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TEMA 10

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE
PATGENOS VIABLES
NDICE DE CONTENIDOS

Introduccin
Preparacin de medios artificiales
Condiciones para el aislamiento de patgenos
Microorganismos y oxgeno
Incubacin en condiciones anaerobias
Incubacin de microorganismos capnfilos
Temperatura de incubacin, pH, humedad

Medios artificiales. Ejemplos.


Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento)
Medios de enriquecimiento
Medios selectivos
Medios diferenciales
Medios cromognicos

Cultivo de patgenos intracelulares obligados


Introduccin
 Regla de oro de la microbiologa
Cultivo y
aislamiento de identificacin
microorganismos
Muestra Cultivo puro

Realizacin
pruebas
susceptibilidad

Etapa limitante en la rapidez del


diagnstico microbiolgico
Medios de cultivo

 Qu es un medio de cultivo
Medios deshidratados
Cientos de formulaciones
Empresas del sector farmacutico
dedicadas a la produccin y control de
calidad de los medios
Placas de petri y tubos con todos los
medios necesarios
EXISTEN CIENTOS DE
FORMULACIONES
DISPONILES EN EL
MERCADO
Preparacin de medios de cultivo artificiales

 Preparacin
 Esterilizacin
 Autoclave
 Tindalizacin
 Filtracin
 Luz UV
 Estufas a 180 C
 xido de etileno
 Adicin de sustancias termolbiles
 Vertido en placas de petri (medios slidos) o
tubos (medios lquidos o medios slidos)
Condiciones para el desarrollo de patgenos

 Medio de cultivo
 No exigentes (nutrientes (C, N, S, P) sales, tampn)
 Exigentes (dem. + sustancias complejas (sangre, suero,
huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas)
 Condiciones ambientales adecuadas
 Atmsfera adecuada
 Temperatura adecuada
 Humedad
 Tiempo de incubacin
 pH
 Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del
crecimiento
Relaciones de los microorganimos
con el oxgeno

 Aerobios
 Anaerobios facultativos
 Anaerobios
 Estufas para anaerobios
 Bolsas para anaerobios
(generan H2 y CO2) (Gas-Pak)
 Microaerfilos
 Frascos con vela
 Agar semislido
 Capnfilos
 Atmsfera de CO2
 Sistemas Gas Pak, Bio Bag
(bicarbonato y cidos)
 Utilizacin de estufas de CO2
Sistemas para anaerobiosis
Sistemas para incubacin de
microorganismos capnfilos

Jarra con vela

Estufas CO2

Sistemas Biobag, Gas


Pak (bicarbonato y
cidos)
CONDICIONES DE INCUBACIN

 Temperatura de incubacin
 35-37 C
 30 C
 Otras temperaturas
 Elevadas (42 C)
 Bajas (4C) enriquecimiento en fro
 Intermedias (22 C)

 Tiempo de incubacin

 pH
Clasificacin de los medios de cultivo

 Medios de aislamiento primario (medios de


crecimiento y medios enriquecidos)

 Medios de enriquecimiento

 Medios diferenciales

 Medios selectivos

 Medios cromognicos
Ejemplos de medios de aislamiento primario o
medios de crecimiento y medios enriquecidos

 Agar nutritivo
 Agar infusin de cerebro y corazn (BHIA)
 Agar triptona soja (TSA)
 Agar sangre
 Agar chocolate
 Agar CLED (urocultivo)
 Agar de Meller-Hinton
 Caldo de carne picada
 Caldo tioglicolato
Agar BHIA (Infusin de cerebro y corazn )

Componentes Cantidad Propiedad


Extracto de cerebro 7,8 g/l Fuente de nutrientes
Extracto de corazn 9,7 g/l Fuente de nutrientes
Peptona 10 g/l Fuente de protenas
Dextrosa 2 g/l Hidrato de carbono
Tampn fosfato 2,5 g/l Regulacin pH
NaCl 5 g/l Sales
Agar 15 g/l Agente solidificante
Objetivo
Medio rico, no selectivo, permite crecimiento de la mayora de
microorganismos no exigentes
Ausencia de agentes inhibidores
CLED (cistina-lactosa-deficiente en electrolitos

Componentes Cantidad

Digerido pancretico de gelatina 4 g/L


Digerido pancretico de casena 4 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Lactosa 10 g/L
L-cistina 0,128 g/L
Azul de Bromotimol 0,02 g/L
Agar 15 g/L

Medio rico y selectivo


Especfico para urocultivo
Deficiencia de electrolitos inhibe la
movilidad de Proteus
Caractersticas y usos de algunos medios ms
frecuentemente utilizados

Agar sangre
 Triptona
 Hidratos de carbono
 NaCl
 Tampn
 Agar
 5% sangre desfibrinada

Medio enriquecido y selectivo

Permite ver distintos tipos de


hemolisis, es diferencial
Recuento de patgenos mediante
la tcnica de estra en placa

Tambin se utiliza para cuantificacin


de resultados:

Estimacin del nmero de


microorganismos en la muestra
original en funcin del crecimiento:
Crecimiento escaso
Crecimiento moderado
Crecimiento abundante
Recuento de patgenos mediante el uso del
asa calibrada (u.f.c.)

Y tambin se utiliza para recuento de microorganismos


mediante siembra con asa calibrada, recuento de unidades
formadoras de colonias por mililito (u.f.c./mL)
Caldo con carne picada para
cultivo de anaerobios

 Es un medio rico , pero es un caldo, un


medio lquido
 Caldo con carne picada fuente de
protenas y nutrientes, potencial redox
bajo (ambiente reductor)
 Aadido o no de glucosa
 Anaerobios (parafina lquida)
Ejemplos de caldos de enriquecimiento

Son medios lquidos que llevan una concentracin baja de agentes


inhibidores
Retrasan el crecimiento de los microorganismos comensales de la
microbiota
Permiten enriquecer la muestra en un determinado patgeno que era
menos abundante respecto al resto de la microbiota
 Caldo selenito Salmonella
 Caldo tetrationato Salmonella y Shigella
 Caldo Gram negativos Salmonella y Shigella

 Subcultivar en medios ms selectivos al cabo de 6-8 horas


Caldo selenito

Componentes Cantidad Propiedad


Peptona 5 g/l Fuente de protenas
Lactosa 4 g/l Hidrato de carbono
Selenito de sodio 4 g/l Agente inhibidor de la mayora de Enterobacterias,
incluyendo muchas especies de Shigella
Tampn
Fosfato de sodio 10 g/l

Objetivo
Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces,
aguas fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio ms selectivo (agar SS o
agar sulfito de bismuto)
Medios selectivos

 Llevan una concentracin alta de agentes inhibidores

 Permiten crecer a unos microorganismos pero inhiben


el crecimiento de otros

 Los agentes inhibidores son sustancias de diferente


naturaleza qumica

Agentes inhibidores: colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde


brillante, eosina), antibiticos, metales (Se, Bi), sales biliares, azida,
alcoholes (alcohol feniletlico), cloruro sdico a alta concentracin
Ejemplos de medios selectivos

 Moderadamente selectivos
 MacConkey
 EMB

 Altamente selectivos
 Agar salino manitol Staphylococcus
 Medio SS Salmonella y Shigella
 Agar Hektoen Salmonella y Shigella
 Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella
 Agar xylosa-lisina-dexosicolato Salmolella y Shigella
 Agar PEA Gram positivos
 Agar Columbia CNA Gram positivos
Agar MacConkey

Componentes Cantidad Propiedad


Peptona 17 g/l Fuente de protenas
Polipeptona 3 g/l Fuente de protenas
Lactosa 10 g/l Azcar fermentable
Sales biliares (conc. moderada) 1,5 g/l Inhibidor de gram positivos
Cristal violeta 0,001 g/l Inhibidor de gram positivos
NaCl 5 g/l sales
Rojo neutro Indicador de pH
Agar 13,5 g/l Agente solidificante
Objetivo
Aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos gram
negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa
Agar MacConkey

Diferenciacin de bacilos entricos gram negativos


fermentadores y no fermentadores de lactosa

Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa
No patgenos (E. coli, Klebsiella,
Citrobacter)

Colonias transparentes
No fermentan la lactosa
Patgenos (Pseudomonas,
Salmonella, Shigella, Yersinia,
Proteus)
Agar entrico Hektoen

Componentes Cantidad Propiedad


Peptona 12 g/l Fuente de C y N
Extracto de levadura 3 g/l Fuente de N
Sales biliares (alta conc.) 9 g/l Inhibidor de gram positivos
Lactosa 12 g/l Azcar fermentable
Sacarosa 12 g/l Azcar fermentable
NaCl 5 g/l Sales
Tiosulfato de sodio 5 g/l Fuente de azufre e inhibidor
Citrato frrico amnico 1,5 g/l Produccin sulfuro
Salmonella/ inhibidor
Indicador de pH
Azul de timol 0,04 g/l
Agente solidificante
Agar 14 g/l
Objetivo: Aislamiento y diferenciacin de especies de Salmonella y Shigella
de otros bacilos entricos gram negativos en muestras fecales
Propiedades diferenciales del medio
Agar entrico Hektoen

Los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven


amarillas. Los no fermentadores se ven incoloros. Salmonella tiene un
punto negro central por la produccin de sulfuro. La mayora de las
especies de Shigella no producen sulfuro.
Medio agar salino manitol (agar de Chapman)

