EVALUACIN DEL EFECTO ANTIBACTERIAL DE UN

CONCENTRADO PRODUCIDO EN FERMENTACIN BATCH POR

Penicillium chrysogenum

INTRODUCCIN
La penicilina ha sido el descubrimiento ms relevante para la humanidad, cuyo auge
se remonta en el ao 1939, ante la necesidad de sanar las heridas infectadas por
bacterias, de los soldados que formaban parte de la Segunda Guerra Mundial.
Florey y Chain que, tras distintas pruebas inconclusas, elige como base de
investigacin mdica a la penicilina, haciendo posible su uso para combatir
infecciones de tipo bacteriana y confirmando las hiptesis de Alexander Flemming
que pasaron inadvertidas anteriormente.
Flemming se dio cuenta de la ausencia de crecimiento de bacterias alrededor de las
colonias del hongo, que contamin accidentalmente los cultivos bacterianos.
Penicillum notatum, los microorganismos, por naturaleza, son capaces de producir
metabolitos primarios y secundarios que le servirn como defensa y supervivencia
ante otros microorganismos, cuyo objetivo es asegurar la mayor cantidad de
sustrato disponible.
Tal es el caso de la produccin de Penicilina como un metabolito secundario a partir
de hongos del tipo Aspergillus o Penicillum (Andrs Illanes 2008), que gracias a la
forma de su estructura son capaces de atacar al grupo de bacterias Gram positivas.
Dentro del estudio de produccin natural de Penicilina se encuentra el hongo
Penicillium notatun, que pertenece a la clase de los Ascomicetos, y que se
caracteriza por obtener mayores rendimientos de penicilina.
B- lactmico es la ruta metablica para producir penicilina, y especficamente acta
inhibiendo la sntesis del peptidoglucano, componente de la pared celular de las
bacterias (Charepraset et al., 2006), teniendo como resultado la disminucin de la
poblacin bacteriana y la muerte celular. El principal problema de la penicilina es su
ligera inestabilidad en medio cido, son muy susceptibles al ataque de la enzima -
lactamasa que destruye la estructura de la penicilina, perdiendo as su funcionalidad
Abraam & Chain, 1940; Kirby, 1944).
La aplicacin de la Penicilina como antibitico ha puesto punto de partida al
desarrollo, produccin y mejoramiento de nuevos frmacos inhibidores de
enfermedades por bacteria, en reas de investigacin, medicina e industria. El
mejoramiento de produccin de penicilina a nivel industrial ha impulsado a
investigadores a realizar los procesos fermentativos en biorreactores.
Biorreactores
El uso de fermentadores biolgicos proporciona un ambiente controlado que
asemeja la naturaleza del microorganismo, tambin las condiciones fisicoqumicas
como temperatura, pH, humedad, oxigeno, aporte de sustrato y nutrientes.
El modo de operacin que nos asegura una produccin ptima de penicilina es un
biorreactor aerobio de tipo Batch o lote, caracterizado por una temperatura que
oscila entre 25 y 27 C. Despus de varias etapas de crecimiento, sometido a
adaptacin de distintos volmenes, el Penicilum notatum est preparado al proceso
de produccin. Durante la fermentacin de la penicilina, el microorganismo alcanza
una fase de crecimiento en 40h con un tiempo de duplicacin de 6h, formando la
mayor parte de la biomasa. Posterior a su fase de crecimiento, el cultivo llega a la
fase real de produccin de penicilina, debido a los nutrientes aportados al medio, en
este caso medio Czapek (McGowan & Tenover, 1997).
Avances biotecnolgicos han llevado a nuevos procedimientos de produccin de
penicilina, en sistemas inmovilizados. Los sistemas inmovilizados protegen a las
clulas del estrs ambiental (Godia et al., 1991), asegurando la interaccin del
microorganismo con su sustrato, aumentando la productividad y por efecto,
reduciendo los costos de los procesos fermentativos.
De acuerdo a las investigaciones, inmovilizacin por alginato favorece la co-
inmovilizacin espontnea de un hongo filamentoso de la especie Penicillium y
Saccharomyces (Peinado, et al. 2005).

JUSTIFICACIN
La obtencin de enzimas como acten como agentes inhibidores de crecimiento
bacteriano, resulta de gran utilidad en el desarrollo de nuevos medicamentos. La
elaboracin de un concentrado que contenga a la enzima B-galactosidasa nos
permitir la realizacin de ensayos que nos ofrezcan informacin para comprobar la
actividad de esta enzima como agente inhibidor del crecimiento bacteriano.

