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ELABORACIÓN DE UNA BEBIDA LÁCTEA FERMENTADA Y SABORIZADA A

PARTIR DEL SUERO OBTENIDO COMO SUBPRODUCTO DE LA

FABRICACIÓN DE MANTEQUILLA

MARÍA CRISTINA CHARRIS OEDING

ROBERTO OSCAR ROIS ROMERO

UNIVERSIDAD DE LA SABANA

FACULTADA DE INGENIERÍA

INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL

BOGOTÁ

2001
ELABORACIÓN DE UNA BEBIDA LÁCTEA FERMENTADA Y SABORIZADA A

PARTIR DEL SUERO OBTENIDO COMO SUBPRODUCTO DE LA

FABRICACIÓN DE MANTEQUILLA

MARÍA CRISTINA CHARRIS OEDING

ROBERTO OSCAR ROIS ROMERO

Proyecto de grado para optar el título de Ingenieros de Producción Agroindustrial

Directora

BERNADETTE KLOTZ

UNIVERSIDAD DE LA SABANA

FACULTADA DE INGENIERÍA

INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL

BOGOTÁ

2001
CONTENIDO

Pág.
INTRODUCCIÓN xv
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 17
1.1 LECHE 17
1.2 ELABORACIÓN DE LA MANTEQUILLA 20
1.3 SUERO DE MANTEQUILLA 23
1.3.1 Clases de suero de mantequilla 25
1.3.2 Propiedades fisicoquímicas y nutricionales del suero de mantequilla 26
1.3.2.1 Densidad 26
1.3.2.2 Acidez 26
1.3.2.3 pH 26
1.3.2.4 Sólidos totales 27
1.3.2.5 Sólidos solubles 27
1.3.2.6 Lactosa 27
1.3.2.7 Grasa 28
1.3.2.8 Proteínas 29
1.3.2.9 Vitaminas 30
1.3.2.10 Cenizas (minerales) 30
1.3.2.11 Fibra dietaria 31
1.3.3 Ensayo enzimático 32
1.3.4 Características microbiológicas del suero de la mantequilla 32
1.3.4.1 Staphylococcus aureus 32
1.3.4.2 Hongos y levaduras 32
1.3.4.3 Coliformes 33
1.3.4.4 Mesófilos 33
1.4 BIOTECNOLOGÍA 33
1.5 BACTERIAS LÁCTICAS 34
1.5.1 Importancia de las bacterias lácticas 34
1.5.2 Género Streptococcus 36

i
ii

1.6 FERMENTACIÓN 36
1.6.2 Fermentación discontinua 42
1.6.2.1 Fase de latencia 42
1.6.2.2 Fase logarítmica 42
1.6.2.3 Fase estacionaria 43
1.6.2.4 Fase de muerte 43
1.7 LECHES FERMENTADAS 43
1.8 ADITIVOS ALIMENTARIOS 46
2. MATERIALES Y MÉTODOS 48
2.1 MATERIALES 48
2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL 50
2.3 METODOLOGÍA 52
2.3.1 Materia prima 52
2.3.2 Realización de pruebas preliminares 53
2.3.3 Ensayo enzimático 53
2.3.4 Caracterización fisicoquímica y microbiológica de la materia prima 54
2.3.4.1 Pruebas fisicoquímicas 54
2.3.4.1.1 Densidad 54
2.3.4.1.2 Acidez 55
2.3.4.1.3 pH 55
2.3.4.1.4 Sólidos totales 56
2.3.4.1.5 Sólidos solubles 56
2.3.4.1.6 Lactosa 56
2.3.4.1.7 Grasa 56
2.3.4.1.8 Nitrógeno total y proteínas 57
2.3.4.1.8.1 Curvas de calibración 58
2.3.4.1.8.1.1 Titulación 59
2.3.4.1.8.1.2 Destilación y titulación 59
2.3.4.1.8.1.3 Digestión, destilación y titulación 61
2.3.4.2 Pruebas microbiológicas 63
2.3.4.2.1 Recuento de microorganismos mesófilos aerobios 63
2.3.4.2.2 Recuento de hongos y levaduras 64
iii

2.3.4.2.3 Número más probable (NMP) de coliformes totales y confirmación de 64


coliformes fecales
2.3.4.2.4 Recuento de Staphylococcus 65
2.3.5 Seguimiento de la fermentación acidoláctica (realización de la curva de 66
crecimiento)
2.3.6 Elaboración de la bebida 66
2.3.7 Análisis organoléptico 68
2.3.8 Caracterización de la bebida terminada 69
2.3.8.1 Pruebas nutricionales 69
2.3.8.1.1 Cenizas (minerales) 69
2.3.8.1.2 Vitaminas 70
2.3.8.1.3 Fibra dietaria (insoluble y soluble) 70
3. ANÁLISIS DE RESULTADOS 71
3.1 PRUEBAS PRELIMINARES 71
3.2 CARACTERIZACIÓN DE LA MATERIA PRIMA 73
3.2.1 Pruebas microbiológicas 73
3.2.2 Ensayo enzimático 74
3.2.3 Pruebas fisicoquímicas 75
3.3 SEGUIMIENTO DE LA FERMENTACIÓN ACIDOLÁCTICA 82
3.4 REALIZACIÓN DE LA BEBIDA Y ANÁLISIS ORGANOLÉPTICO DE LAS 83
FORMULACIONES
3.5 CARACTERIZACIÓN DE LA BEBIDA TERMINADA 87
3.5.1 Pruebas microbiológicas 87
3.5.2 Pruebas fisicoquímicas 88
3.5.3 Pruebas nutricionales 95
3.6 COSTOS APROXIMADOS DE PRODUCCIÓN DE LA BEBIDA 96

CONCLUSIONES 98
RECOMENDACIONES 99
BIBLIOGRAFÍA 101
ANEXOS 103
LISTA DE TABLAS

Pág.
Tabla 1. Composición de la leche. 18
Tabla 2. Composición del suero de mantequilla. 26
Tabla 3. Resultados de las pruebas nutricionales. 95

v
LISTA DE ANEXOS

Pág.
Anexo A. Resultados de los volúmenes para la curva de calibración 103
(destilación).

Anexo B. Resultados de los volúmenes para la curva de calibración 104


(destilación, digestión y titulación).
Anexo C. Composición de los medios de cultivo deshidratados para siembras 105
microbiológicas de laboratorios Merck.

