Princpios de Cultivo Celular

Disciplina de Engenharia Tecidual

Fernanda Nedel
fernanda.nedel@gmail.com

Pelotas, 2011
 Histrico

1907 e 1910 Tubo medular

(sapo)

Quando se tomam precaues asspticas adequadas, os tecidos

sobrevivem nessas condies por uma semana e, em alguns
casos, foram mantidos espcimes vivos durante
aproximadamente quatro semanas

Fibras nervosas surgem das clulas nervosas

 Histrico

Carrel - Burrows
Linfa provenientes de pintos - cultivo de
clulas de aves e mamferos.
Burrows - Rockefeller Institute
 Histrico

1910 e 1911 - Rockefeller Institute

 Histrico

1950 Tripsina
Desenvolvimento de Meios de Cultivo
Antibiticos

1952 1955 Primeira linhagem de clulas humana HeLa

(George Gey)

Adenocarcinoma Cervical - HeLa

 Neuroblastoma Humano - SH-SY5Y
Leucemia Promieloctica Aguda Humano HL-60

Sem aumento de rea superficial

de suporte

A forma assumida pela clula geralmente reflete a sua origem.

Matriz extracelular/ Adeso celular
 Tecido conjuntivo

Matriz extracelular abundante e clulas

esparsamente distribudas.
Rica em polmeros fibrosos, a matriz sofre o
estresse mecnico e no a clula
 Tecido Epitelial

Matriz extracelular esparsa (membrana basal).

Alta densidade celular.
Clulas sofrem o estresse mecnico.
Tecido Epitelial
 Junes Celulares
Ocorrem em pontos de contato clula-clula e
clula-matriz (tecidos repletos de
epitlio)
Junes Celulares
 Junes Celulares
Juno bloqueadora (junes compactas - vertebrados): Impedem que pequenas
molculas vazem de um lado para outro.
Junes bloqueadoras
 Junes de Ancoramento
Juno de Ancoramento: Conectam o citoesqueleto de uma clula ao citoesqueleto
da clula vizinha ou matriz extracelular.
 Juno de Ancoramento

Protenas de ancoramento intracelular (placa):

conectam o complexo a filamentos de actina e
filamentos intermedirios

Protenas de adeso transmembrana :

liga-se a protena de ancoramento intracelular e
domnio extracelular da protena de
adeso transmembrana da outra clula.

Formas Funcionais:

- Junes aderentes (actina) e desmossomos (intermedirio): clula-clula;

protenas de adeso transmembrana famlia da caderinas.

- Adeses focais (actina) e os hemidesmossomos (intermedirio): clula-matriz;

proteina de adeso transmembrana famlia das integrinas
Junes Comunicantes (Tipo Fenda)

Protenas formadora de canais - Conexinas.

No homem 14 tipos diferentes.
1.5 nm (aminocidos, ons, vitaminas, acares,
mediadores intracelular).
Manuteno de uma distncia fixa entre as
clulas.
Molculas de Adeso Celular
(CAMs)
- Protenas transmembranas.
- Molculas de adeso clula-clula ou
clula-matriz.
- Dependentes ou independentes de
Ca.
- Caderinas, superfamlia das
imunoglobulinas e selectinas.
 Molculas de Adeso Celular - (CAMs)

1. Caderinas

Cadeia polipeptdica dobrada em cinco

a seis repeties.
ons posicionados entre cada par de
repetio de caderina,
formando uma estrutura
rgida.
 Molculas de Adeso Celular - (CAMs)

1. Caderinas

Ligao homoflica cederinas do mesmo tipo em ambas as clulas.

Ligao Heteroflica caderinas diferentes.

