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Evaluation in vitro de la sensibilit

bactrienne au antibiotique

PLAN

I-Introduction

II-Bactriostase
1 Dfinition
2-Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
3-Dtermination de la CMI
III-Notion de Sensibilit/Rsistance
1-Dfinition de la rsistance
2-Dtermination des catgories S/I/R
3-Etablissement des valeurs critiques dlimitant les catgories cliniques
4-Relation avec la CMI
IV-Notion de spectre
V-Mthodes dtudes in vitro
A-Antibiogramme
1-Principe
2-Techniques classiques
3-Standardisation 4-
Rsultats
5-Autres techniques
6-Limites de lantibiogramme
B-Autres mthodes
1-Recherche des bta-lactamases
2-Recherche de la mticillino-rsistance chez les staphylocoques
3-Recherche des bta-lactamases spectre tendu (BLSE)
4-Apport de la biologie molculaire

VI-Cas particulier de lantibiogramme


automatis
VII-Epreuves de synergie
VIII-Conclusion

I-Introduction:
Il faut garder lesprit quen pratique, on tudie leffet des antibiotiques in
vitro le plus souvent et dans des conditions normalises de culture. Ainsi, il faut
dterminer des corrlations afin de prsumer de lefficacit in vivo de
lantibiotique et donc de la russite (ou de lchec) du traitement sur la base de
donnes biologiques in vitro.

II-Bactriostase:

1-Dfinition:
La bactriostase correspond un ralentissement de la croissance dune
population bactrienne, pouvant aller jusqu' l'arrt de la croissance. Ceci ne
vaut que si la bactrie tait en phase de croissance avant le contact. Dans le cas
contraire une absence de dveloppement peut aussi correspondre une
augmentation trs prononce du temps de latence.
Elle peut tre tudie en milieu liquide par exemple par un suivi
photomtrique de la croissance des microorganismes en prsence de
concentrations varies d'antibiotiques.
2-Concentration Minimale Inhibitrice = CMI:
Le paramtre le plus souvent utilis pour valuer leffet dun antibiotique
est la CMI. Elle correspond la concentration minimale dantibiotique qui
inhibe la croissance visible du germe en 24H. La CMI explore donc leffet
bactriostatique seulement, (notons que son emploi nest pas justifi
chez un malade immunodprim).
On note de bonnes corrlations biologico-cliniques de l'emploi de la
CMI, qui est un bon prdicateur de l'efficacit de la thrapeutique antibiotique :
Quand elle excde une certaine valeur l'chec thrapeutique est habituel : quand
elle est infrieure une autre valeur le succs est pratiquement assur. Entre les
deux valeurs prcdentes, la prdiction est impossible
3-Dtermination de la CMI:
La CMI n'est pas, pour une bactrie donne, une constante biologique.
Elle est dfinie comme tant la plus faible concentration dune gamme de
dilutions dantibiotique de demi en demi qui entrane linhibition de toute
croissance bactrienne visible.
La mthode par dilution successive en milieu solide est la mthode de
rfrence pour dterminer la sensibilit bactrienne aux antibiotiques. Cette
dtermination exige une standardisation rigoureuse du protocole exprimental
(influence de l'Inoculum, de lincubation, de la technique densemencement,
des antibiotiques tester, de la lecture, du milieu de culture et des contrles de
qualit), toute modification des conditions exprimentales rend linterprtation
difficile.
Dautres mthodes sont applicables : dilutions successives en
milieu liquide (croissance bactrienne apprcie par lapparition dun
trouble) ; E-Test (bandelettes imprgnes dun gradient dantibiotique).

III-Notion de Sensibilit / Rsistance:

1-Dfinition de la rsistance:
La rsistance des bactries aux antibiotiques est soit naturelle,
soit acquise. La rsistance naturelle dune espce ou dun
genre est :
- Une caractristique propre, concernant lensemble des souches de
lespce ou du genre
- Porte par un chromosome donc toujours transmissible la
descendance : transmission verticale
- Un caractre permettant de dfinir le phnotype sauvage ou sensible de
lespce La rsistance acquise, pour sa part :
- Ne concerne quune proportion plus ou moins importante, variable dans
le temps
- Rsulte dune modification gntique par mutation ou par acquisition de
plasmides ou transposons, (rsistance extra chromosomique)
transmissible horizontalement, parfois entre espces diffrentes
- Dfinit des phnotypes rsistants .

Les rsistances croises sexpriment, elles, au sein dune mme classe


dantibiotiques et sont dues au mme mcanisme de rsistance. *

2-Dtermination des catgories S/I/R:

On a dtermin les valeurs critiques qui dlimitent les catgories


cliniques et de proposer un guide pour la dtermination de la sensibilit des
bactries aux antibiotiques. Les valeurs critiques dfinies pour les
concentrations et les diamtres des zones d'inhibition, ainsi que les
recommandations spcifiques certaines espces ou certains groupes
d'antibiotiques
Trois catgories cliniques ont t retenues pour l'interprtation des tests
de sensibilit in vitro : Sensible (S), Rsistant (R) et Intermdiaire (I).
Les souches catgorises S : sont celles pour lesquelles la probabilit
de succs thrapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie
systmique avec la posologie recommande
Les souches catgorises R: sont celles pour lesquelles il existe une
forte probabilit d'chec thrapeutique quels que soient le type de
traitement et la dose d'antibiotique utilise.
Les souches catgorises I : sont celles pour lesquelles le succs
thrapeutique est imprvisible. Ces souches forment un ensemble htrogne
pour lequel les rsultats obtenus in vitro ne sont pas prdictifs d'un succs
thrapeutique.
3-Etablissement des valeurs critiques dlimitant les catgories
cliniques :
La mthode par diffusion utilise la relation entre CMI et diamtre
dinhibition autour dune source dantibiotique, la lecture est donc relativement
directe. Pour une bactrie et un antibiotique donns, le diamtre dinhibition
mesur est compar aux diamtres critiques :
- < au diamtre critique infrieur d, la souche est classe R.
- >au diamtre critique suprieur D, la souche est classe S.
Les diamtres critiques d et D correspondent respectivement aux concentrations
critiques hautes C et basses c.
Les valeurs des concentrations et des diamtres critiques sont dfinies pour
chaque antibiotique.
4-Relation avec la CMI :
Aux regards des concentrations et des diamtres critiques sont considres
comme :

Sensibles (S) : les souches pour lesquelles la CMI de l'antibiotique


test est la concentration critique basse (c), ce qui quivaut un
diamtre au diamtre critique D

Rsistantes (R) : les souches vis--vis desquelles la CMI de


l'antibiotique test est > concentration critique haute C,
correspondant un diamtre < diamtre critique d
De sensibilit intermdiaire (I) : les souches vis--vis desquelles la
CMI de l'antibiotique test et le diamtre correspondant sont compris
entre les deux concentrations critiques et les deux diamtres critiques.
Catgories CMI (mg/L) Diamtre (mm)
Sensible CMI c Diamtre D
Rsistant CMI > C Diamtre < d
Intermdiaire c < CMI C d Diamtre < D

IV-Notion de spectre :
chaque antibiotique est associe une liste d'espces bactriennes qui
constitue le "spectre d'activit" de la molcule. Le spectre naturel, tabli dans
les premires tudes avant tout emploi en thrapeutique, reste stable par
dfinition puisqu'il ne prend pas en compte la proportion de bactries ayant
acquis une rsistance l'antibiotique aprs son utilisation. Cette proportion
augmente au cours du temps parce que l'emploi de l'antibiotique exerce la
pression de slection ncessaire l'mergence de mutants ou de souches
porteuses de facteurs extra chromosomiques de rsistance. Cette notion doit
tre connue du clinicien car elle explique des situations d'apparence
paradoxale : par exemple, le spectre naturel de la pnicilline G comprend
Staphylococcus aureus alors quactuellement 90% des souches sont rsistantes
par production de pnicillinase.

V-Mthodes dtude in vitro:

A-Antibiogramme:
1-Principe:
L'antibiogramme a pour but de dterminer la Concentration
Minimale Inhibitrice (CMI) d'une souche bactrienne vis--vis de divers
antibiotiques.
Le principe consiste placer la culture de bactries en prsence dun ou des
antibiotiques et observer les consquences sur le dveloppement et la survie de
celle-ci. On peut par exemple placer plusieurs pastilles imbibes d'antibiotiques sur
une souche bactrienne dpose dans une bote de Petri. Il existe trois types
d'interprtation selon le diamtre du cercle qui entoure le disque d'antibiotique :
souche ou bactrie sensible, intermdiaire ou rsistante.

2-Techniques classiques :

Mthodes de dilution
Les mthodes de dilution sont effectues en milieu liquide ou en milieu
solide. Elles consistent mettre un inoculum bactrien standardis au contact
de concentrations croissantes d'antibiotiques selon une progression gomtrique
de raison 2.
En milieu liquide (figure 1), l'inoculum bactrien est distribu dans une
srie de tubes (mthode de macrodilution) ou de cupules (mthode de
microdilution) contenant l'antibiotique. Aprs incubation, la CMI est indique
par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d'antibiotique
o aucune croissance n'est visible.

