I.

INTRODUCCIN
El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una tcnica de
reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo
segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de
plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un
estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo.
A diferencia de las tcnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite
la propagacin de grandes volmenes de plantas en menor tiempo; as como el manejo
de las mismas en espacios reducidos.
Por otro lado, la tcnica es de gran utilidad en la obtencin de plantas libres de
patgenos; plantas homocigotas, en la produccin de plantas en peligro de extincin,
en estudios de ingeniera gentica, etc. En la UNASAM el laboratorio in vitro surgi en
1995 en convenio con el INIA, en esa poca hubo problemas con el cultivo de papa ya
que todas las variedades estaban contaminadas, debido a esto los rendimientos eran
muy bajos llegando a 6 TM/Ha, mientras que en otros pases las estadsticas arrojaban
una produccin llegaba a los 10TM/Ha, nosotros a pesar de ser el centro de origen de la
papa no podamos satisfacer la demanda del mercado. Los programas de produccin de
semilla se realizan en tres fases; la primera que es el saneamiento del material y la
multiplicacin la segunda fase es la que se hace en el invernadero donde todas las
plantas pasan un proceso de adaptacin y la tercera que es la produccin de la semilla
certificada en campo. Nosotros poseemos solo un laboratorio pequeo, bsico, a
pequea escala, es muy sencillo y con materiales de pequeo costo.
A continuacin, en el siguiente trabajo se dar a conocer con mayor detalle acerca de
los procesos, ambientes y materiales utilizados en esta metodologa que result muy
eficiente para los biotecnologos y la agricultura en general por el nivel de produccin
que proporciona.

Objetivos

General
Conocer el funcionamiento del laboratorio de cultivos in vitro
Especifico
Reconocimiento de la infraestructura del laboratorio in vitro
Reconocimiento de los equipos del laboratorio in vitro
II. MARCO TERICO
Una unidad de micropropagacin comprende un laboratorio de cultivo de tejidos y un
invernadero de propagacin.
En el planteamiento de una unidad de micropropagacin debemos considerar los
siguientes factores: el espacio disponible, el medio ambiente, los recursos financieros,
el tipo de trabajo que se desarrollar y la capacidad de produccin requerida.
Segn la capacidad de produccin y el espacio disponible podemos considerar tres tipos
de unidades de micropropagacin:
a) A pequea escala. Las instalaciones para el trabajo in vitro pueden ubicarse
dentro de una casa en particular, usando el equipo y los materiales con que cuenta
y que se pueden adecuar para las labores bsicas de micropropagacin. Estara
destinado a micropropagar plantas para aficionados, o plantas madres a
invernaderos para su posterior propagacin por mtodos convencionales.
b) A mediana escala. Se requiere disear, implementar y/o adecuar reas
especficas de trabajo, adquirir equipo y materiales propios para este tipo de labor,
lo que permitira incrementar la eficiencia y uniformidad de los resultados en la
produccin.
c) A gran escala. Las instalaciones y equipos deben ser diseados en funcin al
trabajo que desarrollarn con la tendencia a la automatizacin para mantener un
flujo de produccin ptimo.
A. Organizacin Bsica

El laboratorio para el cultivo de tejidos vegetales requiere de una organizacin bsica

que comprende tres reas:

a) Laboratorio general provisto de espacios para trabajos independientes o

comunes. Algunos equipos y materiales pueden ser de uso comn para varios
trabajadores a la vez (o rea de preparacin de medios).
b) rea de manipulacin asptica del material vegetal (o rea de transferencia).
c) rea de mantenimiento de los cultivos bajo condiciones de luz, temperatura y
humedad controladas (o cuartos de cultivo).

Como mnimo debe haber dos ambientes separados. uno para el lavado. esterilizacin,
almacenaje de materiales y preparacin de medios de cultivo, y otro para el
mantenimiento de los cultivos (cuarto de cultivo),
 La cmara de transferencia puede ubicarse dentro del laboratorio general o en una
habitacin especialmente diseada como cuarto de transferencia, segn las
condiciones disponibles.

