Separao e Purificao de Protenas

Cromatografia de afinidade com metal imobilizado

e suas variantes

baseada na afinidade das protenas

Amin Karmali
Laboratrio de Engenharia Bioqumica
Seco de Biotecnologia do Departamento de Engenharia Qumica
Instituto Superior de Engenharia de Lisboa.
Rua Conselheiro Emdio Navarro
1900 Lisboa Portugal
Tel : 21-8317052 Fax: 21-8317267
e-mail: akarmali@ scientist.com.
Resumo
Neste artigo so abordados os
conceitos bsicos da cromatografia
de afinidade com metal imobilizado
(IMAC) em termos de mecanismos
de reteno de protenas, tipo de
resduos aminoacdicos envolvidos,
seleco do metal, introduo de
caudas de resduos de histidina
nas protenas e metodologia
experimental. As vantagens e
inconvenientes do IMAC em relao
cromatografia de afinidade (AC)
so discutidas. Algumas variantes da
tcnica do IMAC so apresentadas
nomeadamente, a partio por
afinidade com metal imobilizado
(IMAP), electroforese em gel de
afinidade com metal imobilizado
(IMAGE) e electroforese capilar de
afinidade com metal imobilizado
(IMACE). Os princpios bsicos
destas tcnicas so referidos bem
como as suas vantagens e
desvantagens em relao ao IMAC.
Introduo
activadas por metais
metaloenzimas); 2- suporte e
estrutural ( protenas constituintes de
membranas celulares, tecidos e
cartilagens) e 3 - transporte
(hemoglobina) entre outras.
2. Cromatografia de
afinidade com metal
imobilizado (IMAC)
Em 1975 Porath e colaboradores
apresentaram uma tcnica de
separao e purificao de protenas
pelos metais de transio. Esta
tcnica foi denominada
cromatografia de afinidade com
metal imobilizado , do ingls,
Immobilized Metal Affinity
Chromatography (IMAC). O
princpio fundamental do IMAC
consiste na interaco entre as
protenas em soluo e os ies
metlicos imobilizados num suporte
slido. Estes suportes contendo ies
de Cu2+ ,Ni2+ , Zn2+ ou Co2+ so
e apropriados (adequados) para o
fraccionamento de protenas com
base no seu contedo relativo de
resduos de histidina, cistena,
cadeias laterais aromticas de
aminocidos e de grupos N-terminal
acessveis de aminocidos (Porath,
1992). Estes resduos devem estar
disponveis superfcie das protenas
com vista formao de interaces
com os metais de transio (Cu 2+
,Ni2+ , Zn2+ ou Co2+). Assim, esta
tcnica permite no s a purificao
de protenas com base na presena
destes resduos sua superfcie como

1. Introduo
A afinidade das protenas pelos ies
metlicos j conhecida h mais de
um sculo. A habilidade das
protenas se ligarem aos ies
metlicos largamente explorada nos
sistemas biolgicos para
desempenhar vrias funes a seguir
discriminadas: 1- catlise (enzimas Figura 1. Sntese de Sepharose 4B- epox-activada-IDA como adsorvente do IMAC.

