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1.

3 Tcnicas de anlise em espectrometria de massas


I m ediat am ent e aps a ionizao da amostra, as mol-
culas ionizadas e no est ado gasoso ( ou plasm a) ent ram
no setor de anlise do espect rmetro de massas.
Neste, os diferentes ons gerados na cmara de
ionizao (on molecular + fragmentos) sero
Separados de acordo com sua razo massa/carga
( m / z) . O set or de anlise que determina a acurncia
do aparelho e em qual faixa de intervalo de massas
os compostos podem ser analisados. O setor de anlise
pode ser de 4 tipos:
- de campo magntico e elt r ico ( em cojunto ou no)
- de quadrupolo
- de tempo de vo (time of flight, TOF)
- de captura de ons (ion t rap)
- ressonncia ciclotrnica de ons (FT- MS)

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1.3.1 Analisadores de setor magntico e
setor magntico- eltrico ( dupla focalizao)

Os primeiros espectrmetros de massas desenvolvidos


fizeram ( e ainda fazem ) uso da aplicao de um campo
magnt ico para a a separao dos ons. Na presena do
campo magntico, os ons so acelerados em um
trajeto semi- circular. O raio de trajetria dos ons ir
depender de sua razo m/z. O setor magntico ir
separar os ons tambm em funo do raio de sua
trajetria (que por sua vez ir depender da razo m/z).
Os ons capazes de viajar ao longo de toda a trajetria
do setor de anlise ir o atingir a placa coletora de ons,
onde sero detectados.

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Em se utilizando somente um analisador magntico, os ons
sero separados de acordo com sua massa nominal (ou seja,
massa determinada por nmeros inteiros), e por isso os
espectrmetros de massas compostos apenas de um setor de
anlise m agnt ico so chamados de espectrmetros de
massas de baixa resoluo. J os espectrmetros de massas
que so constitudos por um setor de anlise form ado por um
campo magntico acoplado a um setor eltrico pode separar
os ons de acordo com suas massas exatas, e por isso so
chamados de espectrmetros de massas de alta resoluo.

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Quando os ons atravessam o setor magntico, atravessam
um campo magntico perpendicular ao seu movimento.
Como o campo magnt ico provoca a acelerao dos ons,
e a direo da acelerao perpendicular ao seu movimento,
a velocidade dos ons permanecer constante, mas estes
apresentaro uma trajetria circular. Consequentemente, a
geometria do setor magntico semi- circular, para que os
ons possam atravess- lo com uma velocidade constante.
Como os ons viajam velocidade constante, ser possvel
separ- los de acordo com sua razo m/z.

V r Detector

1.3.1.1 Princpio da separao de ons nos analisadores


de setor magntico e setor magntico- eltrico

A energia cintica (Ek ) de um on de massa m se


movendo a uma velocidade fixa v dada por:
Por outro lado, a energia potencial (Ep)de um
Ek = 1m.v2 on de carga z sendo repelido de um campo
2 eletrosttico de voltagem V dada por:

Quando o on repelido, a sua energia


Ep = z.V potencial (Ep) convertida em energia cintica
(Ek). Logo,

Ep = Ek z.V = 1 m.v2 v2 = 2.z.V


2 m

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Quando os ons so capturados no campo magntico
do analisador, eles iro realizar uma trajetria circular.
Para que os ons atinjam a placa coletora de ons no
detector, os ons devem realizar uma trajetria de raio
r que resulta do equilbrio entre a fora centrfuga do on

Fcf = m.v2 e a fora centrpeta exercida pelo m


r que compe o analisador magntico.

Logo, para que o on possa percorrer a


Fcp= z.B.v trajetria do set or m agntico, F cf= F cp
Ou seja...
2
z.B.v = m.v2 v = z.B.r 2.z.V = z.B.r
r m m m
2
m B.r 2
z =
2.V

2
m B.r 2
z = 2.V
Por esta equao fica claro:
1. Porque o espectrmetro de massas no distingue
sinais de ons m + e 2m 2+
2. Que os parmetros B, r e V que determinam o
trajeto dos ons no analisador.

Portanto, pode- se variar B ou V, de maneira a poder


varrer t oda a faixa de m assas ( ou de razo m/z)
desejada para se detectar todos os ons ( M+ e fragm en-
t os) gerados na cmara de ionizao. Usualmente
varia- se V muito mais rpido, e de maneira muito
mais precisa, do que B. Ou seja, varia- se a tenso (V)
aplicada no m de int ensidade B fixa de maneira a
fazer com que os ons percorram uma trajetria de raio
r fixo ( 180 o , 90 o ou 60o ).

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De maneira a aumentar sua resoluo, passaram a ser
construdos aparelhos de espectrometria de massas de
dupla focalizao. Nestes, o setor de anlise apresent a
um analisador de campo elt rico ps o analisador de
campo magntico. O analisador eltrico atua como um
filt ro de energia cintica, permitindo que apenas ons
com uma energia cint ica especfica possam
atravess- lo, a despeit o de suas razes m/z. A
separao de ons no analisador eletrosttico explicada
pela combinao de duas equaes: de fora centrfuga ( 1)
e de energia potencial=cintica (2).

( 1)
Fcf = m.v2 = z.E ( 2) z.V = 1 m.v2
r 2

r = 2V
E = intensidade do campo E
eletrosttico

Assim, o trajeto radial de ons possuindo a mesma


velocidade (energia cintica) independent e de sua razo
m/z. Ou seja, o analisador eletrosttico separa ons com
diferentes velocidades, ou energia cinticas.
Consequentemente, a adio do setor eletrosttico aumenta
a resoluo de um fator de at 100.000. Este tipo de
aparelho comumente utilizado com cmaras de ionizao
do tipo impacto de eltrons (EI), bombardeamento rpido de
t om os ( FAB) ou ionizao qumica (CI), mas no com
electrospray ou MALDI devido ao alto custo destes lt im os.

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Vantagens
- Espectros de massas tradicionais, ou seja pode operar em baixa
(1.000) ou alta resoluo (at 60.000).
- Excelente reprodutibilidade
- Melhor desempenho quantitativo entre todos os aparelhos
- Alta resoluo
- Alta sensibilidade
- Alta preciso nas medidas de massas (5 ppm em alta resoluo).

Desvantagens
- Inadequadas para tcnicas de ionizao pulsada
- Aparelhos muito maiores e mais custosos
- ons precisam ser acelerados com alta energia cintica para compensar
disperso de energia na fonte (8 kV).
- Varreduras relativamente lentas (efeito de esteresse de campo).

Aplicaes
- Para todos os compostos orgnicos
- Para determinao de massa exata
- Medidas de distribuio isotpica

BE ou EB

Anlise Isotpica : detectores mltiplos Alta preciso.

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1.3.2 Analisadores de quadrupolo
Um analisador de quadrupolo consiste em quatro barras
paralelas, arranjadas em dois pares opostos. Um dos
pares apresenta um potencial eltrico aplicado de
( U+ Vcos( wt)) e o outro par apresenta um potencial
eltrico aplicado de - ( U+ Vcos( wt)), aonde U uma
voltagem de corrente contnua e o termo Vcos( wt) uma
voltagem de corrente alternada (ou de radiofrequncia. A
aplicao destas duas voltagens afeta a trajetria centralizada
dos ons. Em se fazendo variar estas voltagens, somente ons
com uma razo m/z determinada iro atravessar no
centro do quadrupolo, enquanto que os outros ons
sero desviados da trajetria central. O espectro de
massas obtido em se fazendo variar as voltagens do
quadrupolo, de maneira a se realizar uma varredura em
t oda a faixa de m / z desej ada. Pode- se ut ilizar 2 m todos:
variando- se w e mantendo- se U e V constantes, ou
variando- se U e V (U/V) e mantendo- se w constante.

Quadrupolos Lineares : Q / q
Paul & Steinwedel 1953
Wolfgang Paul
Prmio Nobel 1989

y
z
-
x +
+
-

A varredura feita variando simultaneamente U (DC) e V0 (AC) mas


mantendo constante a relao U/V0.

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Vantagens
- Espectros de massa tradicionais
- Boa reprodutibilidade
- Aparelhos relativamente pequenos (20 cm), robustos, simples e baratos.
- Podem ser utilizados para gerar espectros do tipo dissociaes induzidas
por colises de baixa energia (Low-energy collision-induced dissociation,
CID MS/MS) em sistemas com quadrupolos triplos e espectrmetros de
massa hbridos, nos quais se analisa as fragmentaes dos fragmentos.
-Varreduras rpidas
- ons acelerados com baixas energias cinticas (15 eV).

Desvantagens
- Resoluo limitada
- Altura dos picos varivel em funo da massa, mas no funo da
abundncia dos ons.
- Inadequada para tcnicas de ionizao pulsadas (MALDI e ESI).
- Baixa sensibilidade

Aplicaes
- Na maioria dos equipamentos de LC/MS e GC/MS
- Sistemas de quadrupolo triplo MS/MS
- Em sistemas hbridos magntico/quadrupolo MS/MS.

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Extrel Pentaquadrupole QqQqQ Mass Spectrometer (MS3)

Eberlin, M. N. Mass Spectrom. Reviews 1997, 16, 113

Extrel Pentaquadrupole QqQqQ Mass Spectrometer (MS3)

M1 M2

Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det.

Eberlin, M. N. Mass Spectrom. Reviews 1997, 16, 113

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1.3.3 Analisadores de captura de ons (ion trap)
tridimensionais
Existem dois tipos de espectrmetros de massas de captura
de ons: captura de ons por quadrupolos tridimensionais
( t am bm chamada de captura dinmica), e de ressonncia
em cclotron (captura esttica). Ambas funcionam acumu-
lando ons no seu interior, em se manipulando correntes
alternada e de radiofrequncia simultaneamente. A captura
permite a liberao controlada de ons, o que permite
analisar sua separao controlada e com uma resoluo
muito grande. Alm disso, utilizada para experimentos
m lti- acoplados (MSn ), que permitem estudar mecanismo de
fragm ent ao de molculas relativamente complexas, alm
de fornecerem espectros com alta sensibilidade. A possibili-
dade de capturar ons por perodos que variam de
milissegundos a dias permite a anlise de reaes de
fragm ent ao extremamente incomuns, dando origem a
espectros de massas que no podem ser obtidos atravs
de nenhuma outra tcnica.

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"Bath gas": adiciona-se hlio a uma presso tpica de 10-3 Torr para
aumentar sensibilidade e resoluo. A repulso entre ons de mesma carga
confinados no centro do trap tende a desestabilizar suas trajetrias por
disperso (efeito "space-charge"). Colises com o "bath gas" resfriam os ons
(energia cintica), mantendo-os aprisionados com refocalizao para o centro
do trap.

Aprisionamento seletivo de ons: seqncia de eventos. Aps o


aprisionamento de vrios ons, um on de m/z especfico (ex: 100) pode ser
mantido no trap, e os demais eliminados. Uma voltagem rf adicional
aplicada nos eletrodos end-cap com amplitude e freqncia ajustadas para
eliminar os ons mais pesados (m/z > 100). A amplitude da voltagem rf (V)
aplicada no ring electrode ento aumentada at um valor limite
(imediatamente inferior aquele necessrio para a eliminao do on de
m/z 100), e durante a varredura de V tanto os ons pesados como os leves
so sucessivamente eliminados.

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QIT - Quadrupolos "Ion Traps Lineares

Vantagens: ~50 vezes mais sensveis; maior capacidade de


armazenamento. Reduzem os problemas de charge space : repulso
on-on e assim minimizam mass-shifts. Sem problemas de self-CI e
perda de 1/3 m/z em MS/MS !

Vantagens
- Alta sensibilidade: ons so pr-concentrados e sucessivamente analisados.
- Permite a realizao de EM em multi-etapas
- Baixo custo, simples, robusto e pequeno: ~ 5 x 5 x 5cm.
- Permite experimentos MSn seqenciais no tempo (ex: MS13).
Desantagens
- Ineficiente para se medir abundncia relativa dos ons
- Baixa dinmica
- Sujeito interferncia por espcies carregadas e reaes inter-moleculares
- Energia de coliso entre partculas mal definida
- Deve-se otimizar vrios parmetros simultaneamente para a obteno de
dados de boa qualidade
- Baixa resoluo: resoluo "unitria". Pode trabalhar em alta resoluo em
varreduras lentas.
- Devido a possibilidade de ocorrer reaes on-molcula durante
aprisionamento, espectros de EI podem ser "contaminados" por CI.
Applicaes
- Sistemas GC/MS, LC/MS e MS/MS
- Anlise de ons especficos
- Estudo da qumica de ons

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1.3.4 Analisadores de tempo- de- vo (time- of- flight)

O espectrmetro de massas com analisador de tempo de vo


faz uso da propriedade do tempo em que ons de diferentes
m/z levam para cruzar o sistema de separao de ons.
Opera em modo pulsado, de tal forma que os ons devem ser
gerados repetidamente (em pulsos). Um campo eltrico
acelera todos os ons formados (on molecular e fragmentos)
para uma regio livre de efeitos externos (campo magntico,
diferena de potencial, etc). Os ons so levados com uma
energia cintica zV, na qual z = carga do on e V uma
voltagem aplicada para que possam ser carregados . Como
a energia cintiva dada pelo termo 1/2mv2 , ons mais leves
viajaro mais rpido do que os pesados, e alcanaro o
detector no fim da regio livre de efeitos externos. Logo, o
t em po de vo de um on depender de sua massa, carga e
energia cintica.

