Aula 5

AMINOCIDOS, PEPTDEOS E
PROTENAS EXPERIMENTAL
META
Apresentar ao aluno os aminocidos e as protenas no laboratrio.

OBJETIVOS
Ao final desta aula, o aluno dever:
saber identificar um aminocido, peptdeo ou protena no laboratrio. Saber diferenciar
entre aminocidos livres e protenas. Conhecer os fatores que causam a desnaturao de
uma protena. Saber extrair as protenas do leite.

PR-REQUISITOS
Aula 03 de aminocidos e aula 04 de peptdeos e protenas, reaes de cidos carboxlicos,
aminas e amidas. Qumica orgnica experimental.

Andr Lus Bacelar Silva Barreiros

Marizeth Librio Barreiros
 Qumica de Biomolculas

INTRODUO

Ol aluno, nas duas aulas anteriores voc foi apresentado aos ami-
nocidos, peptdeos e protenas. Voc aprendeu sobre as suas estruturas e
propriedades, alm de ser introduzido s suas reaes. Nesta aula vamos
aprender a trabalhar com eles no laboratrio. Aprender a identificar um
aminocido, peptdeo ou protena. A diferenciar um aminocido de um
peptdeo ou protena. Vamos ver tambm algumas propriedades das pro-
tenas, como a sua desnaturao, e a deteco da presena de aminocidos
aromticos Phe, Tyr e Trp. Por fim vamos aprender a extrair as protenas
do leite.
Vamos comear ento? Mos a obra!

TESTE DA NINHIDRINA

A reao da ninhidrina detecta a presena do grupo -amino livre

dos aminocidos, do grupo amino terminal de peptdeos e protenas e do
grupo -amino da lisina. Ela segue o mecanismo de adio do nitrognio
nucleoflico aldedos e cetonas, onde formada uma imina (Figura 1). No
caso da prolina que uma amina secundria a reao um pouco diferente,
formando uma enamina ao invs da formar a imina (Figura 2).

Figura 01 - Mecanismo da formao da imina.

Fonte: BRUICE, P. Y. Qumica Orgnica. Vol. II, 4. Ed. Pearson Prentice Hall, So Paulo SP, 2006. Pg. 160.

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 Aminocidos, Peptdeos e Protenas Experimental Aula 5

Figura 02 - Mecanismo da formao da enamina.

Fonte: BRUICE, P. Y. Qumica Orgnica. Vol. II, 4. Ed. Pearson Prentice Hall, So Paulo SP, 2006. Pg. 162.

Em seguida ocorre uma descarboxilao devido presena do grupo

carboxilato ligado ao C-, gerando uma nova imina, que hidrolisa formando
um derivado da ninhidrina aminado. Esse derivado da ninhidrina adiciona
outra molcula de ninhidrina formando como produto uma imina de
colorao violeta (Figura 3), sendo que a cor proprcional concentrao.
Iminocidos prolina e 4-hidroxiprolina formam produtos amarelos, pois a
enamina amarela e no sofre a reao com outra molcula de ninhidrina.

Figura 03 - Mecanismo da reao da ninhidrina.

Fonte: BRUICE, P. Y. Qumica Orgnica. Vol. II, 4. Ed. Pearson Prentice Hall, So Paulo
SP, 2006. Pg. 383.

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 Qumica de Biomolculas

ATIVIDADES

Realizao do teste da Ninhidrina

Materiais: Reagentes:

- Balo volumtrico 100 mL - Tampo fosfato 0,01mol/L

- Pipeta volumtrica 10 mL - Clara de ovo
- Bquer 100 mL - Ninhidrina
- Pra - Glicina 10%
- 3 Tubos de ensaio - Aspartato 10%
- Pipeta graduada 10 mL
- Balana analtica
- Conta-gotas

Procedimento

Prepare uma soluo de albumina 10% (v/v) dissolvendo 10 mL de

clara de ovo em tampo fosfato 0,01 mol/L e avolumando com o tampo
para 100 mL em balo volumtrico. Num tubo de ensaio pipetar 2,0 mL
de soluo de nindrina e adicionar 5 gotas da soluo de protena 10%.
Aquecer em banho-maria fervente por 5 min. Anotar o resultado. Repetir o
procedimento substituindo a soluo de protena por soluo de aminocido
a 10% (glicina e aspartato). Nindrina: Dissolver 100 mg de nindrina em
100 mL de tampo fosfato 0,01 mol/L (pH = 7,0). Conservar em frasco
escuro na geladeira.

