Evaluation 1 Questions de cours + Correction

Q1 : Par quelle technique peut-on amplifier un ARNm ? Dcrire cette technique.

Puisque il sagit dun acide nuclique de type ARNm, on doit strictement passer par la forme
dADNc qui est double brin, lenzyme qui va mener a est la Reverse Transcriptase (RT),
puis on aborde la raction de polymrisation avec ses 3 tapes classique (PCR). Donc cest la
RT-PCR

Q2 : Dcrire les tapes de SOUTHERN Blot. A quoi sert le marquage par fluorochrome dans
cette technique ? Quel risque quon peut avoir si on ralise une exprience de SOUTHERN
Blot en utilisant des sondes fluorescentes + BET (bromure d'thidium) comme marqueur ?
Les tapes ont t dj expliqu (Extraction dADN, Digestion par les ER, Migration sur un gel
dnaturant, transfert sur une membrane (nylon, ou nitrocellulose), hybridation avec des sondes
spcifique, lavage des sondes non spcifique, et rvlation sous UV). Le marquage sert rvler
les fragments dADN dans le gel. Le risque quon peut avoir cest que : si on applique un
marquage de notre ADN avec des sondes on cible une rgion donne (spcificit), Dans une
exprience de SOUTHERN blot, seul les rgions spcifiques avec notre sonde qui vont tre
observ dans lautoradiogramme (malgr quil existe des fragments qui ont migr dans certain
endroit dans le gel, mais il vont pas tre rvl puisquil sont pas spcifique vis--vis notre
sonde) mais si on ralise une exprience avec des sondes spcifique + BET (agent intercalant
entre les bases), toutes les rsultats vont tre errons, car le BET ne choisis pas des rgions
spcifique dans le gnome, il se lie nimporte quelle rgion, pour cela tous les fragments
prsent dans le gel vont tre observ sans exception (non-spcifique).
Q3 : Qui ce quune bactrie comptente ? Comment peut-on savoir la bactrie sil est
comptente ou non ? Si oui, quel procdure quon va suivre afin de slectionner les bactries
comptentes ayant le plasmide recombinant ?
Bactrie capable daccepter un ADN tranger et de lintgr dans leur systme.
Par une slection avec un gne de rsistance un antibiotique.
Gnralement par un deuxime gne de slection qui est le gne Lac Z.

Q4 : Combien de fragments quon peut obtenir si on digre un segment dADN double brin
linaire (10 pb) pendant 4 heures avec :
Enzyme de restriction (avec 1 seul site dans ce fragment) ? deux fragments
ADN ase ? Plusieurs framents
Nuclase S1 ? un seul fragment

Q5 : Quelle est la diffrence entre un gne, une unit transcriptionnelle et un cistron ?

Un gne comporte les squences codantes (Exons) et les squences non codantes (Introns,
UTR5 et UTR3, Squences de rgulation en amont et en aval de la squence codante)
Une unit transcriptionnelle comporte tous ce qui est transcrit (UTR5 + Exons/Introns +
UTR3)

Un cistron est le cadre ouvert de lecture dans un ARNm qui va nous donner une protine,
autrement dit, le cistron cest la squence des bases qui dbute par un AUG dinitiation et qui
va coder pour un produit, les ARNm des eucaryotes ne code que pour un seul produit (protine
ou chaine polypeptidique) pour cela ils sont dites Monocistroniques, par contre les ARNm des
procaryotes ils sont Polycistroniques car un seul ARNm donne plusieurs protines..
Q6 : qui ce que les isoschizomres ?
2 Enzymes de restriction qui reconnaissent le mme site de restriction mais ils gnrent des
coupures diffrentes
Q7 : Vous disposez de la squence nuclotidique ci-dessous (cDNA), et vous dsirez cloner la
squence en gras dans un vecteur plasmidique, sachant que les squences de rgulations
(Promoteur..) sont pralablement prsentes dans le plasmide, Comment pouvez-vous cloner ce
fragment dans le vecteur, sachant que leurs extrmits sont dpourvu de sites denzymes de
restriction ?
5 ATCGTCGTAAATCGCTAGCTAGCAGACTTCCGAAACTACGCAT 3
3 TAGCAGCATTTAGCGATCGATCGTCTGAAGGCTTTGATGCGTA 5

Dabord jai complt le brin anti sens de cette ADNc. Le problme qui se pose cest
que je vais cloner la rgion en gras dans un plasmide, et pour la clon, jai besoin de la digr
au niveau des deux extrmits par deux enzymes diffrents. Mais dj les sites de ces enzymes
ne sont pas prsents dans le fragment, donc la seul technique qui va me permet de cr ces sites
au niveau des extrmits est la PCR, comment ? Je vais amplifier cette rgion en gras avec deux
amorces de sorte que ces deux amorces sont dj prparer au laboratoire, ces deux amorces sont
spcifique aux rgions 3 de brin sens et anti-sens (principe de la PCR), mais un petit segment
de ces amorces est non spcifique car il contient les sites denzymes de restriction, je souligne
sur petit segment car puisque il est petit il ne va pas empcher lhybridation de la sonde. Voir
figure ci-dessous :

Les XXX reprsentent les segments non-spcifiques qui contiennent les sites denzymes de
restrictions, aprs plusieurs cycles de PCR (3me cycle), ces segments vont trouvez leur
complmentaire, donc les ADNc produit par le PCR se caractrisent par la prsence de deux
sites denzyme de restriction. On peut maintenant aborder les tapes classiques de clonage.
Cette technique est nomme : la mutagense dirige