OBJETIVO GENERAL

Producir un concentrado fermentativo con presencia de la enzima glucosa

oxidasa

Objetivos Especficos
Aislar el microorganismo Penicillium chrysogenum para el efecto
antimicrobiano

Producir penicilina a partir de Penicillium chrysogenum inmovilizado en

perlas alginato y sometido a un proceso fermentativo tipo Batch.
MARCO TERICO

Funcionamiento de los antibiticos tradicionales

Los antibiticos tradicionales, es decir aquellos basados en molculas pequeas,
tienen un blanco especfico dentro de las clulas bacterianas y suelen tener gran
afinidad por este blanco: reconocen a su blanco y normalmente no interactan con
ningn otro componente celular. Como ejemplos de la manera en que funcionan los
antibiticos, podemos mencionar que algunos interfieren con la sntesis de la pared
celular de los microorganismos, es decir, evitan que se puedan formar nuevas
clulas bacterianas limitando as su reproduccin; otros antibiticos pueden
interferir con la integridad de la pared celular intercalndose entre sus componentes
y formando poros, provocando que la clula bacteriana tenga problemas para
mantener control sobre lo que entra y sale. Hay antibiticos que interfieren con la
sntesis de protenas o de otros componentes esenciales dentro de las clulas, o
que evitan que el material gentico pueda replicarse de forma adecuada. En
resumen, la funcin en general de todos estos antibiticos es provocar problemas
en la clula bacteriana, tal que impidan su funcionamiento correcto y/o reproduccin.
Lamentablemente las bacterias desarrollan mecanismos para protegerse de los
efectos causados por los antibiticos
Manejo de enzimas como antibiticos
Las protenas antibiticas utilizan mecanismos para combatir infecciones que son
diferentes a los descritos para los antibiticos tradicionales. Hablando
especficamente de las enzimas antibiticas, recordemos que las enzimas son
protenas que catalizan reacciones qumicas; por tanto, una enzima con propiedad
antibitica cataliza una reaccin qumica que puede tener dos consecuencias:
destruir un compuesto que sea importante para la supervivencia del agente
patgeno, y sin el cual no puede multiplicarse o sobrevivir; o bien, generar un
compuesto que sea nocivo para el agente patgeno. Un ejemplo de enzimas
antibiticas son aquellas que inhiben la comunicacin celular (quorum quenching
es el trmino en ingls que se aplica a este fenmeno). Los organismos patgenos
se comunican entre ellos a travs de molculas pequeas; como resultado de esta
comunicacin las clulas evalan el ambiente en el que se encuentran. Cuando este
ambiente es propicio para su replicacin, se pasan esta informacin entre ellas y
envan seales para multiplicarse, lo cual conduce a la infeccin. Las enzimas
antibiticas, ayudan a convertir a las molculas encargadas de esta comunicacin
celular en otro tipo de molcula, que ya no sirve como mensajero. De esta manera,
las clulas de los patgenos nunca se enteran de que pueden multiplicarse a sus
anchas y por tanto la infeccin no ocurre. Una de las ventajas de las protenas
antibiticas es que es ms difcil que los patgenos desarrollen resistencia, por lo
que podran constituir los antibiticos de avanzada generacin.
B-galactosidasa
La hidrlisis de la lactosa se puede realizar mediante cidos fuertes, resinas de
intercambio inico o empleado enzimas, siendo este ltimo mtodo el que asegura
un proceso de hidrlisis sin afectar los otros componentes presentes. Teniendo en
cuenta estas caractersticas en la literatura se indica al mtodo enzimtico como el
ms conveniente para la industria alimenticia (Ladero y otros, 2000). La -
galactosidasa es la enzima utilizada para la hidrlisis de lactosa.
La enzima B-galactosidasa funciona como un agente de inhibicin de crecimiento
bacteriano, produciso a partir de hongo penicillium, sigue la ruta metablica B-
lactamico, donde actua de manera especfica inhibiendo la pared celular de las
bacterias