Anexo D. Cuestionario para la prueba de aceptación (escala hedónica). 106


Anexo E. Ficha técnica del cultivo comercial 992 de la empresa Interenzimas 107
S.A. representante de Vivolac Cultures Corporation.
Anexo F. Ficha técnica del saborizante de maracuyá de la empresa Sabores 108
Ltda.
Anexo G. Ficha técnica del colorante amarillo maracuyá (16255) de la 109
empresa Sabores Ltda.
Anexo H. Ficha técnica de la pulpa de maracuyá de la empresa Prado Fruit 110
Ltda.
Anexo I. Resultados de la prueba de lactosa para el suero crudo (materia 111
prima) del laboratorio Asinal Ltda.
Anexo J. Resultados de las pruebas de lactosa, hierro, calcio y fósforo del 112
producto terminado del laboratorio Asinal Ltda.
Anexo K. Resultados de las pruebas de vitamina A, vitamina D3 y fibra soluble 113
e insoluble del laboratorio Biocontrol Ltda.
Anexo L. Resultados de la evaluación fisicoquímica. 114
Anexo M. Recuento de bacterias acidolácticas para la realización de la curva 115
de crecimiento del cultivo comercial.

vi
LISTA DE FIGURAS

Pág.
Figura 1. Componentes de la leche. 18
Figura 2. Máquina para elaboración continua de mantequilla. 22
Figura 3. Diagrama de flujo del proceso de elaboración de la mantequilla. 24
Figura 4. Proporciones de los componentes en leche, crema, suero y 25
mantequilla.
Figura 5. Hidrólisis de la lactosa por la β-galactosidasa. 37
Figura 6. Esquema de la fermentación de la glucosa. 41
Figura 7. Curva de proliferación típica de una población bacteriana. 43
Figura 8. Diagrama de flujo del diseño experimental. 50
Figura 9. Curva de calibración para la destilación en el método de Kjeldahl. 61
Figura 10. Curva de calibración para la digestión, destilación y titulación en el 63
método de Kjeldahl.
Figura 11. Dispersión para los datos de densidad del suero. 75
Figura 12. Dispersión para los datos de acidez del suero. 76
Figura 13. Dispersión para los datos de pH del suero. 76
Figura 14. Dispersión para los datos de grasa del suero. 76
Figura 15. Dispersión para los datos de sólidos solubles del suero. 77
Figura 16. Dispersión para los datos de sólidos totales del suero. 77
Figura 17. Curva de crecimiento de las bacterias acidolácticas del cultivo 82
comercial (992).
Figura 18. Dispersión para los datos de densidad de la bebida terminada. 89
Figura 19. Dispersión para los datos de acidez de la bebida terminada. 89
Figura 20. Dispersión para los datos de pH de la bebida terminada. 90
Figura 21. Dispersión para los datos de grasa de la bebida terminada. 90
Figura 22. Dispersión para los datos de sólidos solubles de la bebida terminada. 90
Figura 23. Dispersión para los datos de sólidos totales de la bebida terminada. 91

vii
LISTA DE CUADROS

Pág.
Cuadro 1. Propiedades de los principales elementos estructurales de la leche. 19
Cuadro 2. Requisitos microbiológicos para leche pasterizada. 19
Cuadro 3. Contenido aproximado de ciertos lípidos en algunos productos 28
lácteos.
Cuadro 4. Cantidad de proteínas en el suero de mantequilla y los 29
requerimientos proteicos diarios en adultos y niños.
Cuadro 5. Distribución de algunas sales en la leche y sus requerimientos 31
diarios en adultos y niños.
Cuadro 6. Requisitos fisicoquímicos de las leches fermentadas. 45
Cuadro 7. Requisitos microbiológicos para leches fermentadas. 46
Cuadro 8. Volumen de 10 gotas de HCL 1N en una bureta de 10 ml. 59
Cuadro 9. Porcentajes de error de exactitud obtenidos con la curva de 60
calibración para el método de Kjeldahl (destilación).
Cuadro 10. Porcentajes de error de exactitud obtenidos con la curva de 62
calibración para el método de Kjeldahl (digestión, destilación y
titulación).
Cuadro 11. Formulación propuesta por la empresa Sabores Ltda. 67
Cuadro 12. Formulaciones planteadas para la bebida. 68
Cuadro 13. Valores de pH, recuento de mesófilos y porcentaje de sólidos 72
solubles en la fermentación preliminar.
Cuadro 14. Resultados de la pruebas microbiológicas iniciales de la materia 73
prima.
Cuadro 15. Resultados de la caracterización microbiológica de la materia prima. 74
Cuadro 16. Resultados de los estadígrafos para la caracterización fisicoquímica 78
de la materia prima.
Cuadro 17. Volúmenes de HCL 1N empleados en la titulación para la 81
determinación del porcentaje de proteínas de la materia prima.
Cuadro 18. Cantidades de los ingredientes de la formulación de Sabores Ltda. 84
Cuadro 19. Resultados de la prueba de aceptación para la bebida con sabor a 84
maracuyá elaborada con la formulación de Sabores Ltda.
Cuadro 20. Cantidades en peso de los ingredientes para cada formulación. 85
Cuadro 21. Resultados de la prueba de aceptación para las formulaciones de la 86

ix
x

bebida utilizando pulpa de maracuyá de Prado Fruit Ltda.


Cuadro 22. Resultados de la pruebas microbiológicas de la bebida terminada sin 87
pasterizar.
Cuadro 23. Resultados de la caracterización microbiológica de la bebida 88
terminada pasterizada.
Cuadro 24. Resultados de los estadígrafos para la caracterización fisicoquímica 91
de la bebida terminada.
Cuadro 25. Volúmenes de HCL 1N empleados en la titulación para la 94
determinación del porcentaje de proteínas de la bebida terminada.
Cuadro 26. Costo por consumo de energía para el procesamiento de 4.200 lt de 96
suero.
Cuadro 27. Costo de ingredientes y empaque empleados en la elaboración de 97
250 ml. de la bebida fermentada.
Cuadro 28. Promedio de los volúmenes de HCL 0,0996 N empleados en la 103
titulación de los diferentes volúmenes de solución de sulfato de
amonio.
Cuadro 29. Promedio de los volúmenes de HCL 0,9677 N empleados en la 104
titulación de los diferentes pesos medidos de urea.
Cuadro 30. Resultados de la caracterización fisicoquímica del suero. 114
Cuadro 31. Resultados de la caracterización fisicoquímica de la bebida 114
terminada.
Cuadro 32. Promedio de recuento de bacterias acidolácticas, intervalo de 115
confianza del 95% y pH en el seguimiento de la fermentación.
GLOSARIO

