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El proceso de fluorescencia tarda slo unas .Un material fosforescente puede durar
milsimas de segundo emitiendo luz. emitiendo luz durante varios minutos.
PREPARACIN DE MUESTRAS:
Las protenas se presentan comnmente como estructura secundaria, la cual las formas
ms comunes de ella son la doble hlice y la hoja plegada. Otro elemento importante de
estructura secundaria es el bucle (-turn), ya que le permite a la cadena cambiar de
direccin:
La estructura terciaria es como todo se acomoda (o no) en solucin, o como los distintos
elementos de estructura secundaria se organizan espacialmente entre ellos. Lo primero
que tenemos que saber es donde aparecen los picos de los 1Hs de los aminocidos en el
espectro:
Como dijimos antes, no hay conexin entre los distintos AAs: No podemos determinar
cul es cual. Para poder determinar la estructura de una protena por RMN necesitamos
saber la estructura primaria de la protena.
5. ANLISIS Y SECUENCIACIN DE PPTIDOS MEDIANTE
ESPECTROMETRA DE MASAS
Escoger las fracciones de HPLC que se quieran analizar [al contrario que para la
microsecuenciacin automtica, en este caso conviene escoger fracciones que sugieran la
presencia de especies mltiples, con objeto de obtener ms informacin de una misma
muestra]. Secar totalmente las fracciones elegidas en la centrfuga de vaco.
Resuspender la fraccin que se vaya a analizar en 5 ul de medio MHF (metanol/agua
50:50 (v/v) con 0.1% de cido frmico). Agitar fuertemente.
Coger lentamente 1 ul de la fraccin utilizando una P10 con una punta tipo gel loader
y a continuacin coger un poco de aire ajustando el volumen de la pipeta a 3-4 ul.
Introducir la punta en una de las sondas de vidrio de nanoelectrospray recubiertas de oro
y verter el contenido de la punta lo ms cerca posible del extremo recubierto de la sonda.
Centrifugar con un pulso en la micrfuga para que el lquido se site en el extremo de la
sonda.
Colocar la punta en el soporte porta sondas. Colocar el porta sondas en el soporte
posicionador x-y-z y conectar a la toma externa de presurizacin a una presin alrededor
de 1000 hPa (1 bar 15 psi). Acercar muy lentamente la punta de la sonda al capilar, sin
centrar en el orificio, y romper la punta. En cuanto empiece a salir lquido, situar el
extremo de la punta cerca del orificio del capilar, y conectar el voltaje del espectrmetro
de masas.
Identificar el in ms abundante y determinar su carga y su peso molecular monoisotpico
realizando un Zoomscan. Escoger un in de carga +2 +1, si es posible. Fragmentar el
in seleccionado aumentando gradualmente la energa de colisin hasta que la intensidad
del in original disminuya a un 30% aproximadamente.