METODOLOGA

Identificacin y obtencin silvestre de la cepa de Penicillium chrysogenum

Se obtendr la muestra del hongo de una naranja en estado de descomposicin,
provocada por el mismo hongo y que de acuerdo a la literatura es donde se
encuentran con facilidad.
Se teir con azul de algodn el microorganismo aislado para poder observar las
estructuras con una alta calidad. La identificacin microscopia se realizar de
acuerdo a (Lpez-Jacome, et al., 2014), con modificaciones; cortando en trozos de
cinta tipo Diurex comercial de aproximadamente 1 cm2, y aadiendo 1 gota de azul
de algodn sobre un portaobjetos, despus se colocar el trozo de cinta en un asa
de platino y con el lado adhesivo se colocar sobre la parte superior del hongo,
hasta conseguir una muestra considerable, se proceder a colocar la cinta sobre la
gota de azul de algodn en el portaobjetos y se observar en 10x, 40x.

Inoculacin y crecimiento de biomasa de P. chrysogenum

La inoculacin de las clulas se har en medio de cultivo Czapek agar, el cual
proporciona un rpido crecimiento al microorganismo (Samson, Hadlok, & Stolk,
1977. En la preparacin del medio de cultivo para producir biomasa se realizar de
acuerdo a (Visagie, et al., 2014) con algunas modificaciones. Los reactivos sern
proporcionados por la universidad. Una vez preparado el medio, se esterilizar en
la autoclave a 121C y 1.5 psi de presin, durante 15 minutos. Se realizarn
resiembras constantes cada semana para la preservacin de la cepa y para evitar la
contaminacin en los cultivos micolgicos.

Caracterizacin de la cepa para la observacin del efecto de inhibicin

bacteriana.
Para corroborar que la cepa de Penicillium chrysogenum tiene efecto de inhibicin
bacteriana, el hongo ser inoculado en 4 cajas Petri con agar Czapek en presencia
de la bacteria Staphylococcus aureus para posteriormente ser incubados en las
estufas a temperaturas de 29C y 35C.
Crecimiento Radial
El crecimiento radial de P. chrysogenum, se medir en base a los siguientes medios
de cultivo. En un matraz de 250 y 500 ml se formular 100 ml de agar PDA y 250
ml de agar Czapek respectivamente. Se preparar en un matraz de 250 ml, 100 ml
de agua destilada con una gota de tween 80, surfractante hidroflico que protege las
esporas del microrganismo (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2009),
posteriormente se esterilizar junto con palillos en la autoclave a 121 C0 a 1.5 psia
de presin.
Cada medio de cultivo ser vaciado en dos cajas Petri, y a partir de una cepa (con
una semana de crecimiento), se agregar 10 ml de la solucin tween 80 a la caja
Petri y con la ayuda de un palillo, se tomar una gota de la solucin y se colocar
en las cajas que contienen PDA y Czapek. Posteriormente se realizarn mediciones
del crecimiento cada 24 horas por un periodo de 5 das.

Inoculacin en reactor batch con agitacin constante

La inoculacin de clulas de Penicillium chrysogenum en un reactor Batch, se

realizar en 2 matraces de 500 ml, cada matraz contendr 250 ml de medio
especfico con distinta fuente de carbono, al primer matraz se aadir dextrosa y al
segundo matraz se agregar jarabe de maz. El reactor ser colocado en agitacin,
en una estufa con una temperatura de 30 C0 y a 100 rpm.

Evaluacin del efecto de inhibicin bacteriana

La actividad antibacteriana de P. chrysogenum, se ensayar con la bacteria
Staphylococcus aureus, se preparar 100ml de medio de cultivo PDA y se aadir
20 ml de agar en 5 cajas Petri con divisin.
Dos cajas Petri sern utilizadas como controles, positivo y negativo, al control
positivo se le aadir 20 ml de PDA y se inocular la bacteria S. aureus, por el
contrario, el control negativo solo se aadir 20 ml de agar.
Posteriormente a la caja1 se le agregarn 20 ml de agar con 0.025 ml de
concentrado con dextrosa y 0.025 ml con concentrado de jarabe de maz, caja 2 con
0.05 ml de concentrado con dextrosa y 0.05 ml de concentrado con jarabe de maz
y por ltimo la caja 3 se aadi 0.075 ml de jarabe de maz y 0.075 ml de dextrosa,
en ambas divisiones se inocular la bacteria S. aureus y se incubarm a una
temperatura de 37C.

RECURSOS

Cuando hablamos de ser rentable, siempre se busca que sea econmico.

