1

Cintica del crecimiento de levaduras pectinolticas en medio sinttico

Prctica de laboratorio No. 2
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Resumen

El uso de tcnicas analticas para la evaluacin de parmetros cinticos y rendimientos relacionados con una fermentacin
se vuelven relevantes, en la medida que estos datos son claves para el modelamiento y optimizacin de bioprocesos en
miras de su escalado. En este trabajo se llev a cabo el montaje de una fermentacin con levaduras de actividad
pectinoltica sobre un medio lquido sinttico de formulacin conocida en Erlenmeyer de 1L de capacidad operando al
10%. Durante el tiempo de fermentacin se tomaron muestras de 5mL a las horas 0, 16, 18, 20, 22 y 24. Se evalu la
produccin de biomasa, el consumo de sustrato y la produccin de pectinasas, para ello se usaron tcnicas como medicin
de OD, evaluacin de azcares reductores por DNS y medicin de actividad enzimtica. A partir de los datos se esperaba
obtener parmetros de la cintica de la fermentacin y algunos rendimientos; al final se logr calcular un rendimiento
observado de biomasa/sustrato de 0,392 y 0,587 para las muestras 1 y 2 respectivamente. La falta de mediciones en las
etapas tempranas de la fermentacin, limitaron algunos clculos.

Palabras Clave: densidad ptica, parmetros cinticos, bioprocesos, anlisis qumico.

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1. Introduccin

Los bioprocesos a escala industrial requieren de un fuerte desarrollo a niveles menores, como escalas piloto y
de laboratorio. Puesto que, trabajar con pequeos volmenes permite determinar y estudiar, con cierta facilidad,
un mayor nmero de variables que afectan el proceso y, mediante una evaluacin de las mismas, disear un
modelo de optimizacin del mismo [1]. Dicha optimizacin tiene como objetivo aportar informacin sobre la
viabilidad del proceso, tanto de aspectos puramente tcnicos como factores econmicos [2]. Los primeros datos
de estudio se pueden obtener a partir de mediciones experimentales acerca de la estequiometra y la cintica de
la reaccin que se lleva a cabo durante la bioconversin sostenida por los microorganismos en cultivo, usando
tcnicas analticas y bioqumicas. Los datos recolectados servirn para el desarrollo de modelos de crecimiento
y adaptacin de los agentes biolgicos en el proceso durante el escalado.

Un proceso biotecnolgico comienza con la bsqueda de aplicaciones de microorganismos y otras fuentes

biolgicas para fines industriales [3]. Las primeras etapas se centran en identificar y aislar el agente biolgico
desde su nicho, seguido de purificacin y, generalmente, identificacin; esta primera parte se lleva a cabo,
principalmente, en medios microbiolgicos, cuya composicin qumica es desconocida, pero proveen los
recursos necesarios al microorganismo para adaptarse. El siguiente paso en el escalado es la propagacin de la
biomasa, la cual se prefiere llevar a cabo en medios sintticos, donde la composicin y concentraciones son
conocidas [4]. De modo que, al tener las formulaciones precisas de cada componente del medio es posible
efectuar estudios para determinar las condiciones ptimas para el crecimiento del microorganismo en cuestin
durante el desarrollo del proceso. As, en un cultivo batch, se pueden distinguir diferentes etapas de la cintica
del crecimiento microbiano, vista como primera variable en el estudio. Primero la etapa de adaptacin, que se
caracteriza por un crecimiento bajo o inexistente de la poblacin, pero se evidencia alta actividad metablica y
aumento del tamao de las clulas [5]. Luego, est la fase de crecimiento exponencial, en esta, la tasa de
crecimiento de la poblacin es mxima y se observa una relacin lineal entre el logaritmo del nmero de clulas
y el tiempo. Posteriormente empieza una fase estacionaria que resulta del agotamiento de los nutrientes o de la
acumulacin de metabolitos txicos lo que tiene como consecuencia la disminucin de la velocidad de
crecimiento [6].

