovisto de la mayor parte de sus componentes
lineales poco polares, aunque pueda que aún contenga otros de naturaleza más polar.
En cualquier caso, es conveniente llevar a cabo el examen de los espectros IR/RMN, que sin duda,
denotarán la ausencia o presencia de compuestos lineales, y ayudará a decidir si deben aplicarse o
no los procedimientos de “descerado” para facilitar el fraccionamiento subsiguiente y la
purificación de las sustancias bioactivas. Dependiendo de la proporción de componentes lineales
que se detecte, se pueden aplicar, independiente o sucesivamente, las dos técnicas que se
mencionan a continuación.

2.4.2.1. Descerado con metanol

El extracto ED obtenido con DCM, en estado fluido, sin haber terminado de evaporar el disolvente de
extracción (conteniendo aproximadamente una parte de extracto y de una a dos partes de DCM) se diluye
con metanol (muy lentamente al principio y más rápidamente después), mientras se agita y hasta alcanzar un
volumen 50-70 veces mayor que la masa que se estime que corresponde al extracto si estuviera exento de
disolvente. Se deja en reposo durante la noche, en nevera o congelador (entre 4 y -12ºC). Se decanta o filtra
según su aspecto. El residuo sólido o semisólido (LD: Lineales-Diclorometano) contendrá
fundamentalmente componentes lineales poco polares (hidrocarburos, cetonas, estólidos, alcoholes y ácidos
de cadena larga y triglicéridos) y la parte metanólica una vez evaporada a sequedad (DD: Descerado-
Diclorometano) quedaría exenta de esos componentes.
Este fraccionamiento es simple en su realización y muy eficaz en relación con los contenidos de la
parte LD, pero puede no ser todo lo eficaz que se espera, en relación con la ausencia de
componentes lineales en la parte DD. Sin embargo, no suele mejorar la situación aunque se repita la
operación nuevamente con esta última fracción. En el caso de que la proporción de lineales en DD
sea todavía notable, se recomienda aplicar la segunda técnica. El control de la eficacia del
descerado se realiza mediante la observación de los espectros de IR y RMN de 1H. Una placa
cromatográfica, comparando ED, LD y DD, también ayudará en este control.
SE deben tomar las precauciones adecuadas para evitar la inhalación o el contacto físico con el
metanol en todas las operaciones.

2.4.2.2. Descerado con metanol y urea

12
Esta técnica puede aplicarse directamente sobre el extracto ED, si sus espectros indicaran que su
proporción de componentes lineales es baja, o sobre la parte DD, que ya recibió un primer
tratamiento. El extracto o parte resultante de la operación anterior se disuelve o diluye
respectivamente con metanol (caliente, si es necesario hasta 50ºC), hasta un volumen de 30 veces la
masa de extracto, controlando que no se produzcan precipitaciones súbitas o rápidas, y a
continuación se añaden, con agitación, hasta 15g de urea por cada 100mL de MeOH.
Posteriormente se deja enfriar y se almacena a temperatura de -10ºC o menor, durante una noche.
Se filtra, quedando un residuo sólido generalmente de poco interés para la bioactividad
(conteniendo clatratos de los componentes lineales con urea y urea cristalizada) y un filtrado
metanólico que contiene los componentes no lineales del extracto, el cual se evapora con
precaución, para evitar proyecciones al cristalizar la urea. La eliminación de la urea de este nuevo
residuo, se efectúa dispersándolo entre éter dietílico (o acetato de etilo) y agua, extrayendo varias
veces y lavando repetidamente con disolución acuosa diluida de HCl y con agua, hasta neutralidad.
Resuelta la extracción se seca la reunión de disoluciones orgánicas con sulfato sódico anhidro y se
evaporan a sequedad, conduciendo a la fracción DDU (Diclorometano-Descerado-Urea).
Eventualmente, si se manipula el residuo sólido de la filtración de forma similar, podría obtenerse
otra fracción LDU (Lineales-Diclorometano-Urea).
Después de aplicar esta técnica, descrita por Schlenk H y Holman RT. (J. Am. Chem. Soc. 72, 5001,
1950) la fracción DDU, queda prácticamente exenta de componentes lineales.

