Mcanismes biochimiques

Le stress oxydant
Intrt conceptuel et exprimental dans la comprhension
des mcanismes des maladies et potentiel thrapeutique
Alain Favier

Abstract The oxidative stress: concept and experimental interest to understand diseases mechanisms and
therapeutic approaches
Free radicals and their precursors are members of a reactive chemical family named reactive oxygen
species. Living beings use their beneficial reactivity in a lot of processes, as weapon in defence mechanisms
or as signal inside or inter cells. So a useful level of beneficial reactive species is maintained inside cell by
an equilibrium between the generating system producing free radicals such as mitochondrial respiration,
phagocytosis, redox cycle or radiations, and the antioxidant systems such as scavenger molecules absorbed
from the diet (vitamin C, E, carotenoids, polyphenols) or produced endogenously (glutathione, thioredoxin)
or such as antioxidant enzymes (superoxide dismutases, glutathione peroxidases). Unfortunately an
oxidative stress may occur, resulting from a desequilibrium between prooxidant sources of radicals and
antioxidant systems. Oxidative stress will damage intracellular macromolecules, oxidizing lipids, DNA or
proteins. Many cellular dysfunctions result from these biochemical damages, variable according to the level
of stress: excess in cell proliferation, cell death by apoptosis, lipid deposition, mutagenesis. By creating such
disorders, oxidative stress is partly responsible from a great number of age-related diseases as cancer,
cardiovascular disorders, neurodegenerative diseases as Alzheimer disease. So many therapeutical
strategies have been tested in animal and human to prevent the occurrence of these oxidative diseases.
They use nutritional improvement of antioxidant capacities, plant or chemical antioxidants. Chemists
designed various new molecules chelating iron, scavenging free radicals or catalysing destruction by miming
the activity of antioxidant enzymes. But new ways of research have to be now explored to create more
specific and tissue targeted molecules able to regulate the intracellular level and not only to destroy oxygen
radicals.
Mots-cls Antioxydant, stress oxydant, radicaux libres, maladies.
Key-words Antioxidant, stress, free radicals, diseases.

Depuis quelques annes, le monde des sciences biologiques
et mdicales est envahi par un nouveau concept, celui du
stress oxydant , c'est--dire d'une situation o la cellule
ne contrle plus la prsence excessive de radicaux
oxygns toxiques, situation que les chercheurs impliquent
dans la plupart des maladies humaines. Qu'en est-il
exactement ? Est-ce une mode ou une ralit, et dans
ce cas, pouvons-nous trouver de nouvelles armes
mdicamenteuses pour lutter contre ce phnomne ?
Origine du stress oxydant
La dcouverte d'espces chimiques radicalaires prsentes
normalement dans l'organisme a boulevers notre
comprhension des mcanismes biologiques. Ces radicaux
libres sont produits par divers mcanismes physiologiques
car ils sont utiles pour l'organisme dose raisonnable ; mais
la production peut devenir excessive ou rsulter de
phnomnes toxiques exognes et l'organisme va devoir se
protger de ces excs par diffrents systmes antioxydants.
Dans les circonstances quotidiennes normales, des radicaux
libres sont produits en permanence en faible quantit
comme les mdiateurs tissulaires ou les rsidus des
ractions nergtiques ou de dfense, et cette production
physiologique est parfaitement matrise par des systmes
de dfense, d'ailleurs adaptatifs par rapport au niveau de
radicaux prsents. Dans ces circonstances normales, on dit
que la balance antioxydants/prooxydants est en quilibre. Si
tel n'est pas le cas, que ce soit par dficit en antioxydants ou
par suite d'une surproduction norme de radicaux, l'excs
de ces radicaux est appel stress oxydant .
Cette rupture d'quilibre, lourde de consquence, peut avoir
de multiples origines. L'organisme peut avoir faire face
Glossaire
Adduit
Fixation dune molcule sur une des bases de lADN par une liaison
covalente pouvant parfois former un pont intra-catnaire entre les
deux chanes de lADN.
Cytosol
Liquide contenu lintrieur des cellules.
Facteur de transcription
Protine permettant la lecture dun gne lorsquelle se fixe sur son
promoteur.
Radical libre
Espce chimique possdant un lectron non appari.
Rgulon
Chez les bactries, ensemble contigu de gnes codant pour des
protines et de gnes codant pour des protines rgulatrices.
Sites abasiques
Partie de lADN dpourvue dune base purique ou pyrimidique et
ayant perdu linformation gntique par rupture de la liaison entre
une base et le dsoxyribose.
Xnobiotique
Molcule trangre, susceptible de pntrer dans le corps humain.

108 lactualit chimique - novembre-dcembre 2003


une production beaucoup trop forte pour tre matrise, qui
sera observe dans les intoxications aux mtaux lourds,
dans l'irradiation, dans les ischmies/reperfusions suivant
des thromboses. La rupture d'quilibre peut provenir d'une
dfaillance nutritionnelle ou de la carence en un ou plusieurs
des antioxydants apports par la nutrition comme les
vitamines ou les oligo-lments, prsents en quantit limite
dans l'alimentation franaise. Enfin, la mauvaise adaptation
peut rsulter d'anomalies gntiques responsables d'un
mauvais codage d'une protine soit enzymatiquement
antioxydante, soit synthtisant un antioxydant (comme la
gamma glutamyl synthtase produisant le glutathion), soit
rgnrant un antioxydant, soit couplant la dfense
l'nergie (comme la G6PD), soit d'un promoteur de ces
mmes gnes que la mutation rendra incapable de ragir
un excs de radicaux. Gnralement, le stress oxydant sera
la rsultante de plusieurs de ces facteurs et se produira dans
un tissu et un type cellulaire bien prcis, objet de la
dfaillance et non pas dans tout l'organisme.