rea de Lavado y Preparacin de Medios

La seccin destinada para el lavado debe contar con un lavadero grande (de acero
inoxidable, resistente a cidos y alcalinos), agua corriente, mesas que permitan
trabajar de pie y anaqueles para secar y guardar el material lavado. El rea de
preparacin de medios debe estar equipada con una refrigeradora para guardar los
productos qumicos y soluciones utilizadas en los medios de cultivo; balanzas, un
potencimetro, una cocina, un mezclador de medios, un destilador de agua y el
autoclave u olla de presin. Estos dos ltimos equipos deben estar lo ms cerca
posible al lavadero. Opcionalmente se usa la estufa para secar materiales.
rea de Cultivo
Es el rea de incubacin de los cultivos, donde las condiciones ambientales ptimas
cambiarn segn las especies en cultivo, por lo tanto, se debe tener en cuenta las
variaciones de temperaturas, la intensidad luminosa, la calidad de la luz, la humedad
relativa y el fotoperiodo. La temperatura se controla con un equipo de aire
acondicionado o con calentadores, Segn el cultivo, la temperatura promedio de un
cuarto de incubacin varia alrededor de 25 0 C +/- 2 0 C. Para temperaturas ms
altas o ms bajas se usarn equipos de aire acondicionado que permitan alcanzar
las temperaturas deseadas. Es preferible usar termostatos que permitan que la
variacin de temperaturas en el cuarto no exceda los requerimientos del cultivo.
El flujo de aire debe ser uniforme dentro del cuarto de cultivo para poder conservar
la misma temperatura en toda la habitacin.
La humedad relativa es controlada indirectamente por los equipos de aire
acondicionado. Si la humedad relativa decae bajo 50%, se producir una prdida de
agua de los medios de cultivo y la concentracin de las sales minerales aumentar.
en detrimento de los cultivos. Con una humedad relativa alta (80-100%] habr
posibilidad de ingreso de contaminantes en los envases de cultivo.
El promedio es entre 60 y 70%.
La fuente de luz est dada por lmparas fluorescentes y el fotoperiodo es controlado
por un marcador horario. Las lmparas fluorescentes tienen ventaja sobre las
lmparas incandescentes porque tienen una mejor calidad de luz, distribuyen la luz
uniformemente y emiten menos calor. Sin embargo, algunos cultivos crecen mejor
 con una mezcla de ambos tipos de iluminacin. Los cultivos en su mayora requieren
de iluminacin que vara entre 500 a 3000 lux. Algunos necesitan ms de 5000 lux y
otra oscuridad. Al usar lmparas fluorescentes se deber tener en cuenta que los
balastros generan calor y por lo tanto afectan la temperatura del cuarto de cultivo,
por lo que los balastros deben instalarse fuera de la habitacin.
La disposicin de los estantes en los que se ponen los frascos o tubos con los cultivos
variar segn las dimensiones de la habitacin. Los estantes pueden ser metlicos o
de madera, de preferencia pintados de color blanco.
La dimensin de los estantes puede ser variable, una plataforma de incubacin de
0.45 x 0. 90 m, con una altura de 0.30 m. entre plataformas es aconsejable porque
permite una buena iluminacin, acceso y control a los materiales incubados. El
espacio entre el suelo y la primera plataforma debe tener 0. 15 m de altura. para
facilitar la limpieza del piso. Se debe conservar una distancia de 0.05 a 0. 10 m entre
la pared y los estantes para permitir la libre circulacin del aire acondicionado.

B. Operaciones Bsicas
Las operaciones bsicas que se realizan normalmente en un laboratorio de cultivo
de tejidos se pueden resumir en:
a) Lavado del material de vidrio
b) Pesado de reactivos
c) Limpieza de cuarto de cultivo
d) Preparacin de los medios de cultivo
e) Dispensado y sellado de medios de cultivo
f) Esterilizacin de los medios y materiales
g) Micropropagacin de plntulas
h) Cuarto de incubacin
i) Incubacin y crecimiento de los materiales cultivados hasta su madurez.
 El trasplante de las plntulas enraizadas y su crecimiento posterior requiere de las
condiciones de un invernadero adecuado (fase de invernadero y fase de campo).

2.3. Condiciones de asepsia

Las condiciones de asepsia es uno de los requerimientos ms importantes, para asegurar un
buen crecimiento de plantas.

Materiales de vidrio
Los materiales de vidrio usados para realizar los procesos del cultivo in vitro debe ser
fabricado con materiales resistentes a la accin de los agentes qumicos. Se utiliza bastante
material de vidrio en la preparacin de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales.
El material que se seleccione deber ser de alta calidad, resistente a las variaciones de
temperaturas y no liberar sustancia alguna, especialmente aqulla que es utilizada en la
conservacin de soluciones madres. El vidrio corriente no sirve para la fabricacin de
instrumentos de laboratorio por ser muy frgil y vulnerable a los agentes qumicos y fsicos.
Por tal razn se construyen de cristal de vidrio, pudiendo ser este de vidrio grueso o delgado.