2 Boletim de Biotecnologia

tambm uma anlise estrutural
topolgica detalhada das protenas.
2.1. Mecanismo de reteno de
protenas
O princpio do IMAC baseia-se no
facto de que os metais de transio
(Cu 2+ , Ni2+ , Zn2+ e Co2+) podem
coordenar com alguns aminocidos
tais como a histidina, cistena e
triptofano, atravs dos grupos
dadores de electres nas cadeias
laterais desses aminocidos . A
Figura 2. Representao diagramtica de um adsorvente de IMAC (gel de IDA-Me).
Representao das letras Me, P e X: Me metal; P suporte cromatogrfico insolvel e X - H20,
ies de soluo tampo ou resduo aminoacdico da protena (Adaptado de Porath e Olin, 1983).
Figura 3. Resduo de histidina coordenado ao Cu(II)-IDA que est imobilizado a um suporte
cromatogrfico insolvel (Adaptado de Arnold, 1991).
Separao e Purificao de Protenas
utilizao destas interaces para fins
cromatogrficos requer que o io
metlico seja imobilizado num
suporte insolvel. Esta imobilizao
pode ser efectuada ligando um grupo
quelante matriz cromatogrfica.
Existem vrios agentes quelantes
usados no IMAC sendo o cido
iminodiactico (IDA) o mais
utilizado . Este composto pode ser
acoplado a vrias matrizes
cromatogrficas nomeadamente a
Sepharose 6B, Sepharose 4B ou
Sephadex G-100 atravs de um
1994). Embora as cistenas livres
longo brao espaador hidrfilo
(Figura 1).
O brao espaador assegura que o
metal quelante est totalmente
acessvel para todos os centros de
ligao disponveis numa protena
(Figura 2).
Como os metais podero coordenar
com 4 a 6 ligandos, os restantes
centros de coordenao esto
ocupados com molculas de H20 ou
ies de solues tampes que podem
ser removidos ou desalojados por
grupos funcionais apropriados da
protena. Como est ilustrado na
Figura 3, o Cu(II)-IDA coordena
com o tomo de azoto oude um
resduo de histidina disponvel
superfcie da protena. A formao
de um complexo ternrio entre o
quelato com o seu io metlico
ligado e a protena provoca reteno
no IMAC.
2.2 Os aminocidos envolvidos
na ligao ao metal.
Nas metaloprotenas, um elevado
nmero de grupos funcionais
participam na ligao ao metal
nomeadamente os resduos de Glu,
Tyr, Cys, His, Arg, Asp, e Met.
Contudo, no IMAC as cadeias
laterais da histidina dominam a
ligao das protenas aos quelatos de
metal imobilizados (Yip et. al.,
possam ligar-se aos quelatos de
metal, na prtica estes resduos esto
raramente disponveis no estado
reduzido apropriado. Com efeito, os
resduos de cistena expostos
superfcie da protena so
rapidamente oxidados na presena de
ies Cu2+ com a formao de pontes
dissulfureto (Arnold, 1991; Sousa e
Karmali, 1998). Os grupos N-
terminal das protenas tambm se
ligam aos quelatos de metais a
valores de pH a partir de 8.0 quando
esto na forma no-protonada
(Tabela 1).
Os aminocidos contribuem na
ligao aos quelatos de metal de duas
formas: 1- ligao directa ao metal e
2- indirectamente, devido ao seu
Boletim de Biotecnologia 3
 Separao e Purificao de Protenas
Tabela 1. Mecanismos de ligao de protenas aos quelatos de
metal imobilizados [Cu(II), Ni(II) e Zn(II)-IDA]; contribuies relativas
das cadeias laterais de aminocidos e do N-terminal de protenas.
Grupo funcional
Cadeias laterais
His
Cys
Asp, Glu
Lys, Arg
Trp, Tyr, Phe
N-terminal
* Um resduo de cistena ir ligar-se no IMAC apenas na forma reduzida. Os metais catalisam a
oxidao da Cys.
** O mecanismo torna-se directo a altos valores de pH (Adaptado de Arnold, 1991).
efeito na acessibilidade dos resduos
de histidina. As cadeias laterais
aromticas de aminocidos (Trp,
Phe, and Tyr) aparentemente
contribuem na reteno de protenas
no IMAC devido a um efeito
indirecto que aumenta e fortalece as
interaces Cu2+-residuos de