2.4.3. Fraccionamiento Basado en la Naturaleza de los Componentes

Los componentes de un extracto pueden agruparse y separarse en función de su naturaleza acida,
básica o neutra. La realización de pruebas fitoquímicas previas y/o el análisis de los espectros de
IR y de RMN podrán informar sobre la presencia de grupos carboxílicos o fenólicos libres
La manera de operar puede ser diferente, dependiendo de los contenidos que se esperan para el
extracto y de los objetivos de la propia investigación.
En el caso de querer estudiar y aislar solamente los componentes básicos (alcaloides), es frecuente
que se aplique un procedimiento de extracción selectiva del material vegetal con disoluciones
acuosas o acuoso-alcohólicas, aciduladas con ácidos clorhídrico, acético o cítrico, seguida de la
liberación de los alcaloides por neutralización o basificación del extracto con hidróxidos o
carbonatos de sodio o potasio, lo cual permite reextraerlos hacia un disolvente orgánico en el que
sean suficientemente solubles.
En el caso de extractos que contienen solamente componentes ácidos y neutros, el fraccionamiento
por extracción con bases resulta particularmente eficaz; sobre todo, si previamente se han retirado
del mismo los componentes lineales, mediante alguna de las modalidades de descerado que se han
mencionado anteriormente. La recomendación de efectuar este tipo de fraccionamiento es

13
apropiada, tanto si desean estudiar principalmente los componentes neutros, como si solamente se
esta interesado por las sustancias ácidas; ya que, salvo casos particulares o cuando que se apliquen
condiciones particulares de elución o revelado de las placas, los ácidos suelen originar manchas
alargadas que se superponen con otras y originan una mala resolución cromatografica de las
mezclas.
El disolvente orgánico a utilizar, generalmente éter dietílico (Et2O) o acetato de etilo (AcOEt), está
determinado por la polaridad/solubilidad del extracto y por la temperatura ambiente del laboratorio,
tratando siempre de evitar, particularmente en el caso del acetato de etilo, contactos prolongados
con las fases acuosas básicas o ácidas que pueden llegar a provocar su saponificación.
Algunas sales sódicas de ácidos orgánicos pueden ser tan solubles en el medio acuoso como en el
orgánico utilizado y pueden dar lugar a la aparición de interfases, que se hacen bastante tediosas y
que podrían soslayarse utilizando mayores diluciones de ambas fases o añadiendo electrolitos
(NaCl) a la parte acuosa.

2.4.3.1. Fraccionamiento en Partes Acida y Neutra

La extracción de los ácidos de un extracto crudo hacia una disolución acuosa puede efectuarse con
distintas bases. El uso de hidróxidos alcalinos en concentraciones del orden del 4% permite extraer
los ácidos carboxílicos y los fenoles libres; mientras que disoluciones acuosas de carbonato sódico
semisaturado (6 %) pueden permitir extraer más selectivamente los ácidos carboxílicos. Si se
utilizan disoluciones de bicarbonato sódico podrían quedarse selectivamente sin extraer algunos
ácidos carboxílicos ramificados o más débiles.

En el esquema que se representa a continuación se describe en forma simplificada este tipo de

fraccionamiento. El extracto diclorometánico ED, se descera con metanol para separar sus
componentes lineales LD de la parte descerada DD; la cual se somete a extracción con disolución
acuosa de carbonato. La parte no extraida con la base, una vez seca y evaporado el disolvente,
constituye la parte neutra descerada DDN del extracto de DCM. La disolución acuosa básica, una
vez acidulada y extraida con disolvente orgánico, después de lavar, secar y evaporar el disolvente
conduce a la parte ácida descerada DDA del extracto de DCM.