Les radicaux libres de la biologie
Parmi toutes les espces radicalaires susceptibles de se
former dans les cellules, il convient de distinguer un
ensemble restreint de composs radicalaires qui jouent un
rle particulier en physiologie et que nous appellerons
radicaux primaires. Les autres radicaux libres, dits radicaux
secondaires, se forment par raction de ces radicaux
primaires sur les composs biochimiques de la cellule. Ces
radicaux primaires drivent de l'oxygne par des rductions
un lectron tels l'anion superoxyde O2- et le radical
hydroxyle OH, ou de l'azote tel le monoxyde d'azote NO
[1]. D'autres espces drives de l'oxygne dites espces du TNF ) ou nutritionnels (carence en ubiquinone), qui
actives de l'oxygne, comme l'oxygne singulet 1O2, le
peroxyde d'hydrogne (H2O2) ou le nitroperoxyde (ONOOH),
ne sont pas des radicaux libres, mais sont aussi ractives et
peuvent tre des prcurseurs de radicaux. L'ensemble des
radicaux libres et de leurs prcurseurs est souvent appel
espces ractives de l'oxygne (figure 1).
Il ne faut pas penser que tous les radicaux de l'oxygne sont
extrmement ractifs, cette ractivit tant trs variable d'anions superoxydes au niveau de la membrane cellulaire.
selon la nature du radical. Ainsi parmi les radicaux forms
chez les tres vivants, l'anion radicalaire superoxyde (O2)
comme le monoxyde d'azote (NO) ne sont pas trs ractifs,
mais constituent des prcurseurs d'autres espces plus
ractives. La faible ractivit de ces deux radicaux permet
d'ailleurs leur utilisation par l'organisme comme mdiateurs
rgulant des fonctions biologiques telles la vasodilatation
capillaire, la prolifration ou le message de neurones. En
revanche, des radicaux comme les radicaux peroxyles
(ROO) ou surtout le radical hydroxyle (HO) sont
extrmement ractifs, et ce avec la plupart des molcules
des tissus vivants. Ces radicaux libres de l'oxygne ou de
l'azote, mme ractifs, ne sont pas uniquement toxiques ;
au contraire, ils sont produits par divers mcanismes
physiologiques afin de dtruire des bactries au sein des
cellules phagocytaires (macrophages, polynuclaires) ou
pour rguler des fonctions cellulaires ltales telle la mort
cellulaire programme ou apoptose.
Les tres vivants trouvent leur nergie dans la respiration
mitochondriale dont la dernire tape rduit par quatre
lectrons la molcule d'oxygne sans librer d'espces cuivre, vanadium), mais aussi le cuivre et le fer libres (existant
radicalaires. Toutefois, au contact entre l'oxygne et
certaines protines du systme de la respiration, une
production d'anions superoxydes se produit lors du
Mcanismes biochimiques
Figure 1 - Origine des diffrents radicaux libres oxygns et
espces ractives de loxygne impliqus en biologie.
fonctionnement de la chane respiratoire mitochondriale,
production que l'on peut comparer aux invitables dchets
des centrales industrielles d'nergie. Si usuellement cette
production de radicaux superoxydes reste faible et ne
concerne qu'un faible pourcentage de l'oxygne utilis par la
respiration (environ 2 %), elle peut s'amplifier lorsque la
respiration devient plus intense (effort physique, hyperoxie),
ou lorsque interviennent des dsordres inflammatoires (effet
augmentent avec lge.
L'inflammation est par ailleurs une source importante de
radicaux oxygns produits directement par les cellules
phagocytaires actives qui sont le sige d'un phnomne
appel explosion oxydative consistant en l'activation du
complexe de la NADPH oxydase, enzyme capable d'utiliser
l'oxygne molculaire pour produire de grandes quantits
Ce mcanisme, lorsqu'il est contrl, est capital dans la lutte
anti-infectieuse car il permet la phagocytose des bactries
et des corps trangers. Une autre espce radicalaire, le
monoxyde d'azote, est elle aussi produite par les systmes
enzymatiques que sont les diffrentes NO synthases (ou
NOS), des fins de mdiation par les neurones, les cellules
endothliales ou les macrophages. Rappelons que la
production concomitante dans un mme lieu de NO et
de superoxyde s'avre trs dommageable en donnant
naissance au peroxynitrite.
Des sources importantes de radicaux libres sont les
mcanismes de cycles redox que produit dans lorganisme
l'oxydation de molcules comme les quinones. Ce cycle
redox a lieu soit spontanment, soit surtout lors de
l'oxydation de ces composs au niveau du cytochrome
P450. Ce mcanisme est souvent incrimin pour expliquer la
toxicit de l'alcool, des rsidus de la fume de cigarette, ou
de nombreux mdicaments ; mais il se produit aussi avec
des composs endognes comme l'acide lvulinique et
surtout les catcholamines. Les mtaux toxiques (chrome,
lors de surcharges gnrales ou localises) gnrent des
radicaux hydroxyles, trs ractifs, partir de l'espce peu
ractive H2O2, par une raction appele raction de
lactualit chimique - novembre-dcembre 2003 109
Mcanismes biochimiques
Fenton. Les particules inhales (amiante, silice) sont aussi
des sources de radicaux libres, d'une part parce qu'elles
exacerbent la phagocytose, d'autre part parce que leur
surface est tapisse de sels de fer. Les rayonnements sont
capables de gnrer des radicaux libres, soit en scindant la
molcule d'eau lorsqu'il s'agit des rayons ionisants X ou ,
soit en activant des molcules photosensibilisantes lorsqu'il
s'agit des rayons ultraviolets qui vont par ce mcanisme
produire des anions superoxydes et de l'oxygne singulet.
Un paradoxe : les radicaux libres
sont-ils indispensables la vie ?
Le paradoxe des radicaux libres en biologie est quils
constituent des espces extrmement dangereuses,
susceptibles d'engendrer un nombre considrable de
maladies, tout en tant des espces indispensables la vie.