Tubos de ensayo
Son cilindros de vidrios cerrados por unos de sus extremos para calentar, disolver o
hacer reaccionar pequeas cantidades de sustrancias. Se utilizan muy
frecuentemente en los cultivos con pqeuquelas catiodades de soluciones o bien
para diversos tipos de medios. En cultivos que se mantienen en rotacion o en
agitacion, para los medios lquidos, se utilizan tubos de ensayos, asi como tambin
en los medios slidos.
Matraz erlenmeyer
Se utiliza para calentar liquidos, con poca perdida de evaporacion, hacer titulaciones
y recristalizar un solido. Estos materiales se utilizan para preparar medios de cultivo
solidos o quidos; en la preparacion de medios de cultivo. Se usan matraces de
capacidad de 50, 125, 300 y 500 ml; de 1 y 2 litros dependiendo del volumen de
trabajo, se tendra la cantidad requqerida de matraces.
Cajas de petri
Las cajas petri no solo se utilizan para hacer cultivos en medios solidos, tambien
para germinar semillas esterilizadas o bien para esterilizar tapones de hule, filtros
de naylon o de acetato de celulosa, que se utiliza para esterilizar soluciones
organicas e inorganicas y para guardar papel filtro.
Botellas para cultivo
Para propositos de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan las botellas
cilindricas o cuadradas, que pueden ser las botellas de whisky, ron, brandy, etc., que
son resistentes a altas temperaturas y que son muy apropiadas para los medios de
 cultivo solido. Generalmente tienen una tapa rosca y se les puede conservar
facilmente en una posicion vertical u horizontal.
Botellas para reactivos y soluciones madre
Se requieren muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100 ml, 500 ml para
guardar soluciones de varios reactivos. Las botellas oscuras son usadas para evitar
la multiplicacion de hongos y bacterias u oxidacion causadas por la luz. Las botellas
de polipropileno como se utilizan para conservar bajo congelacion compuestos de
composicion indefinida, como el agua de coco, soluciones hormonales o
compuestos orgnicos termo inestables.
Probetas graduadas
Este material permite medir volumenes; las hay de vidrios, de plastico y de
diferentes capacidades. Para el cultivo de tejidos vegetales se requiere probetas de
las siguientes capacidades:
Probetas graduadas: 25, 50, 100, 250, 500, y 1000 ml.
Matraz aforado
Se emplea para medir con exactitud una cantidad de volumen liquido.
Goteros
Permite contener sustancias. Posee un gotero y por esta razon permite dosificar las
sustancias en pequeas cantidades.
Goteros con pera de goma de 10 ml.
Vasijas de vidrio
Para la distribucion de un volumen de medio de cultivo se puede usar diferentes
formas, por ejemplo vasijas de vidrio, embudos grandes en tubos de hule y pinzas
de compresion, columnas de vidrio con boca de salida o botelllas de inyeccion de
linger o simplemente recipientes de aluminio, como jarras.
Jeringas dispensadoras
Cuando son volumenes pequeos de medios de cultivo es muy efectiva la pipeta
automatica del tipo cornwall. Esta pipeta esta diseada especialmente para el
traspaso automatico de dosis repetida de mediciones exactas y con capacidad.
Beacker o vasos precipitados
Es un elemento de vidrio, este instrumento no sirve para medir volmenes exactos,
este se puede calentar sin ningn problema, pues su material resiste altas
temperaturas
Mortero
 Es un elemento de porcelana sirve para poder machacar un objeto del que debamos
extraer algn tipo de sustancias: como por ejemplo para machacar las hojas y poder
sacar as, parte de las sustancias que lo componen.