14
Esquema de fraccionamiento simple de un extracto obtenido con DCM

Extracto ED
Concentración a 1 / 20
Dilución con MeOH

Insoluble Soluble en MeOH (DD)

lineales, LD
evaporar
Et2O (AcOEt)
Na2CO3 (6%)-Acuoso

parte etérea parte acuosa

lavar, secar, acidular, extraer

evaporar lavar, secar,
evaporar

parte neutra parte ácida

DDN DDA

Para que este fraccionamiento funcione adecuadamente, la proporción disolvente a extracto debe de
ser unas 80-100 veces mayor, las extracciones líquido/líquido deben repetirse unas tres veces,
reuniendo las partes homogéneas para seguir la manipulación que corresponda. La parte acuosa, se
neutraliza cuidadosamente para evitar espumas y proyecciones, se acidula hasta pH<3 y se extrae
repetidamente con Et2O (AcOEt). Las fases orgánicas se lavan con agua hasta neutralidad, se secan
con sulfato sódico anhidro. Para desecar la fase neutra puede utilizarse también como deshidratante
el carbonato sódico anhidro.
Si las operaciones se realizan correctamente, la suma de las masas correspondientes a las porciones
LD, DDN y DDA, debe de aproximarse a la masa inicial sin disolvente de ED.
Todas las fracciones resultantes deben caracterizarse y analizarse por medio de sus espectros de IR
y RMN. En caso de que el extracto ED hubiera resultado activo, al menos las fracciones DDN y
DDA debieran someterse al mismo ensayo y en caso de no encontrar la actividad esperada en
alguna de las dos, también debería ensayarse la fracción LD.

15
2.4.3.2. Fraccionamiento de Extractos Etanólicos, EE (etanólico-acuosos)

Para este tipo de extractos, si se han obtenido con posterioridad al de DCM, no se espera que contengan
muchos compuestos lineales; al menos poco polares. Se considera conveniente, una vez evaporada la mayor
parte del EtOH (reducción al 30% del volumen), se podrá fraccionar en presencia de agua adicional, por
extracción sucesiva con DCM (en la fase inferior orgánica, se separará el material EED, muy parecido al
extracto original ED) y n-butanol (en la fase superior orgánica, se separará el material EEB, que contendrá
los componentes polares del extracto). La disolución acuosa residual liofilizada, EEA, contendrá los
componentes hidrofílicos más polares, que podrían en parte, aproximarse a los contenidos de una infusión
acuosa.

Esquema de fraccionamiento simple de un extracto etanólico

Marco Residual del

Extracto ED
EtOH
(3 veces, Agotamiento)

Extracto etanólico
EE

Concentración
Agua + DCM

Fase DCM Fase acuosa

EED
n-BuOH

fase butanólica fase acuosa

EEB EEA

Si se obtuvieron resultados positivos de bioactividad con el extracto EE, se debe también ensayar
las muestras de los extractos EEB y EEA. Opcionalmente EED, sobre todo si ED resulto activo.
El fraccionamiento cromatográfico posterior de los extractos polares activos, derivados de EE,
queda a discreción del investigador, recomendándose una separación inicial por tamaños
moleculares de los metabolitos con sephadex LH20.

16
2.5. Isolamento e Purificação de Compostos Naturais

Tendo em atenção o processo de fraccionamento previamente estabelecido há que considerar o