ATP (TRIFOSFATO DE ADENOSINA): acarreador energético primario de los


organismos vivos que se genera en reacciones de óxido reducción y se emplea en
reacciones biosintéticas.
BUTTERMILK: bebida láctea fermentada a partir de suero ácido o dulce de mantequilla.
DBO5: criterio para determinar el grado de contaminación de aguas. Cantidad de
oxígeno requerido por los microorganismos para estabilizar la materia orgánica
biodegradable en cinco días a una temperatura de 20ºC.
NAD (NICOTINAMIDA-ADENINA DINUCLÉOTIDO): acarreadores intermedios de
electrones que transfieren dos átomos de hidrógeno al siguiente acarreador de la
cadena. Dicha transferencia se conoce como deshidrogenación.
PLASMA: elemento de la leche que incluye el total de su composición exceptuando los
glóbulos grasos.
SUERO LÁCTEO: líquido que corresponde al plasma excluyendo las micelas de
caseína.
SUERO DE MANTEQUILLA: líquido similar al plasma que se obtiene por el batido de la
crema en el proceso de elaboración de la mantequilla.
SUERO DE QUESO: líquido similar al suero lácteo que contiene algunos polipéptidos
derivados de la caseína por la coagulación de la misma para la obtención del queso.
SUSTANCIA NATURALES IDÉNTICAS: sustancias naturales que poseen una
proporción de sustancias artificiales, idénticas a las naturales.

xi
RESUMEN

El objetivo de este proyecto es elaborar una bebida láctea fermentada a base de suero
de mantequilla. Se caracteriza el suero (materia prima) y se fermenta hasta alcanzar un
pH aproximado de 4,6. En dicha fermentación el contenido de lactosa decrece de
4,75% a 4,18%. La bebida fermentada se saboriza agregando pulpas, azúcar y agua en
diferentes formulaciones con el fin de escoger la de mayor aceptación por los
consumidores y caracterizarla.
El producto lácteo obtenido tiene un contenido de proteína del 2,74%, 0,48% de grasa,
0,62% de ácido láctico , pH de 4,15 y un alto porcentaje de sales minerales (0,60%). Su
contenido en vitamina A es de 99,7 UI/100 g y vitamina D3 de 15,1 UI/100 g; la fibra
soluble se encuentra en un 0,1% y la insoluble en un 2,0%.
El costo de producción en la empresa Coolechera sería de $153 en una presentación
de 250 ml.

xii
ABSTRACT

The purpose of this project is the elaboration of a fermented milky drink from whey,
subproduct of butter manufacturing. The whey was characterized and a fermentation
with lactic acid bacteria established. The end point of the fermentation was set at pH 4,6
and a decrease of 12% in the lactose content was determined.
Pulps, sugar and water were added, according to different formulations, to make the
fermented whey more tasty. One formulation was selected through organoleptic
evaluation and characterized as followed: protein 2,74%, fat 0,48%, lactic acid 0,62%,
pH 4,15, minerals 0,60%, vitamin A 99,7 UI/100 g, and vitamin D 15,1 UI/100 g.
The cost of production of this fermented whey was calculated at $153 colombian pesos
per 250 ml.

xiii
OBJETIVOS

GENERAL

Elaborar una bebida láctea saborizada a partir del suero de la mantequilla, mediante un
tratamiento fermentativo.

ESPECÍFICOS

• Caracterizar fisicoquímica y microbiológicamente el suero de la mantequilla (materia


prima).
• Realizar el seguimiento de la fermentación acidoláctica con el cultivo comercial 992
de la empresa Interenzimas S.A.
• Caracterizar fisicoquímica, microbiológica, organoléptica y nutricionalmente la
bebida como producto terminado.
• Estimar los costos aproximados de producción de la bebida láctea.

xiv
INTRODUCCIÓN

Hoy en día es la contaminación ambiental un de los principales problemas que aqueja


la humanidad. Los avances tecnológicos, el aprovechamiento de recursos y el
desarrollo de la ciencia son temas de interés en el mundo entero; aunque no se tiene
debidamente en cuenta las consecuencias que dichos avances traen para la población
actual y futura del planeta. En Colombia se han puesto límites legales a los problemas
de contaminación ambiental desde 1984 con el decreto 1594 sobre vertimiento de
aguas residuales.
En las industrias lácteas se manejan grandes cantidades de desechos líquidos o
efluentes como agua de lavado, leche, productos de bajo pH, suero de queso y
mantequilla entre otros. Los tratamientos que se aplican para manejar los efluentes se
refieren a procesos físicos, químicos, y biológicos.
Las aguas residuales no tratadas podrían destruir completamente un sistema ecológico,
y de esta manera eliminar una fuente de recursos naturales y de producción de
alimentos. Además reducen el contenido de O2 en el agua natural debido a sus
contribuyentes que son química y biológicamente oxidables.
El agua de categoría I que es potable y se utiliza para la producción industrial de
alimentos no debe exceder un DBO5 de 0,5 mg/lt. En Coolechera (Barranquilla,
Atlántico) como en muchas otras empresas de alimentos del país, el suero de
mantequilla no es comercializado y además no sufre ningún pretratamiento para ser
vertido como agua residual industrial, generando un DBO5 de aproximadamente 70.000
mg/lt.
En Colombia el tratamiento de efluentes es uno de los requisitos que deben cumplir las
empresas y en caso de no contar con la infraestructura necesaria, la ley establece un
valor de $46,5/kg de carga contaminante como tarifa mínima por vertimientos puntuales
de demanda bioquímica de oxígeno y $19,9/kg de sólidos suspendidos. Para el caso de
Coolechera dicha tarifa asciende a $30.000.000 anuales.
En Coolechera se procesan aproximadamente 97.300 lt de leche diarios para obtener
8.170 kg de crema en la elaboración de 3,9 ton de mantequilla por día, y se desechan
4.200 lt de suero como efluente.
Existe la posibilidad de recuperar el suero de la mantequilla para su utilización como
componente minoritario o mayoritario de otros productos. De hecho en países como
Chile, Estados Unidos, Brasil, Argentina y Alemania ha sido comercializado como
bebida láctea fermentada en distintas presentaciones por compañías como MLO
Products, Gándara, Nestlé, Parmalat, etc. En Colombia se utiliza, en el área de bebidas,
para la dilución del yogur líquido o aún para alimentar cerdos, como se hacía
antiguamente en los distintos países anteriormente mencionados.
Con el aprovechamiento de este contaminante, se contribuye a la preservación del
medio ambiente buscando mantener un equilibrio que permita asegurar la interacción
hombre-naturaleza de las generaciones futuras. También se logran disminuir los costos
de vertimiento pagados al gobierno por DBO5 ya que el suero no formaría parte del total

xv
Introducción xvi

de los efluentes de la empresas lácteas. Además se aprovecharían sus cualidades


nutricionales, como el contenido de proteínas el cual asciende aproximadamente de 3,2
a 3,5%. El suero de mantequilla contiene minerales, vitaminas y un bajo contenido de
grasa.
Proteínas...........................3,2 – 3,5%
Grasa ................................0,5 – 0,7%
Lactosa..............................4,0 – 5,0%
Minerales...........................0,7 – 0,75%
Fuente: Milcherzeugnisse. En : Ausbildung im molkereifach. Berlin. Vol. 15, (abril de 1994).