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Aumento da Resoluo em TOF
TOF's lineares apresentam baixa resoluo devido a durao do pulso de
ionizao e disperso de energia cintica dos ons na fonte. Soluo paliativa:
Aumento de L ou tcnicas de acelerao "ps-ionizao".
Reflectors (Espelhos Eletrostticos): Uma srie de grades ou eletrodos onde
se aplica um potencial repulsivo crescente. Os ons penetram angularmente no
reflector, so desacelerados por repulso eletrosttica, fazem uma curva, e
assim retornam para o tubo de vo. Considere dois ons de mesma m/z mas
com diferentes velocidades, dispersos no tempo. O on de maior energia
cintica, a frente em tempo de vo, penetra mais profundamente no reflector
e ali permanece por mais tempo. O outro penetra menos profundamente,
e ali permanece por um tempo menor. A disperso corrigida, e os ons
so refocalizados em tempo de vo, com conseqente aumento da resoluo
(largura do pico) ou poder de separao.
Acelerao ortogonal. o-TOF: ons so produzidos de forma contnua na
fonte de ionizao, e acelerados. O feixe de ons focalizado com o auxlio
de lentes e quadrupolos/octapolos "rf-only". Uma acelerao pulsada e
ortogonal ao movimento do feixe de ons aplicada. ons ento adquirem
velocidades "ortogonais" que no so influenciadas pelas suas velocidades
divergentes adquiridas pela acelerao na fonte.

Combinao MALDI - TOF

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Vantagens
- o espectrmetro de massas mais rpido
- Desenhado para tcnicas de ionizao pulsada (MALDI)
- Alta transmisso de ons
- Informao sobre MS/MS aps fragmentao
- Permite a deteco de ons com a maior faixa (de pequena a altssima).
- Alta sensibilidade
- Baixo custo, fcil manuteno.
- Varreduras extremamente rpidas.
- Ampla faixa de varredura > 106 u. nico analisador acoplvel a MALDI de
macromolculas.
- Hoje, uma das melhores relaes custo/benefcio.
Desantagens
- Requer tcnica de ionizao pulsada
- Requer deteco muito rpida, e digitalizao dos sinais.
- Baixa seletividade na gerao de precursores inicos em MS/MS
- TOF's lineares: baixa resoluo. TOF's com reflector: mdia resoluo.
o-TOF's com reflector: alta resoluo e alta preciso ( 5 ppm).
Applicaes
- Todos os sistemas MALDI
- Sistemas de GC/MS muito rpidos

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1.3.5 Espectrometria de Massas com Ressonncia
Ciclotrnica de ons (ICR) e Transformada de Fourier
( FT- MS)

Uma cela cbica posicionada no centro de um ma supercondutor


(~ 3-7 Tesla). Os ons formados dentro da cela (ou ali injetados) se movem
em uma trajetria circular perpendicular ao eixo do campo magntico, de
frequncia angular (frequncia de ressonncia ciclotrnica) wc proporcional
ao campo magntico B e as suas m/z's:

wc = zeB/m

Para evitar que ons escapem da cela, uma baixa voltagem dc aplicada aos
eletrodos de aprisionamento gerando um campo eltrico E perpendicular ao
campo magntico B.

Uma voltagem rf aplicada aos eletrodos transmissores (laterais). Varre-se


ento rapidamente a frequncia da voltagem rf (pulso) mantendo-se B
constante. Quando a frequncia de rf (wrf) se iguala a frequncia angular
de oscilao de algum on: wc, este absorve energia com aumento de
velocidade e do raio de sua orbita mas sem alterar a frequncia de sua
oscilao. Aps poucas rotaes, os ons que absorveram energia estaro
se movendo sincronizadamente. Esta oscilao ciclotrnica sentida pelos
eletrodos receptores (superior e inferior), produzindo uma corrente com
frequncia iqual a wc. Rpida variao de wrf pode ser realizada, sendo o
espectro de massas obtido pela aplicao de FT.

Princpio bsico: Aprisionamento de ons em uma campo magntico/eltrico,


seguido da medida de suas frequncias de ressonncia ciclotrnica.

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FTMS

Princpios de operaco do ICR (FTMS)


Partculas carregadas iro apresentar um
movimento circular em um campo magntico
com uma frequncia ciclotrnica relacionada F = z (v x B)
ao seu valor de m/z !