extracto L (extracto aquoso) que se separa em LI (extracto de isopropanol ou LB - extacto de n-
butanol) e LR (resíduo). O extracto etanólico designa-se por EE. Destes extractos isolam-se
açúcares, péptidos e outros compostos que, devido ao seu carácter polar, têm afinidade pelos
solventes referidos. Os extractos contêm também metabolitos que possuem menor polaridade mas
que ocorrem condensados com unidades de açúcares, o que os leva para extractos polares como é
comum com os compostos fenólicos e terpenóides.
Nalguns casos em que a utilização popular da espécie vegetal se adeque é relevante estudar, além
dos extractos L e EE, um extracto menos polar ED (diclorometano – preparado por extracção
directa a frio do material vegetal seco e moído) onde estarão presentes compostos pouco polares
que ocorrem livres (ie sem unidades de açúcares) tais como compostos fenólicos, e terpenóides dos
quais há que considerar os óleos essenciais, sesquiterpenos, triterpenos e moléculas de natureza
esteroidal. Os compostos de cadeia longa também se encontram no extracto de diclorometano e da
sua relativa importância se falará mais adiante.
Neste parágrafo pretendem apresentar-se processos de isolamento e purificação dos metabolitos
naturais fundamentais que aqui se dividem em seis grupos: alcalóides, compostos fenólicos,
compostos glicosidados, lípidos, péptidos e terpenóides.
São apresentados métodos para o fraccionamento e purificação dos diferentes metabolitos que não
são de modo nenhum relatados de forma exaustiva mas sim são apresentados métodos gerais em
função do comportamento químico comum de cada femília de compostos. Não nos centramos pois
em métodos aperfeiçoados para tipos estruturais específicos.

Alcalóides
Dado o carácter básicos dos alcalóides devem ser directamente extraídos do material vegetal seco e
muído com uma solução ácida. Pode utilizar-se solução aquosa de ácido clorídrico 0,5 M com
agitação durante 30 min à temperatura ambiente. Deve centrifugar-se em seguida e a solução
centrifugada deve ser filtada por papel de filtro para eliminação completa do sobrenadante. A
solução ácida é em seguida basificada a pH 12 com amónia a 25%. Para extração da mistura de
alclóides a solução básica, esta deve ser rápidamente vertida numa coluna com enchimento de
isolute® (0,8g de isolute® /mL de fase acuosa) para que seja adsorvida. Faz-se passar em seguida
diclorometano (4 mL de diclorometano/mL de fase aquosa) que vai dissolver o material orgânico.
Depois de evaporação do solvente o extracto de alcalóides está pronto para ser cromatografado.

17
Os alcalóides são compostos quimicamente heterogéneos e por esse motivo é possível descrever
várias metodologias cromatográficas para o seu fraccionamento. Apresenta-se um método que
pode ser geralmente aplicado.
O fraccionamento do extracto poderá ser feita em coluna de sílica gel 60 com eluição de misturas
de diclorometano:metanol 1% com amónia, com proporções de diclorometano:metanol
determinadas em função da polaridade dos metabolitos. A cromatografía de coluna deve ser
seguida por cromatografía de placa, também de sílica gel, com revelação com solução de
Dragendorff.

Compostos fenólicos
O termo composto fenólico engloba um vasto grupo de substâncias que possuem um ou mais anéis
aromáticos com substituintes hidroxilo. Muitas destas substâncias são solúveis em água pois
ocorrem combinados com unidades de açúcar. Os flavonóides constiuem o maior grupo destes
metabolitos sendo outros grupos compostos por fenóis monocíclicos, fenil propanóides e quinonas
fenólicas. Também se têm que considerar os polifenóis poliméricos tais como as lenhinas,
melaninas e taninos.
Os fenóis podem ser identificados no extracto por cromatografía em sílica gel e revelação com
reagentes adequados (tal como descrito no capítulo de reveladores). A forma clássica de detecção
de fenóis envolve a utilização de cromatografía em papel ou em placas de celulosa. No entanto a
sílica gel pode ser utilizada com bons resultados.
Para a separação de componentes fenólicos pouco polares (ie fenóis livres) o extracto pode
cromatografar-se directamente em coluna de sílica gel 60 utlizando como eluente misturas de n-
hexano:acetato de etilo ou diclorometano:metanol em proporções que devem ser testadas para cada
caso. Para compostos mais polares é necessária a separação sobre sílica gel de fase reversa (RP-18)
tanto em coluna gravítica como por HPLC. Para este último caso podem utilizar-se como eluentes
misturas de água:metanol:ácido acético (testar de início na proporção de 12:6:1) e água:ácido
acético:n-butanol (testar de início na proporção 342:1:14). As proporções propostas devem ser
ajustadas para cada caso.
Toda a cromatografía deverá ser acompanhada por cromatografía em camada fina com revelador
específico.