Ils remplissent en effet de trs nombreuses fonctions utiles
qui, part la phagocytose, ont t dcouvertes rcemment.
Les radicaux libres participent au fonctionnement de
certaines enzymes, la transduction de signaux cellulaires,
la dfense immunitaire contre les agents pathognes, la
destruction par apoptose des cellules tumorales, au cycle
cellulaire, la diffrentiation cellulaire, la rgulation de la
dilatation capillaire, au fonctionnement de certains neurones
et notamment ceux de la mmoire, la fcondation de
l'ovule, la rgulation des gnes, phnomne appel
contrle redox des gnes.
La phagocytose des bactries et parasites par les
macrophages ou les polynuclaires s'accompagne d'une
production d'espces ractives de l'oxygne si brutale et
intense qu'elle est connue, depuis les travaux de Baldridge
sur le polynuclaire en 1933, sous le nom de burst
oxydatif , c'est--dire explosion respiratoire. Au sein du
phagosome, l'activation de la NADPH oxydase et l'action
des superoxydes dismutases (SOD) et NOS aboutissent un
mlange trs corrosif de O2, H2O2, HO, ONOOH, avec en
plus dans le polynuclaire HOCl et 1O2. Ce mlange
ractionnel, que l'Homme a imit en utilisant comme
dsinfectant l'eau de javel ou l'eau oxygne, dtruit par
oxydation l'ensemble des composants bactriens.
Les radicaux libres constituent aussi un systme de
transmission de signaux, sans doute apparu trs tt dans
l'volution de la vie. Ce systme est prsent dans les tres
unicellulaires qui ragissent l'oxygne du milieu ambiant en
adaptant leurs systmes de dfense, et il s'est conserv
chez les tres volus, y compris les mammifres, qui se
sont dots de systmes cellulaires de production de
radicaux libres et de systmes de dtection et de
transduction du signal. Les radicaux oxygns peuvent
donc tre considrs comme des messagers intra et
extracellulaires. Ils permettent d'induire la rponse cellulaire
de nombreux stress, thermiques, ultraviolets,
xnobiotiques, permettant l'expression de gnes de
dfense. Chez les bactries, les gnes de dfense contre le
stress oxydant sont organiss en rgulon : un gne exprime
un premier facteur de transcription qui, aprs activation par
un driv oxygn, va activer le gne d'un deuxime facteur
de transcription ubiquitaire pour un ensemble de systmes
antioxydants. Ainsi, il existe plusieurs ensembles de gnes
mis en jeu lors des stress oxydants chez E. coli : le rgulon
oxyR-oxyS dont l'expression aboutit la synthse de 9
protines en une vingtaine de minutes aprs activation
par H2O2, le rgulon soxR-soxS dont l'expression aboutit
la synthse de nombreuses enzymes antioxydants (la
110 lactualit chimique - novembre-dcembre 2003
SOD-Mn, l'endonuclase IV, la glucose 6 phosphate
dshydrognase qui fournira le NADPH ncessaire la
glutathion rductase, une paraquat rductase qui
paradoxalement produit O2, la protine ribosomiale S6,
et la porine membranaire OmpF).
Chez l'Homme, les gnes antioxydants les plus inductibles
par un stress oxydant sont ceux de la superoxyde dismutase
manganse, de la catalase, de la ferritine, de l'hme
oxygnase, de la glutamyl-cystine synthase, de la iNO
synthase, de la thioredoxine, de l'HSP 70, des
mtallothionines, alors que ceux de la superoxyde
dismutase Cu-Zn et de la glutathion peroxydase sont peu
inductibles [2]. Cette inductibilit des gnes antioxydants
explique le phnomne d'adaptation au stress oxydant des
cellules et des animaux qui exposs rgulirement de
faibles doses deviennent rsistants de fortes doses de
radicaux oxygns. Mais les espces actives de l'oxygne
peuvent aussi activer des gnes de fonctions cellulaires
autres que ceux de la lutte contre les radicaux libres, ceci par
l'intermdiaire de facteurs redox sensibles comme AP1,
HIF-1 ou NF-KB [3]. Ainsi, les gnes des cytokines TNF, IL1,
IL6, de la lipoprotine lipase, de la collagnase, de l'aldose
rductase, des oncognes c-jun et c-fos, de GADD153, de
p21(waf1/cip1), de ELAM 1 et ICAM 1, de la tyrosine protine
phosphatase, de la actine ou de l'ornithine dcarboxylase
sont activs par les espces oxygnes, alors que ceux
de la PEPCK et de l'activateur du plasminogne sont
inversement inhibs par les espces actives de l'oxygne.
Les radicaux libres peuvent aussi servir de relais
physiologiques entre cellules diffrentes, dans la stimulation
de certains rcepteurs membranaires et rgulent de
nombreuses fonctions comme la vasodilatation des
vaisseaux, la prolifration cellulaire. Dans des circonstances
dramatiques, ils seront des signaux de mort cellulaire
lorsque les capacits de rparation seront dpasses. L'effet
du stress oxydant sur la transduction du signal a dj fait
l'objet de plusieurs revues montrant que ce concept est
dsormais accept en nutrition, immunologie, diabtologie
ou cancrologie [4]. Les radicaux oxygns pourraient mme
tre les premiers responsables de l'activation des kinases en
cas de rponse des agressions comme l'irradiation, les
cytokines inflammatoires ou les carcinognes chimiques.
Ayant besoin d'une certaine quantit d'espces ractives de
l'oxygne, l'organisme ne cherche donc pas les dtruire
mais contrler leur niveau pour viter le stress oxydant.
Ceci explique la rgulation trs fine du gnome antioxydant
et de ses mcanismes d'adaptation. La thrapeutique
antioxydante ne doit pas oublier ces activits utiles des
radicaux libres sous peine d'chec, voir d'effets toxiques
paradoxaux, tel l'effet procarcinogne observ dans
certaines tudes de supplmentation par des doses trs
leves de carotne.