Instrumentos y aparatos
Para el cultivo de tejidos hay pocos aparatos e instrumentos diseados
especialmente para este propsito. Sin embargo, se pueden escoger varios
instrumentos mdicos, as como tambin muchos aparatos de microbiologa.
Filtro seitz
Para la esterilizacion del aire y liquidos se emplean filtros especiales. El filtro mas
famoso es el Seitz, es usado para esterilizacion del aire del cuarto aseptico, el cual
esta conectado a una compresora de aire.
Hornos para secado
Estos hornos se usan especialmente para el secadio del material de vidrieria lavado
y para la esterilizacion de instrumentos usados para el cultivo. Para la esterilizacion
por secado, la temperatura que se debe conservar es de 140C durante 4 horas o
bien a 150 C 180 C por una hora, por lo que se requiere de un termostato que
sea preciso.
Camara de flujo laminar
Esta diseada para extraer eficientemente toxicos nocivos y otros materiales
dainos de su area de trabajo. Estos suben por la pared de la campana por un medio
de un extractor hacia afuera y asi evitar la ingestion, inhalacion y contacto con la
piel.
Autoclave
Las autoclaves esterilizan con vapor de presion y tienen dos sistemas de
calentamiento: a base de gas o de electricidad. Los modelos de autoclave son de
tipo horizontal o vertical.
La esterilizacion de algodn, gas, papel para envoltura (aluminio, manila), filtros
Seitz, milipore, pipetas, probetas, matraces aforados, agua y medios de cultivo se
hace en autoclave.
Refrigerador y congelador
Celulas, tejidos y soluciones madre, se deben de conservar a bajas temperaturas y
para ello se requiere un refrigerador. Por otro lado, algunas de las vitaminas o
compuestos de composicion quimica indefinida, requieren ser mantenidas en
congelacion.
 Balanzas
La preparacion del medio requier de realizar el pesaje con precision de todos los
componentes que lo integran con precision de todos los componentes que lo
integran con precision y de acuerdo al tipo y a la cantidad de del constituyente que
se agregue al medio, asi sera el tipo de balanza que se emplee. Existe una gran
diversidad de este equipo,sin embargo, hay dos tipos de balanza que son muy
usuales en el laboratorio: granatarias y analiticas, ambas de precision.
Medidores de Ph potenciometro
El potenciometro no solo se usa para medir el Ph de los medios al prepararse, sino
tambien para medir el Ph de los medios durante el periodo de incubacion.
Recientemente se usan aparatos con control automatico de Ph para los cultivos en
suspension.
Destilador
La preparacion de soluciones madre, medios de cultivo, lavado de cristaleria, etc.,
requiere de grandes cantidades de agua, por lo que es necesario tener un destilador
grande de metal, tomando en cuenta que el agua obrtenida asi, contiene una
pequea cantidad de iones de metales pesados, condicion que afecta el desarrollo
de las celulas en cultivo.
Agitador magnetico
Es un aparato fundamental para la preparacion de los medios de cultivo. Su uso
permite la mezcla de los constituyentes del medio durante la elaboracion de las
soluciones madre o bien en la preparacion del medio definitivo. Tambien existen
diversos modelos, pero su funcionamiento se limita a dos aspectos, agitar, lo cual
permite mezclar el soluto con el solvente y con sistema de calentamiento, lo que
facilita la disolucion de algunos compuestos que requieren calor para entrar en
solucion.
Microscopio.
El microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado
pequeos para ser vistos a simple vista.
Estereoscopio
Los estereoscopios permiten hacer estudios de objetos y especmenes demasiado
pequeos para ser estudiados a simple vista, pero demasiado grandes para ser
estudiados bajo el microscopio compuesto. Su magnificacin va desde cerca de 5x
hasta ms de 60x. Los estereoscopios tambin son conocidos como microscopios de
diseccin, pues en muchas ocasiones son usados para disecar los especmenes o
 muestras, separando de ellos aquellas partes que sern examinadas mediante otros
tipos de microscopa.
licuadora
se utiliza para licuar extractos vegetales para controlar plagas.
Peachimetro.
Es el que mide con exactitud el potencial de hidrogenizacion .
Mechero bunsen
este mechero de gas que debe su nombre al qumico alemn ROBERT W. BUNSEN
proporciona una llama caliente (de hasta 1500 grados centgrados), constante y sin
humo, por lo que se utiliza mucho en los laboratorios. Este formado por un tubo
vertical metlico, con una base, cerca de la cual tiene la entrada de gas, el tubo
tambin presenta un orificio para la entrada de aire que se regula mediante un anillo
que gira. Al encender el mechero hay que mantener la entrada del aire cerrada;
despus se va abriendo poco a poco. Para apagar el mechero se cierra el gas.
Embudo
Es un utensilio que permite filtrar sustancias.
C. MATERIALES Y METODOS
La practica se realizo en el Laboratorio de Cultivos In Vitro de la Ciudad Universitaria,
Facultad de Ciencias Agrarias UNASAM.
a. MATERIALES
Cuaderno de apuntes
Camara fotografica
Lapiceros
b. METODOLOGIA
La practica se realizo el dia 18 de octubre del 2017, dirigido por la Ing Pilar
Caycho Medrano.
Ella nos mostro los espacios utilizados en nuestro laboratorio in vitro a la vez
nos mostro los instrumentos de laboratorio que intervien en todo el proceso de
micropropagacin.
Observamos lo siguiente:
Areas del laboratorio
1. Area de oficina: que sirve como recepcion de personas visitantes y
atencin al publico en general.
2. Area de lavado
3. Area de transferencia
 4. Cuarto de cultivo
Materiales observados
Balanza analitica
Balanza mecanica
Purificador de agua
Potenciometro de meza: mide el ph del agua
Cocinilla electrica: cuando se prepara el medio de cultivo solido
poder entibiar el medio y lograr que se disuleva el agar, la cocinillas
actuales tiene agitador magnetico, pero como no tenemos el
material se agita con varillas
Autoclave
Campana de vacio: sirve para gurdar recactivos sin aire
Microoscopio
Esteroscopio
Reactivos
Sorbitol (antioxidante)
Acido ascorbico
Mannitol (para medios de cultivo de conservacion)
Agua destilada quimicamente pura: nos sirve para eliminar
particulas organicas que puedan haber en el agua
D. RESULTADOS Y DISCUCIONES
4.1. RESULTADOS
No hubo resultados debido a que no se realiz ninguna practica en
el laboratorio
4.2. DISCUSIONES
se observ que si se quiere tener una produccin mejor se tiene
tambin que tener los elementos necesarios para su realizacin,
pero lamentablemente el laboratorio no lo posee es por eso que no
se ha podido subir su nivel de produccin. Adems que el ambiente
que posee es muy bsico y no permite implementar equipos
mejores ni lograr un mayor avance en este tipo de tecnologa
innovadora.
E. CONCLUSIONES
o Se observo que poseemos solo un laboratorio con materiales bsicos poco
sofisticados
 o Se pudo identificar los materiales de laboratorio y sus respectivas funciones
o Se observ que los materiales utilizados poseen un nivel de fragilidad muy
elevados, adems que el uso de cada ambiente en el proceso de
micropropagacin es de suma importancia para lograr el resultado esperado.
F. Recomendaciones
Se recomienda que el laboratorio y lo materiales y equipos utilizados se
encuentre en condiciones de asepsia.
Los micropropagadores deben estar con la indumentaria adecuada para
evitar contaminacin del material (usar guardapolvo, mascarillas, guantes)
Los equipos deben de ser manipulados con sumo cuidado debido a que son
muy frgiles.
Se debe tener cuidado con el material a propagar y con el reconocimiento
de especies debido a que un error puede provocar la prdida total de la
produccin de una campaa.

