UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO

ABAD DEL CUSCO

ESCUELA DE POS GRADO

MAESTRIA: EN QUIMICA MENCION PRODUCTOS NATURALES

ASIGNATURA
PRODUCTOS NATRURALES II

TEMA: CROMATOGRAFIA

DOCENTE: MGT. Leoncio Solis

MAESTRISTAS:

Q.F. CANDIA LOPEZ Carol

Q.F. CUSIHUAMAN PUMA Sofa Esperanza
QCO. LIZARRAGA CONCHA Victoria Yolanda

CUSCO- 2009
 INDICE

I. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

II. CROMATOGRAFA EN COLUMNA DE GELES DE FILTRACION

IV. CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCIA

V. CROMATOGRAFA DE GASES

VI. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

VII. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

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 CROMATOGRAFIA

La cromatografa es una tcnica que permite separar, aislar e identificar

los componentes de una mezcla de compuestos qumicos. La muestra es
distribuida entre dos fases inmiscibles (slida, lquida o gas), una
estacionaria y otra mvil, que se mueven una con respecto de la otra
manteniendo un contacto ntimo, de tal forma que cada uno de los
componentes de la mezcla es selectivamente retenido por la fase
estacionaria. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo
diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la
separacin. Si un componente est la mayor parte del tiempo en la fase
mvil el producto se mueve rpidamente, mientras que si se encuentra la
mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida
es mucho ms lenta.
La separacin se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un
slido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase
estacionaria propiamente dicha como soporte de una fase estacionaria
lquida. Tambin se puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel
de filtro o un slido finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre
una placa de vidrio. Estos tres tipos de cromatografa se basan en los
mismos principios fundamentales, y se conocen respectivamente como
cromatografa en columna, en papel y de capa fina.
La cromatografa es un proceso de separacin muy comn en
ingeniera qumica y bioqumica. Es un procedimiento altamente selectivo,
capaz de distinguir y separar componentes con caractersticas fsicas y
qumicas muy similares. Esta tcnica se considera importante tanto a nivel
de produccin como de anlisis.
El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la obtencin,
preparacin y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicacin de la
tcnica analtica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.
Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden
englobarse en dos grandes grupos: tcnicas de separacin y tcnicas
espectroscpicas. Las tcnicas espectroscpicas proporcionan, para cada
compuesto analizado, una informacin compleja, relacionada con sus
caractersticas estructurales especficas, por otro lado las tcnicas de
separacin se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la
seal obtenida puede utilizarse con fines analticos cuantitativos o
cualitativos.
Actualmente las separaciones analticas se realizan fundamentalmente por
cromatografa y electroforesis.
La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de
una mezcla, sino tambin su identificacin y cuantificacin. Se pueden
separar molculas en funcin de sus cargas, tamaos y masas moleculares.
Tambin a travs de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc.
El anlisis cualitativo est basado en la medida de parmetros
cromatogrficos (tiempos y volmenes de retencin) mientras que el anlisis
cuantitativo est basado en la medida de alturas o reas de picos
cromatogrficos que se relacionan con la concentracin.

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 Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar segn la forma en que
la fase mvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. As en la
cromatografa de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a
travs de la cual se hace pasar la fase mvil por presin. En la
cromatografa en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a
los intersticios de un papel; en este caso la fase mvil se desplaza a travs
de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad.
Las tres clases de cromatografa desde un ngulo ms general son
cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de fluidos
supercrticos. Como su nombre lo indica, la fase mvil en las tres tcnicas
son lquido, gas y fluido supercrtico respectivamente. En la cromatografa
lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que
contiene a la fase fija. Solo la cromatografa de lquidos es la que puede
llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la
de gas como la de fluidos supercrticos estn restringidas a los
procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna
contienen la fase mvil.

La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta resolucin(HPLC),

por su sensibilidad, fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles y su
aplicacin a sustancias de primordial inters en la industria, como son los
aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,
entre otros.

Tipos de cromatografa

FIG. 1 - Mtodos cromatogrficos. CGS: cromatografa gas-slido; CGL:

cromatografa gas-lquido; CLS: cromatografa lquido-slido; CLL: cromatografa
lquido-lquido; CFQU: cromatografa de fase qumicamente unida; CII:
cromatografa de intercambio inico; CCF: cromatografa de capa fina; CP:
cromatografa de papel; CE: cromatografa de exclusin; CPG: cromatografa de
permeacin en gel; CFG: cromatografa de filtracin en gel.

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CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

La cromatografa es una tcnica que se emplea en el fraccionamiento de

protenas. Consiste en la aplicacin de una muestra compleja de protenas a
una columna de cristal en la que se ha situado una matriz slida porosa que
est inmersa en el solvente. A continuacin se bombea una gran cantidad de
solvente a travs de la columna. Las diferentes protenas se van retrasando de
manera distinta segn sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser
recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna.
Segn la matriz escogida, las protenas se pueden separar de acuerdo a su
carga, su hidrofobicidad, su tamao o su capacidad de unirse a grupos
qumicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele
comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.

En toda cromatografa hablaremos de los siguientes trminos:

Matriz de la columa. Sustancia que est empapada de solvente y que

se empaqueta en la columna. Tambin se denomina el lecho de la
columna.
Longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se
empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografa
como la de filtracin en gel y poco importante en otras como la
cromatografa de afinidad.

Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una

columna cromatogrfica.

Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que

atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado
completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la
columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la
primera protena. En general, y dependiendo del tipo de cromatografa
puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna.

'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio inico o de afinidad, el

volumen de solvente ms protenas que atraviesa la columna sin quedar
retenido en ella. Correspondera en el caso de la cromatografa de
afinidad al volumen de solvente que contiene las protenas no afines al
ligando.

Tipos de cromatografa en columna

El principio de separacin de la cromatografa es la aplicacin de un criterio de

separacin a las protenas que se desplazan a lo largo de una matriz slida
porosa. Este criterio de separacin se basa en alguna propiedad que es
diferentes entre las protenas que se quieren separar : peso molecular, carga
elctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc... En funcin de cual sea
el criterio de separacin que se aplique diferenciamos tres tipos de
cromatografa en columna :

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A. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

La cromatografa de intercambio inico se realiza sobre matrices que tienen una

carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna as
como la carga de las protenas m depender del pH del solvente y de su fuerza
inica (proporcional a la concentracin de iones). En unas condiciones
determinadas sern retenidas en la columna las protenas que tengan una
carga complementaria a la de la matriz del gel (las protenas cargadas
negativamente sern retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo
eluidas las restantes. Para eluir las protenas retenidas se puede variar la carga
inica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoelctrico de la
protena de inters o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que
retiene a las protenas en la columna.

B. CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL

La cromatografa de filtracin en gel se realiza empleando unas matrices

formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y
su dimetro est determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos
protenas de tamaos tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y
la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de
los poros, reducindose la concentracin en la fase libre entre las bolas. La
segunda protena, por tamao, slo puede encontrarse entre las bolas. El flujo
de solvente es ms elevado entre las bolas que en el interior de los poros de
stas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las
protenas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular.
En esta cromatografa se eluyen primero las protenas mayores, y en segundo
lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la
columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de
mayor calidad. Empleando patrones de protenas de peso molecular conocido
se emplea para determinar el peso molecular de protenas de tamao
desconocido

C. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD Y DE INMUNOAFINIDAD

En la cromatografa de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la

columna presentan unido en su superficie un ligando, una molcula ante la que
tiene afinidad una o ms de las protenas presentes en la mezcla a separar. Al
atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel
la protena afn, y deja pasar el resto. La elucin de la protena afn se puede
conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH
hasta alcanzar su punto isolctrico, variando la fuerza inica del solvente, etc...)
con lo que se reduce la intensidad de la interaccin hasta anularla.

La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (protena)

unido a las bolas, que seleccionar su/s ligando/s de una mezcla compleja, o el
antgeno empleado en una inmunizacin el que recubre las bolas y que retendr
del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos

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purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando
que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas
protenas que contienen los eptopos que reconocen.

En ocasiones la cromatografa de afinidad se realiza incubando el gel recubierto

con el ligando directamente con la solucin que contiene las protenas a
purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elucin,
primero de las protenas no unidas ('run throught') y posteriormente de las
retenidas (eluido especfico).

I. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

INTERCAMBIADORES DE IONES

La cromatografa de intercambio inico es el tipo de cromatografa ms

empleado en anlisis inorgnico. El intercambio inico es el proceso reversible
de intercambio de iones entre una solucin y un slido insoluble en contacto
con ella. Este cuerpo slido, llamado intercambiador inico, tiene que poseer
ciertas caractersticas. En primer lugar, debe ser un compuesto inico. En
segundo lugar, debe poseer una estructura molecular suficientemente porosa o
abierta para permitir que los iones entren o salgan de ella por difusin.
Existen intercambiadores inicos inorgnicos y orgnicos, naturales y sintticos.
Los ms empleados son polmeros orgnicos llamados resinas de intercambio
inico. Las resinas mas comunes son de poliestireno reticulado y poseen una
estructura molecular 1. Se fabrican a partir de mezclas de los dos monmeros
lquidos estireno (C6H5CH = CH2) y divinilbenceno (H2C = CH - C6H4 - CH = CH4)
en una proporcin que suele ser de alrededor de 12:1 pero que puede variar
segn las necesidades de la sntesis, agregando una pequea cantidad de un
catalizador de tipo radical libre, como el perxido de benzolo, y vertiendo
inmediatamente la mezcla lquida, con fuerte agitacin, en agua que contiene
una pequea cantidad de un agente tensoactivo. La agitacin se contina,
manteniendo las sustancias reaccionantes lquidas suspendidas en el agua en
forma de pequeas gotas, que pueden ser mayores o menores segn la
velocidad de agitacin. En un breve tiempo, las gotculas se convierten en
perlas esfricas slidas, al reaccionar entre s las molculas de estireno y
divinilbenceno polimerizndose formando cadenas muy largas y retculos. A
continuacin, se introducen los grupos inicos (grupos de cido sulfnico,
mediante un tratamiento qumico adecuado, tal como por reaccin con cido
sulfrico fumante.

CH2 CH CH2 CH CH2 HC CH2

+
SO3-H
- +
SO3 H +
HC CH2 SO3-H

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En la Fig. . Estructura qumica de una resina eje intercambio cannico de
poliestireno sulfonado.
Finalmente, la resina obtenida se lava y se clasifica segn los tamaos de las
partculas.
Las resinas intercambiadoras de iones poseen algunas caractersticas que
deberan ser bien comprendidas por el qumico que vaya a usarlas,
especialmente para elegir la resina apropiada para una aplicacin dada. En
primer lugar, el tipo de polmero, o esqueleto estructural. En el ejemplo
descrito antes, ste es el copolmero estireno-divinilbenceno, pero existen
algunos otros tipos, como los polmeros de cido acrlico o incluso productos
naturales, como la celulosa. En segundo lugar, los grupos funcionales o grupos
inicos fijos. En el mismo ejemplo citado, estos son los iones sulfonato, pero
pueden ser tambin iones carboxilato o iones positivos, como los de amonio
cuaternario. As, pues, los iones fijos en la estructura pueden poseer carga
negativa o carga positiva. Si estn cargados negativamente retienen iones
positivos o cationes de pequeo volumen; si lo estn positivamente, retienen
iones negativos o aniones pequeos. Son estos iones pequeos o contra-iones,
los que son intercambiados. Un intercambiador cuyos iones fijos sean
negativos, es un intercambiador de cationes; si los iones fijos son los positivos,
es un ntercambiador de aniones. Entre los intercambiadores de cationes se
distinguen los que son fuertemente cidos y los dbilmente cidos, segn la
naturaleza de los grupos funcionales y el grado de disociacin de stos.
Anlogamente, existen intercambiadores amnicos que son fuertemente
bsicos y otros que son bases dbiles.

El grado de reticulacin mide la compacidad del retculo del polmero. Cuanto

mayor es la reticulacin de una resina, tanto mayor es su densidad y el nmero
de iones que contiene por centmetro cbico. No obstante, un elevado grado de
reticulacin hace ms difcil la difusin de los iones, especialmente la de los de
mayor tamao, a travs de la estructura. Las resinas comerciales ms
corrientes, del tipo del poliestireno, poseen una reticulacin del 8 por ciento,
cifra que significa que la mezcla estireno-divinilbenceno a partir de la cual son
preparados contiene un 8% de divinilbenceno.
Finalmente, otro parmetro importante es el tamao de las partculas. Debe
elegirse el tamao adecuado de partcula en el momento de adquirir la resina.
Esta est constituida por esfrulas, llamadas perlas, que son extraordinariamen-
te duras y difciles de moler, y no se debera adquirir en el comercio un tamao
de perla grande esperando obtener despus tamaos menores por molturacin.
Los tamaos de las partculas se suelen expresar en funcin de la escala patrn
de tamices norteamericana, dando el nmero de orificios por pulgada, o tamao
de malla. Las resinas empleadas en la purificacin industrial de aguas tienen
que permitir flujos rpidos de lquido, por lo cual son de un tamao de malla
grande; generalmente de 20 a 30 mallas. Las usadas en el anlisis
cromatogrficos ms riguroso son resinas de partculas mucho ms finas,
generalmente de 200 a 400 mallas. Las caractersticas desfavorables de las
resinas de partculas de pequeo tamao provienen de su gran resistencia al
flujo. Si se emplean resinas de tanta finura de grano como la indicada, son
precisos sistemas de alta presin para mover las soluciones, pues bajo la
accin exclusiva de la gravedad no fluyen a velocidad satisfactoria.

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En el momento de tener que adquirir resinas para el trabajo de laboratorio
resulta til conocer algunos de los nombres comerciales que figuran en los
catlogos. Se encuentran frecuentemente los nombres siguientes:
Dowex-50 o Dowex-50 W. Es una resina intercambiadora de cationes, acida
fuerte, de composicin basada en poliestireno reticulado que contiene grupos
sulfnico. Se encuentra en el comercio en forma hidrgeno, la cual contiene
iones hidrgeno como cationes sustituibles o contra-iones y en forma sdica,
con iones sodio como cationes sustituibles.
Dowex-1 y Dowex-2. Estas dos resinas son intercambiadoras de aniones, de
carcter bsico fuerte, con el esqueleto estructural de poliestireno y los grupos
funcionales -CH2N(CH3)3+ y CH2N(CH3)2C2H4OH + respectivamente. La forma
hidrxido de la Dowex-2 es una base algo ms dbil que la de Dowex-1. Estas
resinas se encuentran en el comercio en la forma cloruro, la cual contiene iones
cloruro como anin sustituible. La forma hidrxido es algo inestable y se
descompone con el tiempo.
Dowex A-I. Es una resina quelatante con esqueleto de poliestireno y el grupo
funciona - CH2N(CH2COOH)2, el mismo grupo presente en el reactivo EDTA. Se
utiliza para concentrar vestigios de iones metlicos a partir de volmenes
grandes de solucin.
Amberlita IRC-50. Es una resina intercambiadora de cationes acida dbil cuya
unidad estructural es -C(CH3)(COOH) - CH2-. Se encuentra en el comercio en
forma hidrgeno y tambin en forma sdica.
La reticulacin y el tamao de malla de las resinas viene indicado general mente
en su propia denominacin, tal como sigue: Dowex-50 W x -x 4200-400 mallas,
significando el smbolo x 4 que en la preparacin de dicha resma se utiliz un 4
por ciento de divinilbenceno.

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EQUILIBRIO Y SELECTIVIDAD

Como ya se indic en la definicin del trmino, el intercambio inico es

reversible. Un proceso tpico de intercambio inico es el de la sustitucin de
algunos de los iones sodio contenidos en un intercambiador cargado en su
forma sdica, por iones potasio presentes en una solucin exterior

Si se agita una cierta cantidad del intercambiador (en forma sdica) con una
solucin de cloruro de potasio, se alcanza un equilibrio de distribucin, con una
fraccin de los iones sodio y una de los iones potasio en la resina y otra fraccin

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de ambos en la solucin. La distribucin obedece la ley de accin de masas y
viene descrita por una constante de equilibrio. Q:

Para la resina Dowex-50 x 8. el valor de Q es prximo a 2. Los iones potasio

son retenidos ms fuertemente que los iones sodio. Se dice que la
selectividad de la resina para los iones potasio es mayor que para los iones
sodio.
Algunas cifras tpicas relativas a la selectividad de varias resinas de intercam-
bio inico se hallan recogidas en la Tabla. Los valores numricos reales
dependen de las caractersticas de cada resina, pero, en general, la selectividad
para el intercambio de cationes aumenta en el orden: Li (mnima)-Na-K-Rb-Cs,
para los metales alcalinos y Mg (mnima)-Ca-Sr-Ba-Ra, para los alcalinotrreos.
Los iones de los metales pesados, como Cu y Pb, son retenidos ms
fuertemente que Mg y Ca. Para el intercambio de aniones, el orden de los iones
haluro es: F (mnima)-Cl-Br-I.