F = massa . acelerao F = mv2


r
zvB = mv2 c= v = zB
r r m

c= c = zB m= B
2 2 m z 2 c

Espectrmetro de massas FT-ICR ( 9.4 Tesla )

FTMS

Detector
plate

Trapping
plate Detection on
frequency spectrum
Excitation
plate

Magnetic
field, B

Excitation on, one frequency (RF)


excites one m/z

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I llustration of how the image current is
obtained. As the ion(s) in a circular orbit
approach the top plate, electrons are
attracted to this plate from ground. Then
as the ion(s) circulate towards the bottom
plate, the electrons travel back dow n to
the bottom plate. This motion of electrons
moving back and forth between the two
plates produces a detectable current.

Caractersticas principais FT- MS


Altssima resoluo (funo de B como em RMN) que diminui
com o aumento de m/z.
Anlise no-discriminatria ( e no destrutiva) . Alta
sensibilidade. 10- 100 ons precisam normalmente oscilar para
serem sentidos pelos eletrodos receptores.
Alto custo (supercondutores), difcil manuteno.
MSn. Operao semelhante aos ion- traps.
Trabalham sob altssimo vcuo (< 10-8 Torr) enquanto a
quantidade de ons aprisionados na cela pequena ("charge-
spacing").
Muito utilizados em estudos de reaes on- molcula
( estudos cinticos) e em anlise de altssima resoluo-
preciso.

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1.3.6 Espectrometria de massas em sequncia (MS/MS,
ou Tandem Mass Spectrometry)

Nesta tcnica, tambm chamada de Tandem mass spectro-


metry permite a induo de fragmentao e a anlise da
fragm ent ao de fragmentos. Em geral, se induz a coliso
de determinados ons com um gs (em geral He), em
seguida analisando- se o espectro de massas dos
fragm ent os form ados. A fragm ent ao induzida at ravs
de um processo denominado dissociao induzida por
coliso [collision- induced dissociat ion (CID)], na qual um
on int roduzido em um a clula de coliso. O on selecio-
nado colide com um gs (He ou Ar), o que resulta em
fragm ent ao Os fragmentos gerados so separados em
um setor de anlise, gerando um espectro de fragmento .
Assim, pode- se gerar um espectro de fragmento de frag-
mento de fragmento (MS/MS/MS), quantas vezes se quiser
( MSn ). Esta tcnica utilizada para se estudar a fragm en-
t ao de molculas grandes (peptdeos)..

MS/MS em determinao estrutural

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MS/MS em determinao estrutural

1.4 Detectores de ons

Uma vez que os ons so separados no setor de anlise e


separao, devem ser detectados. O detector permite gerar
uma corrente eltrica gerada pelo choque dos ons no seu
int erior. Est e sinal amplificado, e transformado em um
sinal que ser registrado ou acumulado em computador.

1.4.1 Copo de Faraday

O copo de Faraday opera no princpio de que uma mudana


da carga em uma placa de metal resulta em um fluxo de
eltrons, e, consequentemente, gerada uma corrente
eltrica. Um on que atinja a superfcie da placa, formada
por BeO, GaP, ou CsSb, induz a ej eo de vrios eltrons.
Esta emisso temporria de eltrons induz uma corrente
no copo e cria uma pequena amplificao da corrente gerada
pela coliso do on no copo. Este detector de baixa
sensibilidade, mas robusta e de desenho simples.

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1.4.1 Multiplicadora de eltrons
Uma multiplicadora de eltrons um dos meios mais simples
para se detectar ons, apresentando grande sensibilidade
fazendo uso do princpio do copo de Paraday. Na multiplicadora
se utiliza uma srie de placas coletoras de ons em srie,
mantidos em potencial crescente. Os ons atingem a sperfcie
da primeira placa, resultando na transmisso de eltrons.
Estes elt rons so atrados pela segunda placa aonde so
gerados novos eltrons, resultando em uma cascata de
eltrons. O ganho tpico da amplificao da corrente gerada
pela cascata de eltrons da ordem de 1.000.000 de vezes.

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1.4.1 Placa de converso fotomultiplicadora

A placa de converso fotomultiplicadora similar a uma


multiplicadora de eltrona aonde inicialmente os ons atingem
uma placa, resultando na emisso de eltrons. Todavia, os
eltrons gerados atingem uma tela de fsforo. A tela de
fsforo, como uma tela de televiso, ejeta ftons uma vez
atingida por eltrons. Estes ft ons so detectados por uma
fotomultiplicadora, que opera em cascada como uma
multiplicadora de eltrons. A vantagem que os ftons
gerados est dentro de um sistema isolado do resto do
equipamento, o que evita a presena de outras partculas
int erferindo na det eco dos eltrons gerados pelo choque
de ons na placa coletora. Consequentemente, o tempo de
vida da placa coletora muito maior, apresentando uma
grande sensibilidade.

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