Ligao dependente de ligante ligadas por meio de outra molcula

 Molculas de Adeso Celular - (CAMs)

1. Caderinas
Caderina E
Clulas epiteliais
Caderina-N
Nervo, msculo e nas clulas do cristalino
Caderina-P
Clulas da placenta e da derme
Caderina-VE
Clulas endoteliais
80 membros da superfamlia das caderinas (mamferos)
 Molculas de Adeso Celular - (CAMs)

2. Superfamlia das imunoglobulinas

Um ou mais domnios semelhantes a Ig

Molculas de adeso de clula neuronal (N-CAM)

mais prevalente nos vertebrados,
ligao homoflica,
alguns ligao heteroflico.
Biologia Celular

Clulas em Monocamadas
Adeso Celular Proliferao

Carcinoma de Pulmo Humano - A549

Biologia Celular

Etapas da Adeso/Proliferao

1. Adsoro de fatores de adeso: protenas de matriz extracelular;

2. Contato das clulas com a superfcie;

3. Adeso celular;

4. Espraiamento celular.

Carcinoma de Prstata Humano

LNCaP
 Frascos (garrafas) de Cultura

Garrafas de Vidro Propriedades pticas e carga de

superfcie.
Garrafas Plsticas - (Poliestireno) Possuem boas
propriedades pticas, uma superfcie plana, uniformidade
quanto as propriedades e reprodutibilidade.
Hidrofbicas Tratadas com qumicos e irradiao
Biologia Celular
Fibroblastos: adeso
ao substrato

Fibroblasto de Pulmo Humano IMR-90

Clulas Epiteliais: adeso ao

substrato e adeso
clulas-clulas (placas)
Adenocarcinoma de Colorretal Humano HT-29
Biologia Celular
Reagentes
1. Tripsina/EDTA

Clulas aderentes Tripsina/EDTA

Clulas no aderentes - Centrifugao

EDTA atua como quelante

Reagentes

Tripsina

Sem Tripsina
Biologia Celular

Matriz Extracelular

MEC Fentipo Celular

Linhagens Celulares: MEC

Culturas Primrias e Clulas Especializadas: MEC exgeno
Biologia Celular
Matriz Extracelular Exgena

Facilitar a adeso, crescimento e diferenciao

Condicionamento
segunda cultura no frasco e meio de outra cultura

Colgeno
altamente purificado; preo elevado

Laminina
altamente purificada;

Gis
mistura de colgenos, predominncia do Tipo I
Biologia Celular
Feeder Layer

Suporte formado por clulas normais irradiadas (irradiao

gama).
Suplementao do meio por metablitos ou secreo
de fatores de crescimento pelo fibroblastos.
Condicionamento do substrato pelos produtos
celulares
Exemplos: IRR-MRC-5 (Fibroblasto de pulmo humano)
IRR-3T3 (Fibroblasto embrionrio de camundongo)
Biologia Celular
Feeder Layer

Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts

Thomson (1998)
Science
Reagentes

2. PBS

3. Meios de Cultura

Grande nmero de aminocidos

Vitaminas
Minerais (Ca2+, Na+, K+, Cl- )
Glicose
Antibiticos
Suplementos Orgnicos (protenas, peptdeos, piruvato)
Hormnios e Fatores de Crescimento
Vermelho de fenol
Ex: RPMI 1640, MEM (Minimal Essential Medium (Eagle) , DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle Medium)
Reagentes

4. Soro

Soro
Fatores de Crescimento
Fatores de Adeso e Atividade Anti-tripsina
Mineral
Lipdeos
Hormnios
Protenas
Nutrientes e metablitos (aminocidos, glicose...)
Ex: Fetal Bovine Serum, Horse Serum, Goat Serum
Condies Ambientais
1. pH
Vermelho de fenol Pode interferir na fluorescncia e absorbncia

pH 7,6 pH 7,4 pH 7,0 pH 6,5

Condies Ambientais

2. Co2 e Bicarbonato

H2O + CO2 H2 CO3 H+ + HCO3 -

NaHCO3 Na++ HCO3

CO2 - reduo do pH
Bicarbonato de Sdio Aumento do pH

CO2 Liberado por Clulas X CO2 Liberado pela Incubadora

5% de CO2
Condies Ambientais

3. Temperatura

Dependente da temperatura corporal do animal do qual as clulas

foram obtidas.
De variaes anatmicas (ex: pele e testculo).
Incorporao de uma temperatura de segurana.

