Laboratorio de Microbiologa Industrial 2017 - I

Aislamiento de microorganismos amilolticos y produccin de amilasa en cultivo

sumergido y mediante fermentacin en estado slido
A. Barrientos1 - J. Cachay1 - J.Cisneros1 - R. Rodrguez1

Summary:
Amylolytic microorganisms were isolated from a soil sample from the district of San Borja,
Lima - Peru. The isolate with the highest hydrolysis halo was identified as Aspergillus sp. and
was selected for the production of amylases in submerged fermentation (FS) (soluble starch
20 g / L) and in solid state fermentation (FSS) (wheat bran 7.5 g). In FS, the enzyme activity
was 3052.5 U/L while in FSS it was 121.0232 U/g. Volumetric productivity for amylase (E)
was 31.7969 (U L-1 h-1) for submerged fermentation and in FSS it was 256,292 (U L-1 h-1). It
was found that the FSS system culture gives a higher amylase production than a FS culture
in the case of Aspergillus sp.

Keywords: Aspergillus sp amylases, submerged fermentation, solid state fermentation

Resumen:
Se aislaron microorganismos productores de amilasas de una muestra de suelo del distrito
de San Borja, Lima - Per. El aislado con mayor halo de hidrlisis se identific como
Aspergillus sp. y se seleccion para la produccin de amilasas en fermentacin sumergida
(FS) (almidn soluble 20 g/L) y en fermentacin en sustrato slido (FSS) (salvado de trigo 7.5
g). En la FS la actividad enzimtica fue 3052.5 U/L mientras que en la FSS fue 121.0232 U/g.
La productividad volumtrica (E) de amilasa fue 31.7969 (U L-1 h-1) para el cultivo sumergido
y para el caso de la FSS tuvo un valor de 256.292 (U L -1 h-1) . Esto indica que el sistema de
cultivo en FSS fue ms eficaz que el de FS para la produccin de amilasas en el caso de
Aspergillus sp.

Introduccin: al. (2000), su uso en la biotecnologa es

Amilasas es la denominacin que ha importante para diferentes procesos
recibido aquella familia de carbohidrasas industriales como lo son las industrias de
encargadas de la degradacin del almidn, los alimentos, del papel y los textiles,
una de los polisacridos ms conocidos siendo muy til al reemplazar los procesos
segn Redleman (2000). Segn Pandey et de hidrlisis del almidn mediante mtodos