Compostos glicosidados
Os extractos alcoólicos devem ser concentrados a vácuo para remover completamente o álcool e o
extracto aquoso concentrado deve ser libertado de qualquer precipitado por filtação através de
celite ou por centrifugação. Se necessário podem lavar-se os extractos com éter de petróleo para
eliminar lípidos, caso eles estejam presentes. Estes extractos são ricos em metabolitos
glicosidados, e também em açúcares livres e oligassacáridos, os quais não são objecto do nosso

18
estudo. Os açúcares são compostos relaticamente lábeis e podem isomerizar com facilidade e/ou
sofrer abertura de anel durante a extracção e concentração dos extractos1. Por estes motivos não se
devem sujeitar a calor ou grandes alterações de pH quando se faz a identificação de um metabolito
condensado (ie aglícona + unidade de açúcar).
A separação dos componentes dos extractos alcoólicos pode levar-se a cabo por eluição em coluna
de sílica gel RP-18 (ie fase reversa). A coluna deve ser empacotada com metanol e eluída com
água até remover completamente o metanol inicial. A eluição do extracto inicia-se com água e
controla-se a recolha das fracções por TLC (Thin Layer Chromatography) com revelação de α-
naftol-ácido sulfúrico até completa eluição dos açúcares. Após este passo prossegue-se a eluição
com metanol (ou misturas de metanol:água em proporções estabelecidas em função das amostras
em estudo) recolhendo as várias fracções cujos conteúdos em metabolitos glicosidados se
controlam com reveladores específicos tais como – ácido p-toluenosulfónico para flavonóides e
ácido molibdofosfórico para terpenóides. Os péptidos, dependendo das suas estruturas, podem ser
eluídos com metanol ou misturas de metanol:água, e a sua presença é controlada com ninidrina
(vide pruebas químicas).
Após a concentração das fracções em função da revelação são recromatografadas sobre coluna de
RP-18, caso se observem misturas de compostos estruturalmente distintos. Purificações posteriores
devem ser realizadas em sistemas de média pressão ou HPLC em função do comportamento
cromatográfico de cada fracção. Para que se possa identificar a aglícona nos casos em que as
purificações dos metabolitos glicosidados não se consigam concretizar dada a semelhança
cromatográfica, podem hidrolizar-se as fracções em meio ácido com H2SO4 1 M seguindo-se
neutralização com adição lenta de solução de bicarbonato de sódio 10%. A aglícona é extraída com
éter etílico ou acetato de etilo seguida de lavagem com água e posteriormente identificada.
Para estudar os açúcares livres devem analisar-se e identificar-se as misturas destes por
cromatografia gás-líquido e espectrometria de massa por formação de derivados (GLC e MS).2

Lípidos
Nas instruções para preparação de extractos refere-se que se devem eliminar compostos lineares,
pois estes se entendem de importância menor e dificultam a separação de outros compostos. No
entanto estruturas insaturadas podem ser importantes como antioxidantes, ou exibir actividade
devido à presença de funções oxigenadas. O estudo destes compostos apenas se justifica caso a
fracção seja activa. Os lípidos que aqui se indicam referem-se a ácidos orgânicos, alcanos e
compostos relacionados, e ainda poliacetilenos.
A separação dos ácidos orgânicos de um extracto de diclorometano pode ser realizada por
cromatografia em coluna de sílica gel 60 com eluição de diclorometano:metanol ou n-
hexano:acetato de etilo em proporções de acordo com o que se estabelece para cada caso por TLC