Le contrle des radicaux libres par la cellule
Les cellules utilisent de nombreuses stratgies antioxydan-
tes et consomment beaucoup d'nergie pour contrler leur
niveau d'espces ractives de l'oxygne. Certains compo-
ss antioxydants comme les vitamines E (tocophrol), C
(ascorbate), Q (ubiquinone), ou les carotnodes apports
par les aliments, agissent en pigeant les radicaux et en cap-
tant l'lectron clibataire, les transformant en molcules ou
ions stables [5]. La vitamine pigeuse va devenir un radical,
puis sera soit dtruite, soit rgnre par un autre systme.
Ainsi, la vitamine E est rgnre par la vitamine C qui est

elle-mme rgnre par des enzymes, les ascorbates
rductases [6]. Ce type d'antioxydant est appel pigeur
ou boueur ( scavenger pour les Anglo-saxons). De trs
nombreux composs alimentaires peuvent aussi avoir ce
comportement : polyphnols, alcalodes, phytates [7]. Il
existe de plus des composs endognes synthtiss par les
cellules et jouant le mme rle ; le plus important est le glu-
tathion rduit qui protge non seulement contre les radicaux
oxygns, mais aussi contre les peroxydes ou le NO.
D'autres composs endognes jouent un rle sans doute
important mais encore mal valu : les thioredoxines, les glu-
taredoxines, les mtallothionines, l'acide lipoque ou les
polyamines. La plupart des composs biologiques ragis-
sant avec (donc pigeant) le radical hydroxyle, il conviendra
de rserver le terme d'antioxydant des composs dont la
teneur dans les tissus diminue lors d'un stress oxydant
in vivo et qui ne donnent pas de drivs toxiques.
L'autre stratgie utilise est de nature enzymatique, visant
dtruire les superoxydes et peroxydes. Ainsi, les
superoxydes dismutases sont capables dliminer lanion
superoxyde par une raction de dismutation, formant avec
deux superoxydes une molcule d'oxygne et une molcule
de peroxyde d'hydrogne. Les superoxydes dismutases
existent sous plusieurs isoformes dont la structure
densemble est trs bien conserve lors de lvolution,
formant un puits hydrophobe au centre de la protine dans
lequel se glisse lanion superoxyde [8]. Le mcanisme
ractionnel est catalys par un mtal situ au cur de
lenzyme dont la nature permettra de distinguer les
superoxydes dismutases manganse (MnSOD) protgeant
la mitochondrie, des superoxydes dismutases cuivre-zinc
protgeant le cytosol (cCu-ZnSOD), la face externe de la
membrane des cellules endothliales (ecCu-ZnSOD) ou le
plasma sanguin (pCu-ZnSOD). Les principales enzymes
capables de dtruire le peroxyde d'hydrogne sont les
catalases cofacteur fer, prsentes dans les hmaties et
les peroxysomes hpatiques, et les glutathions peroxydases
cofacteur slnium [9]. Des glutathions peroxydases
slnium existent dans le cytosol (cGPX) dans le plasma
(pGPx), au niveau de la membrane cellulaire (HPGPx), et une
isoenzyme est spcifique des cellules digestives (GIGPx).
Ces enzymes sont sans doute le principal systme de
protection car elles dtruisent non seulement H2O2, mais
aussi les peroxydes organiques toxiques forms par
oxydation des acides gras ou du cholestrol. L'activit
de ces enzymes est trs dpendante de l'apport nutritionnel
en slnium.
Le rle des SOD et des peroxydases est complmentaire car
une bonne protection ne peut tre obtenue par les superoxy-
des dismutases seules (figure 2). Il existe de nombreuses
autres enzymes antioxydantes comme les peroxyredoxines,
l'hme oxygnase, la glutathion transfrase, les thioredoxi-
nes rductases ou les thioredoxines peroxydases. La plupart
des enzymes dcrites ci-dessus, de mme que les enzymes
de rparation des dommages oxydants, vont utiliser un
donneur dquivalent rducteur, le NADPH, qui constitue
avec le glutathion les plaques tournantes de la dfense
antioxydante. La production d'nergie ne semble pas ici en
elle mme capitale (la diminution de lATP facilitant mme
la formation du NADPH).
Les consquences du stress oxydant
La production excessive de radicaux libres provoque des
lsions directes de molcules biologiques (oxydation de
Mcanismes biochimiques
Figure 2 - Mode daction des principaux systmes enzymatiques
antioxydants et de leurs cofacteurs mtalliques.
l'ADN, des protines, des lipides, des glucides), mais aussi
des lsions secondaires dues au caractre cytotoxique
et mutagne des mtabolites librs notamment lors de
l'oxydation des lipides. L'organisme peut aussi ragir contre
ces composs anormaux par production d'anticorps, qui
malheureusement peuvent aussi tre des auto-anticorps
crant une troisime vague d'attaque chimique.
Consquences biochimiques
Les lipides et principalement leurs acides gras polyinsaturs
sont la cible privilgie de l'attaque par le radical hydroxyle
capable d'arracher un hydrogne sur les carbones situs
entre deux doubles liaisons, pour former un radical dine
conjugu, oxyd en radical peroxyle. Cette raction appele
peroxydation lipidique forme une raction en chane car le
radical peroxyle form se transforme en peroxyde au contact
d'un autre acide gras qui forme un nouveau radical dine
conjugu [10]. Les hydroperoxydes peuvent subir plusieurs
modes d'volution : tre rduits et neutraliss par la gluta-
thion peroxydase ou continuer s'oxyder et se fragmenter
en aldhydes acides et en alcanes (thane, thylne,
pentane) qui, de par leur volatilit, sont limins par voie
pulmonaire. Le radical peroxyle, aprs volution en un
peroxyde cyclique et coupure de la molcule, peut librer
diffrentes aldhydes toxiques dont le malonaldialdhyde
ou l'hydroxynonenal. La transmission en chane de la rac-
tion de peroxydation lipidique est stoppe par la vitamine E
intercale dans la bicouche lipidique des membranes
(figure 3). Cette attaque des lipides peut concerner les
lipoprotines circulantes ou les phospholipides membranai-
res. Les consquences seront diffrentes : l'attaque des
lipides circulants aboutissant la formation de LDL (lipopro-
tines de densit lgre) oxydes qui, captes par des
macrophages, formeront le dpt lipidique de la plaque
d'athrome des maladies cardiovasculaires, l'attaque des
phospholipides membranaires modifiant la fluidit de la
membrane et donc le fonctionnement de nombreux rcep-
teurs et transporteurs et la transduction des signaux.