COMENTRIO SOBRE AS ATIVIDADES

Todas as trs amostras testadas do resultado positivo, entretanto

a Gly reage mais rapidamente pois no possui cadeia lateral, o que
reduz o impedimento estrico. Em seguida reage o Asp e por ltimo
a albumina. A colorao mais fraca da albumina pode indicar poucos
resduos de Lys em sua estrutura (Figura 4).

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 Aminocidos, Peptdeos e Protenas Experimental Aula 5

Figura 04 - Resultado do teste da Ninhidrina.

Fonte: Foto tirada pelo autor.

TESTE DO BIURETO

O Teste do Biureto um teste geral para protenas e peptdeos com mais

de dois aminocidos. A reao do Biureto o resultado da formao de
um complexo entre Cu2+ e as protenas ou peptdeos com mais de dois
aminocidos. As ligaes peptdicas so ligaes amida, e o par de eltrons
dos tomos de nitrognio das amidas encontram-se disponveis, podendo
servir de ligante para o tomo de cobre II. O sulfato de cobre II em meio
alcalino apresenta colorao azul clara, na presena de protenas ou pep-
tdeos forma produto violeta caracterizando a formao do complexo de
coordenao entre o cobre e os tomos de nitrognio das ligaes peptdicas
adjacentes, agindo como um ligante bidentado (Figura 5). Os dipeptdeos
do reao negativa por apresentarem apenas uma ligao peptdica. Os
aminocidos tambm do reao negativa por no apresentarem ligao
peptdica. Os grupos amino livres no coordenam com o cobre, pois em
pH 7,0 encontram-se protonados na forma de -NH3+, no tendo eltrons
disponveis para doar.

Figura 05 - Complexo formado entre o cobre II e peptdeos ou protenas.

Fonte: Desenhado pelo autor.

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 Qumica de Biomolculas

ATIVIDADES

Realizao do teste do Biureto

Materiais: Reagentes:

- 3 Tubos de ensaio - Sulfato de cobre II penta-hidratado

- 4 Pipetas graduadas 10 mL - Sal de Rochelle (tartarato de
sdio e potssio)
- Balo volumtrico 100 mL - Hidrxido de sdio 10%
- Pra - gua destilada
- Proveta 50 mL - Albumina 10%
- Bquer 100 mL - Glicina 10%
- Balana analtica
- Esptulas

Procedimento

Separe trs tubos de ensaio. No primeiro adicione 1,0 mL de gua desti-

lada, no segundo 1,0 mL de soluo de glicina 10% e no terceiro 1,0 mL de
soluo de protena albumima 10%. Adicione a cada tubo 1,0 mL do reativo
de Biureto. Agite os tubos e observe a cor. Reativo do Biureto: Em 50 mL
de gua destilada dissolver 0,15g de CuSO4.5H2O e 0,6g de sal de Rochelle
(tartarato duplo de sdio e potssio KNaC4H4O6.4H2O). Adicionar 30 mL
de soluo de NaOH 10% com agitao constante. Avolumar para 100 mL.

COMENTRIO SOBRE AS ATIVIDADES

A gua serve de branco, mostrando apenas a colorao do reativo

de biureto que azul clara. A glicina produz a mesma colorao do
branco, pois no ocorre formao de complexo. Apenas a albumina d
resultado positivo com colorao violeta (Figura 6), devido formao
do complexo com o cobre II.

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 Aminocidos, Peptdeos e Protenas Experimental Aula 5

Figura 06 - Resultado do teste do Biureto.

Fonte: Foto tirada pelo autor.

TESTE DE HELLER

Este teste serve para identificar a presena de protenas por desnatura-

o devido acidez do meio. As protenas globulares podem ser solveis em
gua desde que em sua estrutura terciria seus grupos hidroflicos estejam
posicionados para fora e seus grupos hidrofbicos posicionados para o
interior da protena. Uma das foras que mantm a estrutura terciria da
protena a atrao eletrosttica entre os ons positivos de aminocidos
como Lys e Arg e os ons negativos de aminocidos como Glu e Asp. Ao
acidificar o meio os ons carboxilato de Asp e Glu so protonados (-COO-
+ H+ -COOH), perdendo sua carga negativa. Isto quebra as interaes
eletrostticas, desorganizando a estrutura terciria da protena e expondo
dessa maneira os grupos hidrofbicos, tornando a protena insolvel em
gua. O meio cido tambm hidrolisa as ligaes peptdicas quebrando a
estrutura primria. A adio de cido ntrico concentrado portanto desnatura
a protena formando um anel branco de protena precipitada na interface
entre a soluo e o cido.