1
Pregrado en Biologa, Laboratorio de Micologa y Biotecnologa (LMB), Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Agraria La
Molina (UNALM), Lima-Per.
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qumicos, los cuales suelen dejar tras de s
residuos contaminantes. Estas
enzimas que se han reportado muy
extensamente en los microorganismos
(aunque tambin en animales y plantas),
siendo la -amilasa y la glucoamilasa las
que se identifican con mayor frecuencia en
estos.
Debido a su gran importancia,
produccin de estas enzimas a gran escala
es sin duda beneficiosa. Sin embargo,
primero debemos tener en cuenta que es
necesario identificar a los organismos que
son capaces de producirla. La OEA (2000)
establece que el xito o fracaso de un
proceso fermentativo va a depender del
microorganismo elegido, teniendo
cuenta ciertos criterios como
estabilidad gentica de la cepa, que tenga
una alta velocidad de crecimiento, que est
libre de contaminantes (como fagos), que
tengan requerimientos nutricionales tales
que sean satisfechos por medios de costo
reducido, de fcil conservacin por largos
perodos de tiempo sin perder
caractersticas, que sea capaz de realizar
el proceso fermentativo completo en un
lapso corto de tiempo y que si fuese
obtenerse un producto lo haga con el
mayor rendimiento y con la mejor facilidad
de extraccin del medio posible . Las
fuentes de cepa pueden ser naturales o de
una coleccin de cepas. Una vez elegida la
fuente de aislamiento, su xito depender
de la tcnica usada por el mismo. Entre
estas tcnicas tenemos al aislamiento
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directo y el uso del enriquecimiento del
son cultivo. En el primero es deseable que el
medio que se utiliza para el aislamiento
posibilite la mxima expresin del material
gentico del organismo, basndose en la
forma de crecimiento o en la formacin de
halos de degradacin del sustrato u otro
factor.
la Actualmente hay varios sistemas de cultivo
conocidos, como lo son el uso de la
fermentacin sumergido (FS), la
fermentacin sobre sustrato slido (FSS) y
la fermentacin por adhesin a superficies.
Segn Gutirrez-Correa & Villena (2003),
cada sistema tiene sus ventajas y sus
defectos, por ejemplo cuando se refiere a
en FSS debido a su limitacin de agua en el
es la sistema, se puede tener una mayor
concentracin de productos as como una
alta productividad volumtrica; sin
embargo, es complicado escalar los
procesos en este tipo de fermentaciones
para llegar a nivel de industria. Para los
procesos en FS, es muy til referente a
sus aspectos de ingeniera como el diseo del
biorreactor a usar, el control del proceso y
el modelamiento de la fermentacin; a
pesar de ello no es tan barato ni permite
tanto ahorro de energa como lo hara un
proceso de FSS.
En este experimento, se ha hecho un
aislamiento de los microorganismos
amilolticos que habitan en una muestra de
suelo, de forma que se pueda realizar una
identificacin de aquellos con un gran
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potencial degradativo y poder comparar
ciertos parmetros de productividad al usar
la FS o la FSS
Materiales y mtodos:
Lugar de muestreo: Se tom una muestra
de suelo del distrito de San Borja, Lima-
Per (-12.08457812, -77.00393069), del
cual se seleccion un rea de 1m 2 de
suelo. Se retir el material vegetal y se
removi el suelo hasta 15 cm de
profundidad. No se realiz enriquecimiento
del rea, sin embargo se mantuvo la
humedad durante los 15 das anteriores al
muestreo.
Muestreo: Se tom 100 g de suelo
humedecido in situ en un recipiente
desinfectado y se guard en un lugar
fresco, pero no refrigerado.
Aislamiento de microorganismo
amilolticos: Se pes 10 g de suelo y se
aadi a un matraz Erlenmeyer con 90 ml
de agua destilada estril (dilucin 100) y se
agit por 10 minutos. Luego se realiz el
mtodo de las diluciones sucesivas
llegando a la dilucin 10-5. Finalmente, se
tom 1 ml de cada dilucin y se sembr por
incorporacin en placas petri con medio de
aislamiento para hongos (10g almidn
soluble, 0.5 g casena, 1.4 g NH4NO3, 0.5
g K2HPO4, 0.5 g MgSO4, 0.1 ml tritn-x-
100, 15 g agar, 1000 ml agua destilada y
tetraciclina 100 g/ml). Las placas fueron
incubadas por 4 das a 30 C.
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Seleccin e identificacin de hongos
amilolticos: Terminado el periodo de
incubacin, se utiliz una cmara de yodo
metlico para observar los halos de
hidrlisis. Se seleccionaron cepas
amilolticas en base a la amplitud del halo
incoloro. Las colonias se identificaron
morfolgicamente hasta el nivel de gnero
empleando el manual de Barnett (Barnett,
H. y Hunter, B. 1998). La colonia que
presento el mayor halo de hidrlisis fue
trasplantada a tubos con cua y a placas
Petri ambos con Agar Papa Dextrosa
(PDA) los cuales se incubaron a 30 C por
3 das.
Preparacin del inculo: Se seleccion la
cua de la colonia con mayor halo de
hidrolisis de almidn. Las esporas se
lavaron con 10 ml de solucin Twen 80 de
0.1% (v/v) y el recuento se realiz con la
cmara de Neubauer. Se diluy hasta
alcanzar una suspensin de 1 x 10 6
esporas ml-1, la cual se us como inculo.
Cultivo Sumergido (FS): Del inculo se
tom 3 ml y se coloc en un matraz
Erlenmeyer que contena 80 ml de medio
de produccin (20 g de almidn, 2.8 g
NH4NO3, 1 g K2HPO4, 0.5 g KCL, 0.03 g
FeSO4, 0.5 g CaCl2, 1 g peptona, 1000 ml
agua destilada, pH 6.5) el cual se incub
en bao a 30 C con agitacin a 175 rpm
por 4 das.
Cultivo en Sustrato Slido (FSS): Se
aadi 3 ml de inculo a un matraz
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Erlenmeyer que contena medio de
produccin 7.5 g salvado de trigo con
99.1% de almidn, 6 g torta de soya
molida, 15 ml solucin de sales (KH2PO4
0.2%, MgSO4.7H2O 0.03%, CaCl2, agua de
cao decantada). El matraz se incub a
30 C por 4 das (96 h).
Recuperacin de la enzima: Para el
sistema (FS), la suspensin de enzimas se
separ de la biomasa utilizando filtracin al
vaco. Adems se emple papel filtro de
peso conocido. El producto de la filtracin
se sec a 80 C por 2 das, la cantidad de
biomasa se determin por diferencia de
peso seco. Para el cultivo (FSS) se aadi
69 ml de tampn acetato 50mM, pH 4.8, se
agit homogneamente a 200 rpm por 20
min y por filtracin se separ el
sobrenadante del precipitado.
Determinacin de la actividad amilasa y
protenas solubles: Del sobrenadante
obtenido de los dos sistemas de cultivo se
determin la actividad enzimtica (FS
dilucin 1/20, 1/50, 1/100. FSS dilucin
1/150, 1/200, 1/300) mediante anlisis de
azcares reductores liberados durante la
hidrlisis de almidn, mtodo de Miller
(Miller, G. 1959), empleando DNS como
reactivo. La lectura se realiz a 540 nm. Se
entiende por unidad enzimtica (UI) como
la cantidad de enzima que libera 1mol de
glucosa por minuto a 50C y pH 4.8. La
lectura fue realiza a 550 nm. Para la
determinacin de protena soluble se
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emple el mtodo de Lowry (Lowry et al,
1951).
Resultados:
Aislamiento: Se escogi la placa cuya
dilucin fue de 10-4 debido a la presencia
de colonias con una separacin adecuada
y de tamao considerable. La seleccin del
microorganismo se realiz en funcin al
tamao del halo de hidrolisis despus del
revelado en yodo metlico. Se procedi
luego a la identificacin del hongo de
acuerdo a sus caractersticas
morfolgicas, las cuales se compar con lo
estipulado en el Manual de Barnett (Barnett
y Hunter, 1998). La identificacin
microscpica a travs del aumento 400x
permiti determinar que dicho
microorganismo perteneca al gnero
Aspergillus sp.
Consumo de sustrato, secrecin de
protenas y biomasa formada: En la
Tabla 01 podemos ver para el sistema FS
la concentracin de protenas secretadas,
el consumo de sustrato y la biomasa
formada. Debido a que se presentan
ciertas complicaciones en el sistema FSS
para separar la biomasa formada del
sustrato, as como la complejidad del
mismo, no se pudo calcular los dos ltimos
valores, sin embargo si se pudo cuantificar
la concentracin de protena secretada.
Como se puede apreciar, la concentracin
de amilasa producida por el sistema FSS
fue 96.5 veces mayor que para el sistema
FS.
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Tabla 01. Comparacin de parmetros de biomasa, sustrato consumido y protenas

solubles por Aspergillus sp. obtenidos en los sistemas FS y FSS
Concentracin de
Biomasa formada Sustrato consumido
Proceso protenas secretadas
(g L-1) (g L-1)
(g/L)
FS 6.29 21.835 0.823
FSS - - 7.940
Biomasa formada (g l -1)= biomasa producida (g)/volumen de medio de fermentacin (l),
Sustrato consumido (g l -1)=glucosa presente en el medio (g)/volumen del medio de
fermentacin, Protena secretada total (g)=protena secretada soluble (g) contenida en el
volumen total utilizado (80mL para FS y 60mL para FSS).

Parmetros de productividad: Por las Los resultados de los diferentes

dificultades ya explicadas anteriormente
para el sistema de cultivo FSS, algunos
parmetros de productividad tales como
rendimiento enzima respecto a biomasa
formada (YE/X), rendimiento enzima
respecto a sustrato consumido (YE/S),
rendimiento biomasa formada respecto a
sustrato consumido (YX/S), productividad
volumtrica de biomasa (X) y FSS esta resulta ser 8.1 veces mayor que
productividad volumtrica especfica de
amilasa (E/X) no pueden ser calculados.
parmetros de productividad estn
expresados en la Tabla 02.
Como podemos observar, la actividad
especfica (YE/P) del sistema FS es un
16.45% mayor al sistema FSS. Sin
embargo, el valor de la productividad
volumtrica de amilasa (E) del sistema
la presentada por el sistema FS.

