Guiatp2016 Biofisica

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA RIOJA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES

CARRERA DE BIOQUÍMICA
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

CÁTEDRA: Biofísico-química
Esta guía fue confeccionada con el objeto de facilitar el aprendizaje de la materia, y para
que el alumno compruebe en hechos sencillos la influencia de la biofísica en los procesos
fisiológicos y patológicos que tienen lugar en el organismo.
Es mi intención que de las experiencias planteadas surjan nuevas inquietudes que lleven a
preguntas, planteos e hipótesis de explicaciones para casos similares relacionados.
Del bioquímico se espera capacidad de análisis e interpretación de los eventos sucedidos a

nivel molecular, los resultados que brinda son esenciales para determinar la conducta a
tomar que asegure el bienestar de los pacientes.
Por otro lado, la investigación bioquímica es el camino por donde avanza la medicina, y ese
será siempre su mejor aporte a salud, a la sociedad y a los demás profesionales del área.
Quiero compartir con ustedes una cita que me parece adecuada para la ocasión……
En el camino de la medicina, el bioquímico es quien da el primer paso.
Su profesión abre caminos. Es la suma de una aptitud científica

y una vocación humanista. Sus aciertos sirven a la humanidad.
A través de su trabajo diario brinda beneficios previniendo
y curando enfermedades.
Con el afán de dar cada día un poco más intercambia conocimientos

Y se actualiza sobre los nuevos métodos diagnósticos. Desde sus
laboratorios nacen datos orientando al médico a encontrar el
camino para mejor la calidad de vida de los pacientes.
Cuando un bioquímico da un paso adelante, TODA LA CIENCIA AVANZA.
Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica 1

INDICE
Contenido Página
Cronograma de actividades prácticas 3
Régimen de evaluación 5
Conceptos teóricos práctico nº 1 6
Trabajo práctico nº 1 20
Conceptos teóricos práctico nº2 28
Trabajo práctico nº2 41
Conceptos teóricos práctico nº 3 46
Trabajo práctico nº3 64
Conceptos teóricos práctico nº4 68
Trabajo práctico nº 4 85
Conceptos teóricos seminario 91
Problemas seminario 99
2 Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES PRÁCTICAS 2016
SEMANA 1: 29/08
TEORICO PRÁCTICO Nº 1: Termodinámica de las soluciones, soluciones reales e ideales.
Soluciones de macromoléculas. Equilibrio osmótico.
SEMANA 2: 12/09
PRACTICO DE LABORATORIO Nº 1: Presión osmótica, flujo entre compartimientos,
osmolaridad, tonicidad de las soluciones.
Determinación del % de hemólisis, determinación del % de hematocrito, coeficiente
osmótico.
SEMANA 3: 19/09
TEORICO PRÁCTICO Nº 2: Métodos de separación, electroforesis. Fundamentos de la
electroforesis, tipos de electroforesis. Electroforesis de proteínas plasmáticas.
SEMANA 4: 26/09
PRACTICO DE LABORATORIO Nº 2: Electroforesis de proteínas plasmáticas. Proteínas
que conforman las diferentes fracciones, valores normales, asociación patológica
SEMANA 5: 03/10
TEÓRICO PRÁCTICO Nº 3: Métodos de separación, cromatografías. Tipos de
cromatografías, clasificación, principio de separación, Usos en el laboratorio de análisis
clínico.
SEMANA 6: 10/10
FERIADO
SEMANA 7: 17/10
PRACTICO DE LABORATORIO Nº 3:Determinación de la relación lecitina/
esfingomielina en líquido amniótico, por cromatografía en capa fina.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES PRÁCTICAS 2014
SEMANA 8: 24/10
TEORICO PRÁCTICO Nº 4: Fenómenos de superficie. Tensión superficial. Sustancias
tensioactivas. Concentración micelar crítica.
SEMINARIO 5: Interacción ligando-receptor. Resolución de problemas tipo.
Asociación a casos clínicos
SEMANA 9: 31/10
PRÁCTICO DE LABORATORIO Nº 4: Agentes surfactantes, determinación de la
concentración micelar crítica
SEMANA 10: 7/11

TEORICO PRÁCTICO Nº 5: Interacción ligando-receptor. Cálculos e interpretación
SEMANA 11: 14/11: RECUPERATORIOS

RÉGIMEN DE EVALUACIÓN
Las actividades prácticas constan de:
 Seminarios.
 Prácticas de Laboratorio.
Seminarios: En ellos se llevará a cabo la resolución de problemas planteados en la guía de trabajos

prácticos, al final del mismo se tomará un examen escrito individual.
Se evaluará:
 Conceptos Teóricos.
 Capacidad de análisis y resolución de problemas prácticos.
Practicas de Laboratorio:
 Se tomará evaluación escrita individual, se destinará a los mismos 15 minutos previos a la

práctica de Laboratorio.
 Al finalizar el práctico, se deberá entregar un informe final de la actividad realizado en
forma grupal
Se evaluará:
 Conceptos teóricos.
 Articulación de los contenidos teóricos al campo de la práctica.
 Desempeño en el ámbito del laboratorio.
 Cooperación y dinámica de grupo.
Para obtener la regularidad de la materia, los alumnos deberán aprobar el 80% de las
actividades prácticas .Las actividades prácticas NO podrán recuperarse.

CONCEPTOS TEORICOS
TERMODINÁMICA DE SOLUCIONES - PRINCIPIOS BÁSICOS

Una solución es un sistema monofásico que contiene más de un componente. Un componente
es una sustancia química que se puede variar independientemente. La descripción del estado
termodinámico de la solución se determina por el conocimiento de T, P y las cantidades de
los n componentes que la constituyen. Es útil el uso de propiedades molares parciales y
entre ellas el potencial químico o energía libre molar parcial.
El cambio de energía libre para un cambio infinitesimal reversible en el estado de un
sistema en el cual puede variar la composición se expresa como.
dG = G dT + G dP + G ni
T P, ni P T, ni ni nji

dG = -S dT + V dP +  i dni  i = G
ni T,P,nj ni
A P y T ctes : dG = i dni
La importancia del potencial químico proviene que esta variable mide el cambio de energía
libre que acompaña a un cambio de composición o cantidad de componentes de un sistema.
EQUILIBRIO DE FASES
Si un sistema está en equilibrio de fases entonces dG= 0, y para esto los potenciales
químicos de un componente deberán tener el mismo valor en todas las fases en que el
componente esté presente.
dG = i dni + i  dni  = 0 a P y T ctes.
Entonces i dni = i  dni 
Y como el dni es el mismo en ambos casos (lo que quita a uno lo gana la otra fase)
(i - i  ) dni = 0
Es necesario que la diferencia de potenciales sea 0, para ello debe cumplirse que:
i = i   equilibrio de fases.

EQUILIBRIO QUÍMICO
Si un sistema está en equilibrio químico:
aA + bB  gG + hH
dG= A dnA + B dnB + G dnG + H dnH = 0
A dnA + B dnB + G dnG + H dnH = 0 y como

a b g h
A dnA = B dnB = -G dnG = -H dnH

a b g h
aA + bB = gG + H
En el equilibrio la suma de potenciales químicos de los componentes reactantes debe ser

igual a la suma de potenciales químicos de productos, cada uno afectado de su coeficiente
estequeométrico que considera cuanto afecta proporcionalmente al equilibrio total la
variación de cada uno.
Solución Ideal, se define como:
 Aquella en la que H al mezclar los componentes es cero.
 El S está dado por distribución estadística:
Sm = -R  ni ln Xi (+)  espontáneo.
Esto significa que no hay diferencias entre las energías de interacción de moléculas de
soluto y solvente (H=0) y que el cambio entrópico se debe solamente al aumento de
posibilidades de distribución (desorden) del sistema debido a la mezcla.
dG = Hm -T Sm = RT ni ln Xi porque Hm=0 (ideal)
La energía libre de mezcla es:

Gmezcla = G solución -  Gi (componentes puros)
Gmezcla = ni i -  ni iº
iº : es la energía libre molar parcial de una sustancia pura y corresponde a un potencial químico
estándar

Entonces:
 ni (i - iº) = RT  ni ln Xi
Y como los componentes pueden variar independientemente:
i - iº = RT ln Xi Si es diluida se puede aproximar,

i = iº + RT ln Ci IDEAL
De manera real no se expresaría según concentraciones, sino actividades

Estamos interesados en el  del solvente
El subíndice 1 se refiere al solvente
i = iº + RT ln X1 f1 X1 = fracción molar del solvente.
f1 = Coef. Actividad del solvente.
X1 = 1-X2, esto se puede expandir en serie, y resulta:
Ln (1-X2) = -X2-X2……………
2
1 - 1º = - RT ( X2 + ........) + RT ln f1
X2 = fracción molar del soluto = C2 V1 C2 en g/l.

PM2
 1 - 1º= - RT C2 V1 + RT ln f1
PM2
Como f1 < 1 si hay C2 (soluto) el log se puede expandir en serie:
ln f1= - ( C22 +  C23 + ………)
y queda :
 1 - 1º= - RT V1 ( C2 +  C22 + ....)

PM2 =coef. De corrección medida de la no-idealidad de la solución
= -RT V1 C2 (1 +  C2 PM+......) (2º coeficiente de Virial.)
PM2
Si  = 0  ideal
1 - 1º = - RT C2 V1
PM2 El potencial se reducirá si la solución incrementa la concentración C2.

SOLUCIONES DE MACROMOLÉCULAS
Las soluciones de macromoléculas, entre otras son consideradas reales por 3 factores
importantes que determinan su comportamiento:
1- Son moléculas grandes, mayores que las del solvente.

2- Pueden interaccionar con este y entre si.
3- Frecuentemente poseen cargas eléctricas.
La causa mas general del comportamiento no-ideal de soluciones de macromoléculas es su

tamaño. Una solución ideal es aquella en la cual es válida la primera ley de estadística de
entropía de mezcla, como esta no incluye restricciones de tamaño, ello implica que las
moléculas de soluto y solvente pueden ser intercambiables al azar de manera indistinguible.
Esto no es cierto para macromoléculas, y por ello, su distribución en la solución no es nunca
completamente al azar.
SOLUTO SOLVENTE MEZCLA IDEAL

SOLUCIÓN IDEAL: Las moléculas de soluto y solvente son indiferenciables, y pueden ser
intercambiadas al azar en forma indistinguible, las interacciones soluto-soluto, soluto-solvente y
solvente- solvente son exactamente iguales, porque el sistema no puede diferenciar una molécula
de otra
SOLUTO (MACROMOLÉCULAS) SOLVENTE SOLUCIÓN NO IDEAL

En el caso de soluciones de macromoléculas, la distribución en el volumen de la solución nunca es completamente al azar. El
centro de la molécula está excluido de los volúmenes ocupados por las otras.

En esto consiste la no idealidad y por consiguiente el coef. de Virial depende del volumen de
exclusión (ч).
=Nч N= Nº de Avogadro.
2PM22 PM2 = PM del soluto.
Ese volumen de exclusión está determinado por las dimensiones moleculares.
Para esferas: ч = 8 PM2 V2 Y  = 4 V2

N PM2
Para cilindros ч = 2L PM2 V2 y  = L V2

Nd d PM2
L= longitud del cilindro

d= diámetro.
V2= Vol. especifico.
Esta contribución a la no idealidad es pequeña para moléculas esféricas, pero puede

hacerse considerable para moléculas de volumen grande, y asimétricas.
Por otro lado muchas macromoléculas pueden interaccionar entre sí o con el solvente. Esto
puede tener dos efectos:
1- Hm  0
2- Sm puede tener contribuciones del ordenamiento y desordenamiento del solvente.
Una entalpía o calor de mezcla negativo corresponde a una interacción soluto-solvente

favorable, esto lleva a una disminución aún mayor del potencial químico que el esperado para
soluciones ideales y a un valor de  positivo. Por el contrario, si existe buena interacción
soluto-soluto el coef. De Virial será negativo.
Sin embargo un valor negativo muy grande no es tolerado ya que cuando  es un valor
negativo muy grande puede ocurrir un mínimo en la dependencia de i =f (xi) y ocurre
separación de fases. En este caso hay dos concentraciones en el cual el solvente tiene el
mismo potencial químico, significa que las 2 fases líquidas pueden coexistir en el equilibrio.

EFECTO DEL VALOR DE B( SEGUNDO COEFICIENTE DE VIRIAL) EN EL COMPORTAMIENTO DEL
POTENCIAL QUÍMICO DEL SOLVENTE EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO .
μ1
B<<0 (separación de fases)
B< 0 (mal solvente)

Buena interacción soluto-soluto
B=0 Solución Ideal
B > 0 (buen solvente)

Buena interacción soluto-solvente
Concentración soluto C2
El efecto del volumen de exclusión es siempre disminuir aun más el  del solvente, es un
efecto entrópico favorable ya que impide que se acerquen e interaccionen moléculas de
soluto más allá de su volumen de exclusión  favorece su dispersión.
Si el solvente no es bueno la interacción soluto-soluto puede ser tal que tiende a aumentar
el  del solvente, éste es un efecto entálpico desfavorable. El punto donde se
contrarrestan estos dos efectos (el Vexcl. que tiende a separar las moléculas de soluto y la
preferencia energética de moléculas de soluto a interaccionar entre sí) es donde la solución
se comporta como ideal.
EQUILIBRIO ENTRE DIFERENTES COMPARTIMIENTOS
La compartamentalización es uno de los principios básicos de los sistemas biológicos, está

mediada por membranas a través de las cuales ocurre pasaje de materia.
Debido a estas estructuras puede haber diferencias de  aún en condiciones de equilibrio.
Esto se debe a la permeabilidad selectiva de las biomembranas, termodinámicamente se
trata como transferencia de materia entre diferentes fases.

EQUILIBRIO OSMÓTICO
Consideremos una membrana impermeable a solutos y permeable sólo al agua. Si se ponen

en contacto a dos soluciones a través de esta membrana, una conteniendo soluto y otra
solamente solvente podemos considerar que el sistema consiste en dos fases en contacto.
Lado β Lado α
Los requerimientos para que el sistema este el equilibrio son:
i = i
Sin embargo el i solvente en la solución será siempre menor que en el solvente puro. El
equilibrio ya no se puede conseguir por más que se transfiera solvente, la desigualdad
seguirá existiendo debido a la permeabilidad de la membrana al soluto, a menos que se
produzca alguna modificación en otra variable termodinámica del sistema; y esto es lo que
ocurre, entra en juego la presión.
Supongamos que a presión del lado  es P0 y la presión en  se incrementa P0 +  . El
potencial químico como cualquier variable termodinámica depende de la presión:
 =Vi di (T, ni)= Vi dp

P T, ni
Del lado del solvente puro: 1 = 1º

Y del lado de la solución: 1 = 1º- RTV1º(C2/PM2 + C22 + ....) + ∫V1 dP
V1 =Volumen molar parcial

Suponiendo que V1=Vº= cte= v. molar del solvente puro (buena aproximación si la presión
es baja y la solución diluida).
1 = 1º- RTV1º(C2/PM2 + C22 + ....) + V1 
En el equilibrio: i = i 
 = RTV1(C2/PM2 + C22)
V1
 = RT (C2/PM2 + C22) (Solución real)
Esta diferencia de presión se denomina presión osmótica y es una propiedad coligativa, es

decir, depende solamente de la cantidad de partículas, independientemente de su
naturaleza. Es la diferencia de presión requerida entre dos compartimientos para poder
igualar el potencial químico del solvente y llegar al equilibrio. En realidad la presión
osmótica es una medida de la tendencia de una solución a captar solvente y su
establecimiento hace aumentar el potencial químico del solvente en la solución hasta el
valor del solvente puro.
OSMOSIS: Es el proceso por el cual ocurre pasaje de solvente a través de una membrana
semipermeable que separa dos compartimientos conteniendo soluciones de diferentes
concentraciones. La fuerza que impulsa ese flujo de solvente es la diferencia de
concentración.
Si la solución es ideal  = 0
Y  = RT (C2/PM2) ECUACIÓN DE VANT’ HOFF

C2 en g/l.
 = RT C2 C2 en M.
CUANTO MAYOR ES LA CONCENTRACIÓN DE

SOLUTO, MAYOR ES LA PRESIÓN OSMÓTICA.
C2 se refiere a todos los iones o partículas
Osmóticamente activas.
 = RT (C1+ C2 + C3 +.......... + Cn)

Vant`Hoff- 1904

La cantidad de partículas osmóticamente activas que aporta un compuesto químico,
depende de su equilibrio de disociación en solución.
NaCl: dos partículas osmóticamente activas  Na+

 Cl-
MgCl2: tres partículas osmóticamente activas  Mg++

 Cl-
 Cl-
Sacarosa: una partícula osmóticamente activa.
OSMOLARIDAD: Se define como moles de partículas osmóticamente activas en 1000ml de

solución.
NaCl 0.1 M  0.1 mol Na + + 0.1 mol de Cl-  0.2 OsM

MgCl2 0.3 M  0.1 mol Mg ++ + 0.2 mol de Cl-  Solución 0.9 OsM
Sacarosa 0.2 M  0.2 OsM
Ej: Cuál es la presión osmótica de una solución 0.5 M NaCl?
 = RTC C (en OsM)

 = 0.082 atm.l x 298 K x 1M
mol.K
 = 24 atm.
…Y la de una solución de NaCl 145 mM?. (Suero fisiológico)
= 7 atm.