G. BIBLIOGRAFA
Segretn, M. E. (2008). Los cultivos celulares y sus aplicaciones II. Argentina:
Argen-Bio
ROCA, M.W. 1991, CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA
FUNDAMENTOS Y APLICACIONES, EDIT. XYZ, CALI COLOMBIA. PAGINAS. 7-
10.
http://agropimient.blogspot.pe/2010/08/informe-de-laboratorio-cultivo-
invitro.html
http://teca.fao.org/es/read/4290
http://es.scribd.com/doc/3246492/Material-de-laboratorio
 E. ANEXOS

MATERIALES DE VIDRIO

TUBOS DE ENSAYO MATRAZ ERLENMEYER CAJAS DE PETRI

BOTELLAS PARA CULTIVO BOTELLAS PARA REACTIVOS PROBETAS GRADUADAS

Y SOLUCIONES MADRE

MATRAZ AFORADO GOTERO VASIJAS DE VIDRIO

 JERINGAS DISPENSADORAS

INSTRUMENTOS Y APARATOS

FILTRO SEITZ HORNOS PARA SECADO CMARA DE FLUJO LAMINAR

 AUTOCLAVE REFRIGERADOR Y CONGELADOR BALANZA ANALTICA Y MECNICA

MEDIDORES DE PH - DESTILADOR AGITADOR MAGNETICO

POTENCIOMETRO

MICROSCOPIO CAMPANA DE VACIO

 REACTIVOS

SORBITOL ACIDO ASCORBICO - MANNITOL

PHYTAGEL MURASHIGE