histidina bem como a estabilidade
destes complexos (Arnold, 1991).
2.3. Seleco do metal
A afinidade aparente de uma protena
para um quelato de metal depende
fortemente do io metlico envolvido
na coordenao. A reteno de uma
protena nos diferentes metais est de
acordo com a afinidade do metal pelo
imidazole. Assim, quer a reteno de
protenas quer as constantes de
estabilidade dos complexos com
imidazole obedecem seguinte
ordem : Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ~Co2+
(Arnold, 1991).
2.4. Introduo de caudas de
His nas protenas
recombinantes
Na ltima dcada , tem-se observado
um crescente interesse na engenharia
de centros de ligao de metais nas
protenas para a catlise, regulao
da actividade enzimtica,
reconhecimento e purificao de
protenas. As protenas nativas que
4 Boletim de Biotecnologia
Contribuio Mecanismo
++++ directo
++++* directo
- indirecto
+ Indirecto**
+ indirecto
++ directo
no contm grupos funcionais (His,
Trp e Phe) disponveis superfcie
para coordenao de metais, podem
ser modificadas atravs da
tecnologia da engenharia gentica de
forma a apresentar afinidade por
quelatos de metal imobilizados
(Gaberc-Porekar et. al, 1999; Muller
et. al., 1998). Assim, uma cauda de
resduos de His pode ser introduzida
no N-ou C-terminal de uma protena
sendo esta protena produzida na
forma recombinante contendo um
pequeno peptido de 4 a 6 residuos de
His no respectivo terminal. Estas
protenas geneticamente manipuladas
contendo um peptido com afinidade
pelos quelatos de metal podem ser
purificadas por IMAC sendo o
pptido removido da protena atravs
da aco de uma protease obtendo-
se assim a protena na forma nativa e
biologicamente activa.
Esta estratgia foi usada com sucesso
na purificao num s passo
cromatogrfico por IMAC de vrias
protenas de interesse industrial e
teraputico, nomeadamente a
interleuquina 1 humana (Patwardhan
et. al., 1997), -galactosidase e
transcriptase reversa do HIV
(Vosters et. al, 1992). Por
conseguinte, esta tcnica poder ser
til na montagem de um mtodo
universal de purificao de
protenas recombinantes num s
passo cromatogrfico , com um
elevado grau de pureza e rendimento
de actividade biolgica.
2.5. Metodologia experimental
A metodologia experimental bsica
do IMAC bastante simples. Esta
tcnica envolve trs passos
principais: 1 carregamento da
coluna com o metal apropriado; 2-
adsoro das protenas coluna e 3-
eluio das protenas (Pacheco e
Karmali, 1998).
De uma maneira geral, o
carregamento da coluna do IMAC
envolve a passagem da soluo de
um sal de metal (ZnCl2, CuS04 ou
NiCl2) sobre a coluna que est
previamente empacotada com o gel
(Sepharose 6B-epoxi-activada
IDA). Seguidamente, a coluna
lavada com H20 para remoo de
ies Cu(II) em excesso e equilibrada
com uma soluo tampo apropriada.
De uma maneira geral, usa-se o
tampo fosfatos 50mM contendo
NaCl 1M a pH 7.0.
A prxima etapa consiste na
aplicao da amostra contendo a
protena a purificar a um caudal de
10 a 20 cm3/h. A coluna lavada
com a soluo tampo de
equilibrao at a A280 apresentar um
valor inferior a 0.05 e seguidamente
procede-se eluio da protena
adsorvida na coluna. A eluio de
protena pode ser efectuada por
vrios mtodos nomeadamente
atravs de: 1- gradiente decrescente
de pH; 2- gradiente crescente de um
ligando competitivo (ex: imidazole) e
3- gradiente crescente de um agente
quelante (ex. EDTA). Contudo o
mtodo de eluio mais usado no
IMAC consiste num gradiente linear
de imidazole (0-30mM) no mesmo
sistema de tampo. Por fim, a coluna
pode ser regenerada com uma
soluo de EDTA 50mM, carregada
novamente com o metal apropriado
e equilibrada com uma soluo
tampo apropriado para uma nova
corrida cromatogrfica.