La desnutrición proteico calórica infantil continúa siendo un grave problema de salud


pública en todos los países de incipiente desarrollo económico y técnico como el
nuestro. En Colombia el 18% de la población correspondiente a 7,5 millones de
personas sufre de desnutrición.1
Esta es otra de las la razones por la cuales se debe aprovechar cualquier fuente de
proteínas, vitaminas y minerales para compensar el consumo de productos alimenticios
que no puedan ser adquiridos por su elevado costo.
Este proyecto se basa en la elaboración de una bebida láctea cuya materia prima es el
suero de la mantequilla a partir de crema no cultivada, el cual es un medio excelente
para la propagación de microorganismos, ya que posee una alta carga orgánica y un pH
entre 6,7 y 7,0. Al aplicar un proceso de fermentación se busca aumentar la vida útil del
producto con un pH mucho más bajo en el que sea difícil el desarrollo de
microorganismos. Además se pretende contrastar la acidez con un sabor natural
añadido posteriormente.
La fermentación provoca una disminución en el contenido de lactosa del suero por la
acción de las bacterias acidolácticas, haciendo de este un producto más digerible para
personas intolerantes a la misma2. Por otra parte dichas bacterias se implantan en el
tracto intestinal y actúan como probióticos, generando posibles beneficios como el
adecuado balance de la flora intestinal del hombre. La bebida láctea complementa la
nutrición básica de niños en desarrollo no lactantes, apta también para adultos. Los
costos de producción hacen posible un precio de venta relativamente bajo con respecto
a su valor alimenticio beneficiando a personas de bajos recursos.

1
Universidad del Valle. Nutrición en Colombia. En www.hipócrates.univalle.edu.co (Diciembre 2 de 2000)
2
GARCÍA, Garibay, QUINTERO, Ramírez, LÓPEZ, Munguía. Biotecnología alimentaria. México : Limusa,
1993.
CAPÍTULO 1

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Este capítulo cubre los aspectos más relevantes de la fundamentación teórica,


necesaria para el estudio y realización de este proyecto.

1.1 LECHE

Según el decreto 2437 de 1983 expedido por el ministerio de salud en Colombia, la


leche se define como «el líquido producto de la secreción normal de las glándulas
mamarias de animales bovinos sanos, obtenida por uno o varios ordeños íntegros e
higiénicos, sin adición ni sustracción alguna».
Además de proporcionar prácticamente todos los nutrientes necesarios, contiene
también diferentes sustancias que actúan como parte fundamental de los sistemas
inmunológico y de protección del recién nacido.
El aspecto "lechoso" característico de la leche se debe principalmente a las proteínas y
sales de calcio disueltas en ella y el color amarillo de la crema se debe a la presencia
de caroteno, un pigmento naranja que se convierte en vitamina A en el organismo.
La leche animal se compone principalmente de agua (80-90%) en la que se encuentran
disueltas o en suspensión las proteínas, la lactosa, los minerales y las vitaminas
hidrosolubles (Figura 1). La grasa de la leche, donde se encuentran disueltas las
vitaminas liposolubles está en emulsión y distribuida en el líquido a manera de glóbulos
minúsculos que pueden unirse unos a otros formando una capa de crema cuando la
leche fresca se deja en reposo.

17
Revisión bibliográfica 18

Leche

Sólidos no grasos Agua Sólidos grasos

Proteínas Lactosa Vitaminas Sales Triglicéridos Vitaminas


hidrosolubles liposolubles,
minerales y
caroteno
Caseína Proteínas del suero

Figura 1. Componentes de la leche


Fuente: ALAIS, Charles. Ciencia de la leche. Barcelona : Reverté, 1985.

Las proporciones en las cuales se encuentran los diferentes componentes de la leche


de vaca varían dependiendo de muchos factores como lo son la alimentación, la época
del año, la raza, etc.

Tabla 1. Composición de la leche


Componente Porcentaje
Agua 86,5 - 88,7
Grasa 3,0 - 4,7
Proteína 3,2 - 3,6
Lactosa 4,5 - 5,0
Cenizas 0,7 - 0,75
Fuente: ICBF, Tabla de composición de alimentos en Colombia. Bogotá, 1997.

La leche posee una estructura relativamente simple y ha sido bien estudiada. En el


cuadro 1 se muestran algunas propiedades de los elementos estructurales de este
producto.
La grasa de la leche y de los glóbulos grasos no son idénticas porque
aproximadamente la mitad de la película de recubrimiento de dichos glóbulos no es
material lipídico y aproximadamente un 0,4% de la grasa de la leche se encuentra fuera
de los glóbulos.
La leche menos los glóbulos grasos constituye el plasma, es casi igual pero no idéntico
a la leche descremada, ya que la separación o descremado nunca es completa.
Las micelas de la caseína se componen de agua, caseína, sales y algunos
componentes menores, incluidos lipasa y proteinasa; existen vestigios de caseína que
están en solución sin formar parte de las micelas. Al pH de la leche (6,7-7,0) la caseína
retiene unidos fuertemente ciertos cationes, sobre todo Ca y Mg, por lo tanto se dice
que se presenta como caseinato. El suero lácteo se define como plasma menos micelas
de caseína.
Revisión bibliográfica 19

Cuadro 1. Propiedades de los principales elementos estructurales de la leche


Plasma
Suero
Micelas de Proteínas Partículas
Glóbulos grasos
caseína globulares lipoproteicas
Componentes Caseína, agua, Proteínas del
Lípidos Lípidos, proteínas
Principales sales suero
Considerados
Emulsión Fina dispersión Solución coloidal Dispersión
como
Contenido (%
3,8 2,8 0,6 0,01
materia seca)
Volumen de la
0,042 0,06 0,006 0,0001
fracción
Diámetro de la
0,1 – 10 µm 10 – 300 nm 3 – 6 nm 10 nm
partícula
Microscopio Microscopio
Visible con Microscopio Ultramicroscopio
electrónico electrónico
Centrífuga de
Separable con Desnatadora Filtración por gel Filtración por gel
gran velocidad
Punto
3,8 4,6 4,0 – 5,5 4,0
isoeléctrico
Fuente: WALSTRA, Pieter y JENNESS, Robert. Química y física lactológica. España : Acribia,
1987.