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 Qumica de Biomolculas

ATIVIDADES

Realizao do teste de Heller

Materiais: Reagentes:

- Tubo de ensaio - Albumina 10%

- 2 Pipetas graduadas 10 mL - cido Ntrico concentrado

Procedimento

Pipetar 2,0 mL da soluo de protena 10% em um tubo de ensaio. Der-

ramar cuidadosamente e sem agitao 1,0 mL de cido ntrico concentrado
pelas paredes do tubo. Observar o resultado obtido.

COMENTRIO SOBRE AS ATIVIDADES

Ao escorrer o cido sem agitar as fases no se misturam e podemos

observar a desnaturao da protena apenas na interface, formando
um anel branco (Figura 7).

Figura 07 - Resultado do teste de Heller.

Fonte: Foto tirada pelo autor.

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 Aminocidos, Peptdeos e Protenas Experimental Aula 5
REAO XANTOPROTICA

Este teste identifica a presena de aminocidos de cadeia lateral

aromtica (Phe, Tyr e Trp). As protenas que apresentam estes aminocidos
aromticos tambm reagem, sofrendo primeiramente precipitao devido a
desnaturao, seguida do desenvolvimento da colorao amarela. A reao
consiste da nitrao do anel aromtico, formando o nitrocomposto amarelo.
Em seguida a adio de base transforma os nitrocompostos formados em
sais de colorao alaranjada (Figura 8).

Figura 08 - Nitrao da Tirosina.

Fonte: Desenhado pelo autor.

ATIVIDADES

Realizao da Reao Xantoprotico

Materiais: Reagentes:

- 4 Tubos de ensaio - Albumina 10%

- 6 Pipetas graduadas 10 mL - cido Ntrico concentrado
- Bquer 500 mL - Hidrxido de sdio 2,5 mol/L
- Pra - Fenilalanida 10%
- Chapa de Aquecimento - Tirosina 10%
- Pegador para tubo de ensaio - Triptofano 10%

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 Qumica de Biomolculas

PROCEDIMENTO

Pipete 2,0 mL de soluo albumina 10% e transfira para um tubo de

ensaio. Escorra pelas paredes do tubo 1,0 mL de HNO3 conc. e observe a
formao do precipitado branco. Aquea o tubo em banho-maria fervente
durante 1 min e observe e anote a cor do precipitado. Refrie em gua cor-
reste a adicione 1,0 mL de NaOH 2,5 mol/L. Observe e anote a cor. Repita
o teste para soluo 10% de um dos seguintes aminocidos: fenilalanina,
tirosina ou triptofano.

COMENTRIO SOBRE AS ATIVIDADES

Ao entrar em contato com o cido primeiramente a protena desnatura,

da mesma maneira que no teste de Heller. O aquecimento promove a
nitrao dos aminocidos de cadeia lateral aromtica Phe, Tyr e Trp,
assim como hidrlise parcial das ligaes peptdicas, formando produto
amarelo. Ao tratar com NaOH formado o sal do nitro composto
que laranja e no amarelo, comprovando a presena de aminocidos
livres (Figura 9).

Figura 09 - Resultado da reao xantoprotica.

Fonte: Foto tirada pelo autor.

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 Aminocidos, Peptdeos e Protenas Experimental Aula 5
REAES DE PRECIPITAO DAS PROTENAS
(DESNATURAO)

A solubilidade em gua das protenas muito varivel, e depende da

distribuio dos grupos apolares (hidrofbicos) e polares (hidroflicos)
na molcula. Para a protena ser solvel em gua os grupos hidrofbicos
devem estar no interior da molcula onde interagem entre s, e os grupos
hidroflicos expostos no exterior onde interagem com as molculas de
gua. Qualquer alterao nesta distribuo altera a solubilidade da protena,
levando sua precipitao. Uma alterao na estrutura terciria denomi-
nada desnaturao da protena.
Uma forma de alterar a solubilidade a adio de ons. Se a protena
estiver em soluo de pH inferior ao seu pI ela estara em sua forma
catinica (-NH3+), desta forma, para precipita-la basta adicionar nions
tricloroacetato, picrato ou alcalides. A adio de sais de metais pesados
causam a precipitao pela combinao do ction metlico (Pb2+, Hg2+, etc)
com as cargas negativas da protena dos resduos de Asp e Glu (-COO-).
As protenas tambm precipitam pela adio de cido ntrico devido a
desidratao causada pelo nion nitrato e protonao dos resduos de Asp
e Glu (-COO- + H+ -COOH), quebrando as interaes eletrostticas.
Solues salinas causam a precipitao por efeito salting-out, e solventes
orgnicos por desidratao. O calor tambm um agente desnaturante,
pois o aumento da agitao molecular altera a conformao, quebrando
as interaes e expondo os grupos hidrofbicos.

