PRCTICA N 3

TINCIN DE GRAM Y DE MANEVAL

I. INTRODUCCIN:

TINCIN DE GRAM

El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la tincin de Gram,

llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo divide las bacterias en dos
grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificacin
y diferenciacin de microorganismos. La reaccin a la tincin de Gram est basada en la
diferencia en la composicin qumica de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram
positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o murena, mientras que esta capa es ms
fina en las Gram-negativas y est rodeada por una bicapa lipdica externa. El Peptidoglicano es
un polisacrido formado por dos subunidades qumicas, N-acetilglucosamina y cido
Nacetilmurmico.

Fundamento de la tincin: Tincin Primaria, Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas
moradas. Luego se utiliza un Mordiente que puede ser Yodo o lugol. Segn Bergey (1994) El
lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl
(Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo. El yodo, aparte de matar
bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario con la clula, formando complejos
insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido.
Luego de eso se agrega el Agente decolorante. Comnmente se utiliza alcohol etlico al 95% o
acetona. El etanol tiene doble funcin como deshidratante de protenas y solvente de lpidos.
El alcohol disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo
la pared ms porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa
de mureina ms fina de las bacterias Gram negativas, mientras que la pared ms gruesa de las
Gram-positivas retiene el tinte en su interior, colorendose de color morado o violeta. La
ltima reaccin es la Tincin de Contraste con Safranina, un colorante bsico. Este tinte se
utiliza para teir de rojo las clulas previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.
TINCIN DE MANEVAL

En 1982, Lpez, A. J. Barajas, R. sealaron que Muchas bacterias estn rodeadas por
compuestos qumicos superficiales que se ties con mucha dificultad y que ha sido
denominada cpsula. La mayora de las cpsulas bacterianas estn constituidas qumicamente
por polisacridos, aunque en el gnero Bacillus consiste en un polipptido del cido D-
Glutmico. La cpsula desempea un papel importante en la virulencia de algunas bacterias
patgenas, ya que les confiere propiedades antifagocticas que interfieren con los mecanismos
de defensa del organismo. El grosor de la cpsula vara no solo de una especie de
microorganismos a otra, sino que tambin entre las diferentes cepas de la misma especie y
dependiendo de la fase de la curva de crecimiento en que se encuentra el cultivo. El dimetro
de la cpsula puede ser varias veces mayor al dimetro del cuerpo celular, como en el caso de
Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae. Las bacterias con cpsula, en los medios
de cultivo, forman colonias lisas y mucoides mientras que las bacterias no capsuladas
producen colonias rugosas.
Las cpsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teidos con las tcnicas usuales
porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijacin al calor y
lavado las disuelven. Por lo tanto, el mejor mtodo para observarlas es el de las tinciones
negativas. Los colorantes usados son: Maneval A (Rojo Congo), sirve, sobretodo, como
indicador del pH, es decir, de indicador de la acidez de un medio. En su forma bsica el rojo
congo es rojo. Cuando el pH est comprendido entre 3.0 y 5.2 se vuelve rosa y el colorante
Maneval B (Fucsina cida). El objetivo de esta prctica es conocer los fundamentos
moleculares de la coloracin de Gram y Maneval, asi como la observacin de bacterias
Grampositivas y Gramnegativas. Tambin la observacin de cpsula bacteriana en Klebsiella
pneumoniae. Miranda, M. (1994).

II. OBJETIVOS:

Determinar la estructura molecular de las bacterias mediante dos tipos de

tincin.

III. MATERIALES Y MTODOS:

MATERIALES:

Laminillas cubreobjetos
Laminas portaobjetos
Mechero de Bunsen
Aceite de inmersin
10 Isopos de madera
Colorantes para la tincin de Gram.
05 estudiantes (muestra)
Rejilla de soporte o de tincin
Gotero
INSTRUMENTO:

01 microscopio

MTODO:

1 Coloracin de Gram

Realizar un frotis de sarro dentario en una lmina portaobjetos. Permita que los frotis se
sequen al aire y luego fjelos con calor. Teir con cristal violeta agregando suficiente colorante
e inundar suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y dejar actuar durante dos minutos.
Lavar suavemente con agua. Decolorar con alcohol etlico al 95%. Nota: No sobre decolorar,
agregue el alcohol gota a gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul. Lavar
suavemente con agua. Agregar la safranina para la tincin de contraste, y dejar actuar durante
dos minutos. Lavar suavemente con agua. Secar la preparacin. Por ltimo, examinar al
microscopio con el objetivo 100X de inmersin con aceite de cedro.

2 Coloracin de Maneval

Colocar una gota de Maneval A (Rojo Congo) en una laminilla sobre el frotis ya fijado, haciendo
movimientos giratorios con el asa. Extender la suspensin de manera que quede una pelcula
delgada. Dejar secar la preparacin a temperatura ambiente. NO FIJAR EL FROTIS AL CALOR.
Cubrir la preparacin con Maneval B (Fucsina cida) y dejar que acte durante dos minutos.
Lavar suavemente con agua corriente de la llave y seca el frotis mediante un ligero contacto
con una toalla de papel. Observar al microscopio Con el objetivo de inmersin. Las cpsulas se
observan como halos incoloros. El espacio intercelular se observa de un color oscuro y las
clulas bacterianas de color rojo.

I. RESULTADOS:
 II. COMENTARIO CIENTFICO:

III. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

Asca,A.; Aldea,A.; Arru,K. & Valverde,K. (2012). Bacterias Grampositivas y

Gramnegativas. Disponible en: http://biologiamedica.blogspot.pe/bacterias-gram-
positivas-y-gram-negativas.
Bergey, David H.; Holt, John G.; Krieg, Noel R.; Sneath, Peter H. A. (1994). Bergey's
manual of determinative bacteriology. 9 edicin. Lippincott Williams & Wilkins.

Lpez, A. J. Barajas, R. (1982). Manual de Laboratorio para Bacteriologa y Micologa.

Departamento de Bacteriologa. FMVZ-UNAM.