19
em suporte de sílica gel 60. A separação cromatográfica deve ser seguida com revelação com ácido
molibdofosfórico, como referido no parágrafo sobre reveladores (vide pruebas químicas). As
amostras depois de isoladas devem ser guardadas a baixa temperatura e sob atmosfera inerte para
evitar processos de oxidação. (Caso o extracto ainda possua ácidos gordos a dado passo do
fraccionamento, estes podem ser separados passando a fracção por uma coluna de permuta iónica
na forma catiónica, para remover catiões e aminoácidos. Passagem através de resina de permuta
iónica fracamente básica sob a forma de hidroxilo leva à retenção de ácidos orgânicos na forma
aniónica. Estes são posteriormente libertados da resina com solução de HCl 0,1 M)1. As amostras
de ácidos terão de ser derivatizadas (ie. preparação de derivados significativamente menos polares)
para posterior análise por cromatografia gasosa. Esta técnica é fundamental porque os ácidos de
cadeia longa ocorrem em séries homólogas. Podem preparar-se os ésteres metílicos ou os éteres de
trimetilsililo por técnicas standard.3 Os ácidos de cadeia longa ocorrem com maior frequência
esterificados na forma de triglicéridos. Estes podem isolar-se por cromatografia de coluna de sílica
gel 60 e eluição com n-hexano ou éter de petróleo. Para a identificação dos ácidos procede-se à
saponificação da mistura segundo método standard.3
Os alcanos e compostos relacionados são particularmente abundantes nos extractos das folhas.
Estão distribuídos nas películas de ceras protectoras de agentes exteriores sendo também
reguladores do equilíbrio de água das plantas. Para isolar estes compostos há que utilizar material
de vidro e solventes livres de gorduras (nomeadamente parafinas). Se se pretender uma extracção
directa de ceras vegetais podem mergulhar-se as folhas inteiras em éter ou clorofórmio por apenas
30 segundos. Desta forma retiram-se os alcanos sem danificar os constituintes citoplásmicos. A
solução deve ser filtrada para eliminar impurezas sólidas. Os compostos promissores sob o ponto
de vista de actividade são os que resultam de alterações estruturais a partir dos alcanos. Derivam
da introdução de insaturações e/ou ramificações, ou ainda por oxidações das quais resultam
álcoois, aldeídos ou cetonas. A purificação dos extractos pode ser realizada por cromatografia
sobre alumina (Al2O3 – grau 20) e eluição com éter de petróleo.1 Neste processo separam-se quer
os alcanos dos compostos relacionados, quer os óleos essenciais que possam estar presentes. A
identificação posterior faz-se por cromatografia gasosa.
Os poliacetilenos são compostos que além da função acetilénica possuem outras funções tais como
álcoois, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, sistemas aromáticos e furanos. Extractos que
contenham este tipo de compostos podem ser purificados por cromatografia de coluna de sílica gel
60 ou de alumina e eluição com pentano:éter etílico (9:1) ou clorofórmio:metanol (9:1). Os
compostos acetilénicos revelam com cor amarela quando tratados com KMnO4 alcalino (vide
pruebas químicas). Podem também revelar-se as placas cromatográficas com solução de isatina
0,4% em H2SO4 concentrado. Após aquecimento os compostos acetilénicos revelam com cor
castanha (marron) ou verde.

20
Péptidos
A separação de péptidos já foi descrita conjuntamente com a separação de compostos glicosidados,
a qual se leva a cabo em coluna de sílica gel RP-18 e eluição com metanol ou misturas de
água:metanol. A fracção que contém péptidos é identificada por TLC com revelação com ninidrina
(vide pruebas químicas) e é purificada por HPLC em coluna de sílica gel RP-18 e eluição com
misturas de H2O:metanol:ácido trifluoroacético em proporções que são optimizadas de acordo com
a fracção em estudo. (A identificação dos compostos baseia-se fundamentalmente em ressonância
magnética nuclear e espectrometria de massa).

