Vectores de expresin
Plsmido
Estn diseados para producir
muchas copias de una protena
seleccionada en una clula
husped. Para usar este tipo
de vector, el gen a expresar se
clona en una secuencia de
reconocimiento del sitio de
clonacin mltiple, lo que sita
el gen adyacente un promotor
vrico (ej. T7) y un operador (ej.
lac). Despus de introducir los
plsmidos recombinantes en la
clula husped, se induce la
expresin aadiendo un
inductor gratuito al medio, lo
que activa el gen produciendo
grandes cantidades de la
protena codificada.
El vector de expresin pET es
un sistema que utiliza una
clula husped modificada
genticamente. La clula
husped contiene el gen vrico
de la RNA polimerasa T7 bajo
control del promotor y del
operador lac, lo que hace que
sea inducible con el IPTG. Este
sistema combina un promotor
fuerte con una regulacin muy
estricta. Utiliza como gen
selectivo al gen de resistencia
a la ampicilina.
Alejandro Daz de la Vega Gonzlez
Tecnologas de Recombinacin Gentica 5BV1
Vectores de clonacin
Fago Csmidos Cromosomas artificiales
Proceden de molculas Para ser utilizado el tercio
de DNA central del cromosoma puede
extracromosmico que se ser reemplazado por el DNA
encuentran de de manera forneo, sin que ello afecte la
natural, se replica de capacidad del fago de infectar
manera autnoma dentro clulas y formar calvas. Los
de las clulas vectores de recombinantes
bacterianas. Permiten la se empaquetan in vitro en las
produccin de muchas cpsides proteicas del fago, y
copias de DNA. Uno de se introducen en clulas
estos plsmidos es husped bacterianas. Dentro
pUC18 que tiene como de las bacterias, los vectores
caracterstica : se replican y forman muchas
Es pequeo de alrededor copias del fago infectivo, lisan
de 2686 pb, tiene un las clulas husped
origen de replicacin, bacterianas formando muchas
puede producir hasta 500 claras en las placas conocidas
copias, un sitio de como calvas, de las que se
mltiple clonacin, un gen puede recuperar el DNA
reportero lacZ y un gen clonado. Los vectores fgicos
selectivo Amp. pueden transportar insertos de
Generalmente hasta 20 kb. No transportan
transportan hasta 10 kb. insertos pequeos.
Vectores en Procariontes
Son vectores hbridos
construidos utilizando partes
del cromosoma de lambda y de
plsmidos. Los csmidos
contienen la secuencia cos del
fago lambda, necesaria para el
empaquetamiento del DNA del
fago dentro de la cubierta
proteica, y secuencias
plasmdicas necesarias para la
replicacin. Tambin requieren
genes resistentes
antibiticos de origen
plsmidicos, que ayudan a
identificar las clulas husped
que contienen los csmidos
recombinantes. Despus de
insertar los fragmentos de
DNA, los csmidos
recombinantes se empaquetan
en la cpside proteica lambda
para formar partculas
infectivas. Dentro de la clula
husped bacteriana,
csmido se replica como un
plsmido. Los csmidos
pueden transportar casi 50 kb
de DNA.
El csmido pjB8 contiene un
origen bacteriano, una sola
secuencia cos, gen de
resistencia a la ampicilina amp
y una regin que contiene
sitios de clonacin mltiple.
Puesto a que este vector es
pequeo puede aceptar
segmentos de DNA exgeno
de 33 a 46 kb de longitud.
bacterianos
Estos vectores tienen una gran
capacidad de clonacin de
hasta 300 kb, denominado
cromosoma artificial bacteriano
(BAC), basado en el plsmido
de fertilidad (factor F) de
bacterias. Estos vectores
tienen genes de replicacin y
nmero de copias del factor F,
e incorporan al menos un
a marcador de resistencia a
antibiticos y un sitio de
clonacin multiple con diversas
secuencias de
reconocimientos para enzimas
de restriccin. Admas esta
flanqueado por regiones
promotoras que pueden
utilizarse para generar
molculas de RNA y expresar
el gen clonado.
pBAC 108L
el Es un BAC con diversos sitios
de restriccin nicos para la
insercin de DNA exgeno.
Las marcadas como T7 y Sp6
son regiones promotoras que
permiten la expresin de los
genes clonados entre estas
regiones.
Alejandro Daz de la Vega Gonzlez
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 YAC
Los cromosomas artificiales de
levadura YAC (yeast artificial
chromosome) un YAC tienen
telmeros en sus extremos, un origen
de replicacin autnomo ARS y un
centrmero. Estos componentes
estn unidos a genes marcadores de
seleccin y un grupo de secuencias de
reconocimiento de enzimas de
restriccin para insertar DNA
exgeno. El tamao de los
cromosomas de levadura va de 230 kb
a ms de 1900 kb, lo que permite
clonar insertos de DNA de 100 a 1000
kb.
El cromosoma artificial pYAC3
contiene secuencias telomricos TEL,
un centrmero CEN, procedente del
cromosoma del cromosoma 4 de
levadura y un origen de replicacin ori.
TRP1 y URA3 son genes de levadura
que sirven de marcadores de
seleccin para los brazos izquierdos y
derecho del cromosoma. Sitios de
restriccin SUP4. BamH1 flanquea un
segmento espaciador. El corte con
SnaB1 y BamH1 rompe el cromosoma
artificial en dos brazos.
Alejandro Daz de la Vega Gonzlez
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Plsmido Ti
La transferencia de genes a plantas
superiores utiliza vectores
plsmidicos de Agrobacterium
tumifaciens infecta las plantas y
produce tumorales (denominadas
agalla de la corona) en muchas
especies de plantas. La formacin de
los tumores se asocia a la presencia
de un plsmido inductor de tumores
(Ti) un segmento del plsmido
conocido como T-DNA, transfiere
genoma. T-DNA contiene genes que
controlan la formacin del tumor y la
sntesis de molculas necesarias
(genes exgenos). Al quitarle la regin
T, ya no causar la enfermedad, pero
servir como vector, este es conocido
como: plsmido Ti. A este se le
agregan genes de resistencia (gen
selectivo). Y se hace crecer en tejidos
meristemticos.
Vectores en Eucariontes
Retrovirus
Un vector retroviral consiste en
secuencias provricas que contiene el
gen de inters, para permitir la
incorporacin de ambos en las clulas
diana (clulas animales). El vector
tambin contiene promotores de
genes virales y celulares, tales como
el promotor de CMV, para potenciar la
expresin del gen de inters en las
clulas diana.
Cuenta con enzimas como: la
retrotranscriptasa y la que inserta el
material gentico (Integrasa).
Ya que no se sabe donde se inserta el
material gentico representa un
problema Por lo tanto se han
desarrollado dos estrategias:
Entrega directa, consiste en que las
partculas virales con el material
teraputico y se inyecta directamente
al paciente.
Entrega basada en clulas, se hace
un explante, tomar los tejidos del
organismo, luego se transforman las
clulas y ya transformadas, se
vuelven a inyectar al paciente.
Mediado por
transposones
Un segmento del DNA puede saltar de
una zona a otra del genoma, dicho
segmento se
llama transposn o elemento gentico
transponible. El gen que codifica para
la enzima transpososasa, que hace la
transposicin, es la que logra que el
elemento P se pase de un lado a otro,
el gen se ubica en el plsmido helper.
El vector que acompaa al vector
helper debe tener los extremos del
elemento p y en medio se puede
poner genes de inters.
Despus de que ambos plsmidos
son inyectados la transpsosasa
corta en los sitios P e integra la
secuencia al azar en el DNA.
Alejandro Daz de la Vega Gonzlez
Tecnologas de Recombinacin Gentica 5BV1

Qumicos
Mediado por liposomas:
En un reactivo de lipofeccin, dentro de la
bicapa de fosfolpidos se envuelve el
material gentico que se desea insertar,
estos liposomas van a entrar por
endocitosis y con esa endocitosis al
degradarse la pared celular para liberar el
material gentico.
Gradiente de calcio:
Crea un gradiente de
concentracin para estas molculas, por
lo que tienen el potencial para difundirse
hacia el interior de la clula
Alejandro Daz de la Vega Gonzlez
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Trasfeccin de celulas
Fsicos Biolgicos
Transferencia de genes por Virus
lasser: Al quitar los genes que causan la
El lasser mediante un electrodo altera la virulencia se remplazan por los genes
diferencia de potencial de la clula y eso exgenos de inters. Para que estas
hace que esta para recobrar su potencial clulas entren con una clula diana tienen
abra canales. que tener el mismo receptor de la clula
Biobalistica diana y se inyecta el material gentico de
El tejido vegetal es tratado con celulasas y inters.
degradar la pared celular y que solo quede
el protoplasto. Una partcula de Au se
rodea del DNA que se quiere insertar. Y
por afinidad de cargas va a estar unido, y
mediante una pistola de partculas, se
metern a las clulas por bombardeo.
Microinyeccin:
Consiste en introducir el material gentico
directamente al ncleo de la clula.
Electropolacin:
Consiste en provocar un aumento
significativo de la conductividad elctrica y
la permeabilidad de la membrana
plasmtica celular mediante un campo
elctrico aplicado externamente.