Las partículas lipoproteicas llamadas microsomas, varían en cantidad, composición y


forma; están constituidas por restos de membranas, micropelillos, etc.
Las células somáticas de diversos tipos pueden considerarse como partículas extrañas,
aunque siempre se encuentren en la leche; son unas 100.000/ml y suponen el 0,05%
de la leche. Contienen todos los compuestos del citoplasma, principalmente ácidos
nucleicos y enzimas.
Los parámetros de control de calidad microbiológica a cumplir, estipulados en la norma
506 del ICONTEC para la leche pasterizada se presentan en el cuadro 2.

Cuadro 2. Requisitos microbiológicos para leche pasterizada.


Requisitos n M M c
Coliformes totales NMP/ml (30ºC) 3 11 39 1
Coliformes fecales NMP/ml (45ºC) 3 <3 - 0
Recuento de mesófilos UFC/ml 3 5 x 104 1 x 105 1
Fuente: NTC 506 : 1993, Productos lácteos, leche entera pasterizada.

donde:
n: número de muestras
m: número máximo permisible para identificar nivel de buena calidad
M: número máximo permisible para identificar nivel de aceptable calidad
c: número máximo de muestras permisibles con resultados entre m y M
Revisión bibliográfica 20

1.2 ELABORACIÓN DE LA MANTEQUILLA

A partir de la leche fresca se elaboran diversos productos ampliamente aceptados en la


mayoría de la población3. Algunos de ellos se conocen desde hace muchos siglos y su
preparación se practicaba desde entonces como un método de conservación de la
leche.
Entre los productos derivados de la leche se destacan dos como más importantes, la
mantequilla y los quesos. Se emplea el singular al referirse a la mantequilla por ser un
producto relativamente homogéneo cuando se fabrica correctamente por métodos
modernos.
El contenido de agua debe estar disperso en forma de finas gotas, de tal manera que se
pueda extender fácilmente y fundir rápidamente en la boca. La mantequilla se divide en
dos categorías principales, mantequilla de crema dulce y mantequilla de crema ácida o
fermentada, obtenida a partir de una crema que ha sido acidificada por crecimiento
bacteriano.
La crema a partir de la cual se obtiene la mantequilla por batido es un tipo de leche al
que se la ha aumentado considerablemente el contenido de grasa. A nivel industrial
suele obtenerse por centrifugación, en un equipo llamado centrífuga o desnatador, en el
cual se hace girar la leche que sale descremada fuera del recipiente dejando la crema
con menor densidad dentro de este. Una distribución de paletas en la esfera giratoria
permite que la leche descremada y la crema puedan ser separadas continuamente. La
crema obtenida posee un porcentaje de grasa de 30 a 40% dependiendo del país o la
región en la cual se produzca, aunque generalmente dicho porcentaje es de 38% para
la producción de mantequilla.
El contenido de materia grasa en la crema no debe ser demasiado elevado ya que
dificultaría el batido por su alta viscosidad; en general no debe rebasar el 40%.
La congelación de la leche provoca el desemulsionado de la grasa láctea, mientras los
calentamientos elevados, incluido el ultracalentamiento, no originan ningún
empeoramiento de la emulsión de la grasa cuando las instalaciones están
convenientemente construidas.
La presencia de aire perjudica mucho la estabilidad de las membranas de los glóbulos
grasos, por ello debe evitarse la llegada de aire a la leche y a la crema durante el
proceso de elaboración.
De máxima importancia es la calidad microbiológica de la leche y la crema, ya que se
corre con el riesgo de obtener un crecimiento acelerado de bacterias psicrófilas,
termoresistentes y formadoras de esporas en la leche, crema y también en la
mantequilla, provocando grandes deficiencias organolépticas al producto. Por esto se
exige con carácter legal en muchos países pasterizar la crema. Esta operación se
verifica generalmente a temperaturas de 90-95ºC durante 15 ó 20 segundos seguida de
un enfriamiento de 4-8ºC; destruyendo los microorganismos patógenos y las lipasas

3
TEPLÝ, M., MEYER A. Fabricación de productos lácteos. Zaragoza : Acribia, 1994.
Revisión bibliográfica 21

que son enzimas promotoras de la rancidez. Además, en la pasterización, se forman


productos sulfurados reductores que se oponen a la oxidación de la grasa.
Una vez realizada la pasterización se procesa la crema para obtener la mantequilla por
medio de un proceso continuo o discontinuo. La crema se puede definir como dulce o
ácida. La primera se refiere a una crema sin adición de componente alguno, como por
ejemplo un cultivo láctico, que altere su composición o forma y es la utilizada para la
elaboración de mantequilla en la empresa Coolechera. Esta sufre una etapa de
“Maduración física”, es decir que se deja en reposo por un periodo aproximado de dos
horas a temperatura de 6ºC en un tanque de acero inoxidable, con el fin de lograr el
deseado grado de cristalización de la grasa, en el cual se conservan intactas las
envolturas de los glóbulos grasos obteniendo un batido eficaz. La cristalización rápida
de la materia grasa en finos cristales proporciona una estructura suave en el producto
final (la mantequilla).
La maduración física también se presenta en el tratamiento de crema ácida, precedido
por un calentamiento a temperatura de 19-23ºC con el fin de propiciar un medio óptimo
para el desarrollo del cultivo añadido. Generalmente se utilizan combinaciones de
cultivos con Streptococcus lácticos acidificantes (S. cremoris) y productores de diacetilo
(S. diacetylactis) o una mezcla de Streptococcus heterofermentativos productores de
aroma y Streptococcus lácticos acidificantes. Esta etapa se denomina "Maduración de
la crema" y se realiza en tanques maduradores entremezclándola cada 30 minutos; el
proceso termina cuando se consigue la acidez deseada que generalmente corresponde
a un pH de 4,9-5,2 dependiendo de la empresa productora y se desarrolla
aproximadamente en 12-15 horas. La crema se cultiva con el fin de aumentar el aroma
de la mantequilla y realzar sus características organolépticas.
Después de la maduración física de la crema se procede al batido de la misma y
malaxado o moldeado de la mantequilla. Actualmente se utilizan equipos continuos con
los cuales se consigue mayor rendimiento y mejores condiciones de higiene. Consta de
un cilindro batidor de acero inoxidable con un eje motriz horizontal donde se encuentra
el rotor que posee cuatro palas batidoras de sección cuadrada o rectangular dentro de
un cilindro con perforaciones. Este se refrigera, ya que el trabajo mecánico exige un
considerable aporte de energía que motiva el calentamiento de la crema; si la grasa
esta líquida, el batido no da lugar a la formación de mantequilla sino a la
homogenización de la crema. En el proceso de batido se rompen las membranas de los
glóbulos de grasa y a medida que estos se colapsan, la crema se separa en dos fases,
la grasa de la mantequilla y la fase acuosa o suero de mantequilla disuelto con sus
contribuyentes dispersos. El cilindro batidor actúa como un peletizador, en el cual se
forman instantáneamente los granos de mantequilla que pasan a un cilindro de
malaxado inclinado que incluye un tornillo sin fin dando vueltas en sentido inverso para
comprimir la mantequilla forzándola a través de los compartimentos; se obtiene así una
excelente pasta homogénea. El suero de mantequilla cae desde el cilindro batidor hacia
la parte de abajo del cilindro de amasado y la mantequilla sale por la boca del mismo
como una masa continua. En esta parte del proceso se añade sal con un porcentaje de
1,5 a 2%, si se desea, aunque también existe la mantequilla sin sal.
Revisión bibliográfica 22