Bien que l'ADN soit la mmoire de toute la composition bio-
chimique des tres vivants, il s'agit d'une molcule trs sen-
sible l'attaque par les radicaux de l'oxygne. Au bas mot,
cinq classes principales de dommages oxydatifs mdis par
lactualit chimique - novembre-dcembre 2003 111
Mcanismes biochimiques
Figure 3 - Mcanisme en chane de la peroxydation des acides gras
polyinsaturs et nature des produits terminaux forms.
OH peuvent tre gnres. Parmi elles, les bases oxydes,
les sites abasiques, des adduits intra-catnaires, des cassu-
res de brins et des pontages ADN-protines [11]. Les bases
qui composent l'ADN, et particulirement la guanine, sont
sensibles l'oxydation. L'attaque radicalaire peut tre
directe et entraner l'oxydation des bases, engendrant un
grand nombre de bases modifies : 8 oxo guanine, 8 nitro
guanine, formamidopyrimidine, 8 oxo adnine, formimido
uracile, 5 hydroxy cytosine, 5 hydroxy mthyl uracile, thy-
mine diol, oxazolone. Un trs grand nombre de ces compo-
ss et de leurs mcanismes de formation ont t identifis
dans notre laboratoire. Mais le stress oxydant peut aussi
attaquer la liaison entre la base et le dsoxyribose, crant un
site abasique, ou attaquer le sucre lui-mme, crant une
coupure de chane simple brin. Des dommages indirects
peuvent rsulter de l'attaque des lipides dont la peroxydation
gnre des aldhydes mutagnes, formant des adduits sur
les bases de l'ADN de type MDA-guanine ou thnodrivs.
L'attaque radicalaire des protines qui sont trs nombreuses
entrer en contact avec l'ADN pour le protger (histones) ou
pour le lire (enzymes et facteurs de la rplication ou de la
transcription), entrane des pontages des protines ou des
adduits sur des bases de type lysinoguanine. Le rle des
nombreux mtaux fixs l'ADN, qui est un polyanion (Fe,
Mg, Zn, Cu, Ni, Cd...), est crucial pour amplifier ou orienter le
profil de ces lsions. Cette attaque de l'ADN est quotidienne
puisque le nombre de lsions se formant chaque jour dans
une cellule est estim 104. Heureusement, la fidlit de la
squence des 4.109 paires de bases de notre ADN cellulaire
est maintenue depuis des milliers d'annes et dans des mil-
liards de cellules grce des systmes de rparation perfec-
tionns, dont les principaux sont la rparation par excision
de base (BER) ou par excision de nuclotide (NER), couples
ou non la transcription, le systme de rparation des
misappariements et la rparation par recombinaison
(figure 4). Malheureusement, ce beau mcanisme peut se
drgler soit par une surcharge de lsions en cas de stress
112 lactualit chimique - novembre-dcembre 2003
massif, soit par un mauvais fonctionnement de ces systmes
de rparation chez des sujets dficients en cofacteurs (thio-
redoxines, zinc) ou atteints d'une anomalie gntique. Dans
ce cas, les lsions non rpares vont perturber les mcanis-
mes de rplication de l'ADN et entraner soit des erreurs de
lecture et de synthse par des ADN polymrases translsio-
nelles infidles aboutissant une mutation ponctuelle dans
le gnome, soit une impossibilit de copie de l'ADN qui
aboutira la mise en route du suicide programm des cellu-
les par un mcanisme appel apoptose. In fine, cette modi-
fication de l'ADN induit des mutations par transversions GC
(guanine/cytosine) vers TA (thymine/adnine) souvent obser-
ves spontanment dans les cellules cancreuses. Ces sont
les premires tapes de la carcinogense et ce n'est pas une
concidence si les agents carcinognes sont tous des gn-
rateurs puissants de radicaux libres (radiations ionisantes et
UV, fume, alcool, fibres d'amiante, mtaux carcinognes,
hydrocarbures polycycliques).
Si la chimie de l'attaque radicalaire des polysaccharides
a t beaucoup moins tudie que celle des autres
macromolcules, il n'en demeure pas moins que les espces
ractives de l'oxygne attaquent les mucopolysaccharides
et notamment les protoglycanes du cartilage. Par ailleurs, le
glucose peut s'oxyder dans des conditions physiologiques,
en prsence de traces mtalliques, en librant des
ctoaldhydes, H2O2 et OH, qui entraneront la coupure
de protines ou leur glycation par attachement du
ctoaldhyde, formant un driv AGE.
Ce phnomne de glycosoxydation est trs important chez
les diabtiques et contribue la fragilit de leurs parois
vasculaires et de leur rtine.
Les protines les plus sensibles aux attaques radicalaires
sont surtout celles qui comportent un groupement
sulfhydryle (SH). Cest le cas de nombreuses enzymes
cellulaires et protines de transport qui vont ainsi tre
oxydes et inactives. Dautres lsions irrversibles
conduisent la formation d'un intermdiaire radicalaire. Les
protines peuvent alors soit subir des rticulations par
formation notamment de ponts bi-tyrosine dtectables
par leur fluorescence, soit subir des coupures en cas
d'agression forte, soit des modifications de certains acides
amins en cas d'agressions modres. Les protines
modifies par oxydation perdent leurs proprits biologiques
Figure 4 - Lsions de lADN formes par attaque radicalaire du patrimoine
gntique des cellules.