Tabla 02: Comparacin de parmetros de productividad para la produccin de amilasa de Aspergillus bajo
diferentes condiciones despus de 96h de cultivo (1)
YE/X YE/S YE/P YX/S E X E/X
Proceso EA
(U g-1) (U g-1) (U g-1) (g g-1) (U l-1 h-1) (g l-1 h-1) (U g-1 h-1)
FS
3052.5 485.5836 139.7985 3708.99 0.2879 31.7969 0.0655 5.0582
(pH 6)
FSS 121.0232 - - 3098.74 - 256.292 - -
(1) Parmetros de productividad: EA (U/l o U/g) : actividad enzimtica, [P] (g/l) = concentracin de protenas, YE/X (U
g-1) = Amilasa producida (U l-1)/ Biomasa formada (g l-1), YE/S (U g-1) = Amilasa producida (U l-1)/ sustrato consumido (g
l-1), YE/P o actividad especfica (U g-1) =Amilasa producida (U l-1) / protena secretada (g l-1), YX/S (g g-1) = Biomasa
formada (g l-1) / Sustrato consumido (g l-1), E (U l-1 h-1) =Productividad volumtrica de amilasa, X (g l-1 h-1) =
Productividad volumtrica de biomasa, E/X (U g-1 h-1)= Productividad volumtrica especfica de amilasa.
(2) (U l-1) (3) (U g-1)

Discusin: de 400x se pudo determinar que la cepa

Del aislamiento de cepas, se eligi a la que
presentaba mayor halo de hidrlisis,
debido a que esto sugiere que se trata de
un microorganismo con alto potencial en la
capacidad de producir enzimas. A travs
de la caracterizacin morfolgica mediante
el uso del microscopio usando un aumento
aislada se trata del hongo Aspergillus sp.
Este es uno de los gneros ms conocidos
y cuya capacidad de secretar enzimas
amilolticas ha sido previa y ampliamente
estudiada. (Pandley, 2000). Sohail et al.
(2005), seala que el 75% de muestras
aisladas del suelo pertenecen al gnero
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Aspergillus y el 17% de los mismos dirigir su metabolismo al crecimiento en

presenta actividad amiloltica. lugar de produccin de amilasas.
Adicionalmente, se ha reportado que el uso
Al comparar el anlisis de la productividad de fuentes de nitrgeno inorgnico como
en FS y FSS, se encontraron diferencias nitrato de amonio presenta un efecto
entre los dos sistemas usados. Como negativo en la produccin de enzimas por
vemos en la Tabla 02, al comparar la A. oryzae (Jin et al. 1998). Tambin
actividad especfica (YE/P) de FS respecto comparando la alta productividad
a la de FSS, se puede deducir que en el enzimtica (E), as como la mayor
sistema FS se recuper mayor cantidad de concentracin de protenas secretadas al
producto protenico sin actividad medio en el sistema FSS con respecto al
amiloltica. Respecto a la actividad sistema FS se explica segn lo expresado
enzimtica para FSS, la alta actividad por Gutirrez-Correa et al. (2003) respecto
enzimtica en trminos de volumen en la a lo anteriormente explicado respecto al
fermentacin en sustrato slido se ve sustrato slido. La diferencia obtenida se
apoyada por lo mencionado por Gutirrez- puede deber a que el sustrato slido
Correa et al. (2003) al referirse al sustrato empleado presenta mucha similitud al
slido, donde se obtiene una mayor sustrato que el gnero Aspergillus suele
concentracin de productos, en esto caso utilizar naturalmente para su crecimiento.
de enzimas amilolticas. Investigaciones En otras palabras, el hongo tiene un
anteriores confirman los resultados sobre metabolismo que ya est preparado y
la produccin de amilasas, donde se especializado para el consumo de un
menciona que las ventajas del sistema sustrato complejo (Hlker et al, 2004;
FSS ofrece sobre el desarrollo tradicional Souza et al, 2010).
son: altos rendimientos en cortos periodos
de tiempo, mejor circulacin de oxgeno, Para la mayora de -amilasas producida
un ambiente natural parecido para hongos por microorganismos de la especie
filamentosos, alta productividad Aspergillus sp., el intervalo de pH ptimo
volumtrica y alta produccin de energa se limita a 4.5-6.6 (Vihinen y Mntsl,
(Das et al. 2011). 1989), coincidiendo con el pH en que se
obtuvo esta enzima en el sistema FS,
El valor de Yx/s =0.2879 g g-1 para FS se encontrndose dentro del rango de
aproxima al encontrado por Spohr et al. produccin de esta enzima, siendo
(1998), siendo este de 0.51 g g-1, en evidencia de existencia de las enzimas
fermentaciones sumergidas operadas amilolticas, confirmando a su vez la alta
como fed-batch. De esto se puede concluir capacidad de los hongos del gnero
que el hongo Aspergillus sp fue capaz de
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Aspergillus para la produccin de amilasas sorgo, y en la productividad de borregos.