En la figura 2 se presenta el equipo más comúnmente utilizado para la elaboración


continua de mantequilla.
Crema

8
3
2 7
6
5
4

Mantequilla

Suero

1. Cilindro de batido 5. Sección de inyección


2. Sección de separación 6. Sección de amasado al vacío
3. Sección de separación 7. Etapa de amasado final
4. Sección de malaxado 8. Unidad de control de humedad

Figura 2. Maquina para elaboración continua de mantequilla.


Fuente: TETRA PAK. Manual de industrias lácteas. Madrid : Iberia, 1996.

Este equipo responde a las máquinas de la empresa Westfalia (Alemania) o Contimab-


Simon que han logrado difundir y globalizar el procedimiento utilizado para la
elaboración de la mantequilla en forma continua.
En ausencia de dichos equipos se encuentran los discontinuos o batidoras que son
llenadas hasta la mitad y se hacen girar por algunos minutos para luego abrir el
aparato, evacuar el gas y restablecer la presión atmosférica. Luego se procede al batido
con velocidad entre 25 y 50 vueltas por minuto, hasta que comienza la formación del
grano en 30 a 40 minutos.
Existe la alternativa de lavar la mantequilla agregando agua fría (2-4ºC) en el cilindro de
malaxado o en la batidora, dependiendo si se trata de equipos continuos o discontinuos
respectivamente. Esto con el fin de extraer la fase acuosa que todavía se encuentre
adherida a la grasa. Cuando se procesan cremas de buena calidad, es decir con alto
contenido de grasa en procesos continuos no es necesario lavar. La mantequilla que se
obtiene posee un porcentaje de grasa del 80-82% y en Colombia no debe ser menor del
80%4.
El batido en general es mucho más rápido cuando el contenido de grasa líquida es
grande, es decir elevando un poco la temperatura; pero generalmente no se está
interesado solo en el tiempo sino además en la eficiencia. En otras palabras si hay
mucha grasa líquida una gran parte de esta se pierde en el suero de mantequilla.

4
NTC 734 : 1996, Productos lácteos, mantequilla.
Revisión bibliográfica 23

La mantequilla se empaca generalmente en Colombia en papel pergamino ya que es


resistente a grasas y se recubre con papel aluminio para proteger el producto de la luz
solar y evitar su rancidez.

A continuación se muestra el contenido de los componentes de la mantequilla.

Proteínas...........................0,7%
Grasa ................................80%
Lactosa..............................0,4%
Minerales...........................0,15%
Vitamina A.........................2.500 UI / 100g
Vitamina D3.......................55 UI / 100g
Fuente: TETRA PAK. Manual de industrias lácteas. Madrid : Iberia, 1996.

En la figura 3 se presenta el diagrama de flujo para la elaboración de la mantequilla.

1.3 SUERO DE MANTEQUILLA

El suero de mantequilla es un producto líquido, de apariencia lechosa, de poca


viscosidad que resulta como subproducto en el batido de la crema pasterizada, luego
de la aglomeración de cubos de grasa en la elaboración de la mantequilla. En el se
encuentra emulsionada la poca grasa que no se separó de la crema y disueltos gran
parte de los sólidos no grasos de la leche.
El rendimiento del suero de la mantequilla depende de muchos factores como el
contenido de grasa de la leche de la cual se extrae la crema. Este es de un 4,3% con
respecto a la leche y 51,5% con respecto a la crema, si esta tiene un porcentaje de
grasa de 38-40%. Esto indica que si se procesa 1 kg de crema con 40% de grasa,
produce 485 g de mantequilla con 82% de grasa y 515 g de suero con 0,44% de grasa5.
«Además de las cualidades dietarias del suero, este está marcadamente dotado de
fosfolípidos, procedentes fundamentalmente de la película que envuelven los glóbulos
grasos y que en el proceso de batido pasan al suero. Entre estos la lecitina se
encuentra presenta con un 0,12%; cantidad que excede tres veces su contenido en la
leche (0,04%). Esta sustancia es un elemento importante como componente del
encéfalo y de los nervios en los humanos»( Milcherzeugnisse, Vol. 15, 1994, 131). Además
aumenta la cantidad de colesterol que puede solubilizarse en las micelas de los ácidos
biliares, evitando la formación de cálculos biliares.

5
PETERS, K. H., Fettdestabilisierung in Rahm. En: Kieler Milchwoche. Bremen. (mayo de 1993).
Revisión bibliográfica 24

LECHE

Calentamiento a 63ºC
Intercambiador de placas

Estandarización 35-40% grasa


Separadora centrífuga

Pasterización de la crema a 90-95ºC (15 seg.)


Intercambiador de placas

Enfriamiento de 4-8ºC
Intercambiador de placas

Maduración de la crema a 19-23ºC


(12-15 h)
Tanque madurador

Maduración física a 6ºC (2 h)


Tanque de acero inoxidable

Batido
Separación de la mazada
(desuerado)

Amasado o Malaxado

Envasado

Almacenamiento en frío

Figura 3. Diagrama de flujo del proceso de elaboración de la mantequilla


Fuente: ALAIS, Charles. Ciencia de la leche. Barcelona : Reverté, 1985.
Revisión bibliográfica 25

En la figura 4 se pueden observar con claridad las proporciones en que se encuentran


los componentes de cada una de las partes que intervienen en la obtención del suero y
la mantequilla como producto final.