(enzyme, anti-enzyme, rcepteur...) et deviennent beaucoup
plus sensibles l'action des protases et notamment du
protasome. Les protines oxydes deviennent aussi trs
hydrophobes, soit par suppression de groupements amines
ionisables, soit par extriorisation de zones hydrophobes
centrales. Elles vont alors former des amas anormaux dans
ou autour des cellules. Ces amas, associs aux lipides,
forment les dpts de lipofuschines caractristiques des
tissus des sujets gs.
Les consquences biologiques du stress oxydant seront
extrmement variables selon la dose et le type cellulaire. De
lgers stress augmenteront la prolifration cellulaire et
l'expression de protines d'adhsion, des stress moyens
faciliteront l'apoptose, alors que de forts stress provoque-
ront une ncrose et des stress violents dsorganiseront la
membrane cellulaire, entranant des lyses immdiates. De
nombreuses autres anomalies biologiques sont induites par
le stress oxydant : mutation, carcinogense, malformation
des ftus, dpt de protines anormales, fibrose, formation
d'auto-anticorps, dpt de lipides oxyds, immunosupres-
sion.
Figure 5 - Nature de quelques modifications des chanes latrales
dacides amins des protines aprs attaque radicalaire.
Comment mettre en vidence un stress
oxydant chez un malade ?
Un grand nombre de techniques actuellement utilisables
pour valuer le stress oxydant ont fait l'objet d'ouvrages ou
de revues [12]. Toutefois, ce domaine de la biologie n'a pas
encore t tudi avec la rigueur et le souci de
standardisation et d'optimisation des mthodes, habituels
en biologie clinique. Une grande disparit de techniques et
de rsultats complique donc l'interprtation des rsultats et
alimente polmiques et dsarroi de celui qui est dsireux
d'aborder ces techniques. Par ailleurs, il existe des difficults
inhrentes cette exploration, lies la rapide fugacit des
espces radicalaires, l'oxydabilit des paramtres redox,
ainsi qu' la localisation de ce stress dans un type donn et
d'un nombre rduit de cellules dans un tissu sain.
L'exploration du statut radicalaire peut se faire par trois
abords : la mesure de la production de radicaux (statut
prooxydant), la mesure des capacits de dfenses (statut
antioxydant) et la mesure de l'tendue des dsordres
biochimiques spcifiques rsultant d'un dsquilibre entre la
balance antioxydants/prooxydants.
Mcanismes biochimiques
Les maladies lies au stress oxydant
Le stress oxydant est impliqu dans de trs nombreuses
maladies comme facteur dclenchant ou associ des
complications de l'volution. La multiplicit des
consquences mdicales de ce stress n'a rien de surprenant
car, selon les maladies, celui-ci se localisera un tissu et
des types cellulaires particuliers, mettra en jeu des espces
radicalaires diffrentes et sera associ d'autres facteurs
variables et des anomalies gntiques spcifiques
chaque individu. La plupart des maladies induites par le
stress oxydant apparaissent avec l'ge car le vieillissement
diminue les dfenses antioxydantes et augmente la
production mitochondriale de radicaux [13].
En faisant apparatre des molcules biologiques anormales
et en surexprimant certains gnes, le stress oxydant sera la
principale cause initiale de plusieurs maladies : cancer,
cataracte, sclrose latrale amyotrophique, syndrome de
dtresse respiratoire aigu, oedme pulmonaire,
vieillissement acclr. Ainsi, les relations entre stress
oxydant et cancer s'avrent trs troites, les radicaux libres
intervenant dans l'activation des pro-carcinognes en
carcinognes, crant les lsions de l'ADN, amplifiant les
signaux de prolifration et inhibant des gnes suppresseurs
de tumeur comme p53.
Le stress oxydant est aussi un des facteurs potentialisant
l'apparition de maladies plurifactorielles tels le diabte, la
maladie d'Alzheimer, les rhumatismes et les maladies
cardiovasculaires [14]. Dans la gense de la plaque
d'athrome, l'oxydation des LDL est un des phnomnes
clefs transformant les monocytes en cellules spumeuses. Le
stress oxydant joue galement un rle dans l'apparition des
autres facteurs athrognes : augmentation de la rsistance
l'insuline, activation des cellules endothliales librant des
mdiateurs prooxydants (prostacycline, cytokine, facteur
de fibrinolyse, superoxyde, NO), augmentation de la
prolifration des fibres lisses. Un facteur de risque dcouvert
rcemment, l'homocystine, voit son action lie en partie la
gnration de radicaux libres au cours de son mtabolisme.
Les causes essentielles de ce stress oxydant sont soit
d'origine nutritionnelle dans les cas de carences en
vitamines et oligo-lments, ou inversement de surcharges
en facteurs prooxydants (fer, acides gras), soit d'origine
accidentelle (inflammation, exposition des xnobiotiques
prooxydants...), soit d'origine gntique. Le plus souvent,
l'association de ces diffrents facteurs aboutira au
mcanisme pathogne.
La responsabilit la plus nette des radicaux libres est mise en
vidence dans les maladies directement induites par des
anomalies d'un gne antioxydant. Plusieurs mutations de la
CuZn superoxyde dismutase ont t observes dans les
formes familiales d'une maladie neurologique de la sclrose
latrale amyotrophique (SLA). Le transfert du gne de
malade chez la souris recre d'ailleurs une maladie analogue
la maladie humaine. La dgnrescence maculaire lie
l'ge est fortement associe avec la forme valine/alanine
du polymorphisme du gne de la superoxyde dismutase.
Comment lutter contre le stress
oxydant ?
Le stress oxydant tant l'origine de nombreuses maladies,
il semble logique de chercher le supprimer. Toutefois, il faut
bien se garder d'tre simpliste sur un sujet aussi
complexe et ambigu. Tout d'abord, le stress oxydant est
lactualit chimique - novembre-dcembre 2003 113
Mcanismes biochimiques
souvent l'origine des premires anomalies responsables de
modifications irrversibles de molcules et de cellules, et ces
anomalies se produisent plusieurs annes avant l'apparition
des signes de la maladie qui sont irrversibles. Ainsi dans
une maladie auto-immune, les antioxydants ne pourront
rverser le phnomne lorsque les lignes de lymphocytes
auront t slectionnes et actives, mme si les radicaux
libres ont particip modifier les protines cellulaires
plusieurs annes auparavant, pour les rendre antigniques.
On peut envisager sous le titre d' antioxydants au sens
large, l'ensemble des molcules susceptibles d'inhiber
directement la production, de limiter la propagation ou de
dtruire les espces actives de l'oxygne [15]. Ils peuvent
agir en rduisant ou en dismutant ces espces, en les
pigeant pour former un compos stable, en squestrant
le fer libre ou en gnrant du glutathion (figure 6).
Figure 6 - Stratgie de conception de systmes antioxydants susceptibles de
prvenir la formation de radicaux libres oxygns ou de permettre leur destruction.
La prvention nutritionnelle
Laugmentation de lapport nutritionnel en antioxydants
visera donc essentiellement prvenir ces maladies. Or
nous ne savons pas toujours quels sont les antioxydants
responsables des effets bnfiques observs en
pidmiologie avec les aliments riches en antioxydants
comme les fruits et les lgumes. L'alimentation contient un
grand nombre d'antioxydants, non seulement les vitamines
(E, C, Q, carotne) et les oligo-lments (slnium, cuivre,
zinc, manganse), mais aussi 600 sortes de carotnodes,
4 000 polyphnols et flavonodes (trouvs dans les choux, le
th, le vin, les crales, les fruits), des alcalodes, des acides
organiques, des phytates, des drivs soufrs de l'ail et de
l'oignon, des drivs indoliques du choux...
En dehors de la prvention primaire, l'apport d'antioxydants
pourra tre utile pour viter les rcidives. Il permettra aussi
de stabiliser la tolrance l'insuline, d'amliorer l'immunit.
Enfin, les antioxydants pourront tre utiliss pour diminuer la
toxicit des mdicaments, souvent gnrateurs de radicaux
oxygns dans leur mtabolisme. Toutefois, il faudra
se mfier des effets paradoxaux de fortes doses
d'antioxydants, car tous deviennent prooxydants s'ils sont
administrs en excs. De plus, il ne faut pas supprimer le
bruit de fond physiologique des radicaux libres. Nous avons
vu leur utilit dans la dfense anti-infectieuse. N'oublions pas
que l'apoptose est aussi un phnomne utile qui supprime
les cellules infectes par des virus ou les cellules
cancreuses.
Dans tous les cas, l'apport d'antioxydants devra se faire
dans la limite des apports recommands et en prfrant un
114 lactualit chimique - novembre-dcembre 2003
renforcement global des dfenses par un apport simultan
d'un ensemble d'antioxydants activit complmentaire,
plutt que l'apport massif d'un seul d'entre eux. Cet apport
prventif d'antioxydants nutritionnels a montr ses limites
avec plusieurs essais de grande envergure qui se sont
avrs ngatifs, sans doute cause d'un apport des doses
excessives de carotne chez des sujets dj fort risque
de lsions prcancreuses [16]. Par contre, plusieurs autres
tudes utilisant du slnium (tude Precise) ou un mlange
vitamines C et E et slnium (tude du Linxian) ont permis
une rduction du risque de cancers. Nous venons d'obtenir
les rsultats d'une tude similaire ralise en France, l'tude
Suvimax. La prise d'un mlange au sein d'une cohorte de
15 000 volontaires a entran au bout de 8 ans une rduction
de 30 % des cas de cancers chez les sujets masculins, alors
que le supplment n'a pas entran de bnfice chez les
sujets de sexe fminin. Il faut dire que ces dernires
possdaient au dbut de l'tude un statut antioxydant
en carotne nettement suprieur, d leurs
meilleures habitudes alimentaires et notamment une
plus grande consommation de fruits et lgumes.
Les antioxydants naturels et de synthse
Les antioxydants non nutritionnels comprennent des
produits naturels extraits de plantes, utiliss tels quels
ou aprs modifications chimiques, des produits
extraits d'animaux terrestres ou marins (enzymes ou
protines antioxydantes), des produits de synthse
imitant les enzymes, chlatant le fer ou pigeant les
radicaux. Ce dernier groupe de pigeurs de radicaux
de synthse comprend d'anciens mdicaments utiliss
depuis longtemps comme fluidifiants bronchiques,
anti-inflammatoires ou anti-hypertenseurs et redcou-
verts rcemment comme tant antioxydants, et de
nouvelles molcules dessines finalit d'tre antioxydan-
tes. Toutefois, les molcules historiques ont l'avantage de
possder une autorisation de mise sur le march (AMM)
comme mdicaments, alors que bien peu de nouvelles mol-
cules ont russi obtenir cette coteuse et difficile autorisa-
tion.
Les drivs vgtaux sont extrmement nombreux tre
utiliss principalement dans le domaine des supplments
et des produits cosmtologiques anti-vieillissement, qu'il
s'agisse de principes extraits de lgumes, d'pices, de
fruits ou de plantes mdicinales. Ils appartiennent de
nombreuses familles chimiques, alcalodes, glucosides,
drivs indoliques, mais celle des polyphnols a donn le
plus de molcules. Les plus utiliss sont la querctine (chef
de file des flavonodes), le resvratrol, extrait de l'corce du
raisin rouge et la curcumine, extraite de la racine de
curcuma.
Les chlateurs du fer ont t trs tudis, mais peu de
molcules ont russi dtrner la desferrioxamine qui est
un sidrophore naturel extrait de la bactrie Nocardia.
