COLUMNA DE CROMATOGRAFIA

I. INTRODUCCION

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas diferentes

presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de una
fase mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una fase
estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los
distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su separacin. La
cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel
o de tamiz molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas en la
separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza
en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este
fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex),
agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles
(fase estacionaria) se hallan constituidos por grnulos (partculas) de un material
esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamao de dimetro determinado.

Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de

una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el
dimetro de los poros de las partculas, slo podrn moverse en su camino, a travs
de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto,
no se vern retrasadas en su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de
penetrar en las partculas se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor
medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas fluyen en este
tipo de cromatografa por orden decreciente de tamao molecular.

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partculas de menor masa
molecular. De ah que las partculas de mayor peso molecular salgan primero.

II. OBJETIVOS

Realizar una columna de cromatografa con sephadex.

III. MATERIALES

Soporte universal
Colorante (tinta de impresora)
Sephadex ( G200)
2 jeringas de 20 ml
Membrana de serigrafa N120
Corcho de mbolo
Equipo de venoclisis
Tubo de ensayo
Vaso de precipitado
Agua destilada
Gotero
Ribloflamina (vitamina)

IV. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS

Procedemos a montar el soporte universal
Desmontamos la primera jeringa y
colocamos el papel de serigrafa como filtro
y luego el corcho del embolo con un
pequeo agujero en el medio.
Presionamos hasta que llegue a la base de
la jeringa.
Extraemos el corcho restante de la segunda
jeringa y realizamos un pequeo agujero,
dejando entrada por el mismo a la aguja de
la jeringa.
Colocamos la jeringa preparada en el
soporte universal.
 El agua destilada la colocamos en la parte
superior del soporte universal.
Procedemos a instalar el equipo de
venoclisis (desde el empaque del agua
destilada hacia el corcho superior de la
jeringa) de modo que no gotee agua
destilada en la jeringa.
Vertimos el sephadex en el interior de la
jeringa hasta alcanzar 2/3 de su
capacidad.
Con ayuda del gotero procedemos a verter
la riboflamina (disuelta en 1 ml de agua
destilada).
Luego colocamos el corcho superior y
unimos la aguja instalada en el mismo al
equipo de venoclisis.

Finalmente abrimos la llave del equipo de venoclisis y dejamos que filtre la

vitamina por el sephadex.
Recolectamos en el vaso de precipitado y luego vertemos en los tubos de
ensayo.
Llevamos los tubos de ensayo a la centrifuga y luego medimos el nivel de
absorbancia en el espectrofotmetro a 450 nm.

V. CONCLUSIONES

El tiempo en que demore el filtrado de la solucin depende del peso molecular

del mismo (mientras ms peso molecular tenga, ms lento ser el filtrado).

No debemos dejar que se seque el sephadex, esto ocasionara que las burbujas
de gel se atrofien.

Despus de realizar podemos guardar el gel de sephadex, tapando las dos

abertura de la jeringa, previamente llenada de agua destilada.

VI. BIBLIOGRAFIA

ABBOTT, David y ANDREWS, R. S. Introduccin a la Cromatografa. 3ra.

Edicin. Coleccin Exedra. Editorial Alhambra. Espaa. 1973