TABLA
(a)
Selectividad del intercambio inico: valores de Q

Cationes univalentes Cationes divalentes Aniones univa-

(relativo a Li) (relativo a Ca) lentes (relativo a
Cl)
H 1.3 Mg 0,61 F 0,08 Ci 1,00 Br
Na 2.0 2.9 3.1 Ca 1,00 3,5 I 13,5 N03 3,0
K 3,2 8,5 Sr ' 1.25 C104 23,0 OH 0.5
Rb 12,5 Ba 2,2
Cs Zn 0,7
Ag Cd 0,8
T Pb 1,9
Cu 0,75
Ni 0,75

(a) Estas cifras corresponden a resinas a base de poliestireno, con grupos

sulfnico los intercambiadores de cationes, y con grupos de amonio cuaternario
los de aniones; el grado de reticulacin es del 8%. Debe hacerse notar que el
valor numrico exacto vara de una partida de resina a otra.
Al expresar los resultados del intercambio entre iones de diferente carga, como,
por ejemplo, la sustitucin de Ca2+ por 2 Na + , hay que ir con cuidado con las
unidades, pues, en estos casos, el valor numrico de la constante de equilibrio
depende de las unidades en que se expresen las concentraciones. Hay que
observar, adems, la influencia importantsima de la concentracin: cuanto
mayor es la concentracin total tanto ms se desplaza el equilibrio en el sentido
de poner en solucin el ion de carga mayor; recprocamente, cuanto-ms diluida
es la solucin tanto mayor es la fraccin del ion de carga mayor que queda

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retenido en la resina. Ello es consecuencia de la ley de accin de masas, segn
la cual la constante de equilibrio viene dada por:

Res2Ca Na+ 2
Q= 2 2+
ResNa Ca

Este efecto se aprovecha, por ejemplo, en el tratamiento de aguas, para

eliminar la dureza de las mismas.

El hecho de que las resmas de intercambio muestren una mayor apetencia para
una clase de iones que para otras, es lo que hace posible la cromatografa de
intercambio inico. Como se ver ms adelante, el intercambio inico se utiliza
en conjuncin con la formacin de complejos para obtener una selectividad
adicional.

COLUMNAS DE INTERCAMBIO INICO

Los intercambiadores de iones, se utilizan casi siempre en columna. La tcnica

en columna permite que la sustitucin de una clase de Ion por otra llegue a ser
completa, aun a pesar de que la reaccin sea reversible. Adems, se puede
conseguir fcilmente sustituir un in por otro incluso en el caso de que ello vaya
contra el orden de selectividad. As, pasando una solucin de cloruro de sodio
por una columna rellena de una resina en forma potsica, es posible obtener a
la' salida de la columna, por lo menos durante un cierto tiempo, una solucin de
cloruro de potasio puro. La solucin que pasa por la columna cloruro de sodio
en este ejemplo se va encontrando de un modo continuo con resina fresca no
reaccionada, en este caso resina cargada de iones potasio y el exceso de este
reactivo va desplazando el equilibrio de un modo continuo. La tcnica de trabajo
en columna constituye un medio muy bueno para conseguir que una reaccin
reversible llegue a ser completa y es posible conseguirlo en cualquiera de
ambos sentidos.
Gracias a ello, las columnas de intercambio inico se pueden usar repetida-
mente muchas veces. Cuando se agotan, esto es, cuando los iones que
deberan quedar retenidos en la resina ya no lo son y empiezan a salir de la
columna, sta se regenera simplemente haciendo pasar por ella una solucin
de los iones que contena inicialmente. Una vez terminado el experimento, no
se desecha la resina, sino que se pasa por ella una solucin de cido
clorhdrico para eliminar de la misma el calcio y otros cationes metlicos; luego
se lava con agua. Con ello, la resina queda regenerada y lista para ser
utilizada nuevamente.
El titulo de este captulo es el de Cromatografa de intercambio inico, pero
con mucha frecuencia las columnas intercambiadoras se utilizan tambin para
realizar separaciones o sustituciones qumicas que no consisten propiamente
en un proceso cromatogrfico (esto es. en un proceso de migracin diferencial).
Son ejemplos de aplicaciones no cromatogrficas los siguientes: la separacin
de trazas, la separacin de iones interferentes y la determinacin del contenido

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salino total de las soluciones. Los tres primeros experimentos de este captulo
son ejemplos de estos tres tipos de aplicaciones.
En algunas experimentos constituye un ejemplo de concentracin de un
constituyente traza. Se hace pasar una solucin que contiene una pequesima
concentracin de iones cobre por una columna de una resina ntercambiadora
de cationes, la cual fija los iones cobre, eliminndolos de la solucin.
Posteriormente, se recupera el cobre de la columna pasando un volumen
relativamente pequeo de cido clorhdrico diluido. Con ello, todo el cobre que
estaba contenido inicialmente en un gran volumen de solucin queda al final en
un pequeo volumen de una solucin relativamente concentrada, en la cual se
puede determinar volumtricamente.
Al concentrar trazas por intercambio inico no se debe olvidar nunca que este
es un proceso competitivo. Los oros iones presentes pueden competir en la
ocupacin de los grupos activos de la resina con los iones traza que se desea
fijar. As mediante el procedimiento del Experimento no sera posible retener las
trazas de cobre contenidas en el agua del mar: la elevada concentracin de
iones sodio presentes impedira la absorcin del cobre. Para ello
necesitaramos una resina que tuviera una selectividad para los iones cobre
excepcionalmente elevada, como la resina quelatante descrita en la seccin 1.

ELIMINACIN DE IONES INTERFERENTES

Sucede a menudo que un in interfiere en la determinacin analtica de otro.

Por ejemplo, los iones fosfato interfieren en la valoracin de los iones calcio o
magnesio con EDTA y los iones calcio interfieren en la determinacin
acidimtrica de los iones fosfato. Los iones calcio y fosfato, no obstante, poseen
carga de signo contrario, y resulta fcil separarlos por intercambio inico. Si una
solucin que contiene simultneamente iones calcio y fosfato, acidificada
dbilmente para evitar su precipitacin, se pasa por una columna de una resina
intercambiadora de cationes, en su forma acida, los iones calcio son retenidos
por la resina, mientras que los iones fosfato pasan con la solucin. La resina no
separa calcio y fosfato en el sentido de alejarlos fsicamente uno de otro: la
atraccin electrosttica entre iones de carga de distinto signo es demasiado
intensa para que ello sea posible. Lo que hace la resina es producir
asociaciones inicas diferentes de la inicial. As. en este caso, partimos de
fosfato de calcio 'y terminamos con cido fosfrico y cloruro de calcio (si se
emplea cido clorhdrico para liberar los iones calcio retenidos en la resina).
Se utiliza un mtodo anlogo para la puesta en solucin de algunas sales
escasamente solubles, por ejemplo, el sulfato de calcio. El mineral yeso
(principalmente CaS04.2H20) se puede disolver colocando en un vaso la
muestra pulverizada y agitndola con un exceso de una suspensin acuosa de
una resina de intercambio catinico en forma hidrgeno; luego, filtrando la
suspensin por una columna corta que contenga una cantidad adicional de la
misma resina. La solucin final obtenida contiene todo el sulfato de la muestra
original y est exenta de iones calcio y otros iones metlicos. El sulfato se
puede determinar ahora por valoracin con perclorato de bario en isopropanol al
50 por ciento, a pH 2,5. empleando como indicador la sal disdica del acido 2-
hidroxi-3.6-disulfo-l-naftilazobenceno-arsnico. de nombre trivial torina.

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DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN INICA TOTAL

La solucin se pasa por una columna de un intercambiador de cationes, acido

fuerte, en su forma hidrgeno, el cual convierte todas las sales en sus
correspondientes cidos, que se valoran a continuacin con una base patrn.
Este mtodo sirve para determinar la concentracin de los aniones de los
cidos fuertes, no la de los dbiles, como el cido carbnico.

