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Protocole : 1U-CYSDV Protocole : 1U-CYSDV

Prparation des chantillons :


PROTOCOLE Broyer 1g d'chantillon dans 4 mL de tampon de broyage (tampon CYSDV, voir les recommandations
pour plus de dtails). Dans certains cas, le ratio Echantillon/Tampon d'extraction peut tre rduit
dans le but d'obtenir un meilleur signal si le matriel vgtal est faiblement infect.
TEST DAS-ELISA Rhydrater les ventuels tmoins lyophiliss selon les indications mentionnes sur l'tiquette (voir
leur fiche technique).
En suivant votre plan de plaque, dposer avec prcaution 100 l de chacun de vos chantillons et
1. PRINCIPE DU TEST de vos contrles positif et ngatif et 100 L de tampon d'extraction dans vos puits contrles "tampon
d'extraction"/Blanc.
Ce test DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) est une
mthode immunochimique qui met en uvre successivement deux anticorps pour dtecter des
Incuber la plaque 16 heures (toute la nuit) +4C *
( )

antignes. Dans un premier temps, des anticorps sont dposs et se lient la surface dune
Lavage des plaques:
plaque de microtitration ; ils permettent la capture des antignes recherchs. La prsence des
Laver 5 fois comme prcdemment.
antignes dans lchantillon analys est alors dtecte grce des anticorps secondaires
spcifiques coupls la phosphatase alcaline. Au final, laddition du substrat de lenzyme
(pNPP) provoque lapparition dun produit jaune qui absorbe 405 nm, rvlant la prsence ETAPE DE DEPOT DE L'ANTICORPS CONJUGUE code couleur : rouge
ventuelle des antignes.
Prparation des tampons :
Avant l'ouverture des tubes d'anticorps (coating et conjugu), merci de les Prparer le volume de tampon conjugu 1X ncessaire pour le test. Vous aurez besoin de 100 L
de tampon conjugu par puits de votre plaque ELISA.
centrifuger afin de runir tout le volume au fond des tubes. La composition des tampons est fournie page 4.
Le tampon conjugu SEDIAG (ref: CONJ-Buf) doit tre dilu sa concentration finale d'utilisation
2. PROTOCOLE (1X) avec de l'eau osmose ou distille.

Prparation de l'anticorps Conjugu :


ETAPE DE COATING code couleur : bleu
Diluer l'anticorps conjugu dans le tampon conjugu 1X la dilution requise sur ltiquette des
ractifs et galement mentionne sur la fiche technique. Homogniser.
Prparation des tampons : Dposer 100 l par puits.
Prparer le volume de tampon coating 1X ncessaire pour le test. Vous aurez besoin de 100 L de
tampon coating par puits de votre plaque ELISA (voir les recommandations pour un exemple de Incuber la plaque 2 heures +37C *
( )

dilution).
La composition des tampons est fournie page 4. Lavage des plaques:
Le tampon coating SEDIAG (ref: COAT-Buf) doit tre dilu sa concentration finale d'utilisation Laver 3 fois comme prcdemment.
(1X) avec de l'eau osmose ou distille.
Note : Toujours prparer l'anticorps conjugu 10 minutes avant utilisation.
Prparation de l'anticorps de Coating :
Diluer l'anticorps de coating dans le tampon coating 1X la dilution requise sur ltiquette des ETAPE DE DEPOT DU SUBSTRAT
ractifs et galement mentionne sur la fiche technique. Homogniser.
Dposer 100 l par puits. Prparation des tampons :
Incuber la plaque 2 heures +37C *
( ) Prparer le volume de tampon substrat 1X ncessaire pour le test. Vous aurez besoin de 100 L de
tampon substrat par puits de votre plaque ELISA.
Lavage des plaques: La composition des tampons est fournie page 4.
Vider les puits, dans un vier ou dans un container prvu pour ce type de dchet, en renversant la Le tampon substrat SEDIAG (ref: SUBST-Buf) doit tre dilu sa concentration finale d'utilisation
plaque ELISA. Remplir ensuite les puits ras bord avec du tampon de lavage 1X (disponible chez (1X) avec de l'eau osmose ou distille.
SEDIAG la concentration 20X, ref: WASH-Buf). Rpter 2 fois (voir recommandations pour plus de
dtails). Prparation du substrat :
Chaque tablette de substrat pNPP (ref: TAB-Acc) permet de prparer 5 mL de solution de pNPP
Note : Utiliser immdiatement les plaques fraichement prpares. (aprs reconstitution par du tampon substrat 1X port temprature ambiante), une
concentration de 1mg/mL, suffisante pour 45 puits environ. Homogniser.
ETAPE DE FIXATION DES ANTIGENES Si vous utilisez du substrat en poudre, le dissoudre avant utilisation raison de 1 mg de pNPP/mL
par du tampon substrat 1X port temprature ambiante. Homogniser.
Dposer 100 l par puits.
Prparation des tampons :
Prparer le volume de tampon d'extraction 1X ncessaire pour le test. Vous aurez besoin de 100
L de tampon d'extraction par puits de votre plaque ELISA. *
( )
Lors des incubations, les plaques doivent tre couvertes par un film plastique adhsif ou un couvercle
La composition des tampons est fournie page 4.
Le tampon d'extraction CYSDV SEDIAG (ref: CYSD-Buf) doit tre dilu sa concentration finale
d'utilisation (1X) avec de l'eau osmose ou distille.

*
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Lors des incubations, les plaques doivent tre couvertes par un film plastique adhsif ou un couvercle Incuber la plaque +37C *
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3, Bd de Beauregard - 21600 Longvic - France 3, Bd de Beauregard - 21600 Longvic - France
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Lire les absorbances laide dun spectrophotomtre, 405 nm, aprs 1 heure et 2 heures Evaluation des rsultats
dincubation. Voir les recommandations pour l'interprtation des rsultats. Les puits dans lesquels une couleur jaune apparat indiquent un rsultat positif. Les puits dans
lesquels aucune couleur significative n'apparat indiquent des rsultats ngatifs. Les rsultats de vos
Note : Ne pas toucher les tablettes de pNPP avec vos doigts sans gants. Ne pas exposer la tests ne sont valides seulement si les puits dans lesquels vous avez dpos vos contrles positifs sont
solution de pNPP une lumire trop forte. La lumire ou la contamination peuvent entraner la positifs et si vos tmoins ngatifs et vos blancs sont bien ngatifs. Les rsultats peuvent tre
prsence de bruit de fond dans vos puits contenant les tmoins ngatifs. interprts aprs plus de 60 minutes d'incubation aussi longtemps que les puits ngatifs restent
virtuellement clairs.
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Lors des incubations, les plaques doivent tre couvertes par un film plastique adhsif ou un couvercle
4. ASSISTANCE TECHNIQUE
3. RECOMMANDATIONS
Si vous avez des questions concernant l'utilisation de nos ractifs, n'hsitez pas nous contacter
Stockage : Afin d'assurer au maximum leur validit, Il est important de stocker les ractifs et pour plus de dtails par tlphone (03 80 67 49 42) ou par email (info@sediag.com).
tampons aux tempratures recommandes. Ne pas conserver les tampons reconstitus la
concentration 1X.
5. COMPOSITION DES TAMPONS
Scurit : Eviter le contact direct des ractifs et tampons avec les yeux ou la peau. Ne pas
avaler. Il faut toujours bien vous laver les mains aprs l'utilisation des tampons et ractifs. N'hsitez
pas contacter SEDIAG si vous avez des questions propos de l'utilisation de nos ractifs. Les fiches PBS 1X Tampon Coating 1X
de scurit de chacune de nos rfrences sont disponibles sur demande. Dissoudre dans 1 l deau distille : Dissoudre dans 1 l deau distille :
NaCl ......................................... 8 g Na2CO3 .................................... 1.59 g
Prparation des anticorps de Coating et Conjugu Na2HPO4-12H2O .......................... 2.9 g NaHCO3 .................................. 2.93 g
Il est impratif dutiliser les plaques de microtitration MaxiSorp Nunc et de suivre un plan de KH2PO4 .................................... 0.2 g NaN3 ....................................... 0.2 g
plaque tabli au pralable. Le volume de solution prparer dpend du nombre de tests raliser. KCl ......................................... 0.2 g Pourpre de Bromocresol.................. 5 mg
En rgle gnrale, il est conseill de prparer 10 ml de solution par plaque de 96 puits ou 1mL pour NaN3 ....................................... 0.2 g Cette solution est pH 9.6
chaque bande de 8 puits. Dposer les solutions d'anticorps immdiatement dans la plaque ELISA Cette solution est pH 7.4
aprs leur prparation.
Exemple : Si la dilution des ractifs (anticorps ou streptavidine) mentionne sur leur tiquette est Tampon Conjugu 1X
de 1/100 et que vous avez besoin de prparer 10 mL de solution d'anticorps, vous devrez mlanger PBST 1X = Tampon de Lavage 1X A 1 l de PBST, ajouter :
10 ml de tampon avec 100 l de ractif concentr. BSA ........................................... 2 g
A 1 l de PBS, ajouter :
Tween20 ................................ 0.5 ml Rouge Congo..............................40 mg
Lavages
Cette solution est pH 7.4 Cette solution est pH 7.4
Laver les plaques avec du tampon de lavage 3 5 fois selon les instructions du mode opratoire. La
plaque peut tre vide soit par aspiration de la solution soit par renversement en faisant un brusque
mouvement de la main et en tapant fermement la plaque sur une couche de papier absorbant.
Regarder ensuite le fond des puits, ils ne doivent plus contenir d'extrait de plante ni de bulles d'air. Tampon d'extraction CYSDV 1X Tampon Substrat (pNPP) 1X
Si ceux-ci sont toujours prsents, rpter le lavage et taper de nouveau fermement la plaque sur A 1 l de PBS, ajouter : Dissoudre dans 1 l deau distille :
une couche de papier absorbant. PVP (Mw 10,000-40,000) ................ 20 g Diethanolamine ........................ 97 ml
Tween20 ................................ 0.5 ml NaN3 .......................................0.2 g
Prparation des chantillons Lait crm en poudre .................... 20g Ajuster le pH 9.8 avec HCl
Lorsque cela est possible, utiliser du matriel vgtal prsentant des symptmes. Gnralement, la Cette solution est pH 7.3
feuille est le matriel le plus utilis pour raliser les tests ELISA. Cependant, les tiges, graines et
autres tissus peuvent galement tre analyss.
Pour craser les chantillons, il est possible dutiliser des sachets de broyage (ref: SAC-Acc)
spcialement conus, un mortier et un pilon ou tout autre appareil de broyage. Il est ncessaire de
bien laver et rincer le mortier et le pilon entre chaque chantillon. Aprs broyage, le matriel peut
tre stock +4C pendant 12 heures maximum. La sensibilit du test peut tre altre par une
mauvaise conservation, il est donc prfrable de dposer immdiatement les chantillons aprs
broyage.
Lutilisation de contrles positif et ngatif est fortement recommande afin de valider les
rsultats.

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