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Aidè Dìaz Idrogo

Ketty Ugaz Olano


Leydi Rivera Rìos
Plásticos de origen natural

son polímeros que


provienen de fuentes
naturales y renovables. La
mayoría presentan mejor
biocompatibilidad, y
todos son biodegradables Productos compostables
por microorganismos
como bacterias, hongos,
algas.

Los plásticos
biodegradables
LOS SINTETIZADOS QUÍMICAMENTE: como el ácido
poli láctico y la poli-e-caprolactona

LOS QUE CONTIENEN AMIDAS ADICIONADAS A SU


ESTRUCTURA: el amido-polietileno

LOS POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAS):son de origen


microbiano, totalmente biodegradables, presentan
características semejantes a los plásticos derivados del
petróleo y pueden ser producidos a partir de recursos
renovables
poliésteres isotácticos de origen bacteriano
obtenidos mediante fermentación aerobia en
un medio de cultivo rico en hidratos de carbono
Poseen rigidez y Son termoplásticos y
conductibilidad, son poseen alto grado
de polimerización sintetizados tanto
insolubles en agua y por eubacterias
no tóxicos como arqueas
como fuente de
carbono y energía

Las dos clases de La masa


PHAs más comunes molecular
son el P(3HB) y el depende del
copolímero de microorganismo
polihidroxivalerato Características productor, está
físicas (PHAs) en el orden
conocido como
(PHBV). El P(3HB) promedio de 5
tienen propiedades 000 a 1 000 000
similares al Da
polipropileno.
Compuesto Tipo de
Bacteria Fuente de C
limitante PHA
Alcaligenes Savia de
Amonio P (3HB)
latus maple
Azotobacter Agua
Oxígeno PHBV
vinelandii residual
Amonio,
Azospirillum carbono,
brasiliense oxígeno,
magnesio
Bacillus Sulfato de
Glucosa P (3HB)
cereus potasio
B. Sulfato de P (3HB-co-
Glucosa
megaterium potasio 3HV)
Sulfato de
B. subtilis P (3HB)
potasio
B. Caldo Sulfato de
PHB, PHBV
thuringiensis nutritivo potasio
Cado
nutritivo,sucr Sulfato de
Bacillus spp. PHB, PHBV
osa, potasio
alcanoatos
La biosíntesis de P(3HB) o de otros PHA se inicia con el
transporte facilitado y difusión pasiva de una fuente de
carbono hacia el citoplasma.
.Independientemente de la fuente de nutriente, la síntesis de
PHAs depende de la formación de acetil-CoA, un
intermediario en las vías degradativas de los carbohidratos y
del ciclo de Krebs.
Existen cuatro rutas metabólicas para la síntesis de PHAs,
relacionadas con el tipo de microorganismo productor, el sustrato
fuente de carbono y el tipo de PHA producido:

2. En la segunda ruta:
1.En la primera ruta:
Rhodopseudomonas
Cupriavidus necator
rubrum.

Utiliza sustratos como : Utiliza sustratos como:


-Carbohidratos - Acetato
- Piruvato o acetato. - Anhídrido carbónico.
Para la síntesis inicial de acetil-
CoA.
3. La tercera ruta de biosíntesis
de PHAs es observada en la 4.Una cuarta ruta, está
mayoría de especies de: presente en todas las
especies de :
Pseudomonas grupo I
Pseudomonas
(P. olevorans) pertenecientes al grupo II
(P. aeruginosa)
Utilizando sustratos como:
- Àcidos grasos y Utilizando sustratos como:
-Sustancias que pueden ser Gluconato o acetato para la
convertidas en alcanos o ácidos síntesis de PHAs de cadena
alcanoicos. corta.
En el mecanismo • β-cetoacil-CoA
de síntesis de
PHAs de cadena
tiolasa
corta (C3 a • acetoacetil-CoA
C5),intervienen reductasa
básicamente • P (3HB) polimerasa
tres enzimas:
Diagrama de flujo que presenta las etapas de la síntesis
de PHB por Cupriavidus necator a partir de
carbohidratos, piruvato o acetato
Metabolismo de
polihidroxibutirato
(Cholula,2005)
Ruta metabólica para la síntesis de polihidroxialcanoatos a
partir de ácidos grasos (Dantas, 2005).
Estrategia Actual para la
producción de PHAs