ATIVIDADES

Desnaturao de Protenas

Materiais: Reagentes:

- 5 Tubos de ensaio - Albumina 10%

- 5 Pipetas graduadas 10 mL - cido tricloroactico 10%
- Bquer 500 mL - Acetato de chumbo 5%
- Pra - Etanol
- Chapa de Aquecimento - Sol. Saturada de Sulfato de amnio
- Pegador para tubo de ensaio

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 Qumica de Biomolculas

Procedimento

Tome 5 tubos de ensaio e adicione 2,0 mL de soluo de albumina 10%

em cada um. Aquea o Tubo 1 em banho-maria fervente por 3 min. Anote
o resultado. Ao Tubo 2 adicione 2,0 mL de cido tricloroactico 10%. Anote
o resultado. Ao Tubo 3 adicione 2,0 mL de soluo de acetato de chumbo
5%. Anote o resultado. Ao Tubo 4 adicione 5,0 mL de etanol. Anote o
resultado. Ao Tubo 5 adicione 4,0 mL de soluo saturada de (NH4)2SO4
e anote o resultado. Em seguida adicione 6,0 mL de gua destilada e anote
o resultado.

COMENTRIO SOBRE AS ATIVIDADES

Em todos os cinco tubos ocorreu desnaturao pelos efeitos

mencionados na texto. Nos quatro primeiros a desnaturao
irreversivel, entretanto no quinto tubo onde ocorreu o efeito salting-
out a adio de mais gua dilui o sal revertendo a desnaturao no
chamado efeito salting-in.

ISOLAMENTO DAS PROTENAS DO LEITE

O leite um dos alimentos mais completos, contendo em sua com-

posio protenas compostas por todos os aminocidos essenciais, carboi-
dratos na forma de lactose, lipdeos na forma de triacilgliceris, fosfolipdios
e colesterol, alm das vitaminas tiamina, riboflavina, cido pantotnico e
vitamina A, D e K. No leite existem trs tipos de protenas: as casenas que
compem 85% das protenas totais, as lactoalbuminas e as lactoglobulinas,
todas globulares. A casena uma fosfoprotena, pois na cadeia lateral
esto ligados grupos fosfato, principalmente nas hidroxilas das serinas e
treoninas. A casena uma mistura de trs protenas -casena, -casena
e -casena, todas com massas molares bem diferentes. Sozinhas as duas
primeiras precipitariam em presena de Ca2+, entretanto a -casena estabi-
liza a estrutura do sal caseinato de clcio formando uma micela. O ponto
isoeltrico do caseinato de clcio ocorre em pH 4,6 enquanto que o leite
tem pH 6,6. Qualquer fator que altere o pH reduzindo abaixo de 4,6 ir
precipitar a casena. J as albuminas (lactoalbuminas) so solveis em gua e
em solues salinas diludas, entretanto desnaturam e precipitam pela ao
do calor. Por fim as lactoglobulinas so responsaveis pelas propriedades
imunolgicas do leite, encontrando-se em menor quantidade e tambm
precipitando pela ao do calor ou adio de solvente orgnico.
Neste experimento iremos isolar as protenas do leite e conprovar as
suas propriedades. Como utilizaremos leite desnatado, no teremos a pre-

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 Aminocidos, Peptdeos e Protenas Experimental Aula 5
sena de lipdios e nem das vitaminas liposolveis, restando no soro apenas
um soluo do acar galactose.

ATIVIDADES

Isolamento das protenas do leite

Materiais: Reagentes:

- Balana semi-analtica - Leite em p desnatado

- Esptula - gua destilada
- Bquer 250 mL - cido actico 10%
- Banho termostatizado - Carbonato de clcio
- Basto de vidro - Reagente de Biureto
- Bquer 100 mL - Etanol
- Pipeta Pasteur
- Centrfuga
- Tubos de ensaio
- Bancada para tubos de ensaio
- Pissete
- Vidros de relgio
- Erlenmeyer 125 mL

Procedimento

Pese 10g de leite em p desnatado num bquer de 250 mL, acrescente

25 mL de gua destilada e aquea em banho-maria a 40C acompanhando
com um termmetro a temperatura do leite. Quando o leite atingir 40C
comece a adicionar gota a gota 2,5 mL de cido actico 10% e v agitando
lentamente e recolhendo com uma esptula a casena coagulada, tomando
o cuidado de espremer para remover o lquido. Transfira a casena para
um bquer de 100 mL. Se ainda houver lquido neste bquer remova com
uma pipeta Pasteur e retorne pro primeiro bquer. Continue adicionando
o cido actico gota a gota at a casena precipitar totalmente (Cuidado,
no aquea demais nem adicione muito cido para no hidrolisar a lactose).
Centrifugue por 5 min para separar o soro da casena restante.
Retorne o soro para o primeiro bquer e adicione 0,5g de carbonato de
clcio para neutralizar, agite e aquea at 75C, mantendo nesta temperatura
por 5 min, todas as lactoalbuminas devero precipitar. Centrifugue e separe
as lactoalbuminas. Reserve o soro para o isolamento da lactose. Realize o