SEPARACIN DE METALES POR INTERCAMBIO AMNICO

DE SUS CLOROCOMPLEJOS
Este es verdaderamente un ejemplo de cromatografa de intercambio inico.
Parece paradjico que el modo ms efectivo de separar algunos metales, que
consideramos normalmente como formadores de cationes, sea precisamente
por medio de una resina intercambiadora de aniones. La causa reside en que
muchos iones metlicos, aunque no los alcalinos ni los alcalinotrreos, se
combinan con los iones cloruro formando complejos cargados negativamente.
Estos cloro-complejos difieren grandemente entre si con respecto a su
estabilidad, as como con respecto a la fuerza con que quedan retenidos en una
resina intercambiadora de aniones.
Se puede tomar el caso del cobalto como buen ejemplo, ya que sus iones son
coloreados y el color de las soluciones permite apreciar visualmente los
desplazamientos del equilibrio. En una solucin diluida de una sal de cobalto!II)
en agua, la principal especie inica es el catin hidratado, Co(H 20)62 +, que es de
color rosado. Si se agrega cido clorhdrico concentrado a esta solucin rosa, el
color cambia, pasando por varios tonos de prpura y azul. Cuando el cido
clorhdrico es 4 molar, la solucin es de un color azul violceo: a la
concentracin 6 molar el color es azul puro. Este cambio de color corresponde
al desplazamiento del equilibrio:
2+ - 2
Co(OH2)6 + 4Cl CoCl 4 + 6H2O
CATION ROSADO ANION AZUL

Los aniones son absorbidos por las resinas de intercambio aninico, los
cationes no lo son. Si adicionramos gradualmente cido clorhdrico a un
recipiente que contuviera una solucin diluida de cloruro de cobalto y algunas
esfrulas de una resina de intercambio aninico, veramos cmo el cobalto se
incorporora a la resina y la tie de azul cuando la concentracin de cido
clorhdrico llega a ser mayor de 4 molar. La razn de distribucin, D, que
expresa la tendencia del cobalto a penetrar en la resina, aumenta rpidamente
con la concentracin del cido clorhdrico a partir de un valor prximo a 3 molar
y alcanza un mximo cerca de 9 molar. Aumenta, lgicamente, al crecer la
proporcin de cobalto presente en la forma CoCl 42-. Por encima de 9 molar, el
valor de D disminuye algo porque el complejo est ya completamente
estabilizado y los iones cloruro adicionales compiten con los iones CoCl 42 - para
ocupar los puntos activos de la resina.
Esta tendencia est indicada en la Fig., en la que se representan los valores del
logaritmo de D en funcin de la concentracin molar del cido clorhdrico, en los
casos del zinc, del cobalto(II) y del hierro(III). Cada elemento tiene su propia
curva caracterstica. A partir del conocimiento de estas curvas resulta posible

14
idear mtodos para la separacin cromatogrfica de la mitad de los elementos
de la Tabla Peridica, empleando como fase estacionaria una resina
intercambiadora de aniones, bsica fuerte, y como fases mviles, sucesivas
soluciones de cido clorhdrico de diferentes concentraciones.

Fig. . Absorcin de metales a partir de soluciones en cido clorhdrico. D es la

razn de distribucin en mililitros por gramo.

Antes de discutir este experimento, es conveniente indicar los metales cuyos

iones no son absorbidos a partir de sus soluciones en cido clorhdrico,
cualquiera que sea la concentracin de ste. Estos metales son: los alcalinos,
los alcalinotrreos excepto el berilio, el aluminio, el itrio, el lantano y los
elementos de las tierras raras, el torio y el nquel. Excepto en el caso del nquel,
todos los iones de la lista precedente poseen la configuracin electrnica de
gas inerte y se coordinan slo dbilmente o no se coordinan, con los iones
cloruro. Presentan una dbil tendencia a formar enlaces covalentes.

SEPARACIN DE COMPUESTOS ORGNICOS POR INTERCAMBIO

INICO
Las aplicaciones del intercambio inico no se hallan limitadas a la qumica
inorgnica. Los compuestos orgnicos que forman iones, sean positivos o
negativos, se pueden separar por cromatografa de intercambio inico; las
impurezas inicas se pueden separar de los compuestos no inicos, y
viceversa; y en ciertas circunstancias, las resinas de intercambio inico pueden
actuar como absorbentes slidos o como disolventes de productos no inicos.
Un ejemplo de una separacin sencilla que se puede conseguir por intercambio
inico es la de un conocido producto farmacutico en tabletas contra el dolor de
cabeza, el cual contiene cafena, aspirina y fenacetina. La cafena es una base
dbil que en soluciones acidas forma un catin; la aspirina o cido
acetilsaliclico es un cido dbil, que en solucin bsica forma un anin:
finalmente, la fenacetina es una sustancia neutra que no da lugar a aniones ni a
cationes, aunque es absorbida por la accin disolvente de la resina. Las
frmulas son:

15
Un esquema para su separacin por intercambio inico puede ser el siguiente:
Cafena, aspirina, fenacetina

Cada uno de estos compuestos se puede determinar por medicin de su

absorcin en la regin ultravioleta del espectro Podra conseguirse una
separacin anloga por extraccin con disolventes.
Indudablemente, la aplicacin ms importante del intercambio inico al anlisis
de compuestos orgnicos reside en el anlisis de mezclas de aminocidos.
Estos constituyen los sillares de las protenas y son liberados de las mismas por
hidrlisis acida, calentndolas bajo presin con cido clorhdrico diluido. Las
protenas contienen cidos diferentes combinados en diferentes proporciones.
Todos estos cidos contienen el grupo:

En soluciones acidas este grupo se convierte en un catin por protonacin del

NH2: en soluciones bsicas forma un anin por prdida de un protn del
COOH.
En soluciones acidas, por lo tanto, los aminocidos se pueden fijar en resmas
de intercambio catinico. No obstante, son retenidos por fuerzas de diferente
magnitud, pues unos lo son fuertemente y otros lo son dbilmente, lo cual
permite conseguir su separacin por cromatografa. Se toma una columna larga
rellena de una resina de intercambio catinico en forma hidrgeno o en forma
amnica y se introduce en su parte superior una pequea cantidad de la mezcla
de aminocidos. A continuacin se podra proceder a la separacin de los
cidos pasando cido clorhdrico diluido o una solucin de cloruro de amonio:
los aminocidos absorbidos ms dbilmente se desplazaran ms rpidamente,
los absorbidos ms fuertemente lo haran con ms lentitud. En la prctica, no
obstante, se utilizan soluciones reguladoras de cido ctrico con citrato de sodio
o citrato de amonio, y se emplea la tcnica llamada de elucin con gradiente.
Se empieza con una solucin tampn de pH bajo, por ejemplo 3,0 o menor. A
este pH casi todos los aminocidos forman cationes y son absorbidos fuerte-
mente. Slo aquellos cidos absorbidos ms dbilmente avanzan a una
velocidad apreciable; stos son los aminocidos en los que el carcter cido
supera al carcter bsico, por ejemplo, el cido asprtico HOOC CH,-
CHNH2-COOH y el cido glutmco HOOC-CH2 -CH2-CHNH2-COOH, que

16
poseen dos grupos COOH y slo uno NH 2. Despus de que estos han sido
eluidos de la columna, se aumenta el pH de la fase mvil adicionando
cuidadosamente hidrxido de sodio o citrato de sodio (siendo esto ltimo lo
recomendable). En la tcnica de elucin con gradiente, el citrato de sodio es
adicionado de modo continuo al recipiente que contiene el eluyente de modo
que el pH de la solucin crece uniformemente a medida que va pasando lquido.
De esta forma, se puede regular el avance de los diversos aminocidos a lo
largo de la columna para que emerjan uno tras otro a intervalos ms o menos
regulares. En los estadios intermedios de la elucin salen los aminocidos
neutros que contienen un COOH y un NH 2 tales como la glicina CH2NH2-
COOH, la alanina, CH3CHNH2-COOH' y la tirosina HO-C6H4-CH2 CHNH2
-COOH. Los ltimos en emerger son los cidos que poseen dos grupos bsicos
y slo un grupo cido, por ejemplo, la usina H 2N-CH2CH2CH2CHNH2-COH y la
arginina HN = C(NH2)NHCH2-CH2CH2CHNH-COOH.
Los aminocidos se detectan de modo continuo y automtico a medida que
salen de la columna. Una forma corriente de llevar a cabo esta deteccin
consiste en mezclar la solucin saliente con el reactivo ninhidrina y medir
absorciomtricamente los productos rojos que se forman.
Un problema bastante parecido al del anlisis de los aminocidos y que posee
una importancia similar, es el del anlisis de los productos de hidrlisis de los
cidos nucleicos, en particular del cido desoxirribonucleico, o ADN. Estos
productos son de una gran variedad y su complejidad abarca desde la de las
cuatro bases, adenina, guanina, timina y citocina, a la de los nuclesidos
(combinaciones base-azcar) y os nucletidos (combinaciones base-azcar-
fosfato). Tambin para analizar estas mezclas se ha utilizado la cromatografa
de intercambio inico, tanto el catinico como el aninico.
El anlisis de las mezclas de cidos carboxlicos tiene una cierta importancia en
bioqumica vegetal y en el examen de los zumos de fruta. En las frutas se
encuentran cidos tales como oxlico, lctico, tartrico, mlico. ctrico, malni-
co y muchos ms. Pueden separarse cromatogrficamente en columnas de
resinas de intercambio aninico, empleando una solucin de nitrato de sodio
como fase mvil.

17
 II. CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL

La cromatografa de filtracin en gel es una tcnica que permite separar

molculas en funcin de su tamao molecular. La capacidad separadora reside
fundamentalmente en el gel cuya matriz consta de un gran nmero de esferas
porosas microscpicas. Cada gel se caracteriza por un rango de
fraccionamiento que depende del tamao de sus poros. El objetivo de esta
prctica es separar una mezcla de sustancias de distinto peso molecular por
medio de una cromatografa en una columna de Sephacryl S-200 HR y
determinar los correspondientes parmetros que caracterizan el
comportamiento cromatogrfico de cada sustancia.
1
La purificacin de una sustancia de inters se hace siguiendo los criterios de
separacin basados en alguna propiedad fsica o qumica que diferencia al
compuesto en cuestin de otros que en principio estaran ligados a l.

Entre los diversos criterios de separacin cabe citar:

Aquellos que fraccionan las molculas basndose en sus tamaos, como

la cromatografa de filtracin en gel y la ultracentrifugacin.
Los que separan las molculas atendiendo a las diferencias en la carga
elctrica neta del compuesto, como la cromatografa de intercambio
inico y la electroforesis.
Los que se basan en la retencin especfica de slo uno o varios tipos de
molculas, entre los que cabe destacar la cromatografa de afinidad.
Procedimientos de separacin basados en diferencias de solubilidad.
Mtodos basados en la adsorcin diferencial a determinadas matrices.

La cromatografa de filtracin en gel, ms corrientemente llamada de

exclusin molecular, es una tcnica de purificacin muy extendida y
apreciada debido a su sencillez y eficacia en la resolucin de mezclas
complejas de macromolculas. Esta tcnica puede utilizarse con buenos
resultados con fines analticos (por ejemplo, para la determinacin de pesos
moleculares).

PROPIEDAD: Tamao (y forma)

SOPORTE Resina de micropartculas esfricas formadas por polmeros
hidroflicos (dextrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla de ellos).

Tamaos de poro intervalo o rango de fraccionamiento.

P.e. Sephadex G25: 1000 5000 Da

Sephadex G200: 5000 250000 Da

F. ESTACIONARIA (LQUIDA) solvente acuoso (el mismo que el de la

fase mvil) que se encuentra dentro de micropartculas.

F. MVIL (LQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna por los

espacios intersticiales (entre las micropartculas).

18
PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL

Con la cromatografa de filtracin en gel se separan molculas en virtud de

sus diferencias de tamao. La capacidad separadora reside en el gel cuya
matriz consta de un gran nmero de esferas porosas microscpicas. Estas
esferas estn constituidas por largas cadenas de polmeros unidas entre si por
enlaces qumicos para formar una red tridimensional.

El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca

de vidrio quedando listo para su uso. Inmediatamente se deja en contacto con
la muestra lquida que baa la superficie del gel depositado a manera de un
filtro poroso que retiene un espacio muerto ocupado por relleno inerte , esto
permite la salida de la muestra fraccionada.

En el interior de una columna de cromatografa pueden distinguirse varios

volmenes:
El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel
hidratado.

19
 El volumen de vaco (Vo), o el volumen existente entre las esferas del
gel.
El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la
diferencia entre los dos volmenes anteriores: Vt-Vo.

Cuando una mezcla de molculas de diferentes tamaos se hace pasar a

travs de la columna de gel, se produce la separacin en virtud del siguiente
principio: Las molculas de muy pequeo tamao penetran en el interior de las
esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extradas de la
columna hasta que no ha pasado a travs de ella un volumen de lquido igual a
su volumen total (Vt). Sin embargo, aquellas molculas cuyo tamao es mayor
que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y
atraviesan la columna recorriendo nicamente el volumen vaco (Vo), siendo las
primeras en salir de la columna. El resto de las molculas, de tamao
intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de
las esferas en funcin de su tamao, siendo extradas fraccionadamente con
volmenes que estn comprendidos entre el Vt y el Vo.
Cuanto mayor es una molcula, menos capacidad tiene para acceder al interior
de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de lquido que se
requiere para extraerla de la columna.
Teniendo en cuenta que para las protenas globulares el tamao est, en
general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografa separa
las sustancias en funcin de dichos pesos moleculares, obtenindose primero
las ms pesadas.

20
GRADOS DE LOS GELES

Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del

tamao de sus poros. ste viene expresado por dos nmeros que representan
pesos moleculares, correspondiendo el menor de ellos al peso molecular
mximo de una sustancia que difunda perfectamente a travs de todos los
poros del gel, y el mayor, al peso molecular mnimo que ha de tener una
sustancia para que pueda ser excluida de las esferas del gel.
Las sustancias de peso molecular fuera de dicho rango no son fraccionadas
sino que se extraen conjuntamente con el volumen vaco (Vo), las de peso
molecular mayor que el rango, o con el volumen total (Vt), las ms pequeas
que dicho rango.

En el mercado se encuentran geles con rangos de fraccionamiento muy

diversos (desde 1.000-5.000, hasta 10.000-4.000.000), lo que posibilita la
separacin a diferentes escalas de pesos moleculares.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA SEPARACIN

Adems de la diferencia intrnseca de tamao existente entre las molculas

que van a ser cromatografiadas, hay diferentes factores que influyen en una
correcta separacin de las mismas:

Longitud de la columna. La capacidad de separacin de sustancias de

diferente tamao aumenta con la longitud de la columna.
Flujo. La resolucin de la separacin disminuye al aumentar el flujo del
lquido con que son arrastradas las molculas a lo largo de la columna.
Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1.
El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeo
comparado con el volumen total de la columna. Las mejores
separaciones se obtienen aplicando volmenes de muestra iguales o
menores al 5% del volumen total.
Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del
gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no
est empaquetado homogneamente en la columna o se encuentra
excesivamente comprimido.

21
CARACTERIZACIN DEL COMPORTAMIENTO CROMATOGRFICO DE UN
SOLUTO

Los resultados de la cromatografa de filtracin en gel se expresan

habitualmente en forma de grficas (cromatogramas) donde se representa la
cantidad de solutos en funcin del volumen de lquido extrado de la columna
(Fig. 3)

Se pueden utilizar varios parmetros para caracterizar el comportamiento

cromatogrfico de una sustancia:
Volumen de elucin (Ve). Se define como el volumen de lquido
necesario para extraer una determinada sustancia. Presenta el
inconveniente de depender fuertemente del volumen total de la columna.
El volumen de elucin (Ve) de una sustancia vara entre Vt y Vo.
Coeficiente de distribucin (Kav). Es el parmetro ms correcto y
tambin el ms ampliamente utilizado. El Kav de una sustancia se define
como:

Kav = Ve-Vo/Vt-Vo

El valor de Kav oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y

representa la fraccin de volumen del interior de las esferas a la que accede
cada sustancia en virtud de su tamao.
Adems, el coeficiente de distribucin est relacionado con el logaritmo del
peso molecular de un soluto, a partir de su Kav, cromatografiando por filtracin
varios patrones de peso molecular conocido.

22
 III. CROMATOGRAFA DE GASES.

La cromatografa de de gases es una tcnica cromatografa en la que se

muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatografa.

La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia
de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las
molculas de del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs
de la columna.
Existen dos tipos de Cromatografa de Gases (GC):
A. Cromatografa gas-slido (GSC)

B. Cromatografa Gas Lquido (GLC)

Siendo sta ltima la que se utiliza ms ampliamente y que se pude llamar

simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC, La fase estacionaria es
slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de
absorcin. Precisamente este proceso de absorcin, que no es lineal, es el que
ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que
la retencin de analito sobre la superficie es semipermanente y so obtiene picos
en elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies
gaseosas de bajo peso molecular.

CROMATOGRAFIA DE GAS LIQUIDA (GLC GC.)

La GLC, utiliza como fase estacionaria molculas de lquido

inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte.
La GC se lleva acabo en un cromatgrafo de gases. Este consta de
diversos componentes como el gas portador, el sistema d inyeccin de muestra,
la columna (generalmente dentro de un horno) y el detector.

23
TABLA DE CONTENIDOS
Gas portador

Sistema de inyeccin de la muestra

Columna y sistemas de control de temperatura

Detectores

Columnas y tipos de fases estacionarias

Aplicaciones

Referencias.

GAS PORTADOR
El gas portador debe ser un inerte, para prevenir una reaccin con el analito o
la columna. Generalmente se emplean como helio, argn, nitrgeno, hidrgeno,
dixido de carbono y la eleccin de este gas en ocasiones depende del tipo de
detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o
empleando un generador, especialmente en el caso del nitrgeno y del
hidrgeno. Luego tenemos un sistema de manmetros y regladores de flujo
para garantizar un flujo estable y un sistema de des hidrogenacin del gas,
como puede ser un tamiz molecular.

24
 Generalmente la regulacin de la presin se hace a dos niveles: Un
primer manmetro se sita a la salida de la bala o generador del gas y el otro
a la entrada del cromatgrafo, donde se regula el flujo. Las presiones de
entrada entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en
columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min en columnas capilares. Para
comprobar el caudal se puede utilizar un rotmetro o un simple medidor de
pompas de jabn, el cual da una mediada muy exacta al caudal volumtrico que
entra a la columna.

SISTEMA DE INYECCION DE MUESTRA

La inyeccin de muestra es un aparato crtico, ya que se debe inyectar

una cantidad adecuada y debe introducirse de tal forma (tapn de vapor) que
sea rpida para evitar el ensanchamiento de la bandas de salida; este efecto
se ha dado con cantidades elevadas de analito. El mtodo ms utilizado
emplea una micro jeringa (de capacidades de varios micro litros) para introducir
el analito en una cmara de vaporizacin instantnea. Esta cmara est 50 oC
por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil y est sellada
por una junta de goma de silicona septo o septum.

Si es necesario una reproductividad del tamao de muestra inyectado se

puede usar una vlvula de inyeccin, donde la cantidad a inyectar es constante
y determinada por el tamao del bucle de dicha vlvula.
Si la columna empleada en ordinaria, el volumen a inyectar ser de unos
20 L y el caso de las columnas capilares de dicha cantidad es menor de 10 -3
L. Para obtener estas cantidades, se utiliza un divisor de flujo a la entrada de
la columna que desecha parte del analito introducido.

25
 En caso de muestras slidas, simplemente se introducen en forma de
disolucin, ya que en la cmara de vaporizacin instantnea el disolvente se
pierde en la corriente de purga y no interfiere en la elucin.
Segn las curvas de Van Demter (HEPT vs. Velocidad lineal), el mejor
gas a usar en la columna cromatogrfica como portador de los analitos es el
hidrgeno, sin embargo, dada su peligrosidad, es ms usando como gas de
encendido en el detector FID, junto con el aire.

COLUMNAS Y SITEMAS DE CONTROL DE TEMPERATURA

En GC se emplea dos tipos de columnas: Las empaquetaduras o de

relleno y las tubulares abierta o capilares. Estas ltimas son ms comunes
en la actualidad debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de onda de
estas columnas es variable, de 2 a 50 metros, y estn construidas en acero
inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. Debido a su longitud ya la necesidad
de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma
helicoidal con dimetros de 1 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.
La temperatura s una variable muy importante, ya que de ella a
depender el grado de separacin de los diferentes analitos. Para ello, debe
ajustarse con una precisin de dcimas de grado. Dicha temperatura depende
del punto de ebullicin del analito o analitos y por lo general se ajustan a un
valor igual o ligeramente superior a l. Para estos valores, el tiempo de elucin
va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con
diferentes puntos de elucin, se ajusta la llamada Rampa de temperatura, con
lo cual sta va aumentando ya sea en forma continua los etapas. En muchas
ocasiones, el ajustar correctamente la rampa pude significar separar bien o no
los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la
elucin ya que aunque a mayor temperatura la elucin es ms rpida, se corre
el riesgo de descomponer el analito.

DETECTORES
El detector es la parte del cromatgrafo que se encarga de determinar cundo
ha sido salido el analito por el final de la columna. Las caractersticas de un
detector ideal son:
Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisin cuando
sale el analito y cundo sale slo el gas portador. Tienen sensibilidades
entre 10-8 y 10-15 g/s de analito

Respuesta lineal al analito: Con rango de varios rdenes de magnitud

Tiempo de respuesta corto: Independiente del caudal de salida.

Intervalo de temperatura de trabajo amplio: Por ejm desde

temperatura de ambiente hasta 350-400oC, temperaturas tpicas trabajo.

No debe destruir la muestra

Estabilidad y reproducibilidad: Es decir, a cantidades iguales de

analito debe dar salida de seal igual.

26
 Alta fiabilidad y de manejo sencillo: A prueba de operadores
inexpertos

Respuesta semejante para todos los analitos

Respuesta selectiva y altamente predecible: Para un reducido nmero

de analitos.

Algunos Tipos de Detectores:

Detector de ionizacin de llama (FID, Flame Ionization Detector).

Detector de conductividad trmica (TCD, termical Conductivity Detector)

Detector Termoinico (TID, Thermonic Detector)

Detector de Captura de Electrones ECD, Electrn-Capture Detector).

Detector de emisin atmica (AED. Atomic Emisin Detector).

Otros detectores minoritarios son el Detector de Fotmetro de llama (PFD),,

empleado en computo como pesticidas e hidrocarburos que contengan fsforo o
azufre. En este detector se hace pasar el gas eludo por una llama
hidrgeno/oxgeno donde parte del fsforo se convierte en una especie HPO, la
cual a 510 y 526 nm, y simultneamente el azufre se convierte en S 2 , con
emisin a 394 nm. Dicha radiacin emitida se detecta con un fotmetro
adecuado. Se han podido detectar otros elementos, como algunos halgenos;
nitrgeno extrao; germanio y otros.
En el detector de fotoionizacin (PID), el gas eluido al final de la columna se
somete a una radiacin ultravioleta con energas entre 8.3 y 11,7 eV,
correspondiente a una a una 106-149 nm. Mediante la aplicacin de un
potencial a la celda de ionizacin se genera una corriente de de iones, la cual
es amplificada y registrada.

COLUMNAS Y TIPOS DE FASES ESTACINARIAS

Columnas de relleno
Las columna de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio,
metal (inerte a ser posible como el acero inoxidable, Nquel, cobre o aluminio) o
tefln, de longitud de 2 a 3 metros y un dimetro interno e unos pocos
milmetros, tpicamente de 2 a 4. El interior se rellena con un material slido,
dividido para tener una mxima superficie de interaccin y recubierto con una
capa e espesores entre 50 nm y 1m. Para que puedan introducirse en el
horno, se enrollan convenientemente.
El material de relleno ideal consiste en pequeas partculas, esfricas y
uniformes, con una buena resistencia mecnica, para tener una mxima
superficie donde interaccionara la se estacionaria y el analito. La superficie
especifica mnima ha de ser de 1 m2/seg.
Como todos los componentes de la columna para GC, debe ser inerte a
las altas temperaturas (-400 oC y humectantes uniformemente con la fase lquida
estacionaria durante el proceso de fabricacin. El material referido
actualmente (2005) es la tierra de diatomeas natural, debido a su tamao de

27
poro natural. Estas especies, ya extinguidas utilizaban un sistema de difusin
molecular para tomar nutrientes del medio y expresar sus residuos. Por tanto,
debido a que el sistema de adsorcin superficial del analito y la fase
estacionaria es parecido, son materiales especialmente tiles.
El tamao es crtico a la hora de darse el proceso de interaccin el
analito y a menores tamaos la eficacia de la columna es mejor. Pero existe el
problema de la presin necesaria para hacer circular un caudal estable de gas
portador por la columna, ya que dicha presin es inversamente proporcional al
cuadrado del dimetro de dichas partculas. As el tamao mnimo ara usar
presiones mximas de 50 psi es de 250 a149m.

COLUMNAS CAPILARES

Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: Las de pared

recubierta (WCOT) y las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son
simplemente los tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con
una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte
interna una fina capa de material absorbente como el empleado en las
columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se ha adherido la fase
estacionaria. Las ventajas de las SCOT frete a las WCOT es la mayor
capacidad de caga de sta ltima, ya que en su fabricacin se emplean
mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio
mayor. Po orden de eficacia, en primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y
por ltimo las columnas de relleno.
Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundido, conocidas
como: Columnas tubulares abiertas de slice fundido o FSOT. Estas columnas
fabrican a partir de slice especialmente pura, sin apenas contenido de xidos
metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso
de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la
columna pude enrollarse con un dimetro de unos pocos cm. Estas columnas,
con propiedades con baja reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han
sustituido a las WCOT clsicas.
Las columnas FOST tienen dimetros internos variables, entre 250 y
320m (para columnas normales) t de 150-200m para columnas de alta
resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms
sensible, al elur menor cantidad de gas. Existen as mismo columnas macro
capilares con dimetros de hasta 530 m, que admiten cantidades de analito
comparables a las de relleno pero con mejores prestaciones.
En estas columnas existen un problema debido a la adsorcin del analito
sobre la superficie de la slice fundida, adsorcin debida a la presencia de
grupos silanol /Si-OH), los cuales interacciona frecuentemente con molculas
polares orgnicas. Este inconveniente se suelo solventar inactivando la
superficie por sililacin con dimetilclorosilano (DCS). La adsorcin debida a los
xidos metlicos se v paliada en gran pate por la elevada pureza de a slice
empleada.

28
FASE ESTACIONARIA

Las propiedades necesarias para una fase estacionaria lquida

inmovilizada son:

Caractersticas de reparto (factor de capacidad k' y factor de selectividad

) adecuado al analito.

Baja volatilidad, el punto de ebullicin de la fase estacionaria debe ser al

menos 100oC mayor que la mxima temperatura alcanzada en el horno.

Baja reactividad

Estabilidad trmica, ara evitar su descomposicin durante la elucin.

Existen como mucho una docena de disolvente con estas caractersticas.

Para elegir uno, debe tenerse en cuenta la propiedad del analito, ya que a
mayor polaridad del analito, mayor polaridad deber tener la fase estacionaria.
Algunas fases estacionarias utilizadas actualmente son:
Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos
aromticos, polinucleares, drogas, esteroides y PCBs.

Poli (fenilmetildifenil) siloxano (10% fenilo), para esteres metlicos de

cidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados.

Poli (fenilmetil)siloxano (50%fenido), para drogas, esteroides, pesticidas

y glicoles.

Poli(trifluoropropildimetil) siloxano, para aromticos clorados, nitro

aromticos, bencenos alquilsustituidos.

Poli etilenglicol, sirve para compuestos polares, tambin para

compuestos como glicoles, alcoholes, teres, aceites esenciales.

Poli (dicianoalildimetil) siloxano, para cidos grasos poli insaturados,

cidos libres y alcoholes.

Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta

enlazada y entrecruzada para impedir su prdida durante las operaciones de
elucin o lavado .De esta forma se obtiene una mono capa adherida
qumicamente a la superficie de la columna. La reaccin implicada suele ser la
adicin de un perxido al lquida a fijar, inicindose una reaccin por radicales
libres que tiene como resultado la formacin de un enlace carbono-carbono que
adems incrementa su estabilidad trmica. Otra forma es la radiacin con rayos
gamma.
Otro tipo de fase estacionaria son los quirales, lo cual permite resolver
mezclas enantiomricas. Este tipo de fase suelen ser aminocidos quirales o
algn derivado adaptado al trabajo en columna.
El grosor de la pelcula varia entre 0,1y 5 m; el grosor depende de la
volatilidad del analito. Asimismo muy voltil requerir una capa gruesa para

29
aumentar el tiempo de interaccin y separar efectivamente los diferentes
componentes de la mezcla. Para columnas tpicas (dimetros internos de 0.25 o
0.32 mm) se emplean grosores de 0.25 m, y en las columnas macro capilares
el grosor sube hasta 1 m. el grosor mximo suele ser de 8m.

APLICACIONES

La GC tiene dos importantes campos de aplicacin. Por una parte su capacidad

para:
Separar mezclar orgnicas complejas

Compuestos organometlicos

y sistemas bioqumicos.

Su otra aplicacin es como mtodo para determinar cuantitativa y

cualitativamente los componentes de la muestra.
Para el anlisis cualitativo se suele emplear el tiempo de retencin; que
es nico para cada compuesto dada unas determinadas condiciones (mismo
gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de retencin. En
aplicaciones cuantitativas; integrando las reas de cada compuesto o midiendo
su altura; con los calibrados adecuados; se obtiene la concentracin o cantidad
presente de cada analito.

ESPECTROMETRIA DE MASAS DE MEZCLAS

La tcnica combinada de cromatografa de gases y espectrometra de

masas permite realizar anlisis rutinarios de mezcla de compuestos como las
mezclas que se obtienen en la reacciones o Las muestras que se recogen en el
medio ambiente la figura 12-17 muestra un diagrama simplificado de CG-EM.
El cromatografa de gases utiliza una columna capilar incluida en un horno
termostatizado. Esta columna est revestida en su interior con gel de slice /u
otra fase estacionaria), cuya diferente interaccin con la sustancia de las
mezclas permiten separar los componentes de la misma. Se inyecta una
pequea cantidad de muestra (10-6 gr. suele ser suficiente) en un inyector
calentado que permite la volatilizacin de la muestra. Los componentes
voltiles son empujados, entonces, a lo largo de la columna capilar por una
corriente de helio. A medida que la muestra pasa a travs de la columna, los
componentes ms voltiles(o bien que interaccionan menos con la fase
estacionaria) se mueven ms rpidamente a travs de la columna que los
componentes menos voltiles. Los componentes, separados, abandonan la
columna a tiempos diferentes, pasando mediante un conducto de transferencia
a la fuente de iones del espectrmetro de masas, donde las molculas se
ionizan y se fragmentan.
La mayora de los sistemas acoplados, cromatgrafo de gases-
espectrometra de masas, utilizan un cudruplo como sistema de filtrado o
discriminacin de masas, para separar los iones. A alto vaco, los iones pasan
por el espacio entre cuatro barras, las cuales estn sometidas a voltajes
variables (en la fig. 12-17 estn representado dos de los cuatro rodillos). Los
campos elctricos variables hacen que los iones sigan rbitas complejas y

30
que, en cada instante slo fragmentos como una masa concretas lleguen al
detector variando o haciendo un barrido de voltaje, se pueden medir un amplio
intervalo de masas en menos de 1 seg. De esta forma e pueden realizar
muchos espectros de masas, que se almacena en el computador a medida
que los componentes de la muestra pasan desde la columna del cromatgafo
al espectrmetro de masas. Esta poderosa combinacin CG.EM permite que el
coromatgrafo de gases separe los componentes de la mezcla y que
posteriormente sean identificados por su espectro de masas.

IV. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

Introduccin

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme,

de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los
requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo
que mantenga las placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de
adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es
preciso tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa
para activarlas.

La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase

estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos
polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen
con mayor velocidad sern los menos polares.

Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehdo

aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas

Ventajas de la cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros

mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el
utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las
separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor. Pueden
usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El
mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace
que sea un mtodo adecuado para fines analticos.

Adsorbentes

Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las

partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su
adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un adherente (yeso,...).
Algunos de los adsorventes ms utilizados son:

31
 Celulosa
Almidn
Azucares
Gel de slice (silicagel)
xido de aluminio (almina)
Carbn activo (carbn en polvo)
Kieselguhr

Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de

plantas y animales.