El estudio de la cintica de crecimiento microbiano puede hacerse a partir de datos experimentales obtenidos
mediante tcnicas analticas; un anlisis de la composicin qumica de la fermentacin que involucran la
medicin de variables tales como la densidad ptica, el consumo de sustrato, la generacin de producto, entre
otros [7]. En organismos unicelulares, la produccin de biomasa se evala en diferentes puntos del proceso
 2

mediante un mtodo espectrofotomtrico de densidad ptica, donde se mide el grado de turbidez que ha
adquirido el medio, resultado del crecimiento microbiano; mientras el peso seco en biomasa se puede obtener
mediante tcnicas gravimtricas al final del bioproceso, haciendo la diferencia de pesos entre el inicio y el final
[8]. As mismo, se puede hacer un seguimiento al sustrato midiendo su consumo en diferentes tiempos del
proceso; en caso de usar glcidos como fuente de carbono, una fuente muy comn para medios sintticos, se
puede cuantificar directamente la concentracin de azcares reductores a travs de tcnicas colorimtricas,
como lo son el mtodo de DNS y el de Fehling [9]. Otro anlisis tpico se centra en el producto; cuando el
principal objetivo de un proceso biotecnolgico, como generalmente suele serlo, es la obtencin de enzimas,
una medicin de actividad enzimtica es til para determinar la cantidad de enzimas de inters producidas
durante la fermentacin a partir del sustrato. Dicha medicin suele ser indirecta, como por ejemplo, en la
evaluacin de la produccin de pectinasas, se puede medir la cantidad de azcares reductores liberados en el
medio, derivados de la accin de dicha enzima sobre un sustrato proporcionado; la reaccin produce mono y
disacridos que pueden ser cuantificados por DNS o por el mtodo de Nelson y Somogy [10].

La obtencin de todos los datos mencionados proporciona informacin til sobre el proceso, y permite dilucidar
parmetros importantes para la implementacin de un modelo matemtico que describa el comportamiento del
crecimiento celular en el cultivo, como el propuesto por Monod, donde se relaciona la velocidad mxima de
crecimiento de la biomasa con la concentracin del sustrato (fuente de carbono), y est dado por la expresin:
= _max (s/(K_s+s)) [11]
Donde se refiere a la velocidad especfica de crecimiento (h-1), max, por su parte, es la velocidad especfica
mxima de crecimiento (h-1), S la concentracin del sustrato limitante (g/l) y Ks la constante de saturacin
(g/l). El valor de max se obtiene a partir de la pendiente mxima de la curva de crecimiento del
microorganismo, es decir, sobre la fase de crecimiento exponencial, mientras la constante de saturacin Ks
(g/L), es aproximadamente igual a la concentracin de azcares totales en el medio de cultivo para la fase
estacionaria de crecimiento del microorganismo [12]. El modelo desarrollado permitir despus predecir el
comportamiento de la fermentacin y a la implementacin de sistemas de control y optimizacin del proceso.

Con todo lo anterior, el objetivo de esta prctica se centra en la obtencin de las curvas de crecimiento de
biomasa, consumo de sustrato y generacin de producto de una levadura con capacidades pectinolticas aislada
anteriormente, en un medio sinttico previamente formulado, a escala de Erlenmeyer de un litro con agitacin
orbital, para obtener datos sobre los parmetros cinticos que permitan desarrollar el modelo y la optimizacin
del proceso durante las etapas de escalado.