La célula tiene diferentes mecanismos por el cual puede tolerar hasta una cierta cantidad
de agua.
Sale agua
0.15 M  0.25 M
NaCl NaCl
Toma CO2 y lo pasa
a H2CO3
Linfocito
La célula toma CO2 y lo pasa a H2CO3. Este H2CO3 en el interior de la

célula se desdobla en H+ y HCO3-. Los H+ son intercambiados Na+ Cl-
por Na+ y los HCO3- por Cl-, hasta que se iguala la osmolaridad H+
del medio externo y se reestablece el flujo de agua. HCO3-
Entra agua
DETERMINACIÓN DE PESOS MOLECULARES
La ecuación de Van’t Hoff es útil para determinar pesos moleculares.
RT
M2
C2
Si las soluciones son NO ideales
П = RT + BRTC2 + ………..
C2 M2

Se puede obtener algo de información sobre la geometría de la macromolécula implicada a
través del 2º coeficiente de Virial, si B es (+) se trata de una proteína globular o fibrosa
con L/d muy grande. Si B (-) existen interacciones soluto-soluto y asociación molecular.
Efecto del valor del 2º coeficiente de virial para el potencial químico del solvente sobre la dependencia
de la presión osmótica con la concentración de soluto
П/C2
B > 0 (proteína)
α Tg α = RTB
B= 0 solución ideal
B< 0 (interacción soluto-

soluto)
C2
EFECTO DE LA CARGA DEL SOLUTO
Consideremos el caso de una macromolécula disociable PrK:

PrK -------------- Pr - + K +
…Presente en un compartimiento separado de otro por una membrana semipermeable.
Comp. 1 Comp. 2
Partícula Pr-
16 Bioq.
Partícula K+ Maricel Lozdan - Biofísica
Si la molécula disociada y su contraión son los únicos electrolitos presentes, en estas
condiciones, los contraiones permanecerán del mismo lado de la membrana que la
macromolécula según lo requerido por la ley de ELECTRONEUTRALIDAD.
Una situación más realista es aquella en que la solución de polielectrolito está en contacto
con una solución de electrolito.
En este sistema, el estado inicial transcurrirá irreversiblemente hacia el estado de

equilibrio Donnan que se caracteriza por tres fenómenos:
1- Desigual distribución de iones entre ambos compartimientos.

2- Diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana.
3- Existencia de presión osmótica adicional a la ejercida por la solución de la
macromolécula (presión coloidosmótica)
Cuando este sistema transcurre hacia el equilibrio, ocurren cambios en distribución de

componentes en cada compartimiento y como consecuencia cambia la energía libre molar
parcial, pero en el equilibrio ésta debe ser igual en ambos compartimientos.
Los cambios de energía potencial no se deben sólo a los cambios de concentraciones sino
también a la carga de las partículas. Las magnitudes que se igualan en el equilibrio son los
potenciales electroquímicos de las especies difusibles.
 =  + Z F V = μº + RT ln C + ZFV
Z= Valencia del ión.
F= Cte de Faraday.
V= Diferencia de potencial

DISTRIBUCIÓN DE IONES
Para los iones difusibles:  1 =2
Para un catión:
+º + RT ln C1+ + Z+FV1 = +º + RT ln C2+ + Z+F V2 (1)
Para un anión:
-º + RT ln C1- + Z-FV1 = -º + RT ln C2- + Z-F V2 (2)
El trabajo eléctrico para un anión y un catión es de igual magnitud pero de signo invertido:
Z+FV1 = Z- F V1
Z+FV2 = Z- F V2
Relación Donnan: Esta relación expresa que en situación de equilibrio la distribución de

aniones y cationes difusibles es diferente en ambos compartimientos, p/ej: si hay más
concentración de cationes en el compartimiento 1, necesariamente habrá menor
concentración de aniones para que se cumpla la relación Donan.
Además la condición de electroneutralidad requiere que:

 En el compartimiento 1 : C1+ = C1-
 En el compartimiento 2: C2+ = C2- - ZpCp (4)
Zp: Carga de la proteína

Cp: Concentración de la Proteína.

A partir de (3) y (4) podemos ver:
Lo cual indica que si la carga neta de la proteína ó macromolécula es negativa:
Zp < 0 ------ r2 < 1 ; r < 1 y de acuerdo a (3):
C2- < C1- (Conc. de aniones en comp. 2 < Conc. de aniones en comp. 1)
C2+ > C1+ (Conc. de cationes en comp. 2 > Conc. de cationes en comp. 1)
Si la carga neta de la proteína es (+)
Zp >0 -------- r2 > 1 ; r > 1 y de acuerdo a (3):
C2- > C1- (Conc. de aniones en comp. 2 > Conc. de aniones en comp. 1)
C2+ < C1+ (Conc. de cationes en comp. 2 < Conc. de cationes en comp. 1)
Ejemplo:
Lado 1: 8 Na +/ 8 Cl-
Lado 2: 9 Na +/ 6 Cl-/ 3P-

TRABAJO PRACTICO N 1
PRESIÓN OSMÓTICA
CUESTIONARIO DE ORIENTACIÓN: Evalúe con este cuestionario su preparación teórica.
1- Establezca la diferencia entre ósmosis y presión osmótica.

2- En un proceso de ósmosis ocurre flujo de solvente a través de una membrana sólo permeable
al solvente desde:
a- Una solución más concentrada en soluto hacia una más diluida.
b- Una solución de mayor presión osmótica hacia una menor.
c- Una solución de menor numero de partículas osmóticamente activa hacia una de mayor
número de partículas osmóticamente activa.
d- Una solución de baja fracción molar de solvente hacia una de alta fracción molar de
solvente.
3- Grafique /C en función de C (concentración). Considere los casos para una solución ideal y
para una solución real.
4- Dos compartimientos A y B en equilibrio con la presión atmosférica están separados por una
membrana rígida sólo permeable al agua. El compartimiento A contiene agua pura y el B
contiene un volumen de solución de sacarosa 100mM tal que el nivel de ambos
compartimientos es el mismo. Cuando el sistema alcanza el equilibrio existe un desnivel entre
ambos compartimientos Indique:
a- En cual de los compartimientos es mayor el nivel.
b- Como calcularía el valor de la presión osmótica
c- En qué compartimiento es mayor el potencial químico del agua
d- Si el valor de presión osmótica en el compartimiento B en ambos estados es
diferente.
5- Considere un sistema formado por dos compartimientos idénticos A y B separados por una
membrana rígida permeable al agua. El compartimiento A contiene una solución de 0.1 M NaCl
mientras que el B tiene una solución de 0.5 M NaCl. Indique:
a- Cual es la relación (mayor, menor o igual) entre los potenciales químicos del agua de
ambos compartimientos en el estado inicial y en el equilibrio termodinámico.
b- En cual compartimiento mediría mayor presión osmótica.
c- Prediga el flujo de solvente cuando el sistema tiende al equilibrio.
d- Que observaría si la membrana fuera distensible.
6- Calcule el número de partículas osmóticamente activas de 1000 ml de NaCl 1 M si el
coeficiente osmótico es 0.84
7- Dado un sistema de dos compartimientos, indique que cantidad y en cual de ellos es necesario
agregar NaCl para no observar flujo de solvente entre ambos. El compartimiento A contiene
100 ml de una solución de NaCl 200 mM y el compartimiento B 100 ml de una solución de
NaCl 100 mM y 150 mM de MgCl2.

TRABAJO PRACTICO N1
PRESIÓN OSMÓTICA – VOLUMEN CRÍTICO – HEMÓLISIS – COEFICIENTE OSMÓTICO
En una solución ideal los potenciales químicos () de los componentes son menores que los
potenciales químicos de esos mismos componentes con respecto a cuando están puros.
Así por ejemplo, el  del agua en una solución de NaCl es menor que el  en agua pura y el  del
NaCl en la solución es menor que en un cristal de NaCl.
i =  G
 ni T,P,n jzi
i =  + RT ln Xi
El valor de  de un componente depende de la concentración de ese componente. Una

consecuencia de este hecho es que las propiedades coligativas del solvente cambian cuando
variamos la concentración del soluto. Se observa, por ejemplo, descenso del punto crioscópico,
aumento del punto de ebullición o disminución de la presión de vapor del solvente cuando
aumentamos la concentración del soluto.
Suponga que ponemos en contacto, suavemente y sin mezclar enérgicamente, dos soluciones
de sacarosa de diferente concentración. Inicialmente los  correspondientes al agua y a
sacarosa serán distintos. Este sistema, que inicialmente no esta en equilibrio termodinámico, lo
alcanzará cuando el  de cada componente sea constante a lo largo de todo el sistema, es decir
cuando la solución sea homogénea.
t1 t2
lado 1 lado 2
comp.1 comp.2
sol. agua sol. agua

sacarosa pura sacarosa pura
Fig 1
Fig 2
En la Fig. 1 se muestran dos compartimientos de paredes rígidas separados por una membrana
semipermeable: permeable al solvente agua pero impermeable a la sacarosa.
Imagine que a tiempo cero hay una solución de sacarosa en el compartimiento 1 y agua pura en el
2. Está en equilibrio el sistema?. No es difícil deducir la respuesta: la concentración de agua en
el lado 1 es menor y por lo tanto su  es menor que en el lado 2. El sistema entonces, no está en
equilibrio. Cómo evolucionaría hacia el equilibrio?. De alguna manera el  del agua del lado 1
aumentará hasta igualar el  del agua del lado 2.

Una alternativa de aumentar el  del lado 1 es aumentar la presión dentro del compartimiento. A
esta presión se la denomina presión osmótica  y puede calcularse según:
 = - RT ln Xsolvente
V
Note que si planteamos esta ecuación para el lado 2, la  depende de la fracción molar del
solvente y no de la naturaleza del soluto.
Realizando algunas aproximaciones se tiene que relación de Van’t Hoff.
 = RTC
Donde C es la concentración molar de soluto/s osmóticamente activos. En una solución de NaCl

1M, la concentración de solutos osmóticamente activos es 2M (1M de Na+ y 1M de Cl-). Para una
solución de sacarosa 1M es 1M.
Intente resolver analíticamente los siguientes problemas:
1- Si pudiera conectar un manómetro en los compartimentos 1 y 2 de la Fig.1. Cuánto valdría la

diferencia de presión entre los compartimentos?
2- En la Fig.2 se muestra un sistema similar al de Fig.1. Los compartimentos 1 y 2 están en

contacto con el aire a través de los tubos 1 (t1) y tubo 2 (t2). Estos son suficientemente
pequeños como para que cualquier cambio de volumen de solución dentro de los tubos no
produzca cambios apreciables de concentración de sacarosa. Cuando se alcance el equilibrio
cuánto valdrá la diferencia del líquido entre los tubos 1 y 2?
3- Si la membrana semipermeable de la Fig. 1 pudiera desplazarse dentro del compartimiento 2

como un émbolo, cómo evolucionaría el sistema hasta llegar al equilibrio?
4- Como evolucionaría el sistema de la Fig.1 si la membrana semipermeable fuera permeable

tanto al agua como a la sacarosa?.

OBJETIVOS DEL TRABAJO PRÁCTICO
La membrana del glóbulo rojo es permeable al agua e impermeable a iones Cl -, Na+ y a muchos
componentes del citoplasma. El  del agua del citoplasma de un eritrocito es equivalente al de
una solución de NaCl 0.15 M. Que diferencia de presión sentirá esta membrana de un eritrocito
si se resuspende en agua o en 0.15M NaCl? Que sucederá si se resuspende en soluciones de
dilución creciente de NaCl?
El objetivo del presente trabajo práctico es calcular cuanto vale la máxima diferencia de
presión que puede soportar la membrana del eritrocito antes de estallar (hemólisis). Es
relativamente sencillo conocer a que valor de concentración de NaCl externo se produce la
hemólisis dado que se puede evidenciar la salida de hemoglobina citoplasmática mediante
centrifugación y lectura en el espectrofotómetro. Al volumen máximo que puede alcanzar el
eritrocito antes del estallido hemolítico se lo denomina volumen crítico.
TÉCNICAS UTILIZADAS EN EL DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO
EXTRACCIÓN SANGUÍNEA: La extracción de sangre para su posterior análisis es una

operación sencilla, pero requiere una serie de cuidados sin los cuales la sangre extraída no está
en buenas condiciones para su examen. La sangre se extrae por punción venosa del pliegue del
codo. En esta región la piel es fina y móvil, las venas a este nivel suelen ser suficientes, y están
generalmente fijas a las paredes, se dejan atravesar sin dificultad y no se rompen, por lo cual no
se producen hematomas. En muchas ocasiones se localiza mejor la vena por palpación que por
visión directa.

Técnica de la punción:
1- Colocar un brazalete de goma, suave, para favorecer el estasis venoso sin suprimir el pulso
radial. Deberá colocarse el menor tiempo posible antes de la extracción, ya que en estado de
estasis se producen ciertos cambios en la sangre que conveniente evitar en lo posible.
2- Una vez ubicada la vena a canalizar, desinfectar el área con algodón y alcohol al 70%.
3- Realizar la punción de la vena ingresando la aguja con un ángulo de aprox. 45º.
4- Tirar suavemente del émbolo de la jeringa para que la sangre fluya uniformemente dentro de
ella. Las aspiraciones bruscas pueden producir hemólisis o formar burbujas.
5- Una vez extraída la sangre se retirará el brazalete del brazo ANTES de retirar la aguja.
NUNCA AL REVES. Extraer luego la aguja colocando al mismo tiempo un algodón con alcohol
sobre el sitio de punción.
6- Descartar la aguja en un DESCARTADOR, y verter la sangre en un tubo con EDTA
(anticoagulante) sin apretar el émbolo con violencia y dejando que la sangre corra por las
paredes del tubo.
7- Tapar el tubo e invertirlo suavemente para que el anticoagulante se ponga en contacto con
toda la muestra.
AISLAMIENTO DE GLÓBULOS ROJOS: Cada muestra de sangre de 10 ml con anticoagulante

se procesará de la siguiente manera:
a- Centrifugar en tubo plástico 5’ a 3000 rpm.
b- Aspirar el plasma y la capa de glóbulos blancos utilizando una pipeta pasteur.
c- Agregar 5 ml de una solución isotónica de NaCl 0.15 M (0.9 %) mezclar suavemente por
inversión.
d- Centrifugar de la misma manera que en punto a y aspirar el sobrenadante.
EXPERIENCIA 1: DETERMINACIÓN DE % DE HEMATOCRITO
Colocar en 12 tubos de Kahn 0.5 ml de las soluciones de NaCl de tonicidad creciente (ver tabla
1). Agregar 0.15 ml de la suspensión de glóbulos a cada tubo de Kahn. Agitar por inversión suave
y dejar reposar 15’. Suspender los glóbulos rojos por inversión suave y tomar una muestra de
cada tubo para microhematocrito.
Consignar los datos obtenidos en la tabla 1.
Graficar % de hematocrito en función de concentración de NaCl.

Tabla 1 Tabla 2
NaCl% Hematocrito. TUBO NaCl % D.O

TUBO
(0. 5 ml )
1 0.30 1 agua
2 0.40 2 0.20
3 0.45 3 030
4 0.50 4 0.40
5 0.55 5 0.45
6 0.60 6 0.50
7 0.65 7 0.55
8 0.70 8 0.60
9 0.80 9 0.65
10 0.90 10 0.70
11 1 11 0.80
12 1.1
Experiencia 2: HEMÓLISIS
Colocar 5 ml de solución hipotónica en tubos de centrifugación: 10 de concentración desde

0.2% hasta 0.8% y uno de referencia con 5 ml de agua. (Ver tabla 2.)
Agregar 0.1 ml de suspensión de glóbulos rojos al 25% (diluido = 0.4 ml suspensión de glóbulos
+ 1.2 ml de NaCl 0.9 %). Dejar 30 minutos. Centrifugar, separar el sobrenadante y leer en el
espectrofotómetro, a 530 nm. Hacer un gráfico de % de hemólisis en función de la
concentración en relación al valor de absorbancia del tubo 1 (hemólisis total en agua
destilada).
EXPERIENCIA 3: COEFICIENTE OSMÓTICO
El coeficiente osmótico esta relacionado con el número de partículas osmóticamente activas

que es capaz de dar una sustancia a una concentración dada.
Entonces, el coeficiente es el factor de proporcionalidad  que existe entre una solución
ideal y la osmolaridad real.
 = Osmolaridad real
Osmolaridad ideal
Bioq. Maricel Lozdan – Biofísica 25

Este coeficiente indica una idea de cuánto de ideal se comporta una solución. Cuánto vale 
para una solución ideal?. Conociendo los coeficientes osmóticos de tres compuestos usted
debería ser capaz de predecir que relación existiría entre los volúmenes de glóbulos rojos
suspendidos en soluciones de igual osmolaridad ideal.
TÉCNICA: COEFICIENTE OSMÓTICO
Colocar en tubo de Kahn 1 ml de NaCl 0.15 M, 1ml de MgCl2 0.1 M y 1 ml de sacarosa 0.3 M,
respectivamente. Estas 3 soluciones son isotónicas idealmente. Agregar 0.3 ml de glóbulos y
tomar 2 muestras de cada uno de ellos para microhematocrito y anotar en la Tabla 3. Analizar los
resultados justificando claramente las eventuales diferencias entre ellos.
Tubo solución Concent.(M) Osmolaridad Osmolaridad  Hematocrito
Ideal (mosM) Real (mosM) %
1 NaCl 0.15 300 279 0.93
2 MgCl2 0.10 300 258 0.86
3 Sacarosa 0.3 300 307 1.02
26 Bioq. Maricel Lozdan – Biofísica

PARA GRAFICAR
PARA GRAFICAR
CADA ALUMNO DEBERÁ TRAER REGLA, LÁPIZ Y CALCULADORA.

CONCEPTOS TEORICOS
ELECTROFORESIS
Es la migración de una partícula cargada cuando está bajo la influencia de un campo eléctrico
externo.
(+) (-)
v
(-)
Z (-)
Como consecuencia de la interacción de una partícula cargada en un campo eléctrico aparece una
fuerza que es proporcional a la carga de la partícula, a la carga del e - y al valor del campo
eléctrico aplicado.
Esa fuerza acelera la partícula, pero mientras mayor es aceleración, mayor el la resistencia que
aparece al movimiento de la misma (fricción). En un punto estas fuerzas se compensan y queda
definida la movilidad electroforética, que es la velocidad cte de desplazamiento de esa partícula
en el campo eléctrico.
F = Z.e-.E = v.f Z: carga neta de la partícula

e-: carga del electrón
Z .e-.E= v.f E: campo eléctrico
V: velocidad
U= V . f: coef. De fricción
E U: movilidad electroforética.
Se define (U) movilidad electroforética como la velocidad que alcanza esa partícula normalizada
por el valor del campo eléctrico.
U= V.  V= Z. e-.E.  U= Z. e-
E f f
El coeficiente de fricción depende del tamaño de la partícula, y de la viscosidad del medio.
Si se coloca una molécula pequeña, de PM conocido, cargada eléctricamente, que tenga debido a
su tamaño gran movilidad, ésta migrará más que las demás proteínas y marcará el frente de
migración. Generalmente se utiliza un colorante para que se pueda observar macroscópicamente.

Se pueden establecer relaciones entre la velocidad de migración del colorante (d) y de las
restantes proteínas (i), lo que es directamente proporcional a relacionar las distancias de
migración de las mismas.
Rf : Ui = di . Ui: movilidad electrof. Prot. i

Ud dd Ud: movilidad electrof. Del marcador de frente
di: distancia migrada por la prot.

dd: distancia migrada por el marc. de frente
Se puede demostrar que también:
Log Rf= log Rfº - Ki. C Ki: cte que depende del PM
C: concentración del gel
Mientras más gel se coloca para fabricar el soporte, mayor es el entrecruzamiento que se logra y
más difícil será para la proteína migrar sobre el gel.
Los siguientes gráficos muestran la recta que se obtiene al graficar log Rf vs C, y la información
que de ellos se puede sacar acerca del PM de la proteína.
Si observan, la ecuación:
Log Rf = - Ki . C + log Rfº
Y = -ax+b
Es la ecuación de una recta, con pendiente negativa, donde la pendiente está relacionada al PM
de la proteína.
A B
log Rf
log Rf
C
C

En el grafico A se observan tres proteínas de igual PM, (misma pendiente), pero diferente
distancia de migración (Rf), esto se debe a la diferencia de cargas entre ellas.
En el grafico B, observamos que las tres proteínas, tienen la misma velocidad de migración, pero
que sus pesos moleculares son diferentes.
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
Es un método analítico de alto poder resolutivo que combina la migración en un campo eléctrico y
el tamizado molecular a través del gel de corrida. El poro del gel desempeña un papel
fundamental. En algunos geles como la agarosa, los poros son lo suficientemente grandes como
para no retener a la mayoría de las moléculas proteicas que migran, por lo tanto la separación en
este tipo de geles dependerá de la carga neta de las proteínas. Además, dado que se trata de un
compuesto natural, sus poros no son homogéneos.
En el caso de geles de poliacrilamida pueden conseguirse poros de distintos diámetros según las
condiciones de polimerización. Como consecuencia para un gel de determinado poro, el tamaño
molecular y la carga neta serán los factores determinantes de la separación de las moléculas de
la mezcla.
La electroforesis en geles de poliacrilamida puede desarrollarse también usando soluciones
buffer que contienen sustancias disociantes, en especial detergentes no iónicos. Una de las más
usadas es el Dodecil Sulfato de Sodio (SDS), las proteínas a analizar son hervidas a 100º en
presencia de un exceso de SDS y 2-mercaptoetanol. En esas condiciones el diol rompe los
puentes disulfuros que pudieran existir y el agente desnaturalizante (SDS) hace que la proteína
se desdoble, solo mantiene su estructura primaria.
El SDS se fija en una proporción constante, (1,4 gr. de SDS / gr. de polipéptido).
A causa de ello la carga intrínseca del péptido se hace insignificante ante el exceso de carga
negativa del SDS, como consecuencia la carga de todas las moléculas serán prácticamente
idénticas. Su desplazamiento en un campo eléctrico en el que el soporte es un gel de
poliacrilamida de determinada porosidad dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.
DETERMINACIÓN DE PM RELATIVOS MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE

POLIACRILAMIDA EN PLACA
Si se corren en diferentes caras de una misma placa, péptidos de PM conocido que previamente
fueron hervidos en presencia de SDS y 2-mercaptoetanol sustancias cuyo PM se desconoce,
previamente sometidas al mismo tratamiento, es posible conocer los PM de dichas sustancias.
Ello puede hacerse determinando la movilidad relativa de la proteína que nos interesa y
midiéndola con referencia a una proteína estándar o a un colorante trazador. Generalmente se
hace respecto del colorante trazador que se incorpora al gel.

t1
(-)
t2 (+)
t3
Rf = Distancia migrada por la proteína. Colorante
Distancia migrada por el colorante.
Si se determina la relación de frente de distintos péptidos de PM conocido, con los datos

obtenidos es posible grafica log PM vs. Rf de una sustancia en análisis puede calcularse su PM
relativo por interpolación en la curva
Rf
 Rf: relación de frente

t1 (PM) t2 t3 Log PM
GELES EN GRADIENTE
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de

acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño de poro,
pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida.
Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el 30% de acrilamida en gradientes
lineales o cóncavos. El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas a separar. En un
gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza una zona donde el tamaño de poro impide
cualquier avance. Una vez se alcanza el 'límite de poro' no se produce una migración apreciable
aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve
mejor las bandas pues las concentra en regiones muy estrechas. Otra es que incrementa el rango
de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una
concentración fija.
Los geles en gradiente se polimerizan a partir de un formador de gradientes. Una de las

precauciones que se suele adoptar es la inclusión en la solución de polimerización de glicerol o
sacarosa para aumentar la densidad de las soluciones y evitar las mezclas en el proceso de
preparación del gradiente.

ISOELECTROENFOQUE.
Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las

moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas anfotéricas,
como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un
gradiente de pH. La región del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina.
Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las

moléculas que se han de separar tenga su punto
isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que
inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a
su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y
migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se
encuentran en medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y

migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con su
punto isoeléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas
anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL.
La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus dos
propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la
separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según
peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
Geles de electroforesis bidimensional

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Los principales factores que afectan la migración de las proteínas durante la electroforesis son
las siguientes:
1- FUERZA DEL CAMPO ELÉCTRICO (E)
Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico.
Su unidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína
puede ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el
potencial eléctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza
direccional (Fa) y de la carga neta de la molécula (Q). Puede ser calculada a través de la siguiente
fórmula:
E = Fa/Q
E= v/d
Donde:
Fa = Fuerza direccional.
v = voltios.
d = distancia de los electrodos (en centímetros)
Q = carga en (coulomb)
2- TEMPERATURA
Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la concentración de sales (poder de
conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto
"sonrisa" o smiling (Figura).

3- CARGA NETA DE LA MOLÉCULA
La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada proteína
una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminoácidos.
Debido a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico,
la migración de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso
molecular. Para evitar este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas
aprovechando sus propiedades anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias
de carga entre las proteínas, a fin de favorecer la separación de ésta únicamente por su peso
molecular.
4- TAMAÑO Y FORMA DE LA MOLÉCULA

Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante
la electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones
postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generan
modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento del
análisis.
Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioquímica de una proteína no caracterizada,

previamente deberá estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el
análisis de la proteína por electroforesis.
FUENTES DE ERROR EN LA ELECTROFORESIS.
La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores
experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, velocidad de
la polimerización, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparación de
las muestras.
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA DE PROTEINAS PLASMATICAS
La electroforesis que se lleva a cabo para separar las proteínas plasmáticas en un laboratorio de
análisis clínicos se realiza comúnmente sobre un soporte de acetato de celulosa y utilizando un
buffer de ph entre 8.6 y 9.
En estas condiciones, las proteínas séricas tienen cargas negativas y migran hacia el ánodo
separándose en 5 fracciones conocidas como albúmina, 1-globulina, 2- globulina, -globulina y
-globulina.
La albúmina es la más pequeña de las proteínas plasmáticas, por lo tanto es la de mayor frente de
migración, seguidas por 1-globulina, 2- globulina-globulina y globulina.

Patrón de una corrida electroforética de suero
humano en acetato de celulosa
No debe interpretarse cada fracción como una sola proteína, sino como un conjunto de proteínas
que comparten las mismas características de migración en estas condiciones.
Pertenecen a las distintas fracciones las siguientes proteínas, entre otras:
1-globulina: 1-antitripsina (inhibidor de las proteasas),

Globulina GC o DBP (Fija vit. D)
1-glucoproteína ácida u Orosomucoide (Proteína de fase aguda)
2- globulina: 2-macroglobulina (inhibidor inespecífico de las proteasas),

Haptoglobina (fija hemoglobina libre en plasma)
Ceruloplasmina (transporte de Cu)
Colinesterasa (desdobla la acetil-colina)
Antitrombina (inhibe la trombina)
globulina:LDL (lipoproteína de baja densidad)

Transferrina: (Transporte de Fe)
Complemento C3
Hemopexina (Se fija al hemo)
Proteína C reactiva o PCR (Reactante de fase aguda)
Plasminógeno
-globulina: IgA, IgG, IgM, IgE, IgD
En el suero humano se han identificado más de 300 proteínas diferentes que cumplen funciones
diversas. El examen de dichas proteínas puede proporcionar información que refleja procesos
patológicos de distintos orígenes orgánicos.
Desde que se introdujeron las técnicas de electroforesis, el estudio de las proteínas en líquidos
biológicos permitió establecer una serie de perfiles para el diagnóstico de múltiples situaciones
patológicas.
En el siguiente cuadro se muestran las patologías más probables asociadas al aumento o
disminución de las diferentes fracciones proteicas del suero.

INTERPRETACIÓN DEL PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO
FRACCIÓN AUMENTA DISMINUYE

Deshidratación Enfermedad hepática
Estado de shock Enfermedad renal
Albúmina Infección crónica
Desnutrición
Hemorragias
Reacciones inflamatorias Deficiencia hereditaria de 1-
Hiperlipemias antitripsina (los homocigotos
1-globulina Embarazo tienen ausencia de esta banda)
Inflamación aguda y crónica Enfermedad hepática

Síndrome Nefrótico Anemia hemolítica
2-globulina IAM Anemia megaloblástica
Enfermedad de Hodgkin
Asma y alergias
Nefrosis
Hiperlipemias
-globulina Anemias por deficiencias de Fe
Hipergamaglobulinemia Inmunodeficiencias
Enfermedad hepática Edad avanzada
-globulina Enfermedades autoinmunes. Leucemia linfática crónica
Infecciones virales Nefrosis
Mieloma Enteropatías Exudativas
A continuación se muestran las electroforesis y sus respectivos densitogramas en diferentes

cuadros patológicos. Un densitograma es un procedimiento que registra la intensidad de la
tinción en los distintos sectores del material soporte coloreado, se obtiene un trazado que
dibuja una serie de ondas en correspondencia con cada una de las bandas.

PROTEINOGRAMA NORMAL

Presencia de banda monoclonal en la Incremento policlonal de las -globulinas.
región de las -globulinas.
Marcado aumento de la fracción leve incremento de la fracción

Alfa-2 globulina, con descenso de alfa2globulina
las gama globulinas.

Descenso de la fracción albúmina, leve incremento de la fracción alfa2globulina,
unión bandas beta-gamaglobulina moderado incremento de la fracción
gamaglobulina
Leve incremento de la fracción alfa2 globulina, franco descenso de la fracción albúmina, con descenso de
las gamaglobulinas

TRABAJO PRÁCTICO N2
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
CUESTIONARIO DE ORIENTACIÓN: Evalúe con este cuestionario su preparación teórica
1- Concepto de electroforesis.
2- Acerca de la electroforesis en geles de poliacrilamida, indique:
a- Principio de separación
b- Fase móvil y estacionaria
c- Concepto de Rf o migración relativa.
d- Condiciones desnaturalizantes: SDS, urea, mercaptoetanol.
3- Si se tiene una mezcla compleja de las siguientes proteínas con los siguientes PM
Hemoglobina PM= 66 KDa Quimiotripsinógeno PM= 23 KDa

Inmunoglobulina G PM= 150 KDa G fosforilasa PM= 370 KDa
En que orden migraran en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes son SDS?
Proteínas Séricas
El plasma sanguíneo es el medio líquido en el cual están suspendidos los elementos formes de
la sangre (glóbulos rojos, leucocitos y plaquetas). La concentración total de proteínas en el
plasma humano normal varía de 6 a 8 g/dl.
Los primeros métodos de fraccionamiento de proteínas por precipitación con sales
permitieron separar dos grupos principales de proteínas: albúmina y globulinas.
Entre las globulinas se aisló una fracción de menor solubilidad llamada fibrinógeno, que
participa en el proceso de coagulación de la sangre.
Para obtener plasma completo debe agregarse a la sangre un agente anticoagulante, pues si
se deja coagular, el fibrinógeno se convierte en fibrina y ésta forma la red que aprisiona los
elementos formes. Después de la retracción del coagulo se separa un líquido amarillento, el suero
sanguíneo. (Plasma desprovisto de fibrinógeno).
A un determinado PH, los diferentes componentes proteínicos de una mezcla compleja como
el plasma pueden manifestar cargas eléctricas de distintos signo y magnitud. Por esta razón
migran con distinta velocidad hacia uno u otro electrodo cuando se establece un campo eléctrico
en el medio. En esto se basa la electroforesis, método de separación ampliamente utilizado en el
estudio de proteínas de muestras biológicas.

Los métodos mas difundidos utilizan papel de filtro, acetato de celulosa o gel de agar
como medio soporte sobre el cual se realiza la migración. En razón de su simplicidad, el método
sobre acetato de celulosa es el más utilizado en la práctica corriente del laboratorio clínico.
En general, en esos medios se separan cinco fracciones proteínicas en el suero sanguíneo.

Estas fracciones se denotan como bandas cuando se tiñe, mediante un colorante especifico para
proteínas, el material sobre el cual se ha realizado la migración. La intensidad de la coloración y
la amplitud de cada banda son proporcionales a la cantidad de proteína contenida en cada
fracción.
Por densitometría, un procedimiento que registra la intensidad de la tinción en los
distintos sectores del material soporte coloreado, se obtiene un trazado que dibuja una serie de
ondas en correspondencia con cada una de las bandas.
La superficie de cada onda es proporcional a la intensidad de color y tamaño de las bandas

originales. La medición de esas superficies permite determinar la proporción o distribución
relativa de proteínas en cada fracción. Este tipo de trazado suele designarse proteinograma
electroforético.
Habitualmente la separación se realiza a PH 8,6. En estas condiciones, todas las proteínas

séricas poseen cargas negativas y, por lo tanto, migran hacia el ánodo. La fracción mas rápida es
la albúmina y detrás de ella marchan las globulinas, separadas en cinco fracciones 1, 2,  1,  2 y
, en orden decreciente de movilidad.

Mediante electroforesis sobre acetato de celulosa de proteínas del suero normal se obtiene la
distribución relativa de las fracciones. La sgte tabla presenta los valores normales.
FRACCIÓN RANGO PROMEDIO

Albúmina 47 a 70 % 59.0 %
1- globulina 3a7% 4.5 %
2- globulina 5 a 12 % 9.0 %
1-globulina 5 a 16 % 12.0 %
 2- globulina 10 a 20 % 15.5 %
- globulina 3a7% 4.5 %
Fracciones proteicas del suero separadas por electroforesis en acetato de celulosa (los valores
indican porcentaje del total de proteínas).
En las técnicas de electroforesis hasta aquí mencionadas, el único factor determinante de la

separación de las proteínas es la carga eléctrica. La obtención de estas fracciones no debe
interpretarse como índice de la existencia de solo cinco proteínas diferentes en el suero. Cada
una de esas fracciones, sobre todo las globulinas, es en realidad una mezcla de distintas
proteínas que migran juntas porque poseen la misma carga neta.
TÉCNICA PARA ELECTROFORESIS
Materiales requeridos
 Buffer Veronal ph= 9.2

 Veronal Sódico 8.4 g
 Agua destilada csp 1000 ml
 Solución colorante
 Amido Schwartz 500 mg
 Sol. de lavado 100 ml
 Solución de lavado
 Metanol 475 ml
 Ac. Acético 5 ml
 Agua dest. 475 ml
Soporte: Tiras de acetato de celulosa

PROCEDIMIENTO
 Sumergir las tiras de acetato de celulosa en el buffer durante 15´.

 Secar las tiras con papel de filtro, acomodarlas en el soporte y realizar la siembra a 1 cm
del cátodo con semi-micro.
 Colocar la tira ya sembrada sobre el soporte de electroforesis.
 Hacer puente con papel de filtro para cerrar el circuito.
 Encender la fuente para establecer el campo eléctrico.
 Después de la electroforesis las tiras se colorean:
 Sumergir las tiras 10 segundos en amido Schwartz.

 Decolorar hasta que desaparezca el color de fondo.
CUANTIFICACIÓN DE LAS BANDAS
Método por elusión de las fracciones:

 Colocar 5 tubos rotulados Albúmina, 1, 2 ,  1, 2 y .
 Colocar en cada uno de ellos la cantidad que se detalla a continuación de Ac. Acético al 80
%.
ACIDO ACETICO AL 80 %
Albúmina 8 ml
1 globulina 4 ml
2 globulina 4 ml
1 globulina 4 ml
 2 globulina 4 ml
 globulina 4 ml
Nota: El tubo de la albúmina lleva el doble de rvo para conseguir que la absorbancia entre dentro
de la linealidad del fotómetro. Tener en cuenta que al estar diluido el doble que las demás
fracciones, se deberá multiplicar por el factor de corrección 2 para realizar correctamente los
cálculos.

 Cortar cuidadosamente las fracciones del proteinograma y sumergirlas en su
correspondiente tubo.
 Mezclar vigorosamente hasta desaparición del acetato de celulosa.
 Medir la Abs de c/u de los tubos a  = 620 nm. Anotar
ABSORBANCIAS
ALBÚMINA x 2
1-globulinas
2-globulinas
1 globulinas
2 globulinas
 globulinas
La suma de las Absorbancias corresponde al 100 % de las proteínas plasmáticas.
100 %
Su JTP le dará el valor de proteínas totales de su muestra.
Teniendo en cuenta el porcentaje de Abs de cada fracción obtenga el % que representa del total
de proteínas y calcule el valor absoluto de cada fracción en el plasma.
Comparando con la tabla antes expuesta en la guía de TP. Son normales estas fracciones?. Si no
lo son, que patología le sugiere?

CONCEPTOS TEORICOS
MÉTODOS DE SEPARACIÓN
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es una técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de
desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil
(liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual
puede ser sólida o líquida.
Hay que indicar que el nombre de la técnica es incorrecto. Este nombre proviene de la primera
experiencia cromatográfica realizada, la cual se utilizó para separar pigmentos coloreados de
plantas. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett
en 1903. Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas
verdes en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de
una probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilización de esta técnica hasta 1930
cuando khun y Lederer separaron también pigmentos de las plantas usando como adsorbentes
alúmina y carbonato de calcio. Fue a partir de ahí cuando se inicio el verdadero desarrollo de la
cromatografía.
Para explicar el fenómeno cromatográfico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno
remoto y otro próximo.
Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o

físico químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos
finamente divididos), volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o bioquímica, etc. La mezcla
de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de
estas propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos
diferentes como ocurre en cromatografía líquido − líquido.
Deben cumplirse las condiciones siguientes:
 Los componentes de los sistemas empleados deben estar en íntimo contacto entre si.
 El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo más completo posible.
Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies
presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico − químicas frente a un
sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se
basa la separación cromatográfica.
Si se transforma la idea del equilibrio estático establecido entre las dos fases en un equilibrio
dinámico, se tiene la realidad del fenómeno cromatográfico. Como se ha indicado anteriormente,
una de las fases, denominada fase móvil, fluye a través de la otra, a la que se denomina fase
estacionaria, que permanece inmóvil, y que, al menos en una extensión esta en equilibrio con la
fase móvil.

Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y con
respecto a la fase móvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatográficas
para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separación
cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la velocidad de migración de los mismos.
La cromatografía es una técnica de separación de los componentes de una mezcla por su

distribución entre una fase móvil y una fase estacionaria. Los componentes de la mezcla son
llevados a migrar diferencialmente por medio de la combinación del flujo de la fase móvil (un
líquido o un gas) y las interacciones de ellos con la fase estacionaria. Las interacciones con la
fase estacionaria incluyen: adsorción, partición, exclusión por tamaño e interacciones
electrostáticas.
CLASIFICACIONES:
Para clasificar globalmente los procesos cromatográficos es necesario atender a dos criterios
básicos: Fundamento del proceso cromatográfico, lo que conduce a los tipos de cromatografías y
forma de realizar el proceso cromatográfico, es decir, lo que constituye las distintas técnicas
cromatográficas.
TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS:
Si es un sólido, cabe distinguir entre:
 Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en

fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals)
 Cromatografía de cambio iónico: el sólido es un cambiador de iones (fuerzas
electrostáticas)
 Cromatografía de exclusión (o de geles), el sólido es un gel formado por polímeros no
iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.
 Cromatografía de afinidad: es un tipo especial de cromatografía de adsorción, utilizada
especialmente en bioquímica, en la que un sólido tiene enlazado un llamado
ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador enzimático o un anticuerpo. Si
es un líquido que se encuentra soportado en un sólido inerte, se trata de la Cromatografía
de partición. El soluto se reparte entra la fase móvil (liquido o gas) y la fase estacionaria.
Según la naturaleza de la fase móvil, la técnica cromatográfica correspondiente recibe el nombre

de dicha fase móvil:
Si es un líquido, cromatografía liquida, cabe distinguir:
 Cromatografía líquido−líquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se
trata de una cromatografía de partición.
 Cromatografía líquido−sólido (CLS) en la que la fase estacionaria es sólida (adsorción,

cambio iónica, exclusión, afinidad).

Si es un gas, cromatografía de gases, puede ser:
 Cromatografía gas−líquido (CGL), que es una cromatografía de partición.
 Cromatografía gas−sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.
Si es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura

crítica, pero simultáneamente comprimido a una presión mayor que su presión critica), se trata
de la cromatografía de fluidos supercríticos (CFS), que puede ser de partición o de adsorción.
Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción
Exclusión
Cambio iónico
Afinidad
Líquido Partición
Naturaleza de fase móvil Liquido Líquido-líquido ((partición)
Líquido-sólido) adsorción, cambio iónico,

exclusión, Afinidad.
Gas Gas-líquido (CGL)
Gas-sólido (CGS)
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS:
Según la forma de llevar a cabo la separación cromatográfica, es decir, según el dispositivo
utilizado para conseguir la separación entre la fase móvil y la estacionaria, cabe distinguir dos
tipos de técnicas cromatográficas: en columna y plana.
Cromatografía en columna: Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la fase

estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil (líquido o gas) a
través de la estacionaria se consigue:
1) Por presión, 2) por capilaridad, 3) por gravedad.
Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el término de cromatografía en
columna suele aplicarse a la cromatografía liquida para distinguirla de la cromatografía plana ya
que, obviamente la cromatografía de gases solo puede realizarse en columna.

Cromatografía plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad
es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse
bidimensional. Se divide en dos tipos generales:
Cromatografía en papel: en la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria

(cromatografía de partición).
Cromatografía en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografía de
partición), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.
El flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos formas:

1) por capilaridad (cromatografía horizontal y ascendente)
2) por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente).
En la cromatografía plana queda excluido el uso de un gas como fase móvil, por lo que ésta
siempre es líquida.
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS DE USO GENERAL PARA LA SEPARACIÓN DE MEZCLAS

PROTEICAS.
Los métodos mas potentes para el fraccionamiento de mezclas de proteínas hacen uso de
Técnicas Cromatográficas en Columna, las cuales utilizan las diferencias entre propiedades de
las proteínas tales como carga, tamaño, unión a un sustrato, etc...
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Los elementos básicos de una cromatografía en columna son la fase estacionaria y la fase móvil.
La fase estacionaria la forma un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una
columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. Se utilizan columnas de vidrio rellenas de
Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio.
La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase
estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva
solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.
La mezcla proteica que ha de ser separada se coloca en una capa sobre la parte superior de la
columna y se permite que lentamente se introduzca en el interior de la matriz sólida mientras se
añade nueva solución tampón por la parte superior de la columna.
La solución proteica forma una banda dentro de la fase móvil que inicialmente corresponde al
ancho de la banda de proteína aplicada sobre la columna.
La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en
diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la
fase estacionaria.

De esta forma, la banda de proteínas se
ensancha y los diferentes tipos de proteínas se
separan gradualmente, formando bandas dentro
de la banda total de proteínas. La separación, y
por tanto la resolución, aumenta con la longitud
de la columna. Sin embargo, cada banda
individual de proteína también se ensancha con
el tiempo debido a procesos difusionales,
disminuyendo por tanto la resolución.
PRINCIPALES MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS UTILIZADOS EN LA PURIFICACIÓN DE

PROTEÍNAS
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

La cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, es una
cromatografía que separa estrictamente sobre la base del tamaño molecular. La matriz de la
columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las
proteínas de mayor tamaño migran a lo largo de la columna más deprisa que las de pequeño
tamaño, ya que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y
por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las
proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna se hace más
lenta, ya que tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en el interior de las bolas de
polímero en su marcha a lo largo de la columna.

RELLENOS DE COLUMNA.
Se encuentran dos tipos de rellenos: partículas poliméricas y partículas de sílice; en ambos casos
los diámetros oscilan de 5 a 10 µm.
SÍLICE: tienen una gran rigidez, lo que facilita el relleno; permite una mayor estabilidad;
permite el uso de una gran variedad de disolventes incluyendo el agua; una equilibración más
rápida y una buena estabilidad a elevadas temperaturas. Los inconvenientes de las partículas de
sílice son su tendencia a retener solutos por adsorción y su capacidad para catalizar la
degradación de las moléculas del soluto.
Las partículas de vidrio y de sílice tienen tamaños promedio de poro que oscilan entre 40 Ǻ y
2500 Ǻ.
En un principio se llevó a cabo fundamentalmente utilizando como copolímeros estireno-
divinilbenceno. El tamaño de poro en estos polímeros se controla por el grado de
entrecruzamiento entre las cadenas poliméricas.
Los geles de estireno-divinilbenceno son hidrofóbicos y de este modo sólo pueden utilizarse con
fases móviles no acuosas. Sin embargo, en la actualidad se dispone de geles hidrofílicos que
hacen posible el uso de disolventes acuosos para la separación de moléculas grandes solubles en
agua, como los azúcares, siendo estos geles por lo general de poliacrilamidas.
De todos los geles , uno de los mas usados es que resulta del entrecruzamiento de moléculas de
dextrano, este producto conocido comercialmente con el nombre de Sephadex esta constituido
por partículas de distinta porosidad según el grado de entrecruzamiento, para los diferentes
geles el limite de exclusión corresponde al peso molecular del soluto que emerge con el volumen
que se encuentra en los espacios interparticulares, o sea el soluto de mayor PM incapaz de
penetrar a través de los poros de la partícula filtrante.
Los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro, el tamaño de
la partícula y el flujo de elusión. Los diferentes tipos de partículas usadas deben cumplir unos
requisitos: estabilidad mecánica, estabilidad química, bajo contenido en grupos iónicos y
uniformidad de poro y tamaño.
Los compuestos se dividen en cuatro grupos: derivados de dextranos ( Sephadex), derivados de

agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P.) y esferas de vidrio.

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO.
Algunos conceptos:
(VT ): Volumen de líquido que ocupa los espacios interparticulares más el volumen de líquido de
inhibición de las partículas.
Se puede medir con solutos pequeños como el (SO4)2Cu o CoCl2 que penetran en las partículas
filtrantes a través de los poros, retardan su salida y aparecen en un volumen de elusión igual a V t.
V = Volumen de retención o de elusión.

e
V = Volumen de la fase móvil (Volumen de la fase intersticial), es el volumen de elusión que se
0
determina haciendo pasar por la columna una molécula grande e inerte. Este volumen se puede
medir con moléculas de alto peso molecular como el azul de dextrano de PM 1 KD.
V = Volumen de la fase estacionaria
s
Kav = Coeficiente de reparto (cociente entre la concentración de soluto en la fase estacionaria y
concentración en la fase móvil)
La ecuación: V = V + KV se puede escribir como:

e 0 s
K = (V – V )/ V
e 0 s
Sabiendo que el coeficiente de reparto promedio es proporcional a K:
K = (V – V )/( V – V )
av e 0 t 0
 Para las moléculas grandes que no penetran en el gel: V = V porque no penetran en los
e o
poros y no son retenidas y K = 0.
av
 Para las pequeñas que penetran libremente en el gel: V ≈ V y K ≈ 1.
e t av
(V = Volumen total de la columna).
t
 Para las moléculas de tamaño intermedio, que pueden penetrar en algunos poros del gel
pero no en otros, K se situará entre 0 y 1.
av
CTE DE AVERAGE (Kav):

Coeficiente de partición relativo entre la fase estacionaria y la fase móvil de una proteína que ha
sido eluída a través de una columna. Es directamente proporcional al volumen de elusión (Ve) de la
proteína e independiente del tamaño de la columna y del compactamiento del gel.
Kav = Ve – Vo .
Vt – Vo

Este cociente es característico y cte para cada proteína.
D.O
Ve=Vo Ve=Vt ml de eluído
El valor de Kav está comprendido siempre entre 0 y 1.
0< Kav < 1 Kav = 0  Ve = Vo

Kav = 1  Ve = Vt.
El volumen de elusión de una proteína es inversamente proporcional a su tamaño, y se puede

utilizar al mismo para calcular en PM de una dada proteína,
Ve  1 .
PM
Kav
Log PM
Kav log PM

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.
La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o

capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la
columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido
covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando
son lavadas o eluídas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la
columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro
compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.
Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de

naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras
moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos
adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera
reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la
biología molecular.
FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante

cromatografía de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza
biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la
sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe
interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada
que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra
mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce
una nueva fase móvil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos
del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH

que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez
finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace
mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.
La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen

de otros tipos de cromatografía líquidas
 Alta selectividad en el mecanismo de retención
 Campo de aplicación restringido
 Separación de un solo soluto analito
 Empleo de sistema de baja presión
 Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica
LIGANDOS DE AFINIDAD
Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido
inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Pueden
considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas
biológicas o bien moléculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas
bioquímicas, respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la
retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos
grandes grupos: Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un
solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos
bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.
Esquema de un cromatograma de afinidad.

SOPORTES
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de
afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano controlable,
porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas
de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los
polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.
INMOVILIZACIÓN DE LIGANDOS
La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene
connotaciones específicas.
El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos
covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos
posible de la zona activa de bioadsorción.
El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando
bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales:
Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie
de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos
superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de
cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Según el tipo de matriz se originan grupos diferentes:
ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones uno o dos grupos
hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego
sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo,
fundamentalmente con el soporte activado.
MÉTODOS DE ELUCIÓN
Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta la

forma de eliminar los solutos de la columna, cabe distinguir los procedimientos generales de
elución como:
Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado

inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que
interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el
ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una
elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o
no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elución
bioespecífica la normal y la invertida.

La elución normal: se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente. El
analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso
molecular, y eluída con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia
por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluída. Ejemplo, la purificación de
la lectina.
La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una

biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase
móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para
purificar glucoproteína.
En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la desnaturalización del ligando inmovilizado,

del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios
activo, de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o
varias de las causas que la provocan.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.
La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados,
teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es
generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio
iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a
un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta
influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que
compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz
cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase
móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

Esta forma de cromatografía utiliza fases estacionarias que poseen cargas formales (+) ó (-). El
mecanismo más común de retención es el intercambio de iones de la muestra A y de la fase móvil B
con los grupos cargados de la fase estacionaria R.
INTERCAMBIO ANIÓNICO
A - + R+ B -  R+ A - + B -
INTERCAMBIO CATIÓNICO
A+ + R- B+  R- A+ + B+
Los iones de la muestra compiten con los de la fase móvil por los sitios iónicos de la fase
estacionaria.
Los iones de la muestra que interaccionan débilmente con la fase estacionaria serán débilmente
retenidos, mientras que los que lo hacen fuertemente serán más retenidos y fluirán más tarde, la
principal fuerza de interacción es la electrostática.
Para efectuar la separación de los componentes, se controla el grado de ionización de la muestra
por variaciones del PH de la fase móvil.
RESINA INTERCAMBIADORA CATIÓNICA
Punto. Carga a Carga a

Proteínas
Isoeléctrico PH= 10 Ph= 8
P1 5 (-) (-)
P2 8 (-) q=0
R R R CARGA (-)
  
+ +
H3N – C – H  H3N – C – H  H2N – C – H
  
COOH COO - COO-
PI PH
Otros factores que controlan la retención además del PH son:
Carga del ión de la muestra CARGA (+)
Fuerza iónica de la fase móvil

Carga del contraión de la fase estacionaria
Las fases estacionarias de intercambio iónico mas comúnmente usadas contienen un grupo de ácido
sulfónico (SO3)- , donde el contraión protón (H+) puede ser intercambiados por iones
positivamente cargados de las moléculas de la fase móvil.

Una de las fases de intercambio catiónico mas débil es la del grupo COO- , H+, utilizado
comúnmente para la separación de proteínas.
La fase de intercambio aniónico mas utilizada es el grupo amonio cuaternario (-CH2 -N+-(CH3)3 Cl-)
; el anión Cl- es intercambiado con aniones en el soluto o en la fase móvil. Una fase estacionaria
aniónica más débil es la que posee el propio grupo amonio protonado
(-N+-H-(R)2 Cl-).
La medida de los iones contrarios que puede intercambiar una resina constituye se capacidad. Lo
que dependerá del nº de grupos cargados que la resina posea.
CAPACIDAD TOTAL: Cantidad de grupos cargados y potencialmente cargados por gr. de resina.
CAPACIDAD APARENTE (medible): La capacidad determinada experimentalmente depende de la
accesibilidad de los grupos funcionales, de la fuerza iónica, PH, temperatura del eluyente,
naturaleza de los iones contrarios, etc.
-OCH2-COO- + H2O  -OCH2-COOH + OH-

 
Kb = (OH-) (forma ácida) .

(forma básica)
 PH para  capacidad
al POH = PKb la resina tiene el 50% de su capacidad.
CROMATOGRAFÍA PLANA
La cromatografía plana es un tipo de cromatografía liquida en la que la fase estacionaria está
extendida sobre la superficie de un plano y la fase móvil fluye a través de ella. La fase móvil
siempre es un líquido, mientras que la fase estacionaria puede ser un líquido absorbido en un sólido
(cromatografía de partición) o un sólido sorbente (cromatografía de adsorción, cambio iónico o
exclusión). El flujo de la fase móvil se produce:
 Por capilaridad (cromatografía horizontal y ascendente)

 Por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente)
Esta clase de cromatografía es considerada la más simple de todas las técnicas cromatográficas.
La diferencia principal con la cromatografía en columna es de tipo técnico, es decir, difieren en la
forma de soportar la fase estacionaria. En lo que se refiere al fenómeno en que se fundamenta la
separación, es el mismo para ambas técnicas.

En la cromatografía plana, la disolución de la muestra a separar se sitúa sobre el plano que
contiene la fase estacionaria en forma de mancha, o a veces de banda, a corta distancia de uno de
los extremos de dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el extremo del plano próximo a la
misma se pone en contacto con la fase móvil, manteniendo todo el sistema cromatográfico en una
cámara cerrada. La separación se produce por migración diferencial de los componentes de la
muestra en la dirección en que se mueve la fase móvil.
Generalmente, a diferencia de la cromatografía en columna, en cromatografía plana el analito no
abandona el lecho cromatográfico, de forma que el proceso se detiene cuando la fase móvil ha
alcanzado una determinada zona del plano.
Cabe distinguir dos tipos de cromatografía plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF).
La cromatografía en papel tuvo su máximo desarrollo en, los años cincuenta pero en la actualidad
se encuentra prácticamente eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y versatilidad de la
cromatografía en capa fina.
Aproximadamente sólo el 4% de las publicaciones sobre las distintas técnicas cromatográficas se
dedican a la cromatografía en papel. En esta técnica, la celulosa actúa como soporte de la fase
estacionaria que suele ser agua (cromatografía de partición). No obstante, también existen en el
comercio papeles impregnados (como gel de sílice o alúmina, con silicona para separaciones en fase
invertida, con cambiadores iónicos) o tratadas químicamente (grupos cambiadores incorporados al
esqueleto polimérico de la celulosa), que amplían la aplicabilidad de esta técnica.
En cromatografía en capa fina, un sólido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende
en forma de capa sobre el plano de una superficie rígida, normalmente una capa de vidrio o
polietileno, de forma que la fase móvil fluye a través del mismo. Dependiendo de las
características del sólido utilizado, la cromatografía será de partición, adsorción, cambio iónico o
exclusión.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la (CCF) era considerada una técnica cualitativa simple y
rápida, para separar mezclas no demasiado complejas, pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba
una pobre alternativa frente a otras técnicas cromatográficas como la CLAR. Sin embargo,
actualmente, debido a los cambios introducidos en esta técnica, en lo que se refiere a la calidad de
los sorbentes, equipos para aplicar y la muestra y sistemas de detección, el interés por la CCF ha
vuelto a renacer, siendo considerada una técnica útil para separar y determinar cualitativa y
cuantitativamente mezclas complejas a nivel de trazas. Estos cambios han llevado a modificar el
nombre de la técnica, denominada cromatografía en capa fina de alta resolución (CCFAR o HPTLC
en la bibliografía inglesa), al igual que ocurrió cuando se mejoró la capacidad de resolución de la
cromatografía líquida en columna, pasando a denominarla cromatografía líquida de alta resolución
(CLAR o HPLC).
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Se basa en la afinidad del soluto por la fase móvil y la estacionaria. El tipo de adsorbente presenta
partículas chicas y está adherido a un soporte de vidrio, papel o plástico.
El solvente no eluye sino que asciende por la placa cuando se la coloca en la cuba cromatográfica
que contiene la fase móvil. El método de separación puede ser adsorción o partición.

Las sustancias menos polares avanzan más rápido que las polares. Depende del sistema, del
adsorbente, del solvente, del espesor de la capa adsorbente, de la cantidad de material sembrado,
etc.
Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se aplica por
medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o
mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de diferentes fuerzas (Fuerzas de Van der.
Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más utilizados son gel de
sílica, alúmina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan
laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia:
f254 ó f366.
La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse

saturado el eluente (Fase Móvil líquida). El eluente ascenderá o desplazara por capilaridad en la
placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” que representan a los
componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a
las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar
a la separación.

Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de métodos químicos en el
que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de
Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de
métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen
comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo
se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas
patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de
transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la
sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.
El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatográfico en el tanque
cromatográfico.
DIFERENCIAS ENTRE CROMATOGRAFÍA PLANA Y EN COLUMNA:

Aunque con algunas modificaciones, los principios teóricos de la cromatografía en columna pueden
ser aplicados, en general, a la cromatografía plana. Las diferencias entre estas técnicas hay
buscarlas en la distinta configuración de ambos sistemas cromatográficos ya que la cromatografía
plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que la cromatografía en columna es un
sistema de lecho cerrado. Sobre esta base pueden indicarse las diferencias siguientes En la
cromatografía plana la separación se realiza por distancias mientras que en columna se hace por
tiempos (o volúmenes).
En cromatografía plana la velocidad de la fase móvil solo puede controlarse indirectamente ya que
esta gobernada por fuerzas capilares que son las que permiten el paso de dicha fase a través del
lecho cromatográfico. Por el contrario, en cromatografía en columna la velocidad de la fase móvil
puede controlarse fácilmente, dependiendo del gradiente de presión mantenido a través de la
columna.
El tiempo que dura la separación esta determinado por el tiempo necesario para que el frente del
disolvente llegue a una zona determinada del lecho cromatográfico y es independiente del camino
recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografía en columna, cada soluto debe
atravesar completamente la longitud de la columna, por lo que el tiempo que dura la separación
esta determinado por el tiempo que tarda el componente mas lento en llegar al detector.
En lo que se refiere a la forma de llevar a cabo el proceso de separación, en cromatografía en
columna la separación de varias muestras, se realiza de forma secuencial, es decir, cada una de
ellas debe someterse individualmente al mismo proceso de introducción en la columna, separación y
detección, además de proceder a reequilibrar la columna antes de introducir la siguiente muestra.
En cromatografía plan por el contrario, la separación de varias muestras se realiza de forma
simultánea, siendo todas ellas sometidas al mismo tiempo al proceso separativo. Esto supone un
ahorro de tiempo considerable ya que en cromatografía en columna la duración de separación de
varias muestras será la suma de los tiempos parciales necesarios para cada separación individual.

La elección de la fase móvil en cromatografía plana se realiza dé forma que de la separación
requerida, no importando que algunos componentes de la muestra queden en el origen, ya que las
placas se desechan después de cada separación. En cromatografía en columna, la fase móvil debe
elegirse de forma que eluya todos los componentes de la muestra para que no se produzca el
envenenamiento de la columna. Este envenenamiento puede suponer una perdida de tiempo
considerable hasta que se logra eluir completamente aquellos componentes que hayan podido
quedar acumulados al comienzo de la columna. Si es irreversible, el aspecto económico puede ser
de gran importancia.
Otra diferencia básica entre ambas técnicas se encuentra en la forma de llevar a cabo la
detección. Mientras que en cromatografía en columna este es un proceso dinámico, pasando cada
soluto eluído por el detector, en cromatografía plana es un proceso estático. Esta diferencia da
lugar a que la detección en la cromatografía plana sea mas difícil de automatizar que en columna,
pero también, que sea un proceso más flexible y variable. Así, en lo que se refiere a los
disolventes utilizados como fase móvil, la pureza o propiedades (Absorbentes, ácido base, etc.) de
los mismos no son tan críticos como en columna, ya que estos se evaporan completamente entre el
desarrollo y la medida. Por ejemplo, si en columna se utiliza un detector U.V., la fase móvil no debe
contener disolventes o impurezas que absorban en esta zona del espectro, mientras que esto no
supone un problema en cromatografía plana. Por otra parte, en esta técnica, es posible aumentar la
sensibilidad del proceso de detección mediante una selección adecuada de las reacciones
utilizadas para mejorar la señal medida. El sistema de detección estático permite, por ejemplo,
registrar espectros de cada soluto por separado.
En general, los solutos mas retenidos en cromatografía plana forman manchas compactas, por lo
que se detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos más retenidos en la columna
son los que dan picos más anchos menos resueltos y sensibles. Aunque normalmente se considera
que la cromatografía plana es una técnica más simple que la de columna, no es posible en la
actualidad proceder a un desarrollo profundo de este proceso separativo al igual que el realizado
en cromatografía en columna. El motivo de ello es que en cromatografía plana tanto la fase móvil
como la estacionaria no están bien definidas y se encuentran en un estado dinámico con la fase de
vapor que rodea el sistema cromatográfico. Las condiciones experimentales óptimas para realizar
la separación son, por tanto, difíciles de controlar experimentalmente. Se producen los cambios
siguientes. La fase estacionaria puede modificar sus propiedades antes y durante el proceso
cromatográfico adsorbiendo la fase de vapor antes de ser mojada por la fase móvil, o
evaporándose si dicha fase estacionaria es liquida.
Si las fases móviles y de vapor no están equilibradas, la evaporación puede producir una alteración
en la composición de la fase móvil.
La porosidad de la fase estacionaria no es uniforme, por lo que la velocidad de la fase móvil no es

constante. Así, las fuerzas capilares son mas fuertes en las zonas interparticulares mas
estrechas, produciéndose en las mismas un flujo más rápido de la fase móvil.

CROMATOGRAFÍAS
1- Qué es la cromatografía?
2- Cuál es el fundamento de la separación por cromatografía en capa fina?
3- Cuantos tipos de cromatografía conoce?
4- Qué tipos de columnas se utilizan en cromatografía de exclusión molecular?.
5- Qué es la Kav y qué información brinda?
6- Qué métodos de elusión se utilizan en cromatografía de afinidad?
7- Cómo se define capacidad total y capacidad aparente de una cromatografía de intercambio
iónico?
DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN LECITINA/ESFINGOMIELINA EN LÍQUIDO

AMNIÓTICO, POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
El síndrome de distrés respiratorio (RDS) en el R.N es un problema de gran importancia tanto

para pediatras como obstetras.
El RDS es, frecuentemente, resultado de los nacimientos prematuros, y ocasionalmente ocurre en
los nacidos a término. Está caracterizada por dificultad respiratoria causada por falta de
estabilidad alveolar, y puede llevar a la muerte por enfermedad de membrana hialina.
La necesidad de estimación de la madurez fetal por amniocentesis está especialmente indicada en

casos de finalización temprana del embarazo como en la diabetes, sensibilización RH, desordenes
hipertensivos, etc, que puedan llevar a la decisión de un nacimiento pre-término.
La edad gestacional no provee adecuada información acerca de la madurez fetal.
La evidencia muestra que los niños que desarrollan RDS carecen de sustancia que normalmente
estabiliza los finos espacios alveolares y otorga una superficie alveolar activa adecuada.
Esta superficie alveolar activa se atribuye a la presencia de una sustancia conocida como
surfactante pulmonar, que impide el colapso de los alvéolos tras la expiración, y el cual está
formado por fosfolípidos, principalmente lecitina (fosfatidilcolina).
La determinación de niveles de lecitina en líquido amniótico es un indicador sensible de la madurez

fetal. Es útil la determinación de la relación lecitina/esfingomielina.
En un desarrollo normal, las concentraciones de esfingomielina son superiores a las de lecitina
hasta las 26 semanas de gestación. Luego de esto, los niveles de lecitina son iguales o ligeramente
superiores a los de esfingomielina. Hacia la semana 34-36, un aumento rápido de lecitina indica la
madurez pulmonar, y desecha la posibilidad de padecer RDS. En este periodo, la lecitina es 4 veces
superior a la esfingomielina

Valores relativos de lecitina y esfingomielina en
líquido amniótico durante la gestación
CROMATOGRAFÍA EN PLACA
Principio de método:
Los fosfolípidos, incluidos lecitina y esfingomielina, son extraídos del líquido amniótico con una
mezcla de cloroformo-metanol, y corridos en cromatografía en placa fina.
Allí son separados utilizando cloroformo-metanol-hidróxido de amonio como solvente del sistema.
Para visualizar los lípidos, se tiñe con acetato cúprico - ác fosfórico. Tanto lecitina como
esfingomielina son identificadas por comparación con estándar y cuantificadas por densitometría.
La intensidad relativa de los spots se expresa como una relación (L/E).
Procedimiento
 Colocar en la cámara de desarrollo: 38 ml cloroformo, 14 ml metanol y 2 ml de hidróxido de
amonio (fase móvil).
 Tapar la cámara para permitir la saturación de los vapores (aprox. 5 min.), La saturación
previene la evaporación del solvente durante la migración de los fosfolípidos.
 Colocar 5 ul de la muestra sobre la placa de cromatografía. Primero adicionar 2,5 ul, el
resto después de secarse la siembra se coloca sobre el mismo lugar.
NO TOCAR LA TIRA. Es importante que el spot sea lo mas pequeño posible

 Deje secar la muestra durante 5 minutos aprox.
 Colocar la placa cromatográfica dentro de la cámara. La muestra debe quedar como mínimo
6 mm por arriba del nivel del solvente. (hasta 2 cm.).
 Dejar migrar el solvente durante 25-30 minutos.

 Quitar la placa cuando la migración sea completa .Llevar 1 minuto a estufa a 180º - 250º.
 Sumergir la tira en acetato con sulfato cúprico, y llevar nuevamente a estufa de 250º
 entre 7-10 min., hasta que se vean aparecer manchas grises.
 Identificar las bandas de lecitina y esfingomielina. Ver si el paciente es fosfatidilglicerol
(+) ó (-).
En el siguiente gráfico se muestra el patrón de migración de los distintos fosfolípidos.
Lípidos neutros
Fosfatidilglicerol y
fosfatidiletanolamina
Lecitina
Esfingomielina
Fosfatidil inositol y
Fosfatidil serina
Línea de Siembra

Resultados
Un índice L/E 1.5 ó menor inmaduro

1.5 a 1.9  en transición (esperar)
2.0 a 2.5  maduro.
Analice y discuta los resultados encontrados.
1- Según sus resultados. ¿Aconsejaría el nacimiento? ¿Porqué?

2- Averigüe cuál es la conducta a seguir si los resultados muestran inmadurez fetal y es
necesario dar término al embarazo lo antes posible

CONCEPTOS TEORICOS
FENÓMENOS DE SUPERFICIE
TENSIÓN SUPERFICIAL
Si tengo un recipiente de agua en equilibrio con el aire, como muestra la sgte figura:
Las moléculas del seno del líquido sufren fuerzas iguales en todas sus
direcciones, las moléculas de vapor de agua por su parte también están
expuestas a fuerzas simétricas, pero las moléculas que se encuentran
en la interfase sufren fuerzas asimétricas.
Obviamente las fuerzas intermoleculares que mantienen la cohesión del
líquido son mucho mayores que las de vapor, por lo tanto las moléculas de superficie
sufren una fuerza neta que tiende a llevarlas hacia el seno de la solución.
Se debe hacer un “trabajo” para mantener a la molécula en la superficie del líquido, las
moléculas de superficie tienen un contenido energético superior a las del seno de la
solución y es por ello que el líquido trata de asumir la forma que exponga menor superficie
curvando la interfase (menisco) o formando gotitas. Es sabido que la esfera es la forma
geométrica que guarda mayor volumen y expone menor superficie.
La variación de energía libre que hay que efectuar para incrementar una unidad de área de
interfase se denomina TENSIÓN SUPERFICIAL ().
A medida que aumenta la tensión superficial, el líquido tiende a exponer cada vez menos
superficie.
dGI Fuerza . Energía . a P y V ctes.

γ= = =
dA Unidad de longitud Unidad de área
Si un líquido establece entre sus moléculas fuerzas muy grandes de cohesión, tendrá que
hacer más trabajo para mantener la molécula en la superficie, entonces decimos que
tienen una gran tensión superficial. De manera que la tensión superficial es función de la
cohesión intermolecular del líquido
γ = f (cohesión entre las moléculas de los líquidos).

Cuadro comparativo:
INTERFAZ γ (mN/m)
Agua/aire 72
Etanol/aire 22
n-hexano/aire 18
Se puede observar en el cuadro que los líquidos más volátiles, menor energía de cohesión
molecular, presentan menor tensión superficial.
I
Dijimos que γ = dG
dAI
despejando: dGI = . dAI
dGI = . ∫A. dA  este es el aporte del área de interfase a la energía libre
del sistema
Considerando todos los componentes que determinan la energía libre tenemos:
dGI = -S dT + V dP +  i dni + . dAI
A T y P constante:
dGI = . dnI + . dAI (1) donde n son las moléculas en la superficie o interfase
Derivando la expresión: GI = . nI + . AI llegamos a:
dGI = . dni + dni + d . A +. dAI Para que se cumpla (1), los términos en azul deben
ser igual a cero
dni + d . A = 0 LEY DE ABSORCION DE GIBBS
Si dividimos esta expresión por el área dni + d . A = 0

A A

Tenemos que: dni + d . A = 0 ni/A = es la concentración en la superficie.
A A
Por lo tanto, nos queda que: dCI + d = 0
Se deduce de la ecuación anterior que si aumenta la concentración en la superficie, la

tensión superficial debe disminuir para que se conserve la igualdad.
Las sustancias que poseen la capacidad de acumularse en una interfase son conocidas como
TENSIOACTIVAS ó SURFACTANTES y a la propiedad se la conoce como DETERGENCIA-
COMPUESTOS ANFIFILICOS
Las sustancias anfifílicas conocidas bajo el nombre de surfactantes pueden representarse

esquemáticamente por la fórmula L-H. La parte lipofílica de la molécula (L) es en general un radical
hidrocarbonado tal como el dodecil benceno o el tridecano. Por otra parte, H representa la parte
hidrofílica o polar de la molécula, que es en general un grupo oxigenado.
Según el tipo de disociación del grupo hidrofílico en fase acuosa, se denominan surfactantes
aniónicos (H = éstersulfato, sulfonato, carboxilato..); catiónicos (H = amonio cuaternario); noiónico
(H = polímero de óxido de etileno..), o anfotérico, es decir a la vez aniónico y catiónico, como las
betaínas o las taurinas.
A pesar de la gran variedad de sustancias que corresponden a la fórmula L-H, estas poseen
numerosas propiedades en común; el comportamiento global de cada surfactante depende de la
importancia relativa de estas dos tendencias H y L.
En todo caso una solución de anfifilo presentará siempre una particularidad, que una de las partes
del surfactante tendrá afinidad para el solvente mientras que la otra no.
EFECTO HIDROFOBICO EN SOLUCION ACUOSA
Las moléculas anfifílicas presentan a menudo un fenómeno de autoasociación por interacción

hidrófoba. Estudios precisos de conductividad indican que pueden formarse dímeros o trímeros en
los cuales se minimiza la superficie de contacto entre las partes hidrófobas (L) y el solvente
acuoso polar. Para los surfactantes de cadena lipofílica suficientemente larga, típicamente 10 ó
más grupos metileno, puede existir una asociación a mayor escala, llamada micela. Dicho agregado
puede contener varias decenas y aún centenas de moléculas.
En presencia de tal asociación del soluto, es de esperar que las soluciones micelares tengan
propiedades particulares, semejantes en algún sentido a las soluciones coloidales de tipo
macromolecular u otro.

ACTIVIDAD SUPERFICIAL E INTERFACIAL
A la superficie agua-aire, o a la interfase aceite-agua, se observa una brusca transición de

polaridad, lo que es particularmente favorable para la orientación, perpendicularmente a la
interfase, de las moléculas L-H; en esta situación el grupo hidrofílico H "baña" en la fase acuosa,
mientras que el grupo lipofílico L, se encuentra en un ambiente no polar.
Las moléculas orientan su porción hidrofílica

hacia el contacto con el agua, y su porción
hidrofóbica lejos del contacto con el medio
acuoso, tratando de maximizar ambos tipos
de interacción. De este modo dan lugar a la
formación de una capa monomolecular que
disminuye la tensión superficial del solvente.
Aquí se discutirá solamente de la variación de la tensión superficial con la concentración del

surfactante. En el caso de una interfase aceite-agua, el problema es más complejo, ya que el
surfactante puede solubilizarse en las dos fases; sin embargo, los fenómenos son esencialmente
los mismos.
La Fig. 1 indica la variación de la tensión superficial en función de la concentración del surfactante

y posee todas las características del caso general. A partir del valor que corresponde al agua pura
(72 mN/m ó dina/cm), se observa una disminución de la tensión superficial con el aumento de
concentración de surfactante; en esta primera zona (I), la gran mayoría de las moléculas de
surfactante se adsorben en la superficie agua-aire, y la concentración superficial crece
rápidamente.

A partir de un cierto valor, la superficie está ocupada por una capa monomolecular de surfactante,
y la tensión interfacial decrece linealmente con el logaritmo de la concentración; según la isoterma
de Gibbs, esto indica que la concentración superficial permanece constante. En esta segunda zona
(II) la superficie es por lo tanto saturada y las moléculas de surfactante que se añaden deben
solubilizarse en la fase acuosa, lo que es poco favorable desde el punto de vista energético, por la
presencia del grupo no-polar L.
MICELAS Y CONCENTRACION MICELAR CRITICA (CMC)
A partir de una cierta concentración, la fase acuosa se "satura" en moléculas individuales L-H, y se
observa el cambio a la tercera zona (III) de la Fig. 1, en la cual la tensión superficial permanece
constante. En esta región, cualquier molécula suplementaria de surfactante se encuentra encima
de su límite de "saturación" en fase acuosa, y su "solubilización" ocurre en agregados de tipo
coloidal llamados micelas.
Se conoce como concentración micelar crítica (CMC) a la concentración de monómeros en
equilibrio con las micelas.
Se usan comillas para los términos "saturación" y "solubilización" ya que se emplean en un sentido
no convencional. Lo correcto sería decir que a partir de cierta concentración, las interacciones
hidrófobas entre moléculas de surfactantes se tornan suficientemente importantes respecto a las
interacciones hidrofílicas surfactante/agua para que se forme espontáneamente una asociación.
En medio acuoso las micelas pueden agrupar varias decenas y aún algunos centenares de moléculas;
la dimensión y la geometría de estos conglomerados dependen esencialmente de la estructura del
surfactante y del ambiente físico-químico.
Se observa en el esquema de la Fig. 2 que la estructura micelar satisface la doble afinidad de las
moléculas de surfactante.

La concentración micelar crítica (abreviada CMC) corresponde a la transición entre las zonas II y
III de la Fig. 1; no es en realidad un valor exacto, sino un cierto rango de concentración, que
puede ser relativamente amplio si el surfactante es una mezcla de especies químicas notablemente
diferentes entre sí.
La concentración micelar crítica, que se refiere a la zona de aparición de las primeras micelas,
puede detectarse mediante numerosos métodos, ya que diversas propiedades presentan en esta
zona una discontinuidad en su variación (Fig.3-4). Los métodos más empleados se basan sobre la
variación de la tensión superficial (todos tipos de surfactantes) y de la conductividad electrolítica
de las soluciones (sólo surfactantes iónicos).
También se usa a menudo la variación del coeficiente osmótico, el cual está relacionado con el
descenso crioscópico (del punto de congelación). Por otra parte se verá a continuación que la
solubilización micelar posee propiedades particulares, las cuales pueden también permitir detectar
fácilmente la CMC mediante métodos ópticos basados sobre la turbidez o la transmitancia de luz
visible.
Puesto que la transición no es siempre muy nítida, se obtiene en general la concentración micelar
crítica al extrapolar las tendencias observadas encima y debajo de la zona de cambio de variación.
Cy
γ Micela
C
Monómero
CMC CMC
Concentración anfifilo Total agregado de anfifilo
Fig 3: Discontinuidad de las propiedades. Fig 4: A partir de la CMC, el valor de

C: conductividad monómeros permanece constante, y
Presión osmótica aumenta la concentración de micelas.
La explicación del fenómeno a nivel molecular se puede resumir diciendo que en la zona de CMC se
establece un equilibrio entre el anfifilo en su forma de monómero y un agregado multimolecular
denominado micela.

Una micela es una estructura formada por agregación de varios monómeros de anfifilo de tal
forma en que se satisfacen las interacciones hidrofílicas y el efecto hidrofóbico y se reduce el
área de contacto de las zonas no polares del anfifilo con la fase acuosa, mientras que al mismo
tiempo permanecen solvatados los grupos hidrofílicos.
Monómero (m) micela (M)
G = Gº + RT ln[ M ]
[ m]
En el equilibrio G =  Gº = -RT ln[ M ]

[ m]
Si hacemos tratamiento de cambio de fase, y tomamos [M]= 1, entonces:
Gºmicel. = -RT ln 1
[ m]
Gºmicel. = -RT ln1 – ln [ m] como ln1=0, entonces
Gºmicel. = -RT (– ln [ m])

Gºmicel. = RT ( ln [m])
Gºmicel. = RT ln CMC
El proceso de micelización es un proceso exergónico, y será más exergónico cuando más pequeña
sea la CMC, lo cual depende de la naturaleza de la sustancia anfipática.
Por otro lado sabemos que:
Gºmicel. = Hºmicel. -TSmicel.
En el proceso de micelización la entalpía y la entropía se oponen, el H es muy bajo y generalmente

G = -TS
Es decir que es el componente entrópico es el que impulsa el proceso, pero la micelización no se

trata de un “ordenamiento de las moléculas”?. ¿Qué contribuye al aumento de la entropía?.
Es el desorden provocado en las moléculas de agua durante el proceso de micelización, lo que
favorece al mismo.

El adjetivo crítico sugiere que se trata de alguna forma de transición de fase, la cual puede
asemejarse a una "microprecipitación”.
Conviene destacar cuatro propiedades fundamentales:
1) Encima de la CMC, toda molécula adicional de surfactante se incorpora dentro de las

micelas, y la concentración de surfactante en estado molecular "monomérico" o no
asociado, queda prácticamente constante; sin embargo se debe destacar que el
equilibrio monómero-micela es de tipo dinámico, es decir, que existe un
intercambio permanente de moléculas entre las micelas y la fase.
2) La dimensión de las micelas (10-10 Å) y el número de moléculas por micela o número

de agregación, depende del tipo de surfactante y del ambiente físico-químico
(electrolito, alcohol, temperatura).
3) Las tensiones superficial e interfacial de un sistema que contiene un surfactante

puro no varían cuando la concentración de este último sobrepasa su CMC; en otros
términos, se puede decir que un exceso de micelas no cambia en nada la actividad
superficial o interfacial. Sin embargo, la magnitud de los fenómenos de
solubilización micelar varía con la cantidad de micelas (véase secciones siguientes).
4) Debajo de la CMC, las propiedades termodinámicas de las soluciones de surfactante

(presión osmótica, descenso crioscópico, etc) siguen leyes ideales o regulares del
mismo tipo que aquellas de las soluciones que contienen un soluto de gran dimensión
molecular. Por el contrario, encima de la CMC se observa un comportamiento
fuertemente no-ideal y una actividad casi constante; en ciertos casos extremos, se
pueden aún obtener estructuras de tipo gel o cristal líquido, con apenas algunos por
cientos de surfactantes, lo que indica que existen interacciones muy fuertes.
FACTORES QUE INFLUENCIAN LA CMC
COMPETENCIA ENTRE INTERACCIONES

La existencia de la CMC como fenómeno bien definido implica que existe una competencia entre
varios tipos de interacciones, las cuales pueden clasificarse en las que favorecen y las que se
oponen a la micelización.
Ya se mencionó que la minimización de las interacciones entre la parte lipofílica del surfactante y
el agua corresponde al efecto hidrófobo que favorece la asociación de las moléculas en una micela.
Cuando más importante la parte lipofílica o hidrófoba del surfactante, más fuerte la tendencia en
formar micelas y por lo tanto más baja la CMC.
En cuanto a las interacciones que desfavorecen la formación de micelas, son de dos tipos. Primero
aquellas que favorecen la solubilización monomolecular del surfactante en el agua, esencialmente
por efecto de solvatación del grupo polar. Cuando más polar este grupo, menor la tendencia en
formar micelas y por lo tanto mayor la CMC.

El segundo efecto desfavorable a la formación de micelas corresponde a las interacciones de tipo
electrostático que resultan en una repulsión entre las partes hidrofílicas de las moléculas de
surfactantes asociadas en las micelas. Si las fuerzas de repulsión son demasiado grandes, las
moléculas no pueden acercarse suficientemente para que se produzca la interacción hidrófoba
entre grupos lipofílicos. Esto explica porque los surfactantes iónicos que poseen cargas netas en
sus grupos hidrofílicos forman micelas mucho más difícilmente que los surfactantes noiónicos.
Para un mismo grupo lipofílico la CMC de los surfactantes iónicos es típicamente 100 a 1000 veces
mayor.
La tabla 1 indica la CMC de algunos surfactantes corrientes en agua. Como información adicional se
notará que el número de agregación aumenta, en general cuando la CMC disminuye.
El número de agregación es la cantidad de monómeros que conforman una micela.
TABLA 1. CMC de algunos surfactantes.
SURFACTANTE CMC (10-6

mol/l)
Octilfenol + 1 EO 45
n-Hexanol + 6 EO
74000
n-Octanol + 6 EO
11000
n-Decanol + 6 EO
860
n-Dodecanol + 6 EO
90
n-Tetradecanol + 6 EO
10
n-Hexadacanol + 6 EO
1.1
Debido a la importancia de la CMC como característica del surfactante, se han publicado muchos
datos al respecto, sin embargo conviene usar la mayor prudencia en utilizar estos datos ya que
presentan muchas inconsistencias; los errores y discrepancias notadas provienen probablemente
de impurezas incluidas en el surfactante particular o de un ambiente fisicoquímico diferente del
agua.

TABLA 2. CMC de algunos surfactantes iónicos.
Surfactante CMC (mmol/l)
Octal sulfato de Na 120

Decil sulfato de Na 30
Dodecil sulfato de Na 8
Tetradecil sulfato de Na 2
Hexadecil sulfato de Na 0.6
Octadecil sulfato de Na 0.2
Dodecil sulfonato de Na 9
Tetradecil sulfonato de Na 2
Hexadecil sulfonato de Na 0.5
Dodecil sulfato de Li 9
Dodecil sulfato de K 8
Dodecil sulfato de Ca 3
Dodecil sulfato de tetra butil amonio 1
Dodecil trimetil amonio bromuro 16

Tetradecil trimetil amonio bromuro 2
Hexadecil trimetil amonio bromuro 1
Hexadecil piridino amonio cloruro 0.9

Octadecil piridino amonio cloruro 0.2
EFECTO DE LA ESTRUCTURA DEL SURFACTANTE
Como lo indica el razonamiento anterior, la CMC de un surfactante depende a la vez de su grupo

hidrofílico (tipo, tamaño, contra-ión) y de su grupo lipofílico (longitud, ramificación).
LIPOFILO
En medio acuoso, la CMC decrece cuando el número de átomos de carbono del lipófilo del
surfactante aumenta. La tendencia general para grupos lipofílicos lineales puede representarse
mediante una expresión del tipo:
log CMC = A - B N
donde N representa el número de grupos -CH2- de la cadena lipofílica lineal; A es una constante
que depende del hidrófilo, y B un factor de proporcionalidad cuyo valor es del orden de 0.5 para
los surfactantes no-iónicos y de 0.3 para los iónicos. El grupo fenil tiene un efecto equivalente a
aproximadamente tres grupos metileno.

La ramificación del grupo lipofílico es un factor de primera importancia; en efecto se encontró que
la CMC aumenta notablemente con la ramificación, lo que va al par con el aumento de la solubilidad
en agua de los hidrocarburos con su ramificación.
La observación anterior también explica el hecho de que la relación entre el logaritmo de la CMC y
el número de grupo metileno N cese de ser lineal para cadenas largas que tienden a doblarse sobre
sí mismas y por lo tanto, ofrecen menos contacto con la fase acuosa.
HIDROFILO
En lo que se refiere al grupo hidrofílico se debe destacar primero que la CMC de los surfactantes
noiónicos es en general mucho más baja que aquella de los iónicos conteniendo un grupo lipofílico
equivalente. Eso se debe probablemente al hecho de que cada grupo óxido de etileno contiene dos
metilenos, lo que reduce las repulsiones electrostáticas. Estas y las observaciones precedentes
corroboran que la CMC es una medida, probablemente cuantitativa, del nivel de afinidad global de
un surfactante para la fase acuosa.
Por otra parte el tipo de grupo hidrofílico y el contra-ión eventual, son ambos factores
determinantes; en particular se notará que los surfactantes aniónicos de cationes divalentes
tienen una CMC netamente más baja que aquellos de cationes monovalentes, probablemente por el
hecho de que tienen una menor ionización.
La concentración micelar crítica de los surfactantes noiónicos en los cuales el hidrófilo es una
cadena poli-óxido de etileno puede estimarse por la relación siguiente:
log CMC = A + B EON
Donde EON es el número de grupos de óxido de etileno en la cadena hidrofílica; A es una

constante característica del lipófilo; y B un factor multiplicativo del orden de 0.02-0.03, que
depende entre otras cosas de la temperatura.
Estas relaciones empíricas ratifican que la CMC está directamente enlazada al carácter
hidrofílico-lipofílico del surfactante.
Se encuentra que está ligada también con el número de agregación, o número de moléculas de
surfactante por micela, aunque sea de manera menos rigurosa. Como regla general, el número de
agregación aumenta con el carácter lipofílico del surfactante, es decir que varía de manera
inversa a la CMC.
TABLA. Valores de CMC (mol/l)
SURFACTANTES IONICOS log CMC = A + B NCH2
Familia de Surfactante Temp (°C) A B

Carboxilatos de Na 20 1.85 0.30
Carboxilatos de K 25 1.09 0.29
N-alquil-1-sulfatos de K ó Na 25 1.50 0.30
N-alquil-1-sulfonatos de K ó Na 25 1.50 0.30
N-alquil benceno sulfonatos de Na 55 1.60 0.29
N-alquil benceno sulfonatos de Na 70 1.30 0.27

N-alquil amonio cloruros 25 1.25 0.27

N-alquil trimetil amonio cloruros 25 1.70 0.30
N-alquil piridinio bromuros 30 1.70 0.31
SURFACTANTES NOIONICOS log CMC = A + B EON

N-dodecil alcohol-EON 23 - 4.4 0.046
N-dodecil alcohol-EON 55 - 4.8 0.013
p.ter octil fenol-EON 25 - 3.8 0.029
Nonil fenol-EON 25 - 4.3 0.020
N-hexadecil alcohol-EON 25 - 5.9 0.024
EFECTO DEL AMBIENTE FISICO-QUIMICO
Puesto que los electrólitos y los alcoholes pueden modificar el poder solubilizante de una solución
acuosa, no es por lo tanto extraño que tengan una influencia sobre la CMC de los surfactantes.
En realidad este efecto es muy importante, por las características particulares de las micelas.
En efecto la presencia de solutos en la fase acuosa puede modificar tanto las interacciones
favorables como las desfavorables a la micelización.
ELECTROLITOS
La adición de electrólitos tiende a disminuir la solubilidad de muchas sustancias en agua, e incluso
puede producir la precipitación en forma de fase sólida. En este sentido la adición de electrolito
disminuye la solvatación de la parte hidrofílica del surfactante. Por otra parte la adición de
electrólito produce una mayor concentración de iones en la vecindad de la superficie de las micelas
y por lo tanto resulta en un efecto de pantalla que reduce las repulsiones electrostáticas entre las
partes hidrofílicas cargadas. Ambos tipos de efectos favorecen la formación de micelas, y de
manera general se puede decir que la presencia de electrólitos tiende a disminuir la CMC; la Fig. 5
muestra la variación de la tensión superficial con la concentración de surfactante para varias
salinidades de la fase acuosa. Este efecto es más importante para los iones bivalentes que para los
monovalente.

Para los surfactantes aniónicos se puede representar el efecto de las sales monovalentes, tal
como el cloruro de sodio, por la relación siguiente:
log CMC = A - B log S
donde S es la salinidad, y A y B dos parámetros que dependen del surfactante y del tipo de
electrolito.
La disminución de la CMC se debe esencialmente a la reducción de espesor de la doble capa
eléctrica que rodea las micelas, lo que produce una disminución de las fuerzas de repulsión entre
grupos hidrofílicos vecinos, y como consecuencia permite la agregación a concentración de
surfactante más baja.
Para los surfactantes no-iónicos u anfotéricos el efecto de los electrólitos es cualitativamente

semejante, pero de magnitud notablemente menor. Se ha propuesto una relación del tipo siguiente:
log CMC = A - B S
En este caso, la disminución de la CMC se atribuye a una reducción de la solubilidad del grupo
hidrofílico por desolvatación, y por otra parte a un aumento de las interacciones entre el grupo
lipofílico y la solución acuosa. La presencia de electrólito puede producir micelas no-esféricas y
hasta cilíndricas.
ALCOHOLES
Por razones prácticas, los surfactantes se usan a menudo junto con un alcohol, sea por el papel
físico de éste o bien por su influencia físico-química.
Todos los alcoholes tienden a reducir la CMC (Fig. 6). Sin embargo su influencia depende por una
parte del tipo de alcohol (peso molecular y ramificación) y por otra parte, de su concentración; es
decir, que depende de sus características como co-surfactante.

Para las sales sódicas de ácidos grasos lineales, y para bajas concentraciones de alcoholes
primarios, Shinoda (1954) halló la relación siguiente, válida hasta una variación de la CMC de un
orden de magnitud.
CMC = CMC° - K C (A)
donde CMC° representa la CMC en ausencia de alcohol; C (A) es la concentración de alcohol; y K es

una constante de proporcionalidad dependiendo del tipo del alcohol (para un surfactante dado). Se
encontró que K crece con el número de carbonos del alcohol, es decir que cuando más lipofílico el
alcohol, más importante el descenso de la CMC. Este fenómeno se explica por la formación de
micelas mixtas surfactante-alcohol, en las cuales la inserción de las moléculas de alcohol permite
reducir las fuerzas repulsivas entre los grupos hidrofílicos cargados de las moléculas vecinas de
surfactante, lo que resulta en un descenso de la energía de formación de la micelas, y por lo tanto
una reducción de la CMC.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Para surfactantes iónicos, la CMC en solución agua-alcohol primero decrece y luego vuelve a crecer
con la temperatura. Para surfactantes noiónicos, se observa un fenómeno semejante, con el mínimo
cerca de 50°C. Los mismos autores discuten el porqué de la existencia de este mínimo de CMC en
función de la temperatura.
Se debe esencialmente a dos efectos opuestos. De un lado, un aumento de temperatura produce
una reducción de hidratación del grupo hidrofílico. Este efecto es aquel que produce el punto de
turbidez de los surfactantes noiónicos y por lo tanto tiende a favorecer la micelización, es decir
producir micelas a menor concentración (La CMC disminuye).
Por otra parte, un aumento de temperatura produce una desorganización creciente de las
moléculas de agua que se encuentran cerca del grupo no polar; como consecuencia el desajuste
agua-grupo no polar decrece, o en otros términos la compatibilidad aumenta, lo que desfavorece la
formación de la micelas (CMC aumenta).
Entre estos dos efectos que se oponen, la resultante es un cambio mínimo de la CMC asociado a la
temperatura, lo cual coincide con lo que vimos anteriormente, donde el componente entálpico tenía
poca influencia sobre la micelización.
CMC DE SISTEMAS BINARIOS
En presencia de dos especies surfactantes (1) y (2), se obtiene un equilibrio entre dos variedades
de monómeros y agregaciones micelares mixtas.
Diversos trabajos, han mostrado que el reparto de las moléculas surfactantes (1) y (2) entre la
solución y las micelas, no se produce de manera proporcional a las fracciones molares respectivas.
Se ha observado que las micelas tienden a incorporar una mayor proporción de la variedad
surfactante más lipofílica, es decir, la de más baja CMC.
Se puede calcular que cuando la concentración total alcanza la CMC de la mezcla, la fase
monomérica contiene esencialmente 50% de cada especie, sin embargo las primeras micelas
formadas están compuestas de 99,99% del surfactante más lipofílico (2).

Por otra parte, cuando la concentración total excede la CMC de la mezcla por un factor 1000 ó
más, la mayoría del surfactante se encuentra en las micelas y por lo tanto éstas contienen
esencialmente 50% de cada especie. Pero en este caso, la fase monomérica contiene 99,99% del
surfactante más hidrofílico (1).
La Fig. 9 indica la CMC de mezcla y la composición de las micelas en función de la composición de la

monomérica.
SOLUBILIZACION CON SOLUCIONES DE SURFACTANTES
SOLUBILIZACION MICELAR
Cuando se añade a una solución acuosa de surfactante un tercer componente, tal como un alcohol o
un hidrocarburo, los fenómenos observados dependen esencialmente de la presencia y del tipo de
micelas. Debajo de la CMC, la solubilidad del aditivo es esencialmente la misma que en agua pura.
Por el contrario, encima de la CMC, se observa en general un aumento de solubilización del aditivo,
que puede en ciertos casos lograr valores considerables.
La mayoría de los autores hacen la diferencia entre cuatro tipos de solubilización, según la
naturaleza del aditivo.

a) En el caso de compuestos no-polares, tales como los hidrocarburos o los aceites, la
solubilización se realiza en el interior lipofílico de las micelas (Fig. 10-a). Estas últimas pueden
entonces hincharse hasta volverse "microgotas" de varios centenares de Angstroms, recubiertas
de una capa de surfactante. Tales estructuras, las cuales se definen más adelante como
"microemulsiones", pueden solubilizar una considerable cantidad de aceite.
b) El segundo tipo de solubilización concierne los aditivos anfifílicos, tales como los alcoholes.
En este caso se trata de una co-micelización, es decir de la formación de micelas mixtas
conteniendo los dos anfifilos (Fig. 10-b). En cierto modo se puede decir que el alcohol se comporta
como un co-surfactante.
En ciertos casos, la co-micelización produce micelas con gran poder de solubilización, el cual
proviene de un efecto sinergético. Se notará que una situación idéntica puede presentarse al
mezclar dos o más surfactantes diferentes, lo que tiene una gran importancia práctica ya que los
surfactantes comerciales son necesariamente mezclas de complejidad variable.
c) El tercer tipo de solubilización corresponde a los aditivos insolubles a la vez en agua y en el

interior lipofílico de las micelas. Parece que se adsorben en la superficie de la micela (Fig. 10-c).
Este tipo de solubilización se asemeja a los fenómenos de depósito de partículas orgánicas o
coloides en la superficie de las gotas de una macroemulsión.
d) El último tipo de solubilización, es característico de las micelas de surfactantes noiónicos cuyo

hidrófilo H consiste en una o varias cadenas de poli-oxietileno o poli-oxipropileno (Fig. 10-d).
Parece que ciertos compuestos orgánicos pueden ser secuestrados en estas cadenas hidrofílicas,
que pueden alcanzar a veces varias decenas de unidades de óxidos de etileno y actúan por lo tanto
como agentes pseudo-quelantes.
En los cuatro casos anteriores, se puede verificar fácilmente que se trata de una solubilización
micelar al realizar una dilución de la solución. Cuando la concentración de surfactante decrece por
debajo de la CMC, la desaparición de las micelas libera los aditivos que estas últimas solubilizaban,
y se produce una separación de fases, que resulta en una turbidez o una precipitación.
Los mecanismos de solubilización micelar se estudian mediante diversos métodos tales como la
ultracentrifugación, la difracción de rayos X o la difusión de neutrones y mediante la utilización
de aditivos marcados o de sondas.
Cuando la concentración de surfactante en la solución es relativamente elevada, del orden del por
ciento en peso (miles de veces la CMC), las micelas pueden deformarse considerablemente para
producir geles, cristales líquidos y microemulsiones.
Estos sistemas contienen cantidades comparables de solvente y de aditivo y por lo tanto no
corresponden realmente al caso de las soluciones acuosas de este capítulo, sino más bien al
comportamiento de fase de los sistemas surfactante-agua-aceite.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MICELAR CRÍTICA
Los conceptos que necesitará para resolver este cuestionario son:

a- Concentración micelar critica (CMC).
b- Efecto hidrofóbico.
c- H, S y G del proceso de micelización.
d- Fundamento y técnica del T.P.
1- A-Explique porque la presión osmótica () y la tensión superficial () presentan cambios
bruscos en la zona correspondientes a la CMC si se grafican estos en función de la
concentración de detergente.
B-Con el aumento del número de monómeros que conforman una micela (número de
agregación), el cambio será más o menos brusco?
2- A-Dados dos lípidos con idéntico grupo polar y diferente longitud de la cadena
hidrocarbonada: lípido A con un grupo hidrofóbico de 16 átomos de carbono y el lípido B con
10 átomos de carbono, infiera si la CMC son iguales o diferentes, J.S.R.
B-Suponga ahora que ambos lípidos tienen igual cadena carbonada pero el lípido B tiene
mayor área molecular. Analice en forma conceptual como alteran los parámetros de
micelización. (CMC, número de agregación).
3- Dados tres recipientes A, B y C de 1 litro cada uno. Al recipiente A se le agregan 0.2

mmoles, al recipiente B 0.31 mmoles y al recipiente C 0.6 mmoles de un mismo detergente
cuya CMC= 0.3mM. Diga:
a- Cual será la concentración de monómero en cada recipiente.

b- Suponiendo que el número de agregación N de la micela es 100, exprese la
concentración de micelas (mM) en cada recipiente.

4- Dado un lípido monoácido que esta ionizado a pH neutro y forma micelas.
a- Calcule Hº, Sº y Gº del proceso de micelización sabiendo que este compuesto a
25ºc tiene una CMC de 1x10-10 M y a 50ºc es 1.1 x10-10M. En base a estos datos y a
los parámetros calculados deduzca cual es la principal fuerza impulsora del proceso
de micelización.
b- Qué significa desde el punto de vista termodinámico que un proceso exergónico
tienen una muy baja dependencia de su constante de equilibrio con la temperatura?
c- Como se denomina el proceso termodinámico por el cual ocurre el proceso de
agregación (micelización).
5-Teniendo en cuenta los fundamentos del T.P, indique si las siguientes afirmaciones son
verdaderas o falsas. J.S.R.
a- El tubo que contiene solamente agua y colorante tendrá una DO menor que un
tubo que contiene colorante y detergente a una concentración menor que la CMC.
b- Los tubos con colorantes y concentraciones crecientes de detergente por debajo de
CMC deberían dar valores constantes de DO.
c- A medida que se comienza a formar la fase micelar los valores de DO comienzan a
incrementarse.
d- Por encima de CMC los valores de DO en los tubos con colorantes y cantidades
crecientes de detergente deberían ser constantes.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MICELAR CRÍTICA
Sustancias anfipáticas son aquellas que poseen por lo menos dos zonas de polaridad opuesta y
orientada asimétricamente en su estructura química. Cuando en un sistema acuoso se incrementa
la concentración de un anfifilo (sustancia anfipática) varias propiedades como la presión osmótica
(), la conductividad (C) y la tensión superficial () varían con la concentración de anfifilo según lo
indicado en la figura.
Monómero Micela (fig 2)
Cy
γ Micela
Monómero
C

CMC CMC
Concentración anfifilo Total agregado de anfifilo
En soluciones diluidas de sustancia anfipática estos parámetros (,  y C) varían en función de la

concentración según lo indicado en la Fig. de manera similar a soluciones de electrolitos simples,
pero existe una región o valor de concentración en la cual estos parámetros cambian bruscamente.
Esta región de concentración en la cual ocurre el fenómeno se denomina concentración micelar
critica (CMC). La explicación del fenómeno a nivel molecular se puede resumir diciendo que la zona
de CMC se establece un equilibrio entre el anfifilo en su forma de monómero y un agregado
multimolecular denominado micela.
Una micela es una estructura formada por agregación de varios monómeros de anfifilo de tal
forma en que se satisfacen las interacciones hidrofilitas y el efecto hidrofóbico y se reduce el
área de contacto de las zonas no polares del anfifilo con la fase acuosa, mientras que al mismo
tiempo permanecen solvatados los grupos hidrofílicos.

La forma de representar la fase micelar se indica en la Fig. 2. La figura muestra que la
concentración de monómero aumenta hasta alcanzar un valor máximo y al agregar más moléculas
anfipáticas comienza a formarse la fase micelar. La concentración máxima de monomio en solución
en equilibrio con la fase micelar corresponde a la CMC.
El fundamento del práctico consiste en que un colorante como el Sudan Black en agua tiene valores
muy bajos de densidad óptica (DO) debido a su baja solubilidad en medios de alta CTE dieléctrica,
pero es muy soluble en medios de baja polaridad como el corazón hidrofóbico de una micela y
desarrolla un color azul obteniéndose buenos valores de DO en esos medios. Cuando en la solución
NO existe una fase micelar los valores de DO serán bajos y constantes. Los valores de DO
aumentaran significativamente cuando en la solución se forme la fase micelar, ya que el colorante
particiona a la región no polar de la micela.
Conociendo la CMC se puede calcular la energía libre Standard Gº del proceso mediante:
ΔGº = RT ln CMC (1)
Conociendo la variación de la CMC con la temperatura se puede calcular la entalpía Standard Hº
del proceso:
∂ ln (CMC) = ΔHº (2)

∂ 1/T R
Conociendo ΔGº por (1) y ΔHº por (2) se puede estimar la entropía del proceso ΔSº mediante:
ΔGºm = ΔHºm - TΔSºm (3)
Donde el subíndice m indica expresamente el proceso de micelización.
MATERIALES
1- Colorante: Sudan Black al 2% P/V en etanol, diluir 3/25 en agua antes de usar.
2- Detergentes: a- Triton X-100 (Detergente no iónico al 0.04% P/V (PM=643).
b- Cetavlon (Detergente catiónico al 0.33 % P/V (PM= 385).
DETERMINACIÓN DE CMC TRITON X-100

A- Temperatura ambiente
B- A 90ºc.
DETERMINACIÓN DE CMC CETAVLON

A- Temperatura ambiente
B- A 90ºc.

Indicaciones generales para ambos detergentes
a. Todos los tubos una vez agregados todos los reactivos se deja 30 minutos a temperatura
ambiente y se lee a 600nm.
b. Se calienta a 90ºc por 15 minutos y se lee a 600nm.
c. Agitar vigorosamente todos los tubos cada 5 minutos.
TRITON X-100
TRITON
Tubo COLORANTE AGUA Vol.Final Concentración DO DO
0.04 %
Nº ml ml ml ml mM T.amb 90ºc
Blanco 0.0 0.25 3.0 3.25
1 0.15 0.25 2.8 3.25
2 0.3 0.25 2.7 3.25
3 0.5 0.25 2.5 3.25
4 1. 0.25 2 3.25
5 1.15 0.25 1.85 3.25
6 1.25 0.25 1.75 3.25
7 1.35 0.25 1.65 3.25
8 1.5 0.25 1.5 3.25
9 1.75 0.25 1.25 3.25
10 2 0.25 1 3.25
CETAVLON
Volumen
Tubo Cetavlon 0.33 % COLORANTE AGUA Concentración DO DO
Final
Nº ml ml ml ml mM T.amb 90ºc
Blanco 0.0 0.2 2.8 3.0
1 0.1 0.2 2.7 3.0
2 0.2 0.2 2.6 3.0
3 0.3 0.2 2.5 3.0
4 0.35 0.2 2.45 3.0
5 0.4 0.2 2.4 3.0
6 0.45 0.2 2.35 3.0
7 0.5 0.2 2.3 3.0
8 0.6 0.2 2.2 3.0
9 0.7 0.2 2.1 3.0
10 0.8 0.2 2.0 3.0

Una vez obtenidos los valores de DO a temperatura ambiente y a 90ºc, se grafica D.O en función
de la concentración de detergente expresada en mM. El punto de inflexión corresponde a la CMC.
Estime el ΔGº para ambas temperaturas.
Determinación de ΔHº de micelización para ambos detergentes:

Se grafica ln CMC en función de la inversa de la temperatura (1/T) y de la pendiente de la curva
se puede calcular el ΔHº para el proceso de micelización. Estime el ΔSº y compare con el valor de
ΔHº.

SEMINARIO OBLIGATORIO
INTERACCION LIGANDO-RECEPTOR EN EQUILIBRIO
INTRODUCCIÓN
El objetivo de este seminario es brindar una introducción al estudio de la interacción de ligandos

con macromoléculas. Muchos de los procesos que ocurren en la célula están mediados por
interacciones de moléculas pequeñas (ligandos) con macromoléculas complejas como proteínas, o
ácidos nucleicos (receptores).
Generalmente se hace referencia a una interacción ligndo-receptor. Ejemplos:
 sustratos y cofactores de enzimas

 moléculas pequeñas y sus transportadores
 Iones con proteínas, con nucleótidos o ácidos nucleicos
 O2 y hemoglobina.
 Antígeno- anticuerpo
Generalmente cuando se estudia la interacción entre dos moléculas en solución, la reacción

trascurre con la aparición de una especie con características distintas a los reactantes; dos
ejemplos que son familiares:
CH3COO- + H+  CH3COOH
Cl- + Ag+  AgCl
El equilibrio químico que describe la interacción de cualquiera de los ejemplos bioquímicos arriba
mencionados rige en forma idéntica al ejemplo más familiar CH3COO- + H+  CH3COOH. En
forma genérica nos referimos a la interacción de un ligando (L) con un receptor (R), para formar
un complejo ligando-receptor (LR) de acuerdo a:
L + R  LR (1)
La formación del ligando-receptor ocurre por colisión controlada por difusión según
KON
L + R --------------- LR
La velocidad de formación es:
VON = KON [L][R]
Donde KON es proporcional a la frecuencia de las colisiones entre L y R y a la eficiencia de esas

colisiones.

La disociación del complejo ocurre según:
KOFF
LR ------------------- L + R
La velocidad de disociación del complejo es:
VOff = KOff [LR]
Koff es la constante de disociación y depende de cuán estable sea el complejo.

Las concentraciones [ligando], [receptor] y [ligando-receptor] de equilibrio se alcanza cuando
ambas velocidades von y voff son iguales:
KON [L][R] = KOff [LR]
Kon = [LR]
KOff [L][R]
Nótese que el cociente KON / KOff es igual a la constante de equilibrio de la reacción descripta en la
ecuación (1). A esta constante de equilibrio tal como está escrita la llamamos: constante de
asociación
KAS = [LR]
[L][R]
Y podemos definir también una constante de disociación
KDIS = 1 = [L][R]
KAS [LR]
La tendencia termodinámica para que la reacción ocurra está dada por la energía libre G:
G = Gº + RT Ln ([LR]/[L][R])
Y Gº =- RT Ln KAS
Usualmente la constante de disociación KDIS(la inversa de KAS) es más utilizada y se expresa en

moles.litro-1 o Molar. Una KDIS grande significa que el receptor tiene una afinidad muy baja
mientras que una KDIS pequeña significa una gran afinidad. L a constante K DIS no debe confundirse
con la constante de velocidad de disociación KOFF ya que definen parámetros diferentes, la primera
es una constante termodinámica y la segunda es una constante cinética y por lo tanto se expresan
en unidades diferentes.
La fracción de receptores ocupados  (ocupación fraccional) con respecto al total es:
Ocupancia fraccional  [LR] .

[Receptor]TOTAL

Un poco de algebra crea una ecuación más útil: sabiendo que:
[Receptor]TOTAL = [R]LIBRE + [LR]
multiplicando ambos, numerador y denominador por [L], dividiendo ambos por la concentración de
[LR], y sustituyendo por la definición de KDIS se tiene que:
 = [L] . (2)

[L] + KDIS
Cuando la concentración de ligando libre [L] es cero, = 0. Cuando [L] es grande (muchas veces el
valor de KDIS), = 1. Cuando [L]=KDIS, la ocupancia fraccional es = 0.5
Estrictamente, no podemos llegar a la situación en el que el 100% de los sitios están ocupados por
ligandos, pero en general decimos que los receptores están “saturados” cuando hay un gran exceso
de ligando libre y la ocupación fraccional tiende a uno.
La ecuación (2) tiene la forma de una hipérbola, no debe esperarse una relación lineal entre
ligando unido y ligando libre como lo muestra la tabla 1:
Tabla 1
Porcentaje de
Relación [L]/KDIS Ocupación fraccional 
receptores ocupados
1 0.5 50%
4 0.80 80%
9 0.90 90%
99 0.99 99%
El modelo que estamos usando para describir la interacción Ligando-Receptor asume que:
 Todos los receptores son igualmente accesibles al ligando

 Todos los receptores están libres o unidos. El modelo ignora cualquier estado de unión
parcial
 Ni el receptor, ni el ligando son alterados por la interacción
 La interacción es reversible. Esto significa que un determinado ligando puede ser
desplazado del sitio de unión por el mismo ligando marcado con un isótopo radiactivo o por
un análogo de igual o mayor afinidad.
Si el análogo químico que desplaza al ligando natural se une al receptor con una afinidad
equivalente o superior e induce una respuesta fisiológica similar se lo define como un agonista. Si
en cambio el análogo con una estructura química similar une al receptor desplazando al ligando
natural pero sin inducir una respuesta fisiológica, estamos en presencia de un antagonista.

De acuerdo a la ecuación (2 )y para un sitio de unión único se obtiene

una curva como se muestra en la figura 1. Determinar la K DIS a partir
de una curva hiperbólica es complejo pero actualmente existen
programas comerciales para computadoras que lo realizan con
precisión.
También se puede realizar en forma lineal de dos maneras:
[L]
a) Graficando las dobles inversas equivalente a la linearización de
Lineaweaver-Burk, a partir de la ecuación (2):
Figura 1
1 = 1 + KDIS , o en función de kAS: 1 = 1 + 1 .

 [L]  KAS[L]
Y expresando g según g= [LR]/[R]TOT. podemos obtener
1 = 1 + 1 .
[LR] [R]TOT. [R]TOTKAS[L]
[LR] es la concentración de ligando unido, b, y a [R]TOT. lo llamaremos Bmax o carga máxima.

Graficando 1/[LR] en función de 1/[L] podemos obtener el valor de B max y KAS
1/[LR]
1/Bmax
1/KDIS
1/[L]

b) Realizando una gráfica de Scatchard, donde Bmax es la cantidad de sitios disponibles y [L] es la
concentración de ligando libre en equilibrio con el ligando unido [b].
Para una determinada concentración de ligando se puede expresar:
[b] = cantidad de ligando unido = Bmax KAS [L] Grafico de Scatchard

1 + KAS [L] [b]
[L]
Si pasamos el denominador a la izquierda
KAS
[b] + [b] KAS[L] = BmaxKAS[L] si dividimos por [L]
[b] + [b] KAS = BmaxKAS reordenando

[L] Bmax
[b] = [unido] = BmaxKAS - [b] KAS = reordenando

[L]
[b]
Gráficamente, para [b] = 0 [b] = Bmax

[L]
La metodología comúnmente utilizada para describir la unión de un determinado ligando con un

receptor, es utilizar ligandos o agonistas radioactivos. Frecuentemente se observan curvas de [b]
vs [L] que no saturan a pesar de utilizar en el ensayo concentraciones de ligando por encima de la
KDIS. Este fenómeno se debe a la interacción inespecífica, es decir una determinada cantidad de
ligando unido que no obedece a la ley de acción de masas y no es desplazable, especialmente si se
utilizan sistemas que contienen receptores de membrana. Para estos casos la ecuación es:
[b] = Bmax [L] + (inespecífico)

KDIS + [L] [b] Unido + inespecífico
Y en el cálculo se debe restar la cantidad Unido

de inespecífico a fin de ajustar la ecuación
correctamente.
inespecífico
Las ecuaciones arriba descriptas son para
un receptor (o una superficie) que posee
sitios de un solo tipo, idénticos e
independientes, es decir la interacción de [L]
una molécula con un sitio no influencia la
interacción de otra. Existen muchas
condiciones que se desvían de lo esperado y experimentalmente el gráfico de Scatchard
generalmente no es una recta.

Una de las situaciones, se puede descomponer en dos rectas indicando que existen dos sitios
independientes de diferente afinidad. Otra situación es que exista cooperatividad, esto es que la
interacción de una molécula de ligando influenza la afinidad de otra molécula de ligando. Para este
último caso el gráfico de Scatchard es curvado, dado que la K AS cambia con la ocupancia del
receptor (ver gráfico).
L + R LR
L + R  L2R
L + R  LnR
Para los casos de cooperatividad la interacción:
[b] = Bmax [L]Nh

(KDIS + [L])Nh
donde Nh es el coeficiente de Hill y es una medida de la cooperatividad que no debe confundirse

con el coeficiente estequiométrico n.
Si la interacción es para un sitio independiente simple Nh no debe diferir significativamente del
valor de 1. Si se desvía de la unidad significa una determinada cooperatividad. Si Nh es mayor de 1
significa cooperatividad positiva, esto es el aumento de la concentración de [L] o el incremento de
la ocupancia fraccional del receptor multiligando favorece la unión del siguiente ligando.
Uno de los casos más estudiados es la interacción de O2 con hemoglobina.
Dos sitios Interacción cooperativa

[b] [b]
[L] [L]
KAS 1
KAS 2
Bmax 2
Bmax 1
[b] [b]

PROBLEMAS DE APLICACIÓN
Introducción y Objetivos
Los receptores hormonales son dispositivos sensores que traducen señales extracelulares en
eventos intracelulares para que las células proliferen, se diferencien o inclusive mueran.
Cuando la hormona se une al receptor se inicia una cascada de eventos intracelulares destinados a
llevar el mensaje hormonal. Una consecuencia de esto es que muchas veces la acción de una
hormona o droga (ligando) se expresa no solo por los niveles de ésta en sangre, sino también por la
presencia y características de sus receptores en diferentes tejidos. Esto es importante en
general cuando se evalúa la administración de una terapia.
El objetivo de este seminario es comprender la relación que existe entre los niveles de ligandos y
de sus receptores con las constantes de afinidad aparente que gobiernan estos equilibrios a
través de la resolución de problemas que ejemplifican distintas situaciones que pueden
presentarse en el laboratorio de un bioquímico.
Para realizar un gráfico de Scatchard debemos graficar [unido]/[libre] en función de [unido].

Llevado este concepto a la mesada del laboratorio, significa que debemos incubar la macromolécula
con el ligando a diferentes relaciones macromolécula/ligando total y medir en cada uno de esos
tubos la cantidad de ligando unido y la cantidad de ligando libre. Para ello disponemos de una gran
cantidad de estrategias experimentales que se adaptan a las características de cada sistema
particular en estudio. En algunos casos podemos utilizar métodos que involucra una separación
física de la macromolécula con el ligando unido por un lado y la solución que contiene al ligando
libre por el otro.
Estos métodos incluyen filtración, sedimentación, cromatografía de exclusión molecular, adhesión
de la macromolécula a un soporte sólido y posterior lavado de la solución sobrenadante, etc.
En todos estos casos debemos contar con algún método analítico para medir la cantidad de ligando
unido a la macromolécula. Estos métodos, y sobre todo aquellos que involucran lavado del material
sedimentado, pueden ser utilizados solamente cuando la constante de afinidad es suficientemente
grande (Koff pequeña) ya que de otro modo el equilibrio se vería afectado durante el tiempo que
dura la separación y/o el lavado. En otros casos que no requieren de la separación física de la
macromolécula y la solución, podemos medir la cantidad de ligando unido en presencia (equilibrio)
del ligando libre.
Para ello debemos contar con la ventaja de que el ligando unido tenga alguna propiedad
espectroscópica distintiva y de esa manera poder medir su concentración en presencia del ligando
libre. Por ejemplo, la MC 540 unida a interfases lipídicas tiene un espectro de absorción diferente
al de la especie libre en agua y podemos medir la concentración de MC540 unida midiendo la
absorbancia a 540 nm.
En el caso del problema nº 3 de esta guía, el experimento consiste en incubar varios tubos que
contienen la misma cantidad de células con cantidades crecientes de ligando. Luego de
transcurrida la incubación, las células son separadas de la fase acuosa por sedimentación en una
centrifuga. En el sedimento encontramos las células con el ligando unido y en el sobrenadante el
ligando libre. Luego de remover el sobrenadante podemos analizar la cantidad de ligando unido en
el “pellet” (sedimento) de células.

Una metodología analítica muy conveniente para medir ligando unido (o libre) cuando utilizamos
métodos de separación es la que utiliza radioisótopos. Podemos obtener comercialmente una gran
variedad de ligandos de interés clínico que han sido sintetizados con algún isótopo radioactivo en
alguno de sus átomos.
La velocidad de decaimiento radioactivo es directamente proporcional a la cantidad de material

radioactivo. Si utilizamos un isótopo de vida media relativamente larga podemos considerar
perfectamente que la cantidad de material radioactivo es constante durante el tiempo que dura
nuestro experimento y utilizar la velocidad de decaimiento como medida de la cantidad de
radioisótopo y, por supuesto, del ligando que lo contiene.
La velocidad de decaimiento, y por lo tanto la cantidad de material radioactivo, se mide en Curie

(Ci). Un Curie es igual a la cantidad de desintegraciones por minuto que se observan en un gramo
de radio puro. Esto es 1Ci= 2.2 x 1012 dpm (dpm = desintegraciones por minuto). Esto es una gran
cantidad de radioactividad, y normalmente trabajamos con cantidades mucho menores. En los
equipos donde medimos radioactividad, la radiación emitida por cada desintegración es
transformada en luz, que a su vez es medida por un fotodetector. Si la eficiencia de los equipos
fuera del 100%, cada desintegración correspondería a un destello luminoso. Sin embrago, como la
eficiencia es menor, las cuentas por minuto (cpm) que nos informa el equipo no es igual a las dpm
que efectivamente tiene la muestra.
Si queremos conocer entonces la cantidad de material radioactivo midiendo cpm, debemos conocer
la relación entre cpm y dpm para la condición experimental en que estamos trabajando.
Por otra parte, si disponemos por ejemplo de un ligando marcado radioactivamente, sólo una
pequeña fracción de esas moléculas contienen un átomo del isótopo radioactivo. Obviamente, las
moléculas marcadas radioactivamente tienen el mismo comportamiento que las no marcadas; a
estas últimas las llamamos frías. Si medimos entonces la radiactividad de una muestra
necesitamos conocer esta proporción para poder conocer la cantidad de ligando. A esta relación la
llamamos actividad específica.
El siguiente problema sirve para comprender la relación entre dpm, cpm y actividad específica.
Disponemos de una muestra comercial de ATP (PM 600) en solución acuosa, marcado
radioactivamente (solución madre). El fabricante nos informa que la actividad especifica es de
5000 Ci/mmol. Esto significa que 1 mmol de ATP de esa solución produce 5000 x 2.2x10 12 = 11x1015
dpm.
A) Tomamos 10 ul de esa solución y un contador de centelleo con 100% de

eficiencia mide 22x 1026 cpm para esa muestra. ¿Cuántos mole de ATP
hemos tomado?¿Cual es la concentración de ATP en la solución?
B) Tomamos 10 ul de la solución y los mezclamos con 1 ml de ATP frío 10 mM.

¿Cuántos moles de ATP contiene esta nueva muestra? ¿cual es su actividad
específica?.

T.Práctico Nº5: SEMINARIO
INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR
PROBLEMAS
1- La concentración de 17 -estradiol en plasma de una mujer en edad reproductiva es de

aproximadamente 6,5 x10-11M. Sabiendo que la Kd de estrógenos es alrededor de 5x10 -13.
Calcule la fracción de receptores ocupados.
2- Si una mujer joven consume anabólicos esteroideos que tienen una Kd= 1x10-12M por el
receptor de estrógenos y el nivel en plasma promedio es 5x10 -10M. ¿Cuál es la fracción de
receptores estrogénicos ocupados por el anabólico?. Compare con la calculada en el
problema 1
3- Se recomienda en distintos tipos de cánceres determinar los niveles de receptores

hormonales en trozos de tejidos extraídos por biopsia o en la cirugía para facilitar la
evaluación de la terapia a aplicar y elaborar el pronóstico del paciente. Valores de número
total de receptores inferiores a los 100 fmoles/mg de proteina citosólica se consideran
como indicio de peor pronóstico y generalmente se recomienda una terapia más agresiva. A
continuación se trata de dar un ejemplo de un experimento donde se analiza el contenido de
los receptores de 17 -estradiol de dos muestras obtenidas de dos piezas tumorales una
proveniente de la paciente A y oyta de la paciente B-
Se analizó el contenido de receptores estrogénicos utilizando la técnica de radioligando
empleando 17 -estradiol marcado con tritio cuya actividad específica fue de 1000 Ci/mmol
(1 uCi=2,2 x 106 dpm). Se realizaron las curvas de saturación empleando 0,02 mg de
proteína citosóica para cada punto. La cantidad de unido específicamente para cada
concentración se determinó en incubaciones paralelas en presencia de una cantidad igual a
100 veces la del ligando. Las distintas concentracionesutilizadas se obtuvieron de la
siguiente manera: el punto de concentración más baja es 17 -estradiol tritiado, las otras
concentraciones se consiguieron añadiendo 17 -estradiol frío (no tritiado), es decir la
catividad específica del radioligando fue diluída de acuerdo a lo necesario en cada caso
llegando a un volumen final de 1 ml. Se informa el promedio de tres determinaciones
llevadas a cabo simultáneamente.

Ensayo para determinar contenido y afinidad de receptores en tejido tumoral.
MUESTRA 1 MUESTRA 2
17-estradiol Unido Total Unido Unido Total Unido
(Pm) (dpm) Inespecif.(dpm) (dpm) Inespecif.(dpm)
1 1160 45 110 7.5
2 920 40 100 5.0
5 810 35 120 6.0
10 600 30 85 6.5
20 335 35 55 5.0
50 165 25 29 5.5
100 90 20 20 5.0
Determine la cantidad de receptores que tienen estas muestras y sus Kd, para ello realice todos
los cálculos necesarios y grafique Scatchard.¿Qué paciente tiene peor pronóstico y porque?
4-La albúmina sérica es la proteína más abundante del plasma humano y trasporta muchos
compuestos endógenos (como la bilirrubina) y exógenos (como el diazepam y la aspirina). Las
moléculas de drogas que no están unidas a la albúmina son las que ejercen la acción farmacológica
y las que son tóxicas.
a-Una concentración en plasma de aspirina libre mayor que 100 mg/l indican una
intoxicación aguda y se recomienda hemodiálisis ¿Cuál es la concentración de sitios libres
conociendo que la concentración de albúmina en sangre es 35g/l y su pM 66.000, que el
peso molecular de la aspirina es 180, que la interacción albúmina-aspirina tiene una
estequiometría uno a uno y una Kd= 5x10-6M?
b-¿Qué fracción de albúmina tiene unida bilirrubina en condiciones fisiológicas?.

Datos:
 PM Bilirrubina= 585
 Ka= 1,4x108 M
 [Bbna]= 5 mg/l
 Estequiometría 1/1

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA RIOJA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

Del bioquímico se espera capacidad de análisis e interpretación de los eventos sucedidos a

En el camino de la medicina, el bioquímico es quien da el primer paso.

Su profesión abre caminos. Es la suma de una aptitud científica

Con el afán de dar cada día un poco más intercambia conocimientos

Cuando un bioquímico da un paso adelante, TODA LA CIENCIA AVANZA.

Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica 1

Cronograma de actividades prácticas 3

Conceptos teóricos práctico nº 1 6

Conceptos teóricos práctico nº2 28

Trabajo práctico nº2 41

Conceptos teóricos práctico nº 3 46

Trabajo práctico nº3 64

Conceptos teóricos práctico nº4 68

Conceptos teóricos seminario 91

2 Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica

Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica 3

SEMANA 10: 7/11

SEMANA 11: 14/11: RECUPERATORIOS

4 Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica

Las actividades prácticas constan de:

Seminarios: En ellos se llevará a cabo la resolución de problemas planteados en la guía de trabajos

 Se tomará evaluación escrita individual, se destinará a los mismos 15 minutos previos a la

Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica 5

TERMODINÁMICA DE SOLUCIONES - PRINCIPIOS BÁSICOS

Entonces i dni = i  dni 

i = i   equilibrio de fases.

6 Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica

Si un sistema está en equilibrio químico:

dG= A dnA + B dnB + G dnG + H dnH = 0

A dnA + B dnB + G dnG + H dnH = 0 y como

A dnA = B dnB = -G dnG = -H dnH

aA + bB = gG + H

En el equilibrio la suma de potenciales químicos de los componentes reactantes debe ser

Sm = -R  ni ln Xi (+)  espontáneo.

dG = Hm -T Sm = RT ni ln Xi porque Hm=0 (ideal)

La energía libre de mezcla es:

Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica 7

i - iº = RT ln Xi Si es diluida se puede aproximar,

De manera real no se expresaría según concentraciones, sino actividades

X1 = 1-X2, esto se puede expandir en serie, y resulta:

X2 = fracción molar del soluto = C2 V1 C2 en g/l.

Como f1 < 1 si hay C2 (soluto) el log se puede expandir en serie:

ln f1= - ( C22 +  C23 + ………)

 1 - 1º= - RT V1 ( C2 +  C22 + ....)

8 Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica

1- Son moléculas grandes, mayores que las del solvente.

La causa mas general del comportamiento no-ideal de soluciones de macromoléculas es su

SOLUTO SOLVENTE MEZCLA IDEAL

SOLUTO (MACROMOLÉCULAS) SOLVENTE SOLUCIÓN NO IDEAL

Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica 9

Ese volumen de exclusión está determinado por las dimensiones moleculares.

Para esferas: ч = 8 PM2 V2 Y  = 4 V2

Para cilindros ч = 2L PM2 V2 y  = L V2

L= longitud del cilindro

Esta contribución a la no idealidad es pequeña para moléculas esféricas, pero puede

Una entalpía o calor de mezcla negativo corresponde a una interacción soluto-solvente

10 Bioq. Maricel Lozdan - Biofísica

B<<0 (separación de fases)

B< 0 (mal solvente)

B=0 Solución Ideal