Silicagel

El gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, es dbilmente

cido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deber utilizar con sustancias
que se corrompan con los cidos. Los geles de slice normales suelen contener
impurezas de hierro y/o aluminio, este factor tambin se debe tener en cuentas
respecto al uso de componentes. El tamao del grano suele ser de 10 a 40
micras () y el tamao de poro vara de 20 a 150.

Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de

clcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. Tambin han
sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados
(amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de slice.

Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para
neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar
componentes lipfilos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles,
etc). A este proceso se le denomina cromatografa de fase reversa (silanizado).

Almina

La almina u xido de aluminio es un adsorbente ligeramente bsico debido a

que en el proceso de extraccin de la almina a partir de la bauxita quedan
algunas molculas de hidrxido de aluminio adheridas a la almina, dndole a
sta un carcter bsico. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia
depositada como el gel de slice.

La almina puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas cidas,

bsicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas.
Es un adsorbente de carcter polar, de tal forma que retendr con mayor avidez
a los componentes polares.

Preparacin de placas.

El adsorvente se desle en agua destilada. Para mezclar la papilla

homogneamente es preferible agitar de modo mecnico. La proporcin de
adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos parte de agua y una de
adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante, habrn de
consultarse la instrucciones del fabricante.

32
Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, lminas de vidrio,
pero en la actualidad tambin se utilizan lminas de otros compuestos
orgnicos ms flexibles. Dependiendo del tipo de separacin que se desee
(cualitativa o preparativa) se utilizar un tamao de placa u otro. En general
para realizar una separacin preparativa de un gramo de muestra es necesario
una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua
destilada.

Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adicin

de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH
deseado. En la preparacin de las placas tambin se pueden adicionar
indicadores fluorescentes o aglomerantes.

Cabe destacar la adicin de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le

denomina argentacin, y se utiliza para separar componentes insaturados.

El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en

general suele ser de:

0.1-0.2 mm. para separaciones analticas.

0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.

La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectaran al

desarrollo del proceso cromatogrfico. Para ello existen en el mercado
extensores que se utilizan para crear de forma mecnica placas homogneas
del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el proceso a seguir es el
siguiente:

1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.

2. Agitar enrgicamente.
3. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
4. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
5. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.

Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo despus

de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metlicas. En este momento puede
activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a
temperatura ambiente, bien calentndolas durante 30-60 minutos a 105-110 C
(las placas de celulosa no deben calentarse ms de 10 minutos a 105 C) para
expulsar as el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire,
para evitar los agrietamientos que se produciran por efecto del cambio de
temperatura.

Aplicacin de las muestras

Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un disolvente

orgnico no polar que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para
que se evapore despus de la aplicacin.. Sin embargo a menudo se necesitan
disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva.

33
Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l
resulta en la carga 20 g de producto slido. Muchos reactivos de revelado
llegan a detectar 0.1 g de material; por esto con esta carga puede llegarse a
observar un 5% de impurezas.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el

proceso de siembra de la muestra a analizar. Tambin pueden usarse tubos
capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar
(micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al
borde inferior de un centmetro aproximadamente. El punto de aplicacin de la
muestra se denomina toque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma
que en la placa solo quedar la muestra a analizar.

Eleccin del eluyente

La eleccin del eluyente depender lgicamente del componente que se va a

separar y del material en que la separacin se lleva a cabo.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

Eter de petrleo.
Eter dietlico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
cido actico.

*compuestos cancergenos.

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la

polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

34
a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.

c) Aplicando un eluyente ms polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la

misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta dar con el ms
apropiado.

Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias
muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos
eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada
eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el
cual la separacin se realiza de una manera ms eficaz.

Desarrollo de la cromatografa

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el

mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa
casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La cromatografa se realiza en
una cubeta. Para conseguir la mxima saturacin posible de la atmsfera de la
cmara, las paredes se tapizan con papel impregnado del eluyente. A veces
pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes,
cosa que no debe olvidarse.

Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del

desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo,
por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografa
cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una
cromatografa preparativa puede llegar a un par de horas.

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se

alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace
para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10
cm.; parece ser la ms conveniente para medir valores de RF. Despus del
desarrollo, las placas pueden secarse rpidamente con una corriente de aire
caliente.

35
La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el
origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se
desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe
llegar a tocar el borde de la placa.

Si la placa se estropea por accin del aire o de la luz, se secar en una cmara
que contenga un gas inerte o aislada de la luz.

Localizacin de sustancias

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la

posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:

Mtodos qumicos.
Mtodos fsicos.

Mtodos qumicos

Consisten en realizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los

componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos
reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o
mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.

Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el reactivo

revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber realizarse en
una vitrina de gases bien ventilada.

La pulverizacin se realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina no

puede realizarse el baado del cromatograma (en cromatografa en papel s).

Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos

coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero
las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las
manchas aparecidas.

Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona

con los componentes orgnicos produciendo manchas negras.

El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente

separado.

Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:

2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).

36
 Ninhidrina (para aminocidos).

Mtodos fsicos.

El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De

tal forma que al colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo
del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las
zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa
fluorescente excepto donde hay componentes.

Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo

que pueden ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.

Constantes Rf Y Rx

La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la

posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la
retencin de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro

de la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los
RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de
la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El mximo valor de
RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la

misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se
calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no
se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los
compuestos pueden ser iguales o no serlo.

Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la

misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar
una separacin mnima. En este caso no se pueden usar reveladores qumicos,
ya que alteraran los compuestos, sino indIcador ultravioleta.

Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto

(X), que tenga una posicin de desarrollo conveniente; todos los dems
compuestos sobre la placa se relacionan con ste. De esta manera se tiene el ,
RX , ya que:

37
 V. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

Se realiza generalmente en columna (tambin es posible en capa fina), que se

rellena de un adsorbente adecuado. El sistema es baado por un solvente que
fluye a travs de la columna para comprobar el funcionamiento de la misma.
Por la parte superior se introduce la sustancia a separar disuelta
adecuadamente. Se deja fluir por la columna. Antes de que sta quede
totalmente seca se incorporan los disolventes de acuerdo con la solubilidad de
las sustancias, sufriendo durante su arrastre interacciones de polaridad con el
slido adsorbente. Los eluatos son recogidos para su determinacin posterior,
normalmente por un mtodo espectroscpico (espectrofotometra,
espectrofluorimetra). Las separaciones se basan en las diferencias de
distribucin de los solutos entre el adsorbente (fase estacionaria) y el disolvente
(fase mvil) de acuerdo con sus respectivas isotermas de adsorcin.
Los adsorbentes ms utilizados, ordenados de mayor a menor actividad son:
1 Almina
2 Slice
3 Carbonato clcico

Este tipo de cromatografa se utiliza en el laboratorio clnico para la separacin

de 17-cetoteroides, 17-hidroxicorticoides, catecolaminas y otras sustancias
urinarias.

Dentro de esta tcnica pueden diferenciarse dos tipos de cromatografas de

adsorcin denominadas cromatografa cromatografa de columna y de capa fina
(abreviada TLC, del ingls Thin Layer Chromatography).
Para la tcnica de cromatografa de adsorcin en columna se emplean
columnas verticales de vidrio cerrada en su parte inferior con una llave que
permita la regulacin del flujo de la fase mvil. Las columnas se rellenan con un
adsorbente, como almina o gel de slice (fase estacionaria), mojado con el
disolvente que se vaya a emplear en

38
el proceso cromatogrfico. En la parte superior de la columna se pone la
disolucin de la mezcla a separar y a continuacin un depsito que contenga el
eluyente (fase mvil) que se va a utilizar en la separacin. Se abre la llave
inferior de manera que el eluyente comience a bajar por la columna. En este
proceso, los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria
con diferente intensidad, de manera que el proceso de adsorcin-desorcin
hace que unos componentes avancen ms rpidamente que otros. El lquido
que sale por la parte inferior de la columna se recoge de manera fraccionada. Si
los componentes de la mezcla avanzan a muy diferente velocidad se podrn
obtener fracciones cromatogrficas constituidas por un solo componente.

SOLVENTES PARA LA CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

39
 BIBLIOGRAFIA

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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21)http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_capa_fina

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