(Buenda et al, 2003). Agrociencia. 37(4): 317-322.
3. Gutierrez-Correa, M. y Villena, G.K.
An resulta difcil trabajar con aspectos 2003. Surface adhesion fermentation: a
relacionados a la fisiologa y biologa new fermentation category. Rev. Per. Biol.,
molecular de los cultivos microbianos en p. 113-124, vol. 10, No. 2.
FSS, debido a ciertas dificultades que se 4. Holker U., Hofer, y J. Lenz. 2004.
presentan tales como la posibilidad de Biotechnological advantages of laboratory-
realizar una cuantificacin de la biomasa scale solid-state fermentation with fungi.
formada por la complejidad involucrada en Applied Microbiology and Biotechnology
dicho proceso. Ocurre lo mismo con otros 64(2): 175-186.
factores que nos permitirn entender el 5. Jin B., Van Leeuwen HJ, Patel B y Yu Q.
comportamiento individual en el sustrato 1998. Utilization of starch processing
slido, a esto es o que todava se hace wastewater for production of microbial
referencia como lo oculto de la biomass protein and fungal -amylase by
biotecnologa de la fermentacin en Aspergillus oryzae. Bioresource
sustrato slido (Hlker, U. et al, 2004). Technology. 66(3): 201-206.
Para finalizar con esta discusin, cabe 6. Lowry, O. H.; Rosebrough, N.; Farr, A.
mencionar que el xito de un proceso and Randall, R. (1951) Protein
industrial implica el minimizar los costos measurement with the folin phenol reagent.
desde el mismo desarrollo de la J. biol. Chem 193, 265-275.
fermentacin enfocados hacia la variable 7. Miller, G. (1959). Use of Dinitrosalicylic
que determina el costo de produccin, por Acid Reagent for Determination of
lo que el uso de esta tecnologa FSS Reducing Sugar. Analytical Chemistry,
tendra que ser evaluado considerando la 31(3), pp.426-428.
dificultad de su empleo a escala industrial 8. Pandley A., Nigam P., Soccol C.,Soccol
debido a las limitaciones en el control de V., Singh D., Mohan R. 2000. Advances in
las condiciones microbial amylases. Biotechnol. Appl.
Biochem. (31), 135 152.
Bibliografa: 9. Sohail, M.; Ahmad, A.; Shahzad, S. y
1. Barnett, H. y Hunter, B. (1998) Khan, S. 2005. A Survey Of Amylolytic
Illustrated genera of imperfect fungi, 4th Bacteria And Fungi From Native
edition, APS Press, St Paul, MN. Environmental Samples. Pakistani Journal
2. Buenda, G.; Mendoza, G.; Brcena, of Botany 37(1):155-161. Spohr, A.;
R.; Ortega, M.; Sols, J. y Lara, A. 2003. Carlsen, M.; Nielsen, J. y Villadsen John.
Efecto de la glucoamilasa de Aspergillus 1998. tx-Amylase Production in
niger en la digestibilidad in vitro de maz y Recombinant Aspergillus oryzae during
Laboratorio de Microbiologa Industrial 2017 - I

Fed-Batch and Continuous Cultivations. industry - A review. Brazilian Journal of

Journal of Fermentation And Microbiology 41(4) 850-861.
Bioengineering 86(1): 49-56. 11. Vihinen, M. y Mntsl, P. 1989.
10. Souza, P. y Magalhaes, P. 2010. Microbial amylolytic enzymes. Critical
Application of microbial -amylase in Reviews In Biochemistry and Molecular
Biology 24(4):329-418.