Figure 1 : Dtermination de la CMI par dilution en milieu


liquide.

En milieu solide (figure 1bis), l'antibiotique est incorpor dans un milieu


glos coul en botes de Petri. La surface de la glose est ensemence avec un
inoculum des souches tudier. Aprs incubation, la CMI de chaque souche est
dtermine par l'inhibition de la croissance sur le milieu contenant la
plus faible concentration d'antibiotique. La mthode de dilution en milieu
glos, ralise avec une gamme de concentrations en progression gomtrique
de raison 2 est la mthode de rfrence.
Figure 1bis : Dtermination de la CMI par dilution en milieu glos.

La CMI de la souche 3 vis--vis de l'antibiotique incorpor la glose est de


1g/mL. La CMI de la souche 2 est de 2 g/mL. Les dterminations des CMI
des souches 1 et 4 ncessiteraient de tester des concentrations croissantes plus
fortes en antibiotique.

Mthodes de diffusion : antibiogramme standard


Les mthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus
utilises par les laboratoires de diagnostic.
Des disques de papier buvard, imprgns des antibiotiques tester, sont
dposs la surface d'un milieu glos, pralablement ensemenc avec une
culture pure de la souche tudier. Ds l'application des disques, les
antibiotiques diffusent de manire uniforme si bien que leurs concentrations
sont inversement proportionnelles la distance du disque. Aprs incubation, les
disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant une
absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardise, les
diamtres des zones d'inhibition dpendent uniquement de la sensibilit du
germe.
3-Standardisation:
La fiabilit des rsultats d'un antibiogramme est influence par de
nombreux paramtres qui doivent tre rigoureusement contrls. La
standardisation est rgie par des documents manant de l'O.M.S. et des divers
comits nationaux. Selon les pays, il peut exister des variations techniques et il
est important de respecter une technique identique celle utilise pour
l'tablissement des courbes de concordance.
4-Rsultats:
Lecture interprtative de l'antibiogramme
La lecture interprtative de l'antibiogramme est fonde sur la
connaissance des phnotypes de rsistance. Elle a pour principal but de
transformer un rsultat catgoris "sensible" en un rsultat "intermdiaire" ou
"rsistant" en raison d'un risque d'chec thrapeutique. La lecture interprtative
ncessite une identification correcte de la souche et une mthode
d'antibiogramme parfaitement standardise. La mise en vidence de phnoypes
de rsistance hautement improbables compte tenu de l'identification de la
souche doit conduire vrifier l'identification bactrienne, contrler la
puret de l'inoculum et contrler la technique de l'antibiogramme.
Actuellement, il existe des systmes informatiss daide la validation
des rsultats : les systmes experts qui permettent la recherche de rsultats
anormaux. Ce contrle de validation vise :
- Vrifier la cohrence germe/antibiogramme
- Dtecter les phnotypes de rsistance impossibles
- Dtecter labsence dune rsistance associe
- A reconnatre des phnotypes anormaux pouvant correspondre de
nouvelles modalits de rsistance.
Rq : Gnralisation des rsultats des antibiotiques non tests
Le choix des antibiotiques tests repose avant tout sur l'identification du germe
et sur la connaissance de sa rsistance naturelle. Ce choix dpend galement du
site de l'infection. Parmi les antibiotiques susceptibles d'tre utiliss en
thrapeutique, toutes les molcules ne sont pas prises en compte. En effet, la
connaissance des familles d'antibiotiques et des mcanismes de rsistance
croise permet de ne faire figurer dans l'antibiogramme qu'un nombre restreint
de molcules reprsentatives.

5-Autres techniques:

Technique en milieu glos : le E-test


La dtermination prcise de la CMI par la mthode de rfrence est
difficilement utilisable en pratique quotidienne. La commercialisation d'une
technique rapide et simple, le E-test (AB Biodisk) permet un laboratoire une
estimation indirecte de la CMI (figure 4).
Figure 4 : le E-test

B-Autres mthodes:
1-Recherche des bta-lactamases:
Les enzymes inactivant les bta-lactamines peuvent tre dtectes par une
mthode chromognique :
Le principe repose sur l'utilisation d'une cphalosporine changeant de
coloration aprs hydrolyse. La molcule la plus utilise est la nitrocfine
qui, aprs action d'une btalactamase, vire du jaune au rouge. Des disques de
papier imprgns de nitrocfine sont commercialiss : Test Cfinase .

2-Recherche de la mticilino-rsistance chez les staphylocoques:


Dans les conditions standard de lantibiogramme, seule une fraction de la
population exprime la rsistance aux pnicillines M. seules des conditions plus
drastiques (incubation 30C ; milieu MH hyper sal) permettent une meilleure
expression de la rsistance. On dpose un disque doxacilline la surface du
milieu. La lecture se fait 24 puis 48H. Une rsistance htrogne se manifeste
par la prsence de colonies de taille variable autour du disque. La forte
prsence de SARM en milieu hospitalier rend leur recherche indispensable.

3-Recherche des bta-lactamases spectre tendu (BLSE):


La technique par diffusion est galement utilise dans le cadre de la
recherche de Btalactamase Spectre Etendu (BLSE).
Pour cela on dispose sur la surface d'une glose des disques de
ceftazidime (et/ou de cefotaxime, et/ou de cfpime, et/ou d'aztronam) et
d'amoxicilline-acide clavulanique (pour les entrobactries) ou de ticarcilline-
acide clavulanique(pour le Pseudomonas aeruginosa)
Les BLSE sont des Btalactamases et sont donc inhibes par l'acide
clavulanique. On observe alors une synergie d'action entre les deux
antibiotiques, appele "bouchon de champagne
Cette technique permet de diffrencier une bactrie hyper productrice de
cphalosporinase d'une bactrie produisant une BLSE dans la famille des
Entrobactries par exemple.

VI-Cas particulier de lantibiogramme automatis:


Lautomatisation de lantibiogramme sest dveloppe pour pallier aux
inconvnients de cette technique manuelle, dont la ralisation est lente.
Actuellement, ce terme est utilis pour dsigner des appareils effectuant la
lecture et linterprtation de tests faits manuellement. Ces appareils
fonctionnent selon 2 grands principes :
- Ils miment les tests conventionnels dtude de la sensibilit des
bactries aux antibiotiques (technique la plus courante : dilution en
milieu liquide
- Ou bien ils comparent la croissance dun tmoin celle observe en
prsence dune ou plusieurs concentrations dantibiotiques.
Les mthodes dtude de la croissance des bactries font appel des
mthodes optiques directes :
- Analyse de limage recueillie par une camra
- Turbidimtrie (DO dune suspension proportionnelle la masse des
particules en suspension) ;
- Nphlmtrie (mesure de la lumire diffracte). En rgle gnrale,
la nphlmtrie a une sensibilit suprieure mais un domaine de
linarit plus troit que la turbidimtrie.

VII-preuves de synergie:
L'utilisation d'une association d'antibiotiques est justifie dans
quatre cas : l a r g i r le spectre d'activit dans les cas
d'infections germes multiples ;
T r a i t e r en urgence une infection grave non diagnostique ;
Prvenir la slection de mutants rsistants lors des traitements de
longue dure ;
O b t e n t i o n d'un effet synergique.
L'interaction de deux antibiotiques peut produire quatre effets principaux
:
Indiffrence : l'activit d'un antibiotique n'a aucune influence sur
l'activit de l'autre
Addition : l'effet de l'association est gal la somme des effets
produits par chacun des antibiotiques pris sparment
Synergie : l'effet de l'association est suprieur la somme des
effets produits par chacun des antibiotiques pris sparment : Ex
bta-lactamine (ou la vancomycine) facilitent la pntration des
aminosides
Antagonisme : l'effet de l'association est infrieur la somme des
effets produits par chacun des antibiotiques pris sparment : Ex un
bactriostatique (ttracyclines, les macrolides ou les phnicols) diminue
l'activit bactricide des bta-lactamines
VIII-Conclusion:
Lantibiogramme a pour but de prdire la sensibilit dun germe un ou
plusieurs antibiotiques dans le but dadapter au mieux lantibiothrapie dans un
contexte infectieux. Cette tude a lieu in vitro et il convient de considrer
dautres caractristiques des antibiotiques, pharmacocintiques par exemple,
afin de davoir le maximum de chances de gurison pour le malade.
Les techniques de ralisation des antibiogrammes nont cess dvoluer
depuis une vingtaine dannes avec les progrs de lautomatisation. Ceci a
permis de diminuer les temps dattente dans une optique doptimisation de la
qualit des soins, mais galement de standardiser au mieux les antibiogrammes.
Toutefois, les anciennes techniques nont pas disparu, car les techniques
automatises ne sont pas parfaites : les bactries anarobies et croissance
lente poussent mal dans le cadre de techniques en milieux liquides. Ceci tend
prouver quun laboratoire de bactriologie devrait possder deux techniques
pour raliser les antibiogrammes : une automatique et une manuelle, afin
dobtenir une complmentarit maximale entre ces techniques.