LECHE CREMA

87% AGUA 56,6% AGUA


SUERO

MANTEQUILLA
91% AGUA
5,4% S.S 16% AGUA

2% S.S

9% S.S
38% GRASA
82% GRASA
8,5% S.S
4% GRASA
0,5% GRASA

S.S: Sólidos solubles

Figura 4. Proporciones de los componentes en leche, crema, suero y mantequilla


Fuente: Milcherzeugnisse. En : Ausbildung im molkereifach. Berlin. Vol. 15, (abril de 1994).

1.3.1 Clases de suero de mantequilla

Existen dos clases de suero de mantequilla que se nombran como “Suero” y “Suero
Puro”. El primero contiene una porción de agua añadida que corresponde
aproximadamente al 10% de su volumen. Esta dilución se presenta generalmente por el
lavado de la mantequilla y en ocasiones por el lavado de la máquina. Si se renuncia al
lavado de la mantequilla, entonces el suero producto del proceso se llama “Suero Puro”.
Una segunda diferenciación se realiza paralelamente con las dos clases de suero ya
mencionadas. En las fábricas se produce crema dulce y ácida; por consiguiente hay
estas dos clases de suero “Suero Dulce” y “Suero Ácido”. El primero se acidifica para la
elaboración de la bebida fermentada.
El suero de mantequilla trabajado en el proyecto es puro y dulce; cuando se haga
referencia al suero de la mantequilla o suero crudo se entenderá que es de este tipo.
Revisión bibliográfica 26

1.3.2 Propiedades fisicoquímicas y nutricionales del suero de mantequilla

La calidad del suero de mantequilla depende fundamentalmente del tratamiento de la


crema y del proceso de batido. Un batido adecuado se traduce en la obtención de un
suero de buena calidad. La composición en porcentaje del suero de mantequilla se
muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Composición del suero de mantequilla


Propiedades Porcentaje
Agua 90,5 - 91,1
Extracto seco 8,90 - 9,50
Grasa 0,50 - 0,70
Proteínas 3,20 - 3,50
Minerales 0,70 - 0,75
Lactosa 4,00 - 5,00
Fuente: Milcherzeugnisse. En : Ausbildung im molkereifach. Berlin. Vol. 15, (abril de 1994).
SPREER, Edgar. Lactología Industrial. Zaragoza : Acribia, 1991.

1.3.2.1 Densidad

Es la relación existente entre la masa de un cuerpo y la unidad de volumen que esta


ocupa. Esta propiedad, en los productos lácteos, depende del contenido de grasa y de
sólidos totales. La densidad de la grasa láctea es de 0,91 a 0,95 g/ml, indicando que
entre mayor sea su contenido en el producto lácteo, menor será la densidad de este;
teniendo en cuenta el contenido de sólidos que contribuyen al aumento de la misma.

1.3.2.2 Acidez

En los productos lácteos la acidez es un índice de la calidad microbiológica, porque los


microorganismos son los responsables de la degradación de la lactosa a ácido láctico.
«La acidez de la leche pasterizada no debe exceder de 0,18% de ácido láctico (p/p)».
(NTC 506, 1993, 3). Para el suero de mantequilla no existen en Colombia parámetros de
referencia.

1.3.2.3 pH

El método más ampliamente usado para expresar la concentración de iones hidronio es


el pH, el cual se define como el logaritmo negativo de dicha concentración molar,
siendo esta una propiedad que se relaciona directamente con el grado de acidez. Entre
mayor sea el contenido de ácidos, mayor número de iones hidronio se disocian y menor
será el pH. En el suero de la mantequilla esta propiedad se encuentra entre 6,7 y 7,0.
Revisión bibliográfica 27

1.3.2.4 Sólidos totales

Se entiende por sólidos totales el residuo expresado como porcentaje en peso, obtenido
después de efectuada la desecación del suero en condiciones determinadas. Incluye
todos los componentes del suero exceptuando el contenido de agua.

1.3.2.5 Sólidos solubles

Corresponde a la diferencia entre extracto seco y grasa. El contenido de sólidos


solubles del suero debe ser un poco menor que el contenido de sólido totales porque la
grasa representa un pequeño porcentaje y es el único factor que los diferencia.

1.3.2.6 Lactosa

En el suero como en la leche se encuentran presentes ciertos carbohidratos sobre los


cuales no se tiene acuerdo de concentración. La lactosa (4-ο-β-D-galoctopiranosil-D-
glucopiranosa) es el único azúcar libre que existe en cantidad importante. Es también el
componente más simple, más abundante y el más constante en proporción. Excepto en
la leche, la lactosa es un azúcar muy raro en la naturaleza; se sintetiza en la mama a
partir de la glucosa sanguínea y a partir de los ácidos volátiles producidos en el rumen.
Es el componente del más lábil frente a la acción microbiana, ya que es fácilmente
presa de bacterias, que la transforma en ácido láctico y otros ácidos alifáticos.
Valor nutricional: La lactosa actúa principalmente como fuente de energía
proporcionando 16,8 kJ/g.
El valor nutricional de la lactosa en el adulto tiene aún reservas a causa de la
intolerancia, que se observa en relación con la raza en los seres humanos.6
El origen se encuentra en la deficiencia de la enzima ß-lactosidasa o lactasa que es
específica del enlace 1,4-β de la lactosa, producido por células epiteliales en el intestino
delgado. La enzima rara vez está ausente pero su producción puede ser muy reducida.
La lactosa no se asimila, y se comporta como un azúcar de absorción lenta o nula;
actúa osmóticamente atrayendo el agua hacia el yeyuno y sirviendo de sustrato de la
flora coliforme a nivel del colon. Dicha flora es productora de gas, y de allí el
hinchamiento, el gorgoteo y las diarreas, que pueden aparecer inmediata o tardíamente,
a las doce horas de su ingestión. La deficiencia de lactasa puede deberse a
gastroenteritis; los microorganismos que atacan la porción pilosa del intestino delgado
pueden alterar su actividad lactásica. También se debe a factores genéticos; en algunos
lactantes se ha observado una rara deficiencia congénita de lactasa.
La incidencia de la intolerancia varía mucho en los distintos grupos étnicos; numerosos
estudios han demostrado grandes variaciones geográficas. La desaparición de la
lactasa es bastante rara en europa occidental, sobre todo en los nórdicos (menos del
10% de la población en la península escandinava). Es muy frecuente en los negros y
orientales y en los judíos que proceden de países con poca producción lechera (80-