1. El proceso en paralelo: 2.El proceso en serie:


Se ha demostrado en Rodospirillum Primero se cultivan las bacterias
rubrum ; sin embargo parte del con fuente de carbono para la
polimero formado inicialmente se obtención de biomasa y luego
pierde debido a la utilización del se elimina un nutriente esencial
sustrato en el metabolismo celular. del medio, a la vez que se
añade un sustrato para la
formación del polímero
Cupriavidus
necator Alcaligenes latus

. Las bacterias se cultivan en •Es utilizado para


medio con glucosa y producir PHB con
determinada cantidad de sucrosa como fuente
fosfato. de carbono.
•En un proceso fed
. Produce P(3HB) y P(3HB-co- batch más de 1
3HV). tonelada de PHB
puede ser obtenido
en menos de 1
semana.
Azotobacter
vinelandii Melitótrofos:

.Acumula más del 75% de P(3HB) .El metanol es uno de los sustratos
durante la fase exponencial de carbonados mas baratos que se
crecimiento . puede emplear en la producción
.Es un buen candidato para la de PHAs.
producción de PHAs por su
capacidad para utilizar sustratos .No obstante el bajo costo del
baratos y un eficiente proceso de metanol ha sido atractivo para
purificación. diversas investigaciones , el metanol
como fuente de carbono a 30°C y
con 2.5 ppm de oxígeno disuelto ,
en un cultivo con
Methylocabacterium extorquens.
• Pseudomonas fluorescentes sintetizan PHAs de cadena media (6 a
14 carbonos) cuando se les cultiva en ácidos alcanoicos de 6 a 10
carbonos alcanzando 30 % de contenido de PHAs.

• Octano: 33 %
• P.Oleovorans • Ácido octanoico : 37,1 %
• Octanol

• Pseudomonas spp.
• Pseudomonas putida Ácido oleico: 44,8 %
Fuentes de carbono: acetato, amidas, ácido
hidroxibutírico, ácido propiónico, celulosa, glicerol,
lactato, lignina, etc.
1. Fuentes de carbono económicas :
Aceites de origen vegetal = renovable y
económica
2. Aprovechar la materia prima abundante en
una región.
Ejm: savia de maple, el bagazo de agave, lodo
desarrollado en proceso anaerobios-aerobios
Aplicaciones industriales: Transportadores biodegradables para la
liberación controlada de:
- fertilizantes
- fungicidas
-herbicidas e insecticidas,
-redes de pesca
-embalajes para alimentos
- frascos
-Recipientes
- emulsificantes
- materia prima para la producción de tintes
- adhesivos.
suturas
Materiales
osteosintéticos
Jeringas como placas
óseas

trasportadores
biodegradables
Grapas Aplicaciones para la liberación
médicas controlada de
drogas y
medicamentos.
Impacto ambiental positivo Tiempo de resistencia corta
capacidad de ser biodegradados

Mismo equipamiento Pueden ser procesados de la misma


forma que los plásticos convencionales

Fuente Producidos a partir de fuentes renovables


 Los PHA pueden ser totalmente degradados por las bacterias que los producen y
por otras bacterias, hongos y algas .Enzimas extracelulares de polimerasas e
hidrolasas que catalizan la ruptura del polímero en compuestos solubles en agua.
 También pueden ser degradados por un mecanismo no biótico de hidrólisis química
especialmente en altos valores de pH.
 La tasa de biodegradación varía según la población microbiana presente en el
ambiente, temperatura, pH, nutrientes, cristalinidad, aditivos y área superficial de
los polímeros.
Fig 1: Biosíntesis y degradación de P(3HB) en C. necator (1) 3-cetotiolasa, (2)acetil-CoA reductasa dependiente
de NADPH, (3) acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADH,(4) PHA polimerasa,(5) PHA depolimerasa, 6) ®-
3-hidroxibutirato deshidrogenasa, (7) acetoacetil-CoA sintetasa (Saito, et al., 1993).
OBJETIVOS:

• Aislar e identificar cepas de Azospirillum spp. de raíces


de tomate y arroz cultivados en los distritos de Reque y
Pomalca respectivamente en Lambayeque.

• Detectar y cuantificar gránulos de PHAs y determinar la


concentración de PHAs en estas cepas nativas.
En la segunda fase se
detectaron y
El trabajo de investigación cuantificaron gránulos de
se ejecutó en dos fases. PHAs y se determinó la
En la primera se realizó el concentración (gL-1) de
aislamiento, identificación PHAs en las cepas
del género y especies de nativas de Azospirillum
Azospirillum spp. spp. En ambas fases se
obtenidas de raíces de utilizó un diseño no
tomate y arroz. Experimental
transeccional descriptivo
• Durante los meses de febrero a mayo
de 2010 se recolectaron 192 muestras
de raíces de cultivos de tomate y arroz,
en fructificación establecidos en
campos comerciales de los distritos de
Reque y Pomalca provincia de
Chiclayo, región Lambayeque.
• El suelo ligeramente alcalino (pH: 7.30) Fig. 3: Raíz de la planta de arroz.
en los campos cultivados con tomate y
así como fuertemente alcalino
(pH:8.05) ) en los campos de arroz.
• Las muestras se depositaron en bolsas
plásticas debidamente etiquetadas
inmediatamente se transportaron para
su procesamiento en el laboratorio de
Microbiología y Parasitología de la
Facultad de Ciencias Biológicas,
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo,
Lambayeque.
Fig. 4: Raíz de la planta de tomate.
• Las raíces se lavaron con agua potable hasta eliminar el suelo remanente, se cortaron
en secciones, se desinfectaron con (NaClO) se enjuagaron tres veces consecutivas con
agua destilada estéril.
• El enriquecimiento de cada una de las muestras, en tubos conteniendo. La incubación
se realizó en aerobiosis a 30 ºC por 5 días y se seleccionaron los tubos donde se
observó viraje del color verde hacia el azul y la presencia de una película gruesa
blanquecina.
• Posteriormente, se tomó una alícuota de la película, con la que se obtuvo una
suspensión en 1 mL de SSE y se sembró por agotamiento y estría en placas de Petri y
se incubo a 30 ºC durante 3 a 5 días, se desarrollaron colonias blanquecinas y
pequeñas con viraje del verde al azul, se seleccionó la colonia y se sembró en medio
Nfb semisólido en aerobiosis a 30 ºC por 1 semana y posteriormente en placas de Petri
con agar rojo de Congo a 30 °C por 48 a 72 horas.
• Después se seleccionaron las colonias rojo escarlata, se sembró en placas de Petri
con agar nutritivo para obtener cultivos puros. La identificación de Azospirillum spp. se
realizó en función de las características morfológicas y fisiológicas.
• Para la obtención del inóculo, se cultivaron en 1.7 mL
de caldo Azotobacter modificado y se incubaron a 30
ºC, 150 rpm durante 20 horas.
• Para el proceso fermentativo en lote alimentado
discontinuo, los cultivos fueron llevados a frascos con
caldo Azotobacter e incubados a 30 ºC, 150 rpm
durante 24 horas.
• Después se inició la adición de 0.08 gramos de carbono
cada 12 horas mediante la incorporación de 3 mL de Fig. 5: Cepas nativas de Azospirillum spp.
una solución concentrada de ácido málico estéril.
• El régimen de alimentación discontinua se mantuvo
hasta las 48 horas. A partir de las 36 horas de realizada
la inoculación, se tomó una alícuota para detectar la
producción de PHAs. La presencia de gránulos negros
o grisáceos en el interior de las células vegetativas
rosadas se consideró como positivo para la detección
de PHAs.
• Fueron seleccionadas 20 cepas de Azospirillum spp. de
tomate y 20 de arroz para determinar la concentración Fig. 6: Inóculo en 15 mL del mismo caldo :
de PHAs. 30 ºC x 24 horas (150 rpm)
Fig. 7: 24 horas Primera alimentación con 3 mL de solución saturada de ácido málico- Incubación 30 ºC por 12
horas