Lamentablemente, si hablamos de un proyecto a nivel industrial, no se puede
esperar tener un proceso a bajo costo con excelentes rendimientos.
Para poder llevar estos procesos a escala industrial hay que tener en cuenta el costo
de todo el proyecto, esto incluye: contratacin de personal para las distintas reas
designadas, el pago de cada una de ellas, el material que se requiere, la
instrumentara que se necesita, los reactivos y la materia prima que este proyecto
abarca.
Se pueden optar por opciones que nos lleven a un proyecto ms rentable, sin tener
que invertir tantos millones de dlares.
Para hacer un estimado aproximado, solo de la maquinaria necesaria, se recurri a
investigar los precios del equipo principal para llevar a cabo este proyecto: el
biorreactor.
Tomando en consideracin el aspecto econmico, se cotiz el precio de los
biorreactores con la capacidad requerida y que cumpliera con nuestras
necesidades.

Teniendo como resultado de la bsqueda biorreactores desde:

$500-2000 US, siendo estos con una capacidad de 30 L, muy buen precio
considerando que se quiere empezar con algo pequeo, pero, la industria
demanda grandes cantidades y si no se pueden cubrir las demandas
industriales, entonces habra que buscar con mayor capacidad.
$599-3,999 US, teniendo una capacidad de 50 L, a pesar del costo que
tienen, estos biorreactores son considerados de entre los ms econmicos,
pero que logran cubrir las necesidades para este proyecto.
$20,000 US, en caso de que se lograra llegar a una meta, de tener muy
buenas demandas de producto, estos biorreactores seran los indicados para
lograr dicho propsito. Teniendo capacidades desde 0.1 L hasta 100
Toneladas, son los costosos pero grandes biorreactores industriales a
grande escala.

Costos de las cepas a utilizar

Para llevar a cabo estos procesos fermentativos, es crucial la presencia de cepas

especializadas en este proceso, en este caso se utilizarn cepas de Penicillium
chrysogenum, sabiendo que los costos de esta cepa, a nivel industrial son bastante
elevados, se optar por cultivarlos de manera manual; el inconveniente de esta
situacin es:
1. El costo del medio de cultivo y de la maquinaria necesaria para mantener las
condiciones ptimas para la cepa.
2. El tiempo de incubacin y extraccin de la cepa. Ms tiempo=ms dinero
invertido
Si se hace un comparativo de los dos mtodos, cada uno tiene desventajas
considerables, sin embargo, para el propsito de este proyecto, se recomienda el
uso de cepas preparadas para uso industrial, ya que as se reduce
considerablemente el costo de la instrumentara y dems necesarios para
mantenerla en condiciones ptimas.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

MESES AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE

SEMANAS 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Actividades
Identificacin de fuentes del X
microorganismo
Aislamiento de microorganismos X X

Identificacin y pruebas de X X
crecimiento de microorganismo

Inoculacin del microorganismo X

en biorreactor

Evaluacin de equipos para de X X

control de factores
Ajuste de las variables X X
Recuperacin de producto final X X X

Purificacin de producto X X X

Presentacin de resultados X

REFERENCIAS

Fleming, A. (1929). On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special

reference to their use in the isolation of B. influenzae. British journal of experimental
pathology, 226-236.

Gonzales, N., Wong, I., Pimentel, E., Zamora, J., Salazar, E., & Mena, J. (2009).
Expresin de proteasas extracelulares en el cultivo de alta densidad del microorganismo
con actividad bionematicida Tsukamurella paurometabola C-924. Tecnologa Qumica, 83-
90.

Lpez-Jacome, L. E., Hernndez-Duran, M., Coln-Castro, C. A., Ortega-Pea, S., Cern-

Gonzlez, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones bsicas en el laboratorio de
microbiologa. Mediagraphic, 10-18. Retrieved from http://www. medigraphic.
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Pirt, S. J. (1967). A Kinetic Study of the Mode of Growth of Surface Colonies of Bacteria
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Samson, R. A., Hadlok, R., & Stolk, A. C. (1977). A taxonomic study of the Penicillium
chrysogenum series. Antonie van Leeuwenhoek, 169-175.
Visagie, C. M., Hobraken, J., Frisvad, J., Hong, S.-B., Klaassen, C., Perrone, G., . . .
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Micology, 343-371.