6
ALAIS, Charles. Ciencia de la leche. Barcelona : Reverté, 1985.
Revisión bibliográfica 28

100%). En los Estados unidos de América el 70 al 80% de los negros adultos son
"alactásicos" contra el 15% de los blancos.
La intolerancia a la lactosa se produce normalmente entre los siete y los diez años en
los blancos y hacia los tres años en los pueblos de color. Según Charles Alais, la
lactasa desaparece cuando la leche ya no figura en cantidad suficiente en la ración.
Pese a todo, se han puesto de manifiesto casos de adultos aparentemente intolerantes,
que se han habituado de nuevo a la leche, debido a su consumo en cantidades
importantes, tras haber superado las alteraciones digestivas durante una o dos
semanas. La lactasa sin duda alguna no ha reaparecido pero la flora intestinal se ha
podido adaptar.
Otro defecto genético del metabolismo de la lactosa es la galactosemia, que se debe a
la falta hereditaria de la enzima galactosa-1-fosfato-uridil-transfarasa que cataliza una
de las reacciones del metabolismo de la galactosa. En ausencia de transferasa, se
acumulan en la sangre productos como la galactosa, la galactosa-1-fosfato y galactitol.
Los síntomas de la galactosemia son, entre otros, vómitos, diarrea, detención del
crecimiento, cataratas y retraso mental. Algunos de los síntomas se cree que los
produce el galactitol que se forma por la reducción de la galactosa. El único remedio
que se conoce es la eliminación total de la galactosa de la dieta. Su frecuencia se
calcula en uno por cada 50.000 nacimientos7.

1.3.2.7 Grasa

El contenido de grasa del suero de manequilla depende sobre todo de la refrigeración


de la crema y de la temperatura de batido. Si en la maduración física no se suministra
una temperatura adecuada (6ºC aprox.) no se da la cristalización de los glóbulos de
grasa y por tanto no existe buena separación. Los triglicéridos del suero de la
mantequilla se encuentran en la mayor proporción siendo los representantes de la
fracción lipídica en el producto. Existen sustancias lipídicas de bajas concentraciones
como los son los fosfolípidos, los ácidos grasos libres, los esteroles y algunos
hidrocarburos entre otros.

Cuadro 3. Contenido aproximado de ciertos lípidos en algunos productos lácteos


Producto Grasa total (%) Fosfolípidos (%) Esteroles (%) A.G. libres (%)
Leche 4,00 0,035 0,013 0,008
Leche descremada 0,06 0,015 0,002 0,003
Crema 40,0 0,210 0,110 0,060
Suero de mantequilla 0,60 0,130 0,011 0,002
Mantequilla 81,0 0,250 0,210 0,120
Fuente: WALSTRA, Pieter y JENNESS, Robert. Química y física lactológica. España : Acribia,
1987.

Valor nutricional: Los lípidos sirven principalmente como fuente de energía. Estos dan
como media 37 kJ/g. La grasa láctea está casi completamente líquida a la temperatura
corporal (37ºC), lo que es un prerrequisito para su digestibilidad.
7
ALAIS, Charles. Ciencia de la leche. Barcelona : Reverté, 1985.
Revisión bibliográfica 29

A los lípidos dietéticos se les ha prestado mucha atención por estar estrechamente
relacionados con enfermedades coronarias y arteriosclerosis. Los ácidos grasos
saturados de cadena larga de la dieta suben los niveles de colesterol, mientras que los
ácidos grasos polinsaturados los rebajan. Por esto se ha recomendado a veces la
restricción o exclusión de la grasa láctea de la dieta.

1.3.2.8 Proteínas

Una de las cualidades nutricionales del suero de la mantequilla es el contenido de


proteínas. Los dos tipos de proteínas más importantes presentes en dicho suero son:
las caseínas, las cuales contienen fosfato y calcio y precipitan a un pH de 4,6
constituyendo cerca del 80% del total, y las que permanecen en solución a pH 4,6
llamadas proteínas del suero del queso. Estás representan aproximadamente el 20%
restante formadas por un grupo en el que se incluyen α-lactalbúmina, β-lactoglobulina.
Existen además trazas de otras proteínas que son la albúmina del suero,
inmunoglobulinas y péptidos de bajo peso molecular.
Dependiendo del pH del sistema estos polímeros pueden actuar como cationes y como
aniones, de tal manera que al desarrollar la misma carga eléctrica provocan fuerzas de
repulsión que se traduce en un constante movimiento responsable de su estabilidad.
Cuando se exponen a un cierto valor de pH que representa la función del equilibrio de
los grupos ionizables de cada molécula, el número de cargas positivas es igual al
número de cargas negativas y como consecuencia se da una anulación de la carga
eléctrica de la proteína; entonces las moléculas no se siguen desplazando aunque
estén sometidas a la acción de un campo eléctrico. Se dice que precipitan en dicho pH
al que se le llama punto isoeléctrico.
Con la pasterización de la crema y la acción mecánica del batido en la elaboración de la
mantequilla, las proteínas sufren una pérdida parcial de la solubilidad provocando su
precipitación a un pH entre 4,0 y 5,0.
Valor nutricional: El valor nutritivo de las proteínas depende de los aminoácidos
esenciales que el hombre no puede sintetizar. Estas sustancias desempeñan funciones
biológicas en el organismo humano, entre las que se cuenta principalmente la
regeneración y formación de tejidos, la síntesis de enzimas, anticuerpos y hormonas, y
como constituyente de la sangre, entre otras; forman parte del tejido conectivo y
muscular de los animales y de otros sistemas rígidos estructurales. Los órganos del
hombre están compuestos fundamentalmente por proteínas. Los alimentos ricos en
estas macromoléculas, como la carne, la leche y el huevo, son escasos en la mayoría
de los países en vía de desarrollo, y además, por ser los más costos de producir son los
más difíciles de adquirir.

Cuadro 4. Cantidad de proteínas en el suero de mantequilla y los requerimientos


proteicos diarios en adultos y niños
Cantidad en el suero Necesidad Necesidad niños de 10 a 12
(g/100g) Adultos (g/día) años (g/día)
3,2 – 3,5 38,5 44,8
Fuente: NESTLÉ, La adolescencia. En : Anales Nestlé. México. Vol. 53 No. 3 (1995).
Revisión bibliográfica 30

La mezcla de caseína y proteínas del suero de queso, es decir las proteínas contenidas
en el suero de la