2. Antecedentes

En la tabla 1 se presentan 10 artculos relacionados con el estudio de la cintica de microorganismos en el rea

de los bioprocesos mediante tcnicas analticas.
Tabla 1. Matriz bibliogrfica
Ttulo Revista Objetivo Sustrato Producto Microorganismo

Multi-substrate Applied Construccin de un Fenol Fenol Pseudomonas putida

growth kinetics of Microbiology modelo cintico no lineal degradado
and de doble sustrato, fenol y
Pseudomonas Biotechnology oxgeno disuelto,para el
putida for phenol May 1997, crecimiento de P. putida
removal Volume 47, en un fermentador
Issue 5, pp continuo.
610614
[14]
 3

Bioprocessing of Journal of Estudiar la produccin de Cscara de Pectinasas Aspergillus niger

citrus waste peel Radiation pectinasas a partir de ctricos
for induced fermentacin de residuos
pectinase Research and agroindustriales como la
production by Applied cscara de naranja por
Aspergillus niger; microorganismos como
Sciences Aspergillus niger.
its purification and
characterization Volume 9,
Issue 2, April
[15] 2016, Pages
148-154

Biodegradation Bioresource Evaluar la eficacia de Benceno Benceno Bacillus sp. M3

and kinetic study Technology especies microbianas con degradado
of benzene in 242, pp. 92- potencial para
bioreactor packed 100 degradacin de benceno.
with PUF and Adems, maximizar la
tasa de biodegradacin
alginate beads and
por optimizacin de
immobilized with parmetros del proceso
Bacillus sp. M3 como el pH, la
[16] temperatura y la
concentracin del
benceno y el tamao de
los inculos usando las
especies ms eficientes.

Use of non- Food Analizar las interacciones Tanino de Vino M. pulcherrima , L.

Saccharomyces Microbiology entre las cepas semillas thermotolerans , T.
yeasts and Volume 69, seleccionadas no de uva. delbrueckii , y dos
oenological tannin February Saccharomyces y los cepas silvestres de
in red 2018, Pages taninos enolgicos Schizosaccharomyces
51-63 durante la AF, tambin se pombe ( S. pombe ),
winemaking:
estudiaron los efectos del 938 y V1i.
Influence on tanino enolgico sobre el
colour, aroma and color, el aroma y las
sensorial propiedades sensoriales
properties of del vino. Adicionalmente,
young wines se estudi mtodos de
inoculacin y los
[17]
desarrollos de levaduras
durante la AF

Investigating the Bioresource Investiga la eficiencia de Amonaco, Amonaco, Paracoccus

nitrification and Technology la tasa de eliminacin de nitrato y nitrato y denitrificans
denitrification Volume 242, nitrgeno, como la nitrito. nitrito
kinetics under October 2017, nitrificacin heterotrfica degradado.
aerobic and Pages 334-343 y la desnitrificacin
aerbica, as como la
anaerobic
cintica bajo condiciones
conditions by aerobias y anaerobias a
Paracoccus partir de aguas residuales
 4

denitrificans sintticas por bacterias.

ISTOD1
[18]

Assessment of Bioresource Investigar la Atrazina, Atrazina, Bacillus sp.

pesticides removal Technology biodegradacin de malatin y malatin y
using two-stage Volumen 242, Atrazine, Malathion y paratin. paratin
Integrated Aerobic octubre de Parathion con especies degradados.
Treatment Plant 2017, pginas bacterianas potenciales
(IATP) by Bacillus 45-54 aisladas de los sitios
sp. isolated from contaminados con dichos
agricultural field. plaguicidas. Evaluar
[21] parmetros cinticos
importantes, tales como la
constante cintica de la
velocidad biolgica de
primer orden ( K obs), el
rendimiento celular ( Y X
/ C ) y los coeficientes de
desintegracin ( K dp ).

Treatment of Canadian Estudiar y comparar Fenol. Fenol Ewingella

wastewater from Journal of diversas configuraciones degradado. Americana.
syngas wet Chemical de un biorreactor para Gulosibacter sp. YZ4.
Engineering eliminar el fenol. P. Putida ATCC
scrubbing: Model- Volume 95, Determinar la cintica en 11172.
based comparison Issue 9, los reactores haciendo uso P. Putida ATCC
of phenol September de la ecuacin de 49451.
biodegradation 2017, Pages Haldane-Andrews para P. Putida MTCC
basin 1652-1660 una variedad de 1194.
microorganismos. P. Putida LY1.
configurations. Alcaligenes Faecalis.
Bacillus Brevis.
[22] Bacillus Cereus WJ1.

Comparative study Biotechnology Comparar dos nuevos Ftalato de Ftalato de Pseudomonas sp.
on the degradation Reports degradadores de DBP, dibutilo. dibutilo V21b and
of dibutyl phthalate Volume 15, que han demostrado una degradado. Comamonas sp. 51F.
by two newly September capacidad de degradacin
isolated 2017, Pages 1- eficiente de DBP
Pseudomonas sp. 10 individualmente en el
V21b and medio de sal mnimo
Comamonas sp. suplementado con DBP
51F. [23] en el laboratorio y en
muestras contaminadas
con DBP recogidas del
sitio ambiental.

Revista Evaluar las condiciones Melaza de Biomasa.

U.D.C.A ptimas, bajo las caa.
Evaluation of cane Actualidad & circunstancias de la Lactobacillus
 5

molasses as Divulgacin investigacin actual, de plantarum.

substrate for Cientfica 13 crecimiento de L.
Lactobacillus (1): 97-104 plantarum en melaza de
caa, como sustrato.
plantarum growth.
[24]

3. Metodologa

3.1 Preparacin de medio de cultivo

Se utiliz un medio de cultivo de composicin conocida (5g/L Glucosa, 0.1g/L CaCl2, 0.6g/L MgSO4.7H2O,
0.78 g/L KH2PO4, 0.45 g/L cido ctrico, 0.3 mL/L solucin de Urea, 1.0mL/L solucin de vitaminas, 1.0mL/L
solucin de cationes) pH 4,7. Solucin de vitaminas: Inositol 70 g/L, Acido p-amino benzoico 1.0 g/L,
Pantotenato de calcio 4,0 g/L, D-Biotina 0.06g/L, Piridoxina 1.0g/L, Acido nicotnico 12 g/L, Tiamina 0.6 g/L.
Solucin de cationes: FeSO4 .7H2O 0.2mg/L, ZnSO4 .7H2O, 60 g/L. El cultivo se realiz en 2 Erlenmeyer
de 1000 mL con 90 mL de medio en cada uno. El medio se esteriliz en autoclave a 15 psi, 120C por 15 min.

3.2 Inoculacin del medio y condiciones de fermentacin

Se tomaron 10 mL de cada suspensin del microorganismo proveniente de 2 siembras en tubo inclinado y se
agregaron al medio de cultivo en ambos Erlenmeyer. stos fueron incubados a 30 bajo agitacin orbital a
200 rpm durante 24 horas.

3.3 Toma de muestra para cintica

Se tomaron alcuotas de 5ml del medio de cultivo en ambos Erlenmeyer a la hora 0, 16, 18, 20, 22 y 24. Estas
se almacenaron en tubos falcon a - 20 para su posterior lectura.

3.4 Densidad ptica

La lectura de densidad ptica se realiz con un espectrofotmetro, leyendo la absorbancia de cada muestra en
todos los puntos a una longitud de onda de 600 nm, con celdas plsticas con capacidad para 1 mL.

3.5 Peso seco

Para medir el peso seco se filtran 5 mL del medio 24 horas despus del inculo en un papel filtro del cual se
conoce previamente su peso. Para esto se utiliza una bomba de vaci como se muestra en la figura 1. El filtro
con la biomasa se lleva a secado (100C por 24 horas) y se pesa nuevamente. La diferencia de pesos ser el
valor de la biomasa en el volumen filtrado.

Figura 1. Bomba de vaco para medir concentracin celular por el mtodo de peso seco
 6

3.6 Mtodo DNS para medicin de sustrato

El mtodo de DNS es una tcnica espectrofotomtrica que se basa en una reaccin redox entre el cido 3,5
dinitrosaliclico (DNS) y los azcares reductores presentes en la muestra [13]. El DNS naturalmente es de color
amarillo, al ser reducido por un azcar reductor a alta temperatura, su color cambia a tonalidades naranjas y
rojas. La absorbancia de una solucin, luego de ocurrir la reaccin, se puede leer a 540 nm de longitud de onda
en un espectrofotmetro, y utilizando una curva de calibracin se halla la concentracin de azcar reductor
presente en la muestra. En este caso, el azcar reductor que permite la reduccin del DNS es la glucosa en el
medio de cultivo; de esta manera, se mide la concentracin de sustrato en cada punto de la cintica.
Inicialmente, se realiz una dilucin 1/30 con agua tipo I, del primer punto (hora 0) de las dos muestras. Se
llev 1 mL de estas diluciones y 1 mL de los dems puntos (hora 16, 18, 20, 22, 24 de ambas muestras) sin
diluir, a tubos tapa rosca de 25 mL. Se utiliz un tubo ms con 1 mL de agua tipo I para el blanco reactivo. Se
cubri cada tubo en la parte inferior con papel aluminio para protegerlos de la luz, y se adicion, a cada tubo,
1 mL de una solucin de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS) preparada previamente. Posteriormente, se dejaron
en agua hirviendo por 7 minutos para permitir la reaccin, y luego 5 minutos en un bao fro para frenarla.
Finalmente, se dejaron reposar por 3 minutos a temperatura ambiente y se realiz la lectura de absorbancia a
una longitud de onda de 540 nm en el espectrofotmetro. Tambin se ley la absorbancia de cada punto de la
cintica, sin el reactivo DNS para utilizarse como blanco muestra, ya que la biomasa hace que la muestra sea
turbia y esto afecta la lectura. Como los puntos de la hora 0 estaban diluidos, no hubo tanta turbidez y no se
realiz blanco muestra para estos puntos.

3.7 Mtodo de actividad poligalacturonasa para medicin de producto

Este mtodo se basa en la oxidacin de azcares y sustancias reductoras por compuestos orgnicos cpricos en
una solucin alcalina [19]. Para esto se utiliza un sustrato (PGA) que ser degradado por la pectinasa que se
espera sea el producto del microorganismo inoculado, y se generarn las sustancias reductoras. El reactivo de
Somogyi contiene los compuestos orgnicos cpricos y el reactivo de Nelson proporcionar la solucin
alcalina. Cuando se da la oxidacin, el medio se torna de un color azul cuya absorbancia es leda en el
espectrofotmetro a 660 nm para calcular la concentracin de la enzima de manera indirecta, al asociarla con
mol de poder reductor por minuto de reaccin utilizando la curva de calibracin dada por los monitores de la
prctica.
El producto se midi nicamente en el ltimo punto (hora 24) donde se espera que ha producido una cantidad
suficiente de enzima. Inicialmente, se prepararon 2 diluciones, 1/30 y 1/10, para cada muestra. Luego se
adicionaron 50 L de cada dilucin y 50 L de las muestras sin diluir, y 450 L de PGA (cido
poligalacturnico) (20g/L) en buffer cido actico/acetato de Na (AcB) (20 mM, pH: 5,0), en tubos tapa rosca
de 15 mL. Se permiti la reaccin en un bao Mara a 37 C por 10 minutos y luego se detuvo sumergiendo los
tubos de reaccin en un bao de hielo/agua. Posteriormente, se agreg 500 L de reactivo de Somogyi y se
llev a un bao en ebullicin por 10 min. La reaccin se detuvo sumergiendo nuevamente en un bao de
hielo/agua por 10 min. Luego se agreg 500 L de reactivo Nelson, se agit en vortex y se dej en reposo por
30 min. Finalmente se agregaron 4,5 mL de agua destilada y se ley la absorbancia a 660 nm.
La curva de calibracin se obtuvo a partir de soluciones de AGA en AcB en intervalos de concentraciones
desde 50 hasta 250 mg/L. Se define una unidad de actividad PGasa como los moles de poder reductor generado
por minuto en las condiciones de reaccin [20].

4. Resultados

4.1 Concentracin de biomasa por densidad ptica y peso seco

En la tabla 1 se muestran los valores para el peso seco de la biomasa, medida de una muestra de 5 mL de medio
de cultivo a las 24 horas de la fermentacin, para los cultivos 1 y 2.
 7

Tabla 2. Peso seco de biomasa a las 24 horas de la fermentacin.

Muestra a las 24 Peso (g) Concentracin
horas de biomasa (g/L)
Filtro Filtro+Biomasa Biomasa
1 0,0816 0,0973 0,0157 3,14
2 0,0818 0,0993 0,0175 3,50

La tabla 3 muestra las absorbancias para las 2 muestras a travs del tiempo. Teniendo en cuenta la ley de Beer-
Lambert, la cual postula que la absorbancia de la muestra es directamente proporcional a la concentracin de
esta, se calculan las concentraciones a los diferentes tiempos a partir del peso seco medido a las 24 horas de
realizar el inculo (tabla 2) suponiendo que el peso seco segua la misma tendencia que las absorbancias. La
figura 2 muestra el comportamiento del crecimiento microbiano durante el tiempo de cultivo para las dos
muestras.

Tabla 3. Densidad ptica y concentracin de biomasa a diferentes tiempos posterior al inculo.

Muestra 1 Muestra 2

Tiempo (h) OD Concentracin OD Concentracin

(g/L) (g/L)
0 1,156 1,32 0,902 1,47

16 2,167 3,13 2,139 3,49

18 2,169 3,15 2,148 3,51

20 2,171 3,14 2,141 3,5

22 2,155 3,12 2,127 3,47

24 2,162 3,14 2,144 3,50

 8

Figura 2. Cintica del crecimiento microbiano.

4.2 Mtodo DNS para medicin de sustrato

La tabla 4 muestra las absorbancias obtenidas en cada punto de la cintica, para ambas muestras luego de
completar el mtodo por DNS para medir concentracin de sustrato.

Tabla 4. Absorbancias de las muestras a diferentes horas

Punto Diluci Abs muestra Abs blanco Abs blanco Abs real
(hora n muestra reactivos
)
Muestr Muestr Muestr Muestr Muestr Muestr Muestr Muestr
a1 a2 a1 a2 a1 a2 a1 a2

0 1:30 1,07 0,834 0 0 0,138 0,138 0,932 0,696

16 1:1 0,71 0,584 1,85 1,187 0,141 0,141 0 0

18 1:1 0,733 0,585 1,287 1,457 0,141 0,141 0 0

20 1:1 0,92 0,57 1,54 2,15 0,141 0,141 0 0

22 1:1 0,95 0,667 1,715 2,238 0,141 0,141 0 0

24 1:1 0,37 0,259 0,844 0,345 0,141 0,141 0 0

Ambas muestras en la hora 0 presentaban colores naranjas luego de la reaccin, mientras que las muestras en
las dems horas, todas tenan un color amarillo similar al blanco reactivo.
 9

La figura 3 muestra la curva de calibracin proporcionada por los monitores del curso, y en la tabla 5 se
presentan los resultados de concentracin de sustrato en cada punto de la cintica de las muestras. La
concentracin se halla despejando la x de la ecuacin de la curva de calibracin ingresando la absorbancia (y)
de cada muestra y dividiendo por la dilucin. Los resultados se expresan en gramos de glucosa por litro de
medio.

Figura 3. Curva de calibracin para DNS con glucosa

Tabla 5. Concentracin de sustrato en las muestras a diferentes horas

Punto (hora) Concentracin glucosa (g/L)

Muestra 1 Muestra 2

0 4,644 3,461

16 0 0

18 0 0

20 0 0

22 0 0

24 0 0

4.3 Mtodo de actividad poligalacturonasa para medicin de producto

La curva de calibracin de la figura 4 fue utilizada para obtener la concentracin de producto medido
indirectamente como mol poder reductor/min rxn, de la misma forma en que se us la curva de calibracin
 10

para el medir el sustrato con DNS. La tabla 6 muestra las absorbancias obtenidas en el mtodo para medir
actividad poligalacturonasa y los resultados en ppm de pectinasa segn los clculos con la curva.

Figura 4. Curva de calibracin para actividad poligalacturnica con Pectinasas

Tabla 6. Absorbancias para medicin de producto

Absorbancia Concentracin
pectinasa (ppm)
Diluci Muestra Muestra Blanco Real Real Muestra Muestra Commented [1]: Perdn por borrar el comentario
n 1 2 muestra 1 muestra 2 1 2 Creo que fue mitad buffer y mitad agua

1:1 0,576 0,551 0,557 0,019 0,006 0 0 Commented [2]: Si es as deba ser transparente y tambin
qued azul, entonces algo pas :(

1:30 0,615 0,565 0,557 0,058 0,008 0 0 Commented [3]: No s entonces

1:10 0,500 0,558 0,557 0 0,001 0 0

Tanto las muestras como el blanco se observaron de color azul, sin alguna diferencia sensible que se pudiera
apreciar, en cuanto al tono del color.

4.4 Cintica de crecimiento, consumo de sustrato y producto

La figura 5 muestra la cintica de crecimiento microbiano junto con la de consumos de sustrato.

 11

Figura 5. Cintica de crecimiento microbiano y consumo de sustrato para ambas muestras

Segn la estequiometra de procesos microbianos de Monod, el cambio en la concentracin celular es

directamente proporcional al cambio en la concentracin de sustrato. As, se denomina rendimiento
biomasa/sustrato a la constante de proporcionalidad calculada segn la siguiente ecuacin.

/ = = 24 0
( 24 )
0

El rendimiento biomasa/sustrato observado es 0,392 para la muestra 1 y 0,587 para la muestra 2.

5. Discusin

La figura 2 muestra la tendencia del crecimiento microbiano durante el tiempo de fermentacin de las muestras
1 y 2. La falta de datos durante las primeras horas del proceso impiden diferenciar las etapas de la fase lag y el
crecimiento exponencial; por el contrario, las fases, estacionaria y de muerte celular se ven con ms detalle, de
modo que se puede saber que el crecimiento exponencial termina entre las 16 y 18 horas del proceso. Lo cierto,
es que la representacin corresponde a una adaptacin de los datos de absorbancia medida durante varios puntos
de la fermentacin con el dato de peso seco obtenido para la ltima muestra; este procedimiento resulta un poco
forzado, pero se llev a cabo dada la falta de datos tericos que respalden las absorbancias, como una curva de
calibracin para el microorganismo trabajado. A pesar de esto, es claro que en el periodo de 16 horas donde no
hubo toma de muestra, el medio de cultivo le proporcion los nutrientes necesarios al microorganismo
inoculado, para multiplicarse y aumentar la concentracin de biomasa.

Es probable que las diferencias observadas entre las muestras 1 y 2, aunque sutiles, se expresan debido a que
cada Erlenmeyer fue inoculado a partir de cultivos separados de la misma levadura, lo que pudo significar que
se introdujera ms inculo a un ensayo que al otro. Aunque al comparar su comportamiento respecto al consumo
de sustrato, est claro que en ambas fermentaciones ste se acab despus de las 16 horas, lo que as mismo
corresponde al inicio de la fase estacionaria y de muerte celular.
 12

