Dnombrement des microorganismes

revivifiables par incorporation en

glose
Mise jour le 09/03/2010
Par lhuillier

Dernire mise jour : 6 mai 1999

Objectifs
Evaluer la qualit bactriologique d'une eau. L'absence de micro-
organismes dans une eau peut s'interprter de deux manires : eau
protge des sources de contamination ou prsence d'lments toxiques
ayant entran leur disparition. La prsence d'une quantit importante de
micro-organismes rvle l'existence d'une contamination dont il faut
rechercher les causes et les lments.

Informations
Nature des micro-organismes : bactries, levures, moisissures se
dveloppant en arobiose 37C +/- 1C.
Norme : pour les eaux livres sous forme conditionne, le nombre
de micro-organismes doit tre infrieur 20/mL aprs 24 heures de
culture, infrieur ou gal 200/mL aprs 72 heures.
Effets sur la sant : ils dpendent des espces de bactries
prsentes dans l'eau et de leur nombre.
Principe de la mesure
Mise en culture sur une glose nutritive d'un d'chantillon d'eau d'un
volume de 1 mL et comptage des colonies aprs incubation 37C
pendant 24 72 h.
Matriel
Strilisation : four (temprature minimale de 170C) ; autoclave ;
cocotte minute.
Etuve ou enceinte thermostate 37C +/- 1C.

Matriel de microbiologie : boites de ptri striles, pipettes 1 mL

striles (usage unique), flacons striles, glose PCA (Plate Count
Agar), tubes bouchon vissant contenant 9 mL d'eau strile.
Protocole
Prparation de la glose et conservation :
 Suivre les indications fournies avec la glose PCA et striliser en
flacons de 100 mL 200 mL.
Laisser cette glose en surfusion dans une tuve 47C si le TP
est prvu dans la semaine. Sinon conserver la glose au
rfrigrateur, la mettre en fusion au four ou au bain marie
bouillant quelques heures avant le TP.
Strilisation des flacons de prlvement
Mettre du coton card (hydrophobe) sur l'embouchure, recouvrir
de papier aluminium.
Striliser (au four 170C pendant 1 heure ; l'autoclave
120C pendant 20 min ; dans une cocotte minute contenant un
peu d'eau pendant 40 minutes aprs la mise en rotation de la
soupape).
Prlvement :
Eau de rivire, de puits, etc. : attacher la bouteille strile une
corde, lester. Maintenir la bouteille dans l'eau la profondeur
souhaite. Boucher avec le coton card conserv dans le papier
aluminium.
Eau du robinet : nettoyer le robinet avec un tissu propre, laisser
couler l'eau pendant 1 2 min. Striliser la flamme (briquet,
lampe alcool) l'embouchure du robinet, laisser couler l'eau
pendant 1 2 min. Remplir le flacon en laissant un peu d'air.
Boucher avec le coton card conserv dans le papier
aluminium.Conserver l'chantillon au rfrigrateur, ensemencer
le plus vite possible.
Ensemencement :
Prparer une zone strile en plaant autour du bec bunsen le
matriel ncessaire : boites de ptri, pipettes striles, glose en
surfusion
Agiter le flacon vigoureusement et prlever 1 mL d'chantillon. Si
l'chantillon provient d'un milieu qui semble contamin, raliser
des dilutions en srie en zone strile. Mettre 1mL d'chantillon
d'eau dans un tube essai contenant 9 mL d'eau strile (dilution
au 1/10). Agiter ce tube, y prlever 1 mL et verser dans un autre
tube contenant 9 mL d'eau strile (dilution au 1/100). Etiqueter le
fond des boites de ptri : lieu de prlvement, dilution
 Mise en culture. En zone strile, verser 1 mL d'chantillon dans
une boite de ptri, rpartir au fond de la boite par gouttes. Couler
la glose en surfusion (5 mm d'paisseur suffisent). Mlanger
par rotation, mettre le couvercle entrouvert, et laisser solidifier en
zone strile. Si l'chantillon semble contamin, faire plusieurs
ensemencements des dilutions diffrentes : 1/1, 1/10, 1/100.
Incubation

Placer les boites l'tuve 37C (incuber les botes couvercle

vers le bas pour que la condensation s'accumule dans le
couvercle) .
Retirer 22 24 heures aprs. Conserver au rfrigrateur.
Rsultats
Dnombrement

Le dnombrement des bactries repose sur le principe selon

lequel une colonie se forme par divisions d'un seul micro-
organisme.
Compter les colonies en marquant chaque colonie sur le fond de
la bote avec un marqueur indlbile.
Pour des raisons de scurit, ne jamais ouvrir la bote.
Lisibilit des rsultats

Une boite est considre comme lisible si la population est

infrieure 300 colonies. Sinon, effectuer le comptage sur une
boite o l'chantillon a t dilu.
En cas de dilution, une boite est considre comme lisible si elle
contient au moins 1 colonie.
Nombre de bactries par mL

Calculer la population par mL en tenant compte de la dilution.

Dcontamination
Ouvrir les boites au laboratoire, les dcontaminer l'autoclave 120C
pendant 20 minutes ou dans l'eau de Javel dilue (un berlingot de
250 mL complt 1 L avec de l'eau distille) pendant 24 heures.