 Agente inhibidor

 NaCl al 7,5% slo crecen


Staphylococcus y Microccocus

 Incluye manitol y rojo fenol como


indicador (medio diferencial)

 Los microorganismos que fermentan el


manitol se observan como colonias
amarillas
 Los que no fermentan el manitol se
observan blancos o del color del medio
Agar Alcohol Feniletlico (PEA)

Componentes Cantidad Propiedad


Extracto de carne 3 g/L Fuente de C y N
Triptosa 10 g/L Fuente de N
Feniletanol 2,5 g/L Inhibidor de Gram negativos
Cloruro de sodio 5 g/L Estabilizador osmtico
Agar 15 g/L Agente solidificante
Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente
estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota
mixta. La adicin de alcohol fenil etlico inhibe o reduce drsticamente el
crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la sntesis de ADN.
Adems, previene la proliferacin de colonias invasivas tipo swarming.
El alcohol fenil etlico es un antimicrobiano, antisptico y desinfectante que
tambin se utiliza como esencia aromtica y preservativo en farmacia y
perfumera. Las placas de este medio recin preparadas huelen a rosas.
Agar Alcohol Feniletlico (PEA)

Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se


convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias
anaerobias presentes en muestras clnicas donde hay una
microbiota abundante y heterognea que contiene bacterias Gram
negativas de crecimiento rpido tal como Proteus.
Medios diferenciales

Permiten distinguir entre bacterias diferentes en base a un comportamiento


bioqumico (p.e., fermentacin o no de la lactosa, fermentacin del manitol,
produccin o no de sulfuro, distintos tipos de hemolisis, etc.).

Pueden ser, a su vez, ricos, enriquecidos o selectivos


Ejemplos de medios diferenciales

 MacConkey (moderadamente selectivo y diferencial)


 EMB (moderadamente selectivo y diferencial)
 Agar CLED (no selectivo, medio rico y diferencial)
 Agar sangre (no selectivo, medio enriquecido y diferencial)
 SM, SS, HE, XLD (altamente selectivos y diferenciales)

 Agar sangre, CLED

 Agar XLD,
EMB, MacConkey;
SS; HE; ADC

 Agar SM
Medios cromognicos

Medios diferenciales
Incorporan sustancias cromognicas
Deteccin de actividades enzimticas caractersticas
de determinados gneros o especies de bacterias
- galactosidasa
- glucosidasa
- glucuronidasa

Produccin de un color caracterstico identificacin

- galactosidasa
ONPG ONP + galactosa
Incoloro amarillo
Ejemplos de medios cromognicos

 CPS ID3
 Chromogenic UTI (infecciones tracto urinario)
 ChromAgar Orientation
 UriSelect 4 (urocultivos)

 Identificacin bacterias en infecciones urinarias


 Tres tipos de enzimas
 Se puede aadir triptfano (prueba del indol o TDA)
se incrementa el nmero de microorganismos que se
pueden identificar
Medios diferenciales cromognicos para la
identificacin de bacterias en muestras de orina

E. coli Klebsiella pneumoniae

Enterococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa


MEDIOS CROMOGNICOS PARA LEVADURAS

Un ejemplo de medio
cromognico
ChromAgar Candida
Permite diferenciar e
identificar tres especies
de este gnero
(colonias verdes,
azules y transparentes)
Medios especficos

BCYE (agar tamponado con carbn


y extracto de levadura) Legionella
Bordet-Gengou Bordetella pertussis
Regan-Lowe Bordetella pertussis
Thayer-Martin Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae
New York City Neisseria gonorrhoeae y micoplasmas
genitales
Lowestein-Jensen Mycobacterium tuberculosis
CIN (cefsulodina-irgasn-novobiocina) Yersinia
TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) Vibrio cholerae
Pico de flauta de Loeffler Corynebacterium difteriae
Diamond Trichomonas vaginalis
Sabouraud Hongos
CCF, CCYE Clostridium difficile
Patgenos intracelulares obligados

 Crecen slo dentro de las clulas


 No se ha encontrado un medio
completamente artificial para su
desarrollo
 Treponema pallidum No se pueden cultivar
 Mycobacterium leprae en medios artificiales
 (Legionella pneumophila BCYE)

 Cultivos de tejidos en el laboratorio


Cultivos celulares

 Cultivos primarios n Cromosomas=2n


 Clulas de rin
 Fibroblastos
 Lneas celulares continuas aberraciones en
el n de cromosomas aneuploida

 Hep-2, HeLa, Vero efecto citoptico de la


toxina de Clostridium
difficile
 McCoy Clamidias
 A-549, RD, MDCK Virus

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