133
 Qumica de Biomolculas

teste do biureto com uma pequena quantidade das protenas isoladas em

2,0 mL de gua destilada. Seque em vidros de relgio separados e determine
o rendimento na prxima aula.
Tome o lquido reservado do experimento anterior e adicione 45 mL de
etanol. Ocorrer precipitao de slidos (globulinas). Aquea at 60C para dis-
solver a lactose e centrifugue ainda quente por 2 min. Descarte o material slido
e transfira o lquido para um erlenmeyer de 125 mL. Deixe esfriar. Realize os
testes de Molish e Benedict com um pouco do lquido. Deixe o restante tampado
recristalizando por 1 semana. Observe os cristais de lactose na semana seguinte.

COMENTRIO SOBRE AS ATIVIDADES

Ao adicionar o cido actico o caseinato de clcio desestabilizado,

pois a protena casena atinge seu ponto isoeltrico pI, precipitando
desta forma e podendo ser separada. A lactoalbumina e a lactoglobulina
no so desnaturadas neste pH 4,6. A lactoalbumina mais sensvel
ao calor, desnaturando a 75C, podendo assim ser isolada. Por fim a
lactoglobulina desnaturada pelo etanol, sendo insolvel tanto a quente
quanto a frio. Como a lactose solvel em etanol quente, efetuamos
a centrifugao ainda quente, removendo a globulina e deixando a
lactose dissolvida no soro. Ao ser resfriada a soluo a lactose cristaliza
lentamente no fundo, podendo ser removida por filtrao a vcuo
lavando com etanol gelado.

CONCLUSO

Como vimos, possivel diferenciar os aminocidos das protenas no

laboratrio por um teste simples. E podemos caracterizar as protenas por
suas propriedades. As protenas e aminocidos esto presentes em diversos
alimentos que consumimos.

RESUMO

Neta aula aprendemos sobre como identificar aminocidos, peptdeos

e protenas pelo teste da Ninhidrina, aprendemos a diferenciar aminoci-
dos dos peptdeos e protenas pelo teste do Biureto. Vimos tambm que
as protenas desnaturam em meio fortemente cido pelo teste de Heller, e
identificamos a presena de aminocidos de cadeia lateral aromtica pela
reao Xantoprotica. Avaliamos os diferente fatores que podem causar a
desnaturao de uma protena. Por fim, extramos as protenas e o acar
do leite e realizamos a sua caracterizao.

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 Aminocidos, Peptdeos e Protenas Experimental Aula 5

AUTO-AVALIAO

1- Que grupo funcional o teste da Ninhidrina identifica?

2- Por que o teste da Ninhidrina daria negativo para a propilamina e posi-
tivo para a alanina?
3- Qual aminocido falha no teste de Ninhidrina e porque?
4- Por que o teste do Biureto d negativo para aminocidos e positivo para
peptdeos e protenas?
5- Em que se baseia o teste de Heller?
6- Mostro o mecanismo da reao Xantoprotica com o aminocido Tyr.
7- Quais fatores causam a desnaturao de uma protena? Explique cada
um deles:
8- Quais os tipos de protenas encontradas no leite?
9- Por que podemos separar os diferentes tipos de protenas do leite?
10- Desenhe a estrutura em forma de cadeira da lactose:

PRXIMA AULA

Na prxima aula vamos aprender sobre uma classe especial de protenas:

as enzimas, e sua atividade cataltica.

REFERNCIAS

BRUICE, P. Y. Qumica Orgnica. 4. Ed. Pearson Prentice e Hall, So

Paolo SP, 2006. Vol. 2.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princpios de Bio-
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MASTROENI, M. F., GERN, R. M. M. Bioqumica: Prticas Adaptadas.
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PAVIA, D. L., LAMPMAN, G. M., KRIZ, G. S., ENGEL, R. G. Qumica
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PETKOWICZ et. al. Bioqumica:Aulas Prticas. 7. Ed. Editora UFPR,
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VOGUEL, A.I. Qumica Orgnica: Anlise Orgnica Qualitativa, Ed. Ao
Livro Tcnico S.A., Vol. 1, 2 e 3, 1971.

135