Temperatura utilizada: 37C

Condies Ambientais

4. Osmolalidade

Plasma humano: 290 mosmol/kg

Cultivo Celular: 260 mosmol/kg e 320 mosmol/kg
Diferena de Osmolalidade entre os Meios de Cultivos e evaporao.

Humidade relativa do ar 95% (mais prximo da saturao)

Condies Ambientais

5. Forma e Composio de Suportes para Adeso

Celular
Tipos de Cultivo
1. Cultivo Primrio de Explantes
o estagio da cultura aps o isolamento das clulas e antes da primeira sub-
cultura.
Migrao celular do tecido.
(Freshney 2005)

Neural Crest-derived Cell Adult Human Retina

Wang (2010) Mayer (2005)
Cell Death and Disease British Journal of Ophthalmology
Tipos de Cultivo
2. Cultivo Celular
Refere-se a uma cultura derivada de clulas dispersas oriundas de um tecido
ou linhagens celulares.

Carcinoma de Prstata Humano

LNCaP
Linhagens Celulares

Linhagens Finitas e Contnuas

Neuroblastoma - SH-SY5Y
Tipos de Cultivo

3. Cultivo de rgo
Refere-se a uma cultura tridimensional de tecidos no desagregados que
retm parcialmente ou completamente a histologia de um tecido in vivo.

rgo Dental
Tcls (2008)
Journal of Biomedical Materials Research Part B:
Applied Biomaterials
 Categoria Cultivo de rgo Explante Cultura de Clulas

Fonte rgos embrionrios Fragmentos de Tecido desagregado,

e fragmentos de tecidos culturas primrias e
tecidos (adulto) linhagens celulares

Empenho Alto Moderado Baixo

Histologia Informativo Difcil No plausvel de

aplicao
Propagao No possvel Possvel Procedimento padro

Reprodutibilidade e Muita variao entre Muita variao entre Baixa variao entre
homogeneidade as amostras as amostras as amostras

Quantificao Difcil Difcil Fcil, muitas tcnicas

disponveis
Tipos de Cultivo

4. Histotypic Culture (Cultivo Histotpico)

As clulas so re-agregadas ou crescem para re-criar uma estrutura
tridimensional com uma densidade celular semelhante ao do tecido.

Carcinoma de Prstata Humano

LNCaP
Tipos de Cultivo
5. Organotypic Culture (Cultivo Organotpico )
Refere-se a co-cultura, com ou sem matriz, de diferentes tipos celulares.
 Possibilidades de Estudo
Farmacologia
Ao de drogas, interao
receptor-ligante ,
metabolismo de drogas,
resistncia a drogas.
Atividade Intracelular
transcrio de DNA, sntese
de protena, apoptose,
diferenciao, ciclo
celular.
Imunologia
Eptopos da superfcie
celular, hibridomas,
citocinas e sinalizao ,
inflamao.
Genmica
Anlise gentica,
transfeco,
transformao,
imortalizao.
Fluxo Intracelular
Produtos Celulares Processamento de RNA,
Proteomica, produtos metabolismo do clcio,
biotecnolgicos, fluxo de metablitos,
secrees. transduo de sinais,
receptores hormonais,
transporte de
membrana.
Interao clula-clula
Morfologia, controle
parcrino, cintica de
proliferao celular,
cooperao metablica,
adeso e mortalidade
celular
Toxicologia
citotoxidade, metagnese,
carcinognese,
Engenharia Tecidual irradiao, infeco,
inflamao.
Biologia Celular
Matriz Extracelular Exgeno

Matrigel
Sarcoma de EngelbrethHolmSwarm Camundongo

Clulas epiteliais

Componentes bsicos da membrana laminina,

fibronectina e proteglicanas