Terpenóides
Os terpenos são em geral compostos pouco polares, portanto lipossolúveis (caso não ocorram
combinados com unidades de açúcares) que se detectam facilmente por cromatografia de camada
fina com revelação com solução de ácido molibdofosfórico (revelam azul forte após aquecimento).
Geralmente são os compostos mais abundantes dos extractos de n-hexano, éter de petróleo, éter
etílico ou diclorometano de um material vegetal.
A variedade estrutural é grande desde os monoterpenos (componentes volácteis) passando pelos
sesquiterpenos (terpenos de maior diversidade e complexidade estrutural), diterpenos e triterpenos
assim como os esteróides, entre outros. Como se está a tratar de extractos polares é natural que
estes compostos enquanto aglíconas não façam parte da sua composição.
Falar da separação e isolamento destes compostos dos extractos polares de que aqui tratamos
apenas se têm que considerar estes compostos quando ocorrem glicosidados. Desta forma a
polaridade dos compostos é regida pelo componente de açúcar das moléculas e por este motivo a
sua separação e purificação deverá ser feita utilizando sílica gel de fase reversa (RP-18) e sempre
que possível HPLC utilizando-se como misturas de água:etanol. O HPLC aumenta enormemente a
eficiência de separação, sendo geralmente a única alternativa para a sua purificação.

21
2.6. Caracterização fitoquímica dos extratos de Cissus sulcicaulis

O efeito biológico das drogas vegetais utilizadas com fins medicinais depende de sua composição
química e esta de seu metabolismo ou capacidade biossintética. Na atualidade, conhecer a
composição química geral de uma droga é prática rotineira que se apóia em técnicas de "tamizage"
que conjugam a economia e a rapidez, com a segurança dos resultados a obter. Um exemplo do
exposto nos apartados precedentes se apresenta a continuação, para o caso da espécie envolvida no
Projeto Cissus sulcicaulis (Fam. Vitaceae).
Parte-se de 5g da planta seca triturada ou moída, realizando sobre o mesmo material 3 extrações
diferentes aumentando a polaridade dos solventes desde éter dietílico até água e etanol como
solvente de polaridade intermediária. A continuação se resume nos esquemas de trabalho e na
forma de realização dos ensaios e análises dos resultados.

Esquema de obtençao e caracterizaçao do extrato etéreo de C. sulcicaulis

5 g de planta

50 mL Et2O, macerando 24h

ou refluxo em banho de água, 15-30 min

Planta, resíduo 1 (*)

Extrato Éter

alícota seca alícota seca alícota seca alícota seca alícota seca

Dragendorff Liebermann Börntrager Baljet Sudan

Burchard

22
Esquema de obtençao e caracterizaçao do extrato etanólico de C. sulcicaulis

Planta, resíduo 1 (*)

50 mL EtOH, macerando 24h

ou refluxo em banho de água 15-30 min.

Planta, resíduo 2 (**)

Extrato Etanol

20 mL(seco) 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Fehling Baljet Espuma Cloreto Ninidrina
Férrico
Resto do extrato
concentrar até secura
adicionar 10 mL de HCl a 10%
aquecer e filtrar.
Repetir uma vez mais

Resíduo Lavados ácidos

Redissolver em
4 mL de CHCl3 1 mL
Dragendorff

Ajustar pH a 9 com NH4OH

Börntrager Liebermann Acrescentar 0,5g de Na2SO4
Burchard Lavar 2x15 mL de CHCl3

Solução acuosa Clorofórmio

2 mL, seco
Shinoda
2 mL 2 mL Börntrager
seco seco
Kedde Shinoda

23
Esquema de obtençao e caracterizaçao do extrato acuoso de C. sulcicaulis

Planta, resíduo 2 (**)

50 mL água, macerando 24h

ou aquecendo em banho de água 15-30 min.