Fig. 8: 36 horas Primera toma de muestra y frotis para detectar PHAs


Fig. 10: Decolorar con xilol y secar a
temperatura ambiente
Fig. 9:Tinción con solución de Sudán negro B x 15 minutos

Fig. 11: Teñir con safranina por 1 minuto y enjuagar con agua destilada
Fig. 12: DETECCIÓN DE PHA
Los gránulos de PHA se observan de color gris o negro y las células vegetativas rosadas
• Después del proceso fermentativo en lote alimentado discontinuo, hasta por 72 horas
con alimentación de carbono cada 12 horas a partir de las 24 horas, momento en el
que se tomaron 6 mL de muestra para determinar la absorbancia a 600 nm y después
cuantificar la biomasa y PHAs producidos por las cepas nativas de Azospirillum spp.
• Para cuantificar la biomasa, se centrifugaron a 3500 rpm durante 30 minutos, el
sedimento o paquete celular se lavó con agua destilada estéril, después se
deshidrató en estufa a 40 ºC por 24 horas y se pesó en una balanza digital.
• Para cuantificar el PHA, en el tubo que contenía la biomasa deshidratada se agregó 1
mL de hipoclorito de sodio para debilitar la membrana celular y facilitar el proceso de
extracción y después se agregó cloroformo para separar la biomasa del polímero.
Transcurridos 20 minutos, los tubos fueron centrifugados a 3500 rpm durante 5
minutos y se obtuvieron dos fases, una superior conteniendo hipoclorito de sodio con
restos celulares y una inferior correspondiente al cloroformo con el PHA.
• Después se extrajo el cloroformo con el polímero, se depositó en un tubo y se llevó a
estufa a 40 ºC por 24 horas para acelerar la evaporación del cloroformo.
• El polímero obtenido fue digerido con H2SO4 80% durante 30 minutos a 90 ºC (baño
María), se dejó enfriar a temperatura ambiente y luego se leyó la absorbancia a 235
nm en espectrofotómetro con luz UV (celda de cuarzo).
Fig. 13: CUANTIFICACION DE BIOMASA
Centrifugar el caldo cultivado (3000 rpm por 30 minutos
Fig. 14: Lavar el paquete celular por dos veces (agregar solución salina y centrifugar)
deshidratada
Fig. 15: Deshidratar (70ºC hasta peso constante) y pesar

Fig. 16: Agregar 1 mL de hipoclorito de sodio 5 % a la biomasa


Fig. 17: Mezclar durante 2 horas y luego agregar 1 mL de
cloroformo. Inmediatamente se forman dos fases.
Centrifugar (2000 rpm x 5 minutos)
Fig. 18: Se visualizan mejor
las dos fases. Con una pipeta
Pasteur extraer el cloroformo
con el polímero (fase inferior) y
depositarlo en tubos de vidrio.
Evaporar el cloroformo ( estufa
24 horas).
Fig. 21: Digestión con ácido sulfúrico y corrida espectral con
pico máximo a 235 nm
Fig. 19: Remover el polímero con ayuda de un ansa

Fig. 20: Extraer el polímero PHA y pesar


Calcular el Y p/x (Rendimiento de biomasa en producto)
INTEGRANTES:
• Aidé Díaz
• Ketty Ugaz Olano
• Leydi Rivera Rios