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Universit Mohamed Khider-Biskra

Facult des sciences exactes et des sciences de la


nature et de la vie
Dpartement des sciences de la nature et de la vie

Mr. BENSLAMA A.

2016/2017
Prparation des acides
nucliques (extraction
et purification)

Mr. BENSLAMA 2016/2017


Introduction

Lextraction et la purification des acides nucliques sont les premires tapes


dans la plupart des tudes de biologie molculaire et dans toutes les
techniques de gnies gntique. Lobjectif des mthodes dextraction des
acides nucliques dans le cas prsent est dobtenir des acides nucliques
purifis, tirs de sources diverses, afin de pouvoir mener une analyse
spcifique comme la raction de polymrisation en chane (PCR). La qualit et
la puret des acides nucliques comptent parmi les facteurs les plus critiques
pour lanalyse PCR. Afin dobtenir des acides nucliques hautement purifis
exempts de tout contaminant visibles, des mthodes dextraction adquates
devraient tre appliques.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Les mthodes dextraction/purification des acides nucliques issus dextraits


cellulaires sont gnralement des combinaisons de deux ou plusieurs des
techniques et avec plusieurs tapes.

Lyse des cellules


Elimination des protines

Elimination des autres acides nucliques (ARN, etc.)


Concentration de l'ADN par prcipitation l'alcool

Extraction/prcipitation

Chromatographie

Centrifugation

Sparation par affinit


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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)
Mthode de extraction/purification

Lextraction dacides nucliques dun matriau biologique requiert la lyse cellulaire,


linactivation des nuclases cellulaires et la sparation de lacide nuclique souhait
de dbris cellulaires. La procdure de lyse idale est souvent un compromis de
techniques et doit tre suffisamment rigoureuse pour briser le matriau de dpart
complexe (par exemple, le tissu), mais suffisamment douce pour prserver lacide
nuclique cible. Les procdures de lyse courantes sont les suivantes :

le rupture mcanique (ex. : broyage ou lyse hypotonique)

le traitement chimique (ex.: lyse dtergente, agents chaotropiques,


rduction des thiols)
la digestion enzymatique (ex.: protinase K)

La rupture de la membrane et linactivation des nuclases intracellulaires peuvent


tre combines. titre dexemple, une solution simple peut contenir des dtergents
pour solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour
inactiver les enzymes intracellulaires.
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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Mthode de extraction/purification

Lextraction utilise la solubilit diffrentielle des molcules (acides nucliques /


contaminant) entre deux phases non miscibles. En pratique, on mlange
vigoureusement la solution dacides nucliques une phase non miscible. Aprs
centrifugation, rcuprer la phase aqueuse contenant les acides nucliques la
pipette. Selon la phase non miscible, on distingue :

lextraction phnolique: utilise pour dbarrasser les acides nucliques des


protines ; le phnol tant un dprotinisant puissant.
Ex : purification d ADN ou ARN partir de cellules

lextraction au chloroforme ou ther: complte toujours lextraction prcdente


pour liminer toutes traces de phnol.

lextraction lisobutanol: permet dextraire les molcules organiques (ex :


bromure dthidium) et de concentrer la solution dacides nucliques de 10%.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Extraction de lADN

Le lysat obtenu des prparations prcdentes est purifi par addition de


phnol satur de tampon Tris-EDTA. Aprs agitation douce du mlange, on
spare les phases par une centrifugation de 10 min sous 10000 g la
temprature de 4C. A la sortie, on distingue une phase aqueuse surnageante
contenant les acides nucliques en solution, une phase organique au fond du
tube: phnol + lipides et linterface un gteau de protines prcipites.
On recueille la phase aqueuse avant de la laver par un mlange de
chloroforme (CHCl3) et dalcool isoamylique dans un rapport 24/1
(volume/volume). On recueille nouveau une phase aqueuse contenant
lADN en solution et une phase organique (24/1) contenant des restes de
phnol, de protines et de lipides.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Prcipitation des acides nucliques

Elle se fait le plus souvent par addition rpte des solutions dalcool qui suffisent
dbarrasser lacide nuclique des protines contaminantes et enzymes. Elle a pour
but de rcuprer les acides nucliques sous forme solide. Ainsi protgs, ils pourront
aprs schage tre rsolubiliss la concentration souhaite.

Principe
En prsence dalcool, les brins dADN se regroupent et forme une pelote non soluble
favorisant ainsi linteraction ADN-Alcool au dpend de linteraction ADN-ADN.
Diverses solutions alcooliques peuvent tre utilises pour la prcipitation. On a par
exemples :

Prcipitation lalcool thylique haute force ionique. Lthanol forte concentration


prcipite presque totalement les acides nucliques. Rcuprer le prcipit par
centrifugation

Prcipitation lisopropanol : mme principe que prcdemment sauf que le sel nest pas
ncessaire et que les petits fragments dADN sont limins car non prcipits.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Prcipitation des acides nucliques Prcipitation de lADN

La solution dADN, porte haute force ionique par addition de NaCl 3 M


(1/10 du volume), est additionne dun large excs dthanol absolu -20C.
Au bout de quelques minutes au maximum, on voit apparatre un prcipit
blanchtre, translucide et filamenteux (la mduse ) constitu de longs
filaments dADN prcipit. On recueille ce prcipit par centrifugation
10000 g pendant un quart dheure environ. Pour laver lADN on resuspend le
prcipit dans de lthanol 75 % toujours -20C. puis on centrifuge
nouveau. Le culot de cette dernire centrifugation est goutt, puis sch
sous vide. On peut conserver lADN sec ou le redissoudre immdiatement
soit dans de leau pure strile, soit dans un tampon Tris-EDTA.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Prcipitation des acides nucliques Prcipitation de lARN

Parmi les acides ribonucliques extraits des cellules, la classe la plus tudie
est celle des ARN messagers. La phase aqueuse transfre dans un nouveau
tube, on fait prcipiter lARN ( phase aqueuse) avec lisothanol. Utiliser 0.5ml
disopropanol pour 1ml frizol incub 15-30C. Centrifuger 12000g
maximum 15min entre 2C et 8C le prcipit. LARN, souvent invisible avant
centrifugation, forme un culot collodal du ct et au fond du tube. Le
prcipit dARN tant invisible avant centrifugation, on procde un lavage.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Diffrentes variantes sont employes, suivant que l'on cherche extraire de l'ADN
gnomique (issu du ou des chromosomes des cellules analyses) ou de l'ADN
plasmidique (provenant de plasmides ports le plus souvent par des cellules
bactriennes comme Escherichia coli). Il existe aujourd'hui des kits commerciaux
permettant de raliser rapidement ces extractions l'aide de ractifs prts
l'emploi.

Prparation d'ADN gnomique

On commence en gnral par une lyse des cellules ou des tissus, consistant
ventuellement en un broyage, suivi d'une extraction par des dtergents, qui vont
disperser les bicouches lipidiques des membranes et dnaturer les protines, et en
particulier celles qui sont associes l'ADN dans la chromatine. La solution obtenue
est en gnral trs visqueuse, car l'ADN ainsi libr forme de trs longs filaments qui
s'opposent aux coulements hydrodynamiques.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Prparation d'ADN gnomique

L'tape suivante est la dprotinisation de la solution qui se fait par une extraction au
moyen de solvants organiques, en gnral du phnol additionn de plus ou moins de
chloroforme. Les protines dnatures forment un prcipit l'interface phnol-eau,
tandis que l'ADN reste en solution dans la phase aqueuse qui est rcupre par
dcantation ou par centrifugation.

L'ADN est ensuite prcipit par addition d'thanol ou d'isopropanol dans la phase
aqueuse, collect par centrifugation et dissout dans du tampon. Pour liminer les
traces de phnol et d'autres contaminants, on peut enfin pratiquer une dialyse ou
une tape de purification par chromatographie prparative.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Prparation d'ADN plasmidique

La prparation d'ADN plasmidique partir de bactries est l'une des techniques les
plus courantes de la biologie molculaire, galement connue sous les noms abrgs
de miniprep, midiprep et maxiprep en fonction du volume de la culture bactrienne
utilise. Le principe de l'extraction est connu sous le nom de lyse alcaline. Cette
mthode permet de prparer slectivement l'ADN du plasmide contenu dans les
bactries, tout en liminant l'ADN du chromosome bactrien. Le principe de cette
mthode consiste effectuer la lyse des cellules au moyen d'un dtergent (dodcyl
sulfate de sodium) en prsence de soude, pH 13. ce pH trs alcalin, l'ADN est
dnatur, cest--dire que les deux brins de la double-hlice sont spars. On
neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la renaturation brutale
(rappariement des brins du duplex d'ADN).

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Prparation d'ADN plasmidique

L'ADN chromosomique, trs long (~10 paires de base), ne parvient pas se


rapparier compltement et forme des enchevtrements insolubles. L'ADN
plasmidique, court (~10 paires de base), parvient se rassocier compltement et
reste en solution. On spare alors les espces par centrifugation. Les protines
prcipites, sont galement limines avec le dtergent et l'ADN chromosomique.
L'ADN plasmique, rest en solution, est alors concentr par prcipitation l'alcool.

Diffrentes variantes ou amliorations de cette mthode existent notamment dans


un grand nombre de kits commerciaux. Ces derniers contiennent souvent des petites
colonnes de rsine chromatographique changeuse d'ion, permettant d'amliorer la
puret de l'ADN obtenu. Pour liminer les ARN, on ajoute frquemment des
ribonuclases qui vont hydrolyser slectivement ces acides nucliques, en laissant
l'ADN intact.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Vrification de la puret

Au terme de notre purification, on peut vrifier son effectivit soumettant


notre acide nuclique divers tests pour vrifier sa puret.

- Electrophorse sur gel dagarose.

- PCR : La raction en chane par polymrase

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)
Vrification de la puret Electrophorse sur gel dagarose

Par lectrophorse sur gel d'agarose, on peut analyser la prsence et la taille des
acides nucliques contenus dans la prparation. Ceux-ci sont rvls par le bromure
d'thidium, un colorant dont la fluorescence augmente trs sensiblement quand il
interagit avec l'ADN.

En milieu basique, les fragments dADN sont chargs ngativement. Plac dans un
champ lectrique, ils vont donc dplacer vers lanode, mais leurs charges respectives
tant peut prs quivalentes, cest leur masse molculaire qui va rgler leur vitesse
de dplacement travers les mailles du gel dans lequel ils ont t plac. Plus les
fragments sont petits, plus ils vont migrer rapidement et donc, plus loin de la zone de
dpt.

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Prparation des acides nucliques (extraction et purification)

Vrification de la puret Electrophorse sur gel dagarose

La dilution et la densification de lADN par une solution colore de bleu de


bromophnol (BBP) va permettre de suivre lavancement de. Chaque fragment de
restriction est dpos dans le gel et la cuve mise sous tension (250 V) pendant une
heure environ. Quand le front de migration atteint lextrmit du gel, on arrte la
manipulation. Le gel est introduit dans une cage connecte un cran dordinateur.
La projection de la lumire UV permet dobserver les migrations de diffrentes
bandes.

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PCR

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PCR

L'amplification en chane par polymrase ou raction en chane par polymrase (PCR


est l'abrviation anglaise de polymerase chain reaction),

La PCR est une mthode de biologie molculaire d'amplification gnique in vitro, qui
permet de dupliquer en grand nombre (avec un facteur de multiplication de l'ordre
du milliard) une squence d'ADN ou d'ARN connue, partir d'une faible quantit (de
l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nuclique (squence spcifique dADN
(lAmplicon)) et d'amorces spcifiques constitues d'oligonuclotides de synthse de
20 25 nuclotides.

La PCR permettant d'obtenir, partir d'un chantillon d'ADN, d'importantes


quantits d'une squence d'ADN spcifique. Cette amplification repose sur la
rplication d'une matrice d'ADN double brin. Elle se dcompose en trois phases : une
phase de dnaturation, une phase d'hybridation avec des amorces et une phase
d'longation. Les produits de chaque tape de synthse servent de matrice pour les
tapes suivantes, ainsi on ralise une amplification exponentielle.

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PCR

Les lments de PCR

LADN matriciel

En thorie une copie ADN de la squence recherche est suffisante pour avoir une
amplification, il faut cependant tenir compte de la probabilit de rencontre des
molcules dADN matrice avec les amorces. Dans la pratique plusieurs copies sont
ncessaires pour avoir un rsultat correct. Mais attention, la mauvaise qualit et/ou
une quantit trop importante dADN matrice peut conduire une amplification
aspcifique, voire une inhibition enzymatique.

LADN polymrase

Les premires ADN polymrases utilises provenaient d'une bactrie thermophile


(rsistante des tempratures trs leves), comme par exemple Thermus aquaticus
(Taq polymrase). De nos jours, les enzymes utilises sont dites recombinantes, ce
qui simplifie considrablement leur obtention, et leurs proprits ont t largement
modifies pour les rendre plus efficaces et plus fidles.

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PCR

Le tampon
Le tampon utilis pour la raction PCR sert maintenir stable le pH du milieu ractionnel
au niveau optimal pour la Taq polymrase (TrisHCl pH basique 8,5 9). Il contient des
cations bivalents Mg2+, cofacteurs indispensables pour la raction de polymrisation avec
la Taq polymrase. La prsence dans le milieu ractionnel des cations bivalents Mg2+ et
de cations monovalents (K+ ou NH4+) vont neutraliser les charges ngatives des
groupements phosphates au niveau de lADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En
pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec lactivit de lADN
polymrase. En plus de ca le milieu contenant les dNTPs.

Les amorces
Dans la mise au point de la raction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir
un rle : en s'hybridant l'ADN matrice, elles dlimitent la rgion dADN amplifier (tape
2 du cycle) et avec leur extrmit 3' OH libre servir damorce pour lADN polymrase
(tape 3 du cycle).
Les oligonuclotides amorces shybrident aux extrmits de la squence qui va tre
amplifie, il faut donc connatre les squences nuclotidiques des extrmits de la rgion
ADN amplifie. C'est en effet au niveau de ces extrmits que les oligonuclotides
amorces vont s'hybrider.
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les enzymes de restriction

Les tapes de la PCR

La PCR est une technique base sur une rptition de cycles de transition de
temprature. Sauf pour certaines mthodologies (par exemple lutilisation de sondes
dhydrolyse), chaque cycle contient trois tapes.

1) La dnaturation

2) Lhybridation

3) Llongation

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PCR
Les tapes de la PCR 1) La dnaturation

C'est la sparation des deux brins d'ADN, obtenue par lvation de la temprature.
Avant de commencer les cycles de PCR proprement dit, une tape de chauffage
(gnralement 10 15 minutes 95 C) est ralise. Cette tape permet de :
dshybrider les ADN double brin, de casser les structures secondaires,
dhomogniser le milieu ractionnel par agitation thermique, dactiver les
polymrases de type Hot start , de dnaturer dautres enzymes qui pourraient
tre dans la solution (Transcriptase Inverse, Uracil-N-Glycosylase). tape de
dnaturation, est ralise environ 95C, pour une dissociation complte des deux
brins dADN.

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PCR

Les tapes de la PCR 2) Lhybridation

Cette tape (gnralement 2 60 secondes 56-64 C) permet aux amorces de


shybrider aux ADN matrice grce une temprature qui leur est
thermodynamiquement favorable. Peu de brins dADN matrice peuvent shybrider
(se lier) avec leur brin complmentaire, ce qui empcherait la fixation des amorces,
car ces dernires sont bien plus courtes et en concentration bien plus importante.
ltape dhybridation se fait une temprature qui sera dfinie selon la nature des
amorces (cette temprature varie de 50 60C). Cette temprature va dterminer la
stabilit des hybrides une fois que lappariement amorces / matrice est ralis.

En abaissant la temprature, les amorces spcifiques s'hybrident sur les molcules


simple brin d'ADN. Les amorces sont constitues de courtes squences d'ADN
complmentaires de la squence de l'ADN amplifier. Il s'agit toujours d'un couple
d'amorces, complmentaire encadrant le fragment d'ADN amplifier.

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PCR

Les tapes de la PCR 3) Llongation

Cette tape (gnralement 4 120 secondes 72 C) permet aux polymrases de


synthtiser le brin complmentaire de leur ADN matrice une temprature qui leur
est optimale. Ce brin est fabriqu partir des dNTPs libres prsents dans le milieu
ractionnel. La dure de cette tape dpend normalement de la longueur de
lamplicon. ltape de polymrisation est environ 72C, temprature de travail
de lADN polymrase thermorsistante utilise. Au cours de cette tape, les brins
complmentaires dADN sont synthtiss partir des extrmits 3OH libre des
amorces hybrides.

C'est la synthse du brin complmentaire. Une enzyme polymrase, la Taq


polymrase, ajoute l'extrmit de l'amorce des oligonuclotides prsents dans le
milieu de raction. Un cycleur, sorte de bain-marie, o les montes et descentes en
temprature sont programmes, permet de raliser un nombre de cycles dtermin.

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PCR

Les tapes de la PCR

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PCR

Les tapes de la PCR

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PCR

Les tapes de la PCR

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RT-PCR

L'acronyme RT-PCR signifie Reverse Transcriptase PCR, soit une PCR aprs
transcription inverse d'un acide ribonuclique (ARN) en ADN complmentaire (ADNc)

La RT-PCR est une technique qui permet de faire une PCR (raction en chane par
polymrase) partir d'un chantillon d'ARN. L'ARN est tout d'abord rtrotranscrit
grce une enzyme appele transcriptase inverse, qui permet la synthse de l'ADN
complmentaire (ADNc). Ce dernier est ensuite utilis pour raliser une PCR.

Dans la recherche scientifique, la technique de qRT-PCR, pour RT-PCR quantitative,


est frquemment utilise. Celle-ci permet de quantifier un type d'ARN initialement
prsent dans un chantillon. Elle est par exemple utilise pour connatre le niveau
d'expression d'un gne dans une condition donne. Plus un gne est exprim, plus le
nombre de molcules d'ARN synthtises sera grand. Grce la qRT-PCR, les
chercheurs peuvent donc comparer le niveau dexpression dun gne donn dans
deux conditions diffrentes.

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RT-PCR

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RT-PCR

Synthse de l'ADNc

La synthse d'ADNc est catalyse par des transcriptases inverses (reverse


transcriptase RT en anglais). Ces enzymes sont des ADN polymrases ARN
dpendantes, capables d'utiliser un brin d'ARN comme matrice pour catalyser la
synthse du brin d'ADN complmentaire (cf. tableau ci-dessous). Cela correspond
effectivement l'inverse d'une raction de transcription de l'ADN en ARN.

Les transcriptases inverses sont des enzymes issues de rtrovirus dont elles sont une
des principales caractristiques.
Exemples : la transcriptase inverse du Virus du Myloblastome Aviaire (AMV) ou du
Virus de la Leucmie Murine (Mo-MLV ou Mu-LV).

ARN matrice ADNc synthtis


A T
G C
C G
U A
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RT-PCR

Synthse de l'ADNc

Comme toutes les ADN polymrases, les transcriptases inverses ne peuvent pas
initier seules la synthse d'un brin d'ADN. Elles ont besoin d'une amorce possdant
une extrmit 3'-OH libre. Lorsque les ARN a amplifier sont polyadnyls en 3'
(ARNm eucaryotes par exemple), l'amorce choisie peut tre simplement une
squence polyT constitue d'une succession de dsoxythymidines (comme sur le
schma ci-dessous en rouge). Dans ce cas, tous les ARNm sont a priori copis en
ADNc.

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Le squenage de l'ADN

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Le squenage de l'ADN

Le squenage de l'ADN, consiste dterminer l'ordre d'enchanement des


nuclotides dun fragment dADN donn. Le squenage d'un ADN, c'est dire la
dtermination de la succession des nuclotides le composant

Historique

Les premires techniques de squenage ont t dveloppes en parallle au milieu


des annes 1970. Les mthodes de Sanger (Grande-Bretagne) et Gilbert (Etats-Unis)
ont toutes deux t rcompenses d'un prix Nobel de chimie en 1980.

Le premier organisme a t squenc en 1977. Il s'agissait du virus bactriophage,,,


X174, possdant un ADN simple brin ne ncessitant donc pas l'tape de dnaturation
utilis dans les mthodes de Sanger et Maxam et Gilbert.

L'apparition des squenceurs automatiques a notamment permis l'automatisation de


ces technologies et ont contribu la finalisation du gnotypage humain en 2003.

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Le squenage de l'ADN

Le squenage de l'ADN

Mthode de Maxam
Mthode de Sanger
et Gilbert

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Sanger

Le principe de cette mthode consiste initier la polymrisation de lADN l'aide


d'un petit oligonuclotide (amorce) complmentaire une partie du fragment dADN
squencer. Llongation de lamorce est ralise par le fragment de Klenow (une
ADN polymrase I dpourvue dactivit exonuclase 53) et maintenue par des
ADN polymrases thermostables, celles qui sont utilises pour la PCR. Les quatre
dsoxyribonuclotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajouts, ainsi quune faible
concentration de l'un des quatre didsoxyribonuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou
ddTTP).

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Sanger

Ces didsoxyribonuclotides agissent comme des poisons terminateurs de chane:


une fois incorpors dans le nouveau brin synthtis, ils empchent la poursuite de
llongation. Cette terminaison se fait spcifiquement au niveau des nuclotides
correspondant au didsoxyribonuclotide incorpor dans la raction. Pour le
squenage complet d'un mme fragment d'ADN, on rpte cette raction quatre
fois en parallle, avec les quatre didsoxyribonuclotides diffrents.

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Sanger

Par exemple, dans la raction o on a ajout du ddGTP, la synthse s'arrte au niveau


des G. Le mlange ractionnel contenant, la fois du dGTP et un peu de ddGTP, la
terminaison se fait de manire statistique suivant que l'ADN polymrase utilise l'un
ou l'autre de ces nuclotides. Il en rsulte un mlange de fragments dADN de tailles
croissantes, qui se terminent tous au niveau d'un des G dans la squence. Ces
fragments sont ensuite spars par lectrophorse sur un gel de polyacrylamide6, ce
qui permet ainsi de reprer la position des G dans la squence.

La dtection des fragments ainsi synthtiss se fait en incorporant un traceur dans


l'ADN synthtis. Initialement ce traceur tait radioactif ; aujourd'hui, on utilise des
traceurs fluorescents, attachs soit l'oligonuclotide, soit au
didsoxyribonuclotide.

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Sanger

Pour commencer, il vous faut un brin d'ADN squencer. Ensuite, vous ajoutez une
squence d'amorce, les quatre nuclotides et un enzyme appel ADN polymrase qui
incorpore de nouvelles bases de nuclotide, faisant un nouveau brin d'ADN conforme
l'original. Dans la mthode originale de Sanger, quatre diffrentes ractions de
squenage sont effectues. Chaque raction comprend un nuclotide modifi
diffrent qui, une fois incorpor, constitue la fin d'une chane d'ADN, ce qui permet
d'identifier la base finale. Ces chantillons sont alors soumis l'lectrophorse en
gel, mthode qui permet de sparer les nouveaux brins d'ADN sur une base en gel
l'aide de courant lectrique. Les brins d'ADN peuvent alors tre vus l'aide de rayons
X ou de lumire ultraviolette. Pour lire le gel, vous commencez par le bas et regardez
les bandes (tirets noirs) afin de dterminer
le squenage du fragment d'ADN.

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Sanger

3' TGCATGGCTA 5'

Le brin complmentaire

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Le squenage de l'ADN
Mthode de Sanger

dd
G C A T
-

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Maxam et Gilbert

Cette technique est pratiquement abandonne de nos jours. Nous la dcrirons


brivement pour des raisons historiques. Cette mthode, publie paralllement
celle de Sanger en 1977, par son caractre rvolutionnaire a grandement contribu
lhistoire de la biologie molculaire.
Il sagit, dune mthode chimique de squenage. est base sur une dgradation
chimique de l'ADN et utilise les ractivits diffrentes des quatre bases G, C, [A +G]
et [C+T] pour raliser des coupures slectives. Cette technique permettait danalyser
des fragments allant jusqu 500 pb. En reconstituant l'ordre des coupures, on peut
remonter la squence des nuclotides de l'ADN correspondant. On peut
dcomposer ce squenage chimique en six tapes successives :

Marquage : Les extrmits des deux brins d'ADN squencer sont marques par
un traceur radioactif (32P). Cette raction se fait en gnral au moyen d'ATP
radioactif et de polynuclotide kinase.

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Maxam et Gilbert

Coupure. les ADN s sont soumis des ractions chimiques spcifiques des
diffrents types de base, l'ADN est cliv au niveau de la modification par raction
avec une base, par exemple, une raction pour les G (alkylation par le sulfate de
dimthyle), une raction pour les G et les A (dpurination), une raction pour les
C, ainsi qu'une raction pour les C et les T (hydrolyse alcaline).

le produit de squence est dpos sur un gel dacrylamide, puis la squence lue
aprs autoradiographie. Cette analyse est analogue celle que l'on effectue pour
la mthode de Sanger.

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Le squenage de l'ADN

Mthode de Maxam et Gilbert

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