Toutefois, cette molcule doit tre administre par voie
parentrale. La Dexrazoxane est un chlateur de cations
divalents bidentate qui, en pr-traitement avant la
doxorubicine, permet de diminuer l'incidence et la svrit
de la toxicit cardiaque. Toutefois, sa faible dure de vie,
compare celle du mdicament, diminue son efficacit.
L'utilisation des enzymes a t trs limite par leur peu
d'efficacit clinique et par le risque de contamination
accrue depuis l'apparition de l'encphalopathie bovine
spongiforme. Par contre, les chimistes ont fabriqu un grand

nombre de molcules proprits superoxydes dismutases,
dits SOD likes , bases sur des complexes de cuivre, de
fer ou de manganse. Mais pour tre efficace in vivo, une
molcule montrant une activit SOD in vitro doit tre non
toxique, stable, avoir une longue demi-vie, ne pas former de
complexes ternaires avec les composants cellulaires, ragir
lentement avec l'oxygne molculaire sous sa forme rduite,
tre capable de traverser des membranes cellulaires et de
gagner un site hydrophile ou lipophile. De mme, des drivs
du slnium prsentent des proprits peroxydasiques.
Parmi eux, l'Ebselen [2-phnyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-
one] est maintenant commercialis dans de nombreux pays
europens comme anti-inflammatoire.
Les pigeurs chimiques appartiennent de nombreuses
familles : drivs phnoliques (butyl hydoxy tolune, probu-
col ou 4,4'[(1-mthylthylidne) bis(thio)]bis-[2,6-bis(1,1-
dimthyl) phnol]), drivs strodiens (lazarodes), drivs aussi chercher, comme notre organisme, utiliser les
soufrs (N-actyle cystine, DMSO, pnicillamine), drivs
de la mthyl xanthine (cafine, thobromine, thophylline,
pentoxifylline, allopurinol, trimtazidine), drivs hydroxyls
(mannitol, dipyrimadol).
Lapproche biologique
L'utilisation en thrapeutique des enzymes antioxydantes
s'est avre dcevante, sans doute parce que la quasi-
totalit des essais thrapeutiques ont port sur la
superoxyde dismutase cuivre-zinc cytosolique, enzyme
ambigu quant son rle strictement antioxydant puisque
sa surexpression fait produire la cellule du peroxyde
d'hydrogne plus dangereux que le superoxyde, car tant
neutre, il traverse les membranes et peut gnrer OH par
la raction de Fenton. Les enzymes slnium comme
les protines soufres (mtallothionines, thioredoxines)
seraient thoriquement beaucoup plus intressantes mais
doivent tre produites en grande quantit par gnie
gntique et testes chez l'animal. Deux autres approches
semblent prometteuses : la thrapie gnique et le transfert
de protines cibles. La thrapie gnique par transfert de
gnes antioxydants a donn des rsultats encourageants
chez l'animal : diminution des consquences de l'ischmie
du myocarde par les gnes de la catalase ou des SOD,
suppression des mtastases de cancer du poumon par le
gne de la SOD extracellulaire, suppression des tumeurs
gliales par la SOD. Le transfert de protines tagues permet
de les faire pntrer dans les cellules, grce une petite
squence peptidique cationique, le PTD (ou protein
transduction domain ), qui par un rcepteur membranaire et
de l'nergie, permet la protine fusionne de traverser
la membrane plasmique et mme la barrire hmato-
mninge. Nous avons rcemment montr qu'il tait ainsi
possible de faire entrer des protines antioxydantes dans
des lots de Langerhans (cellules scrtant l'insuline au sein
du pancras) et de les protger des stress oxydants trs
importants chez le diabtique.
Avenir
Le stress oxydant est devenu une notion incontournable en
biologie mdicale et porteuse d'espoir thrapeutique, mais
une notion plus complexe et plus riche que ce que nous en
percevions initialement. De nombreuses lacunes demeurent
dans l'arsenal thrapeutique contre le stress oxydant. Nous
ne disposons d'antioxydants efficaces et utilisables en
mdecine que contre les radicaux superoxydes (peu
Mcanismes biochimiques
toxiques) ou hydroxyles (difficiles atteindre car ragissant
instantanment). Il est donc capital de trouver de nouvelles
molcules efficaces pour neutraliser le peroxyde
d'hydrogne, l'oxygne singulet, le monoxyde d'azote et
surtout le peroxynitrite. Toutefois, l'idal serait d'aboutir
des mdicaments cibls un tissu et permettant un contrle
de l'tat redox des cellules ou la prvention du stress, plutt
qu' un effet global antioxydant qui ferait perdre la cellule
le bnfice potentiel qu'elle tire paradoxalement des
radicaux libres de l'oxygne. Pour cela, les chimistes
pourraient fabriquer des molcules modulant l'expression
des gnes antioxydants. L'industrie cosmtologique
dveloppe ainsi beaucoup de recherches sur les inducteurs
de ces protines au niveau cutan. Un autre abord est la
synthse de mimtiques d'enzymes autorguls par le
niveau redox de la cellule. Mais l'industrie chimique peut
radicaux libres pour activer par voie redox des prodrogues,
permettant une action cible aux cellules actives
produisant ces radicaux, soit pour rduire l'inflammation,
soit pour stopper l'infection virale, soit pour dclencher
l'apoptose de cellules cancreuses.
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Alain Favier
est professeur de biochimie, directeur du
Laboratoire de recherche Lsions des acides
nucliques du CEA de Grenoble*, et directeur
du Dpartement de biologie intgre au CHU
de Grenoble.
* Laboratoire Lsions des acides nucliques, Centre
dtude Nuclaire de Grenoble, rue des Martyrs, 38054 Grenoble.
Tl. : 04 76 76 54 84. Fax : 04 76 76 56 64.
Courriel : favier@drfmc.ceng.cea.fr
lactualit chimique - novembre-dcembre 2003 115