2.6 IMAC e cromatografia de
afinidade (AC)
Atravs das consideraes tecidas
nos pontos anteriores, podemos
constatar que o IMAC uma tcnica
poderosssima de separao e
purificao de protenas com
aplicao potencial escala
industrial. O IMAC apresenta
algumas semelhanas tcnica
convencional de cromatografia de
afinidade (AC) e a Tabela 2
(Adaptado de Arnold, 1991) resume
as principais vantagens
inconvenientes destas duas tcnicas.
2.7 Aplicaes do IMAC
O IMAC uma tcnica de separao
e purificao de protenas largamente
usada no isolamento de enzimas e
anticorpos num s passo
cromatogrfico.(Boden et. al., 1995;
Pacheco e Karmali, 1998; Chaga et.
al., 1999). Estas protenas so
purificadas com um elevado
rendimento de actividade biolgica e
apresentam elevado grau de pureza
(Sousa e Karmali, 1998; Martinho et.
al., 1998). As caractersticas desta
tecnologia permitem que seja usada
escala industrial para isolamento de
protenas de interesse comercial.
Por outro lado, o IMAC apresenta
aplicaes interessantes na anlise
topolgica de protenas podendo
diferenciar protenas mutantes ou
alteradas com uma nica substituio
aminoacdica na cadeia polipeptdica
(Hemdan et. al., 1989; Martins, et.
al., 2000).
Tabela 2. Estudo comparativo do IMAC e da cromatografia de
afinidade (AC).
Estabilidade do ligando
Capacidade da coluna
Condies de eluio
Recuperao do ligando
aps regenerao
Selectividade
Custo
Separao e Purificao de Protenas
3. Partio por afinidade
com metal imobilizado
(IMAP)
O sistema de duas fases aquosas
uma tcnica poderosssima de
separao e purificao de protenas
(Karmali and Serralheiro, 1988;
Huddleston et. al., 1991). Baseando-
se na teoria do IMAC, foi
demonstrado que a introduo do
Cu(II)-IDA-polietileno glicol (PEG)
no sistema de duas fases aquosas de
PEG-dextrano aumenta a partio de
e
protenas contendo resduos de
histidina acessveis sua superfcie
na fase superior rica em PEG
(Pesliakas et. al., 1994). De uma
maneira geral, o mecanismo de
reteno de protenas observado no
IMAC tambm se mantm, na
partio de afinidade com metal
imobilizado, do ingls, Immobilized
Metal Affinity Partitioning (IMAP).
Alm da separao e purificao de
protenas, esta tcnica tambm foi
usada na separao de vrios tipos de
clulas nomeadamente eritrcitos
humanos e de coelho (Botros et. al.,
1991), linfcitos B e T e monocitos
(Laboureau et. al., 1996). O
mecanismo bsico de reteno de
protenas observado no IMAC
tambm se aplica, de uma maneira
geral, neste sistema celular de IMAP
na medida em que ocorrem
interaces entre os resduos de
histidina acessveis superfcie das
protenas membranares dos
eritrcitos e o quelato de metal em
soluo. Esta variante do IMAC foi
usada com sucesso na purificao de
IMAC AC
elevada baixa
elevada baixa
suaves drsticas
geral/incomplet
completa
a inconvenientes nomeadamente as
baixa-mdia elevada
baixo elevada
vrias protenas nomeademante,
isoenzimas de lactato e malato
desidrogenases (Otto and
Birkenmeier, 1993; Pesliakas et. al.,
1994) bem como na separao de
vrios tipos de clulas animais
(Laboureau and Vijayalashmi, 1997;
Nanak et. al., 1995).
Alm da possibilidade de se efectuar
a separao de vrios tipos de
clulas, esta tcnica apresenta uma
vantagem em relao tcnica
convencional do IMAC na medida
em que permite a purificao de
protenas directamente a partir do
extracto celular bruto contendo
fragmentos e detritos celulares.
4. Electroforese em gel de
afinidade com metal
imobilizado (IMAGE)
A electroforese em gel de afinidade
com metal imobilizado, do ingls,
Immobilized Metal Affinity Gel
Eletrophoresis (IMAGE) um dos
mtodos derivado do (IMAC).
Assim, o quelato de metal (IDA-
Cu(II)) ligado covalentemente a
um polmero (PEG 5000) e
incorporado na agarose solvel como
matriz de separao electrofortica
(Goubran-Botros et. al., 1992). Os
resultados demonstraram claramente
que o mecanismo de reteno de
protenas no IMAC se mantinha na
variante de IMAGE. Efectivamente,
as protenas padro contendo n s
crescentes de residuos de histidina
disponveis superfcie
apresentavam uma forte ligao aos
quelatos de metal obtendo-se baixos
valores de constante de dissociao
(Kd). Esta tcnica de IMAGE
apresenta uma vantagem em relao
ao IMAC na medida em que uma
tcnica essencialmente analtica
permitindo a quantificao de
interaces das protenas com os
quelatos de metal atravs da
determinao de Kd (Baek et. al.,
1996). Contudo, apresenta alguns
condies do IMAC (fora inica,
pH, agentes no quelantes) devem
Boletim de Biotecnologia 5
 Separao e Purificao de Protenas
ser mantidas e o uso de uma gama de
pH entre 6.0 7.0.
5. Electroforese capilar de
afinidade com metal
imobilizado (IMACE)
Uma outra variante de IMAC foi
desenvolvida que envolve a A. K. agradece Fundao para a
utilizao de pequenos ligandos
ligados covalentemente a uma matriz
solvel e substituvel. O quelato de
metal (IDA-Cu(II)-PEG) foi usado
num sistema modelo e as interaces
com diferentes protenas modelo foi
investigado (Haupt et. al., 1996).
Este mtodo permite a determinao
de constantes de dissociao (Kd)
que apresentam uma correlao com
o n. de resduos de histidina
acessveis e o microambiente da
histidina na protena. O mecanismo
bsico observado no IMAC tambm
se mantinha nesta variante
denominada electroforese capilar de
afinidade com metal imoblizado, do
ingls, Immobilized Metal Affinity
Capillary Electrophoresis (IMACE).
Esta variante do IMAC necessita de
pequenssimas quantidades de
amostra e permite quantificar as
interaces de baixa afinidade entre
a protena e o quelato de metal (Kd)
bem como a anlise da estrutura
topolgica da protena e a relao
entre a estrutura e funo de
protenas (Haupt et. al., 1996; Jiang
et. al., 1999). Contudo, esta tcnica
apresenta algumas desvantagens
nomeadamente as condies do
IMAC (fora inica, pH, agentes no
quelantes) devem ser mantidas, uso
de uma gama de pH entre 6.0 7.0 e
elevado gradiente de potencial
elctrico.
6. Concluses
As consideraes apresentadas neste
artigo permitem concluir que o
IMAC e suas variantes so tcnicas
poderosssimas de separao de
protenas e com o auxlio da
engenharia de protenas ser
possvel, num futuro prximo,
desenvolver um mtodo universal
6 Boletim de Biotecnologia
de purificao de protenas. Por outro
lado, estas tcnicas apresentam
muitas potencialidades na anlise
estrutural de protenas mutantes ou
alteradas e protenas de espcies
diferentes.
Agradecimentos
Cincia e Tecnologia pela atribuio
de bolsas PRAXIS (BTI) Carla
Sousa e Vanda Pacheco para a
realizao do trabalho de
investigao sobre o IMAC.
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Bionotcias

O 27o Encontro da FEBS, em 2001, em Portugal, em Lisboa

O 27o Encontro da FEBS (Federation of European
Biochemical Societies) vai realizar-se, de 30 de Junho a
6 de Julho de 2001, em Lisboa. Este Encontro da FEBS
organizado em colaborao com a PABMB (Pan-
American Association for Biochemical and Molecular
Biology). Informaes detalhadas sobre o Programa,
condies de inscrio e de candidatura a bolsas a
atribuir a jovens participantes, encontram-se no
seguinte web-site:
http://www.itqb.unl.pt/FEBS2001/
A realizao deste Encontro internacional em Portugal
, simultaneamente, uma grande responsabilidade e
uma grande oportunidade para a comunidade cientfica
Portuguesa que desenvolve a sua actividade em torno
da Bioqumica. O FEBS 2001 representa uma
excelente oportunidade para essa comunidade
cientfica evidenciar o nvel atingido no
desenvolvimento dos seus programas de investigao.
Permitir ainda, principalmente aos mais jovens,
usufruir, no seu Pas, da experincia e do contacto com
um magnfico e diversificado conjunto de cientistas
convidados que participaro em 8 lies plenrias, 35
simpsios e 14 Workshops, sob temas de grande
actualidade e relevncia. Durante o Encontro, realizar-
se-o ainda vrias sesses de exibio de paineis,
durante as quais ser favorecida a troca de ideias entre
os participantes e, entre os resumos dos trabalhos
submetidos para exibio em painel, sero
seleccionados alguns para apresentao oral. Durante o
Encontro, decorrer ainda uma exposio de material
tcnico, por parte das principais empresas nacionais e
internacionais. Pela iniciativa e ousadia, aqui se
cumprimenta a Sociedade Portuguesa de Bioqumica e
a Comisso Organizadora FEBS 2001, na pessoa da
sua Presidente, a Prof Claudina Rodrigues-Pousada.
Em nome da Comisso Organizadora, convida-se todos
os que utilizam uma abordagem Bioqumica, na
compreenso dos fenmenos biolgicos e suas
aplicaes, a participar activamente neste Encontro
internacional. Chama-se ainda a ateno para as
seguintes datas importantes:
Inscrio e submisso de Resumos:
at 28 de Fevereiro de 2001
Submisso de Candidaturas a Bolsas:
at 10 de Janeiro de 2001
(continua na pgina 17)

Boletim de Biotecnologia 7