Planta, resíduo final

Extrato Água

5 mL 2 mL 2 mL 2 mL esfriar sabor
acidificar NaAcO
Espuma Dragendorff Cloreto Fehling Mucílago principios
férrico amargos e
astringentes

2.6.1. Ensaios fitoquímicos aplicados

Dragendorff: A fração dissolvida em 1mL de ácido clorídrico a 1%, sem solvente orgânico, se
mescla com umas gotas do reativo. Um precipitado vermelho "tijolo" (púrpura) indica a presença
de alcalóide.

Liebermann-Burchard: A fração dissolvida em 1mL de clorofórmio acrescenta-se 1mL de acético

anídrico e se mistura. Pela parede do tubo de ensaio se deixa cair 3-4 gotas de ácido sulfúrico
concentrado. Uma cor verde-verde escura indica a presença de triterpenos e/ou esteroides.

Börntrager: A fração dissolvida em 1mL de clorofórmio, agita-se com 1mL de hidróxido de sódio
a 5%. Se a fase alcalina se colorir de rosa-vermelho isto indica a presença de quinonas.

Baljet: A fração dissolvida em 1mL de etanol, acrescenta-se uma mistura recém preparada de 1mL
de ácido pícrico a 1% em etanol e 1mL de hidróxido de sódio a 10% em água. Uma cor ou
precipitado vermelho laranja indica a presença de grupamentos lactônicos.

Sudan III: Quando um extrato etéreo se evapora em presença de uma solução de Sudam III a 6%
em glicerina-água (1:1), o aparecimento de gotas oleosas de cor vermelho escuro, indic a presença
de lipídios e/ou azeite essencial.

24
Espuma: A fração dissolvida em 1mL de etanol adiciona-se 10mL de água e agita-se a mistura
fortemente durante 2 minutos. Se aparecer uma espuma similar a de sabão que se mantém por mais
de 5 minutos isto indica a presença de saponinas.

Cloreto Férrico: A fração dissolvida em 1mL de etanol, acrescenta-se 0,5 mL de uma solução de
cloreto férrico a 5% em solução salina. O aparecimento de uma cor ou precipitado verde escuro
indica a presença de fenóis e/ou taninos. No extrato aquoso adiciona-se acetato de sódio prévio ao
ensaio.

Fehling: A fração concentrada a seco ou em água, se trata com uma mistura recém preparada de
1mL de Fehling A e 1mL de Fehling B. Aquece-se em banho de água durante 15-30 minutos. O
aparecimento de uma cor ou precipitado vermelho indica a presença de açúcares redutores.

Shinoda: A fração em 2mL de água, ou se está em 1mL de etanol acrescentar 2mL de água,
adiciona-se 1mL de ácido clorídrico concentrado e um pedaço de magnésio metálico. Quando a
reação termina, acrescenta-se 1mL de álcool amílico e agita-se. Se o álcool amílico se colorir de
amarelo, laranja, vermelho ou marrom mas com cores intensas, o ensaio indica a presença de
flavonóides.

Aminas: A fração dissolvida em 1mL de etanol, adiciona-se 1mL de solução de ninhidrina a 5%

em etanol. Aquece-se em banho de água 5-10 minutos. O aparecimento de uma coloração azul ou
violeta indica positividade do ensaio.

Kedde: A fração dissolvida em 1mL de etanol, é tratada com uma mistura recém preparada de 1mL
de 5-5 dinitrobenzoico ao 2% em etanol e 1mL de hidróxido de potássio a 5,7% em água. O
desenvolvimento de uma cor violeta entre 1-10 minutos indica a presença de glicosídio
cardiotônicos.

Mucilagem: Quando um extrato aquoso que contém mucilagem se esfria, a viscosidade da solução
aumenta e apresenta consistência gomosa ao tato.

Sabor: Uma gota do extrato se dilui com 5 gotas de água e se prova 1 gota. O paladar define a
presença de princípios amargos e/ou adstringentes.

Bibliografía
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25
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