UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMÁTICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BACHARELADO EM QUÍMICA

DETERMINAÇÃO DE PARABENOS EM AMOSTRA DE

ÓLEO ESSENCIAL POR ELETROFORESE CAPILAR.

Adoniran Jose Kohler

Florianópolis, Santa Catarina, Brasil

Setembro/2016
 1 INTRODUÇÃO

1.1 ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração de

espécies carregas em um campo elétrico. Como o nome sugere utiliza um
capilar preenchido de tampão em cada extremidade um eletrodo, com o
auxílio de uma fonte de alta-tensão fornece uma diferença de potencial alta,
esse campo gerado em toda a extensão do tampão é o agente separador
das espécies químicas.
A execução da técnica em capilares permite a aplicação de campos
elétricos muito elevados (100 a 1000 V/cm) isso por que o capilar de
comprimento longo e área da seção transversal pequena fazem com que a
resistência seja alta isso favorece a dissipação de energia (P=I 2/R) e
adicionalmente a grande área superficial do capilar e o volume pequeno
favorecem a dissipação de calor então a convecção por calor na técnica
não ocorre de maneira significativa.
Como se pode aplicar campos muito altos e a velocidade de
migração dos íons depende do campo aplicado a técnica é relativamente
rápida mais é também uma técnica de boa resolução pois apenas a difusão
longitudinal é considerada já a resistência à transferência de massa não
está presente e são fatores que contribuem para o alargamento das
bandas.
O número de pratos em eletroforese capilar é alto e geralmente está
no intervalo de 100000 á 200000 pratos.
Se olharmos para o tratamento percebemos que altos potenciais
aumentam o número de pratos e isso é desejável para se melhorar a
resolução.
N=
As separações ocorrem por que em solução temos espécies
carregas de tamanhos diferentes e cada uma delas tem uma velocidade de
migração (v) diferente a velocidade de migração é diretamente proporcional
ao campo aplicado (E) e a mobilidade eletroforética (μ e) que é diretamente
proporcional a carga do íon e inversamente ao tanho do íon. Podendo ser
expressa a velocidade de migração segundo a equação:
v = μe.E
 O campo elétrico é uma função do potencial aplicado e do
comprimento do capilar já a mobilidade eletroforética indica a rapidez com
que um íon pode se mover e está relacionada com fatores de atrito e da
carga dos íons.
A carga do íon (q) é fixa para íons inteiramente dissociados tais
como ácidos fortes, mas pode ser afetado por mudanças de pH no caso de
ácidos ou bases fracas. O raio do íon (r) pode ser afetado pela presença de
um
contra-íon ou pela presença de agentes complexantes. Da Equação 2
pode-se
observar que diferenças na mobilidade eletroforética são causadas por
diferenças
no raio e carga dos íons do analito 46 .

Os diferentes mecanismos de separação favorecem sua aplicação

em um vasto campo variando desde moléculas pequenas até moléculas de
milhares de Daltons 35,36,37 .
Uma das grandes versatilidades desta técnica é a possibilidade da
utilização de uma ampla gama de detectores, que são basicamente uma
adaptação daqueles utilizados nos equipamentos de cromatografia em meio
líquido para o formato capilar. Tais detectores podem ser de absorção no
UV-vis38, fluorescência 39, fluorescência induzida por laser 40,

espectrometria de massas 41, condutividade 42, amperometria 43,

radioatividade 44, índice de refração e Raman 45.
A escolha do detector depende quase que exclusivamente das
propriedades do soluto em questão e da faixa de con centração
contemplada. A Tabela 1 mostra os limites de detecção típicos encontrados

para diversos detectores 45.

1.1.1 Fluxo eletrosmótico.

Em pH acima de 3 grupos (SiOH) são ionizados formando uma dupla

camada elétrica no interior do capilar, cátions do tampão se direcionam
para a parede do capilar e outros se dirigem para o seio da solução sendo
solvatados, e quando o campo elétrico é aplicado são arrastados para o
pólo negativo carregando o solvente, esse fluxo é geralmente maior que a
velocidade de migração eletroforética dos íons individuais e é a bomba da
fase móvel.
O fluxo eletrosmótico inicia-se na parede do capilar desta forma
apresenta um perfil plano deferente daquele apresentado em cromatografia
líquida de alta eficiência que apresenta um perfil parabólico assim o fluxo
eletrosmótico não contribui para o alargamento das bandas.

Figura 1: Fluxo eletrosmótico.

