UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

2017 - B Facultad de Ingeniera Qumica

IDENTIFICACION DE BACTERIAS TINCION GRAN

1. OBJETIVOS:

Identificar bacterias Gram positivas y negativas de inculos conocidos en

medios selectivos.

2. FUNDAMENTO TEORICO:

TINCION DE GRAM:

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en

microbiologa para la visualizacin de bacterias. Debe su nombre al bacterilogo dans
Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse
a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin
a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias
que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan
de color rosa o rojo.

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares
de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna
de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipo-
teicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el
peptidoglucano (tambin conocido como murena).

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se

encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin
distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipo-protenas. La membrana
exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipo-polisacrido.
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Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas

diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo
poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la

membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como
por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin
azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular
ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos,
lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloracin azul-violcea.

BACTERIA GRAM NEGATIVA

En microbiologa, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no

se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram, y lo hacen de un color rosado
tenue: de ah el nombre de "Gram-negativas" o tambin "gran negativas".

Esta caracterstica est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por

lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana.

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos

Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseriagonorrhoeae), meningitis
(Neisseriameningitidis) y sntomas respiratorios (Moraxellacatarrhalis), entre otros. Los
bacilos Gram-negativos incluyen un gran nmero de especies. Algunos de ellos
causan principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilusinfluenzae,
Klebsiellapneumoniae , Legionellapneumophila, Pseudomonasaeruginosa),
enfermedades urinarias (Escherichiacoli, Proteusmirabilis, Enterobactercloacae,
Serratiamarcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori,
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Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros estn asociadas a infecciones

nosocomiales (Acinetobacterbaumanii).

Estructura

La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas est compuesta por una

membrana citoplasmtica (membrana interna), una pared celular delgada de
peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared
celular de estas bacterias. Entre la membrana citoplasmtica interna y la membrana
externa se localiza el espacio periplsmico relleno de una sustancia denominada
periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutricin en estas bacterias.

La membrana externa contiene diversas protenas, siendo una de ellas las porinas o
canales proteicos que permiten el paso de ciertas sustancias. Tambin presenta unas
estructuras llamadas lipo-polisacridos (LPS), formadas por tres regiones: el
polisacrido O (antgeno O), una estructura polisacrida central (KDO) y el lpido A
(endotoxina).

BACTERIA GRAM POSITIVA

En microbiologa, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se

tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Gram-
positivas" o tambin "gran positivas". Esta caracterstica est ntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organizacin
bacteriana. La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la
membrana citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de
peptidoglicano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana
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citoplasmtica mediante molculas de cido lipo-teicoico. La capa de peptidoglicano

confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte
durante la tincin de Gram. A diferencia de las Gram-negativas, las Gram-positivas no
presentan una segunda membrana lipdica externa a la pared celular y esta pared es
mucho ms gruesa.

Incluyen especies tanto mviles (va flagelos) como inmviles con forma de bacilo
(Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco
(Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas
(Mycoplasma). Algunas especies son fotosintticas, pero la mayora son hetertrofas.
Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables.
Realmente, no todas las bacterias del grupo son Gram-positivas (no se tien por la
aplicacin de ese mtodo), pero se incluyen aqu por su similitud molecular con otras
bacterias Gram-positivas.

La clula bacteriana est rodeada por una envoltura que, observada al microscopio
electrnico, se presenta como una capa gruesa y homognea, denominada pared
celular. Luego en seccin (corte) se observa una estructura semejante a dos lneas
paralelas separando una capa menos densa; esto corresponde a la membrana
plasmtica. Entre la membrana plasmtica y la pared celular se encuentra el peri-
plasma o espacio peri-plasmtico. En el interior de la membrana plasmtica se
encuentra el citoplasma que est constituido por una disolucin acuosa, el citosol, en
el cual se encuentran ribosomas y otros agregados de macromolculas, y en el centro
se ubica la zona menos densa llamada nucleoide, que contiene una madeja de hebras
difcil de resolver (distinguir) y cuyo principal componente es el ADN.

La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como
base qumica fundamental el peptidoglicano, que es un polmero de N-acetil-2-D-
glucosamina, unido en orientacin -1,4 con N-acetil murmico, a ste se agregan por
el grupo lactilo cuatro o ms aminocidos. Esta molcula se polimeriza gran cantidad
de veces, de modo que se forma una malla especial, llamada sculo de murena.
Dicho compuesto es de vital importancia para conservar la forma y darle rigidez a la
clula bacteriana (si este compuesto no existiese, la clula reventara debido a su gran
potencial osmtico).
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Las siguientes caractersticas estn presentes generalmente en una bacteria Gram-

positiva:

Membrana citoplasmtica.
Capa gruesa de peptidoglicano.
cidos teicoicos y lipo-teicoicos, que sirven como agentes quelantes y en
ciertos tipos de adherencia.
Polisacridos de la cpsula.

Comparacin de las envolturas celulares bacterianas

ARRIBA: Bacteria Gram-positiva. ABAJO: Bacteria Gram-negativa.

1- Membrana citoplasmtica. 1- Membrana citoplasmtica.

2- Peptidoglicano. 2- Espacio peri-plasmtico.
3- Fosfolpidos. 3- Membrana externa.
4- Protenas. 4- Fosfolpidos.
5- cido lipo-teicoico. 5- Peptidoglicano.
6- Lipoprotena.
7- Protenas.
8- Lipo-polisacridos.
9- Porinas
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3. MATERIAL DE PRACTICA

Mechero Bunsen.
Asa de siembra esterilizada.
Placas petri.
Pipetas.
Tubos con cultivos bacteriano crecidos
Agua destilada.
Lugol.
Lavado con acetona: agua (80) y acetona (20).
Safranina.
Laminas para objetos.

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

a) Todos los materiales deben ser esterilizados por dos minutos por lo menos.
b) Preparar la muestra para identificar las bacterias gram positivas o gram
negativas.
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c) Esterilizar el asa de siembra en el mechero por unos dos minutos.

d) Coger una pizca de muestra (colonia bacteriana) con el asa de siembra y

colocar en la lmina porta objetos, disolver sobre una gota de agua destilada.

e) Extender la muestra como una capa fina sobre la lmina porta objetos. Se deja
secar la preparacin, se fija la colonia al calor suave (mechero).
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f) Adicionar una gota del colorante cristal violeta, dejar reposar por un minuto y
luego enjuagar con agua destilada.

g) Luego aadimos una gota de lugol, dejamos reposar por un minuto y

enjuagamos con agua destilada.
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h) Tincin de contraste con safranina. Las bacterias gram positivas ya estn

teidas con cristal violeta y permanecen de color purpura. Las bacterias gram
negativas se tien de color rosa. Por un minuto enjuagar con agua destilada.

5. CALCULOS Y/O RESULTADOS

Las muestras dadas en forma separada ambas fueron bacterias gram

negativas.
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6. CONCLUSIONES

Para la primera muestra que dio una coloracin azul o violeta, nos da una

bacteria gram positiva.

Para la segunda muestra, tambin nos dio una coloracin azul o violeta e

indica una bacteria gram positiva.

Se logr comprobar que la tincin gram nos ayuda a diferenciar por

coloracin las bacterias gram positivas de las gram negativas.

7. RECOMENDACIONES

Se debe extender la suspensin con mucho cuidado hasta conseguir una

capa fina.
Al secar la preparacin acercndola a la llama del mechero, evitar que se
caliente demasiado para no afectar a la estructura y forma de los
microorganismos.