En cuanto a la medicin de consumo de sustrato, hubo un inconveniente. Debido a que el tiempo de la prctica
no era suficiente, no se centrifugaron las muestras antes de comenzar el mtodo de DNS y las muestras tenan
biomasa suspendida, esto genera turbidez que tambin absorbe luz a la longitud de onda de la tcnica y causa
interferencia. Todas las muestras que no se diluyeron, presentaron turbidez. Se quiso corregir el error utilizando
blancos muestra, pero todos presentaron absorbancias mayores a las de la prueba correspondiente, por lo que
al restar las absorbancias se obtendra un nmero negativo. Adicionalmente, la observacin visual de los colores
luego de la reaccin, nos indica que ambas muestras en la hora 0 tenan una cantidad considerable de sustrato,
ya que la solucin era de color naranja. En cambio, las muestras en las dems horas eran de color amarillo, lo
que indica que no haba o haba muy poco sustrato en el medio y no se dio la reaccin, incluso a pesar de que
se decidi no diluir las muestras de las horas diferentes a la hora 0 para tratar de lograr que ocurriera la reaccin
de DNS. Por esta razn, nicamente las muestras en la hora 0 se ingresaron a la curva de calibracin para hallar
la concentracin de sustrato presente. Para las dems muestras, se asumi la absorbancia negativa como 0,000
lo que indica que no hay sustrato presente.
Se esperaba que la concentracin de sustrato medida en las muestras a la hora 0, deba ser muy similar a la
concentracin de glucosa utilizada al preparar el medio de cultivo, pues en la hora 0 an no comenzaba en
crecimiento de las clulas y el sustrato an no haba sido consumido. En efecto, los valores hallados de 4,6 g/L
y 3,4 g/L se acercan a la concentracin de 5 g/L utilizada al preparar el medio. Las diferencias se deben a un
leve deterioro de la glucosa al almacenar las muestras bajo congelacin hasta finalizar las 24 horas, perdiendo
su capacidad reductora e imposibilitando su cuantificacin por el mtodo de DNS. Tambin se sugiere que un
experimento tenga por lo menos dos o tres repeticiones para disminuir errores experimentales, en este caso solo
se trabaj con una repeticin, lo cual no genera resultados estadsticamente confiables.

Adicionalmente, se esperaba que el microorganismo inoculado en el medio era capaz de producir pectinasas,
ya que fue aislado de un fruto rico en pectina y sembrado en un medio selectivo para estas enzimas. A pesar de
esto, los resultados indican que no hubo produccin de pectinasas segn el mtodo utilizado. Debido a que las
absorbancias obtenidas estaban por debajo del primer punto de la curva de calibracin, las concentraciones
obtenidas fueron nmeros negativos, lo que indica que no hay presencia de la enzima (0 ppm). Con esto se
puede afirmar que los nutrientes y las condiciones proporcionadas durante la fermentacin, fueron suficientes
para permitir el crecimiento microbiano, pero no para permitir ciertas rutas bioqumicas que generen el producto
de inters. Seguramente, con un poco ms de tiempo y mayor control de las variables del proceso, la produccin
de enzimas pectinasas sera positiva.

Finalmente, debido a la ausencia de producto, se analiz la relacin de la biomasa y el sustrato nicamente. En

la figura 5, claramente se observa cmo la concentracin de sustrato disminuye mientras la concentracin de
biomasa aumenta. Esto es de esperarse, pues el sustrato es la principal fuente de carbono y energa que permite
el crecimiento del microorganismo, por lo que debe consumirlo y gastarlo, ya que se trabaj un sistema cerrado
donde no se ingres sustrato continuamente.
El rendimiento biomasa/sustrato fue mayor en la muestra 2 que en la muestra 1, esto indica que en la muestra
2 hubo mayor aprovechamiento del sustrato en el metabolismo del microorganismo para su crecimiento. La
razn de esto es muy difcil de saber, debido a que ambas muestras provenan de un microorganismo aislado
del mismo lugar, sembrado en un medio de cultivo de componentes iguales; pero el metabolismo es diferente
en cada microorganismo y es afectado por mltiples factores, as como tambin, segn se mencion
anteriormente, pudo afectar la cantidad de inculo que se us para cada ensayo, puesto que no se llev a un
estndar y se parti de cultivos slidos diferentes del mismo microorganismo.

El rendimiento biomasa/sustrato observado es 0,392 para la muestra 1 y 0,587 para la muestra 2.

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