O eletrograma é parecido com um cromatograma mais seus picos
geralmente são mais estreitos.
A velocidade do fluxo eletrosmótico é diretamente proporcional com o
campo aplicado e com a mobilidade eletrosmótica assim a velocidade de
migração de um íon pode ser representada pela equação:
v = (μe + μeo).E

1.1.2 Instrumentação

A instrumentação requerida para a eletroforese capilar é ilustrada na

Figura 2.

Figura 2: Esquema de um equipamento de eletroforese capilar.

 Os equipamentos de eletroforese capilar apresentam características
básicas como uma fonte de alta tensão, um módulo de detecção, o capilar
(normalmente de sílica fundida), os eletrodos (normalmente de platina) e
um computador para aquisição e tratamento de dados.
A separação das espécies em eletroforese capilar é efetuada em
tubos com dimensões de 15 a 100 m de diâmetro interno com 30 a 150 cm
de comprimento, suas extremidades são inseridas em res ervatórios
separados e estes são preenchidos com o eletrólito de corrida. Em cada um
destes reservatórios são posicionados eletrodos conectados a uma fonte de
alta tensão capaz de aplicar até 30 kV. O analito é injetado no capilar por
alguns instantes pela substituição de um dos reservatórios dos eletrólitos
(normalmente no ânodo) pelo reservatório do analito. A injeção pode ser
hidrodinâmica quando uma alíquota do analito é introduzida no capilar
através da aplicação de uma pressão determinada por um breve período de
tempo no recipiente do analito ocorrendo a transferência deste para o
capilar. A injeção do an alito no capilar também pode ser eletrocinética,
quando é aplicada uma diferença de potencial por alguns segundos no
reservatório onde encontra-se o analito. Após a injeção do analito,

o reservatório de eletrólito retorna a extremidade do capilar, uma diferença

de potencial é aplicada através do capilar e a separação é então iniciada. A
detecção óptica dos analitos separados pode ser alcançada diretamente
através da parede do capilar, normalmente próximo à extremidade oposta
(cátodo).
 2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Este trabalho tem como principal objetivo o desenvolvimento de
curvas de calibração e comparação de tempos de retenção para identificar e
quantificar compostos em uma amostra de óleo essencial pelo método de
eletroforese capilar.

2.2 Objetivos Específicos

 Caracterizar e quantificar parabenos metil, etil, propil e butil.
 Comparar os resultados com aqueles permitidos por órgão
nacionais (ANVISA) e internacionais.

 Conhecer a técnica de eletroforese bem como os limites de

quantização da técnica.

 Conhecer e poder comparar as vantagens e desvantagens do

método de separação.
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1 Reagentes e Amostra.

Foi utilizado solução estoque de TBS (100mmol/L) e MP, EP, PP e

BP e ácido cinâmico (padrão interno) de 1000 mg/L cada.
Preparar 5mL do eletrólito de corrida TBS 20 mmol/L pH= 9,0
Foi preparado cinco soluções com 20uL de TBS e 100uL de ácido
cinámico com concentração de parabenos de 10, 30, 50, 70, e 90 ppm,
mostrados na tabela abaixo:
Concentração de Volume de parabenos Volume padrão Volume de água
parabenos em ppm interno
10 100uL 100uL 800uL
30 300uL 100uL 600
50 500uL 100uL 400
70 700uL 100uL 200
90 900uL 100uL 0

Os analitos foram acompanhados em 297nm e como padrão interno

sera utilizado o ácido cinâmico (20mg/L)

3.2 Equipamento e instrumentação.

Equipamento de eletroforese capilar modelo HP 7100 da agilent
Technologies, equipado com detector de arranjo de diodos (DAD). Para as
análises será utilizado um capilar de Sílica fundida de 48,5cm e 50m de
diâmetro interno. Condiçoes de separação: Injeção hidrodinâmica para
soluções padrão com 50mBar por 3s de pressão pelo inlet (extremidade
mais distante do detector),voltagem aplicada de +30 kV. Lavagem entre
corridas de 1 minuto com eletrólito. Tempo total de análise inferior á 3
minutos.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Desenvolvimento das curvas de calibração.

As curvas de calibração foram realizadas com o auxílio do software
exel e foi plotado quatro gráficos da área dos picos pela concentração,
sendo que as áreas foram divididas pela área do padrão interno para
corrigir erros de injeção.
 Tabelas foram realizada no software com os dados obtidos dos dos
PROPIL
METIL
ETIL PARABENO
PARABENO
PARABENO
eletroferogramas. Abaixo tabelas dos dados das áreas dos padrões e áreas
4.5
46
divididas pela área do padrão interno:
4
3.5 PROPIL
ETIL
METIL
5
3.5
3
PARABENOS 34
2.5[] ppm BUTIL PROPIL ETIL METIL
PADRÃO
2.5
23 INTERNO
ÁRE
ÁRE
2
10 3,64 4,17 4,83 6,17
1.5 10,9
1.52
30 11,7 12,83 15,2 19,2
1 11,43
1
50 19,74 21,93 25,33 31,41
1 11,55
0.5
70 27,91 30,45 35,18 43,8 11,16
0
90 41,14 44,7 51,47 64,19 12,97
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
AMOSTRA 1:1 30,45 34,98 6,47
AMOSTRA 300µL EM CONCENTRAÇÃO
CONCENTRAÇÃO[PPM]
[PPM]
9,33 24,38
1000µL 12,39
Tabela 1: Áreas do padrão para a curva de calibração.

PARABENOS [] ppm
BUTIL PARABENO
BUTIL PROPIL ETIL METIL
3.5
10 BUTIL 0,3339449 0,3825688 0,4431192 0,5660550
3
5 1 7 5
2.5
30 1,0236220 1,1224846 1,3298337 1,6797900
2 5 9 7 3
50 1,7090909 1,8987013 2,1930735 2,7194805
ÁRE

1.5
1 9 2
70
1 2,5008960 2,7284946 3,1523297 3,9247311
6 2 5 8
0.5
90 3,1719352 3,4464148 3,9683885 4,9491133
0 4 9 4
AMOSTRA 0 10 20 30 40 50 60 70 80
4,7063369 90 100 5,4064915
CONCENTRAÇÃO [PPM] 4
AMOSTRA 300ULEM 0,7530266 1,9677159
1000UL 3
Tabela 1: Áreas do padrão divididas pelo padrão interno.

A partir de tabelas inseridas no excel foram realizados as confecções de

gráficos das curvas de calibração e a equação da reta como segue abaixo:

4.2. Caracterização das espécies presentes na amostra.

Para sabermos se temos todos ou quais os análitos de interesse
fazemos a comparação de um eletroferograma do padrão com o
eletroferograma da amostra.
 O fluxo eletrosmótico carrega todas as espécies para o polo negativo
as espécies positivas tendem a chegar primeiro pois a elas tem uma
velocidade de migração no mesmo sentido que o fluxo eletrosmótico.
Cargas negativas são arrastadas para o pólo negativo espécies de
maior mobilidade eletrosmótica ou seja com uma razão carga tamanho
elevada saem por último no eletroferograma

Se analisarmos os parabenos percebemos que aqueles que tem

maior mobilidade são os menores com o grupamento metil etil, propil e butil
então é esperado que o uv-vis detecte primeiro o butil seguindo pelo propil,
etil e metil.
Os parabenos são compostos que apresentam um hidrogênio ácido
do grupo fenol que possui um pka de aproximadamente 10 e uma solução
básica como a utilizada desprotona esse grupo deixando a molécula
carregada como o desejado.
4.3. Quantificação da amostra.
 Como foi identificado aos compostos propil e metil parabeno vamos
utilizar a equação da reta calculada anteriormente.

Equação da reta do propil parabeno Equação da reta do metil parabeno

y = 0,0387x -0,0177 y = 0,0444x – 0,0009
y = 0,75302663 y = 1,9677159
x = 19.91 mg/L x = 44,33mg/L

Calculo da massa de propil parabeno na amostra:

C V =C V
300 µ L. C=1000 µ L .19,19

1000 µ L . 19,19 66,36 m g

C= =
300 µ L L
m 66,36 m g m
C= =
V 1000 m L 10 m L
m=0,6636 m g
Portanto temos 0,6636mg de propil parabeno em 558,3mg de óleo
essencial assim a concentração em massa é 1180ppb ou 0,1188%
Calculo da massa de metil parabeno na amostra:
C V =C V
300 µ L. C=1000 µ L . 44,33

1000 µ L . 147,46 m g
C= =
300 µ L L
m 147,46 m g m
C= =
V 1000 m L 10 m L
m=1,4746 m g
Portanto temos 1,4746mg de metil parabeno em 558,3mg de óleo
essencial assim a concentração em massa é 2640ppb ou 0,2640%
A União Européia e a Agência de Vigilância Sanitária Brasileira
(ANVISA 2001), estipula os limites de parabenos 0,8% e 0,4% (8000 e
4000 ppm) respectivamente, em produtos cosméticos. Em fármacos
normalmente não excedem 1%. Os resultados revelam que a amostra não
excede os valores estipulados
4.4. Discussão.

5 CONCLUSÕES
 Um método rápido, com uma boa exatidão e precisão como o
utilizado e ainda podendo ser aplicado para a análise simultânea de
compostos de interesse tem uma boa aplicabilidade.
A análise quantitativa e qualitativa que o método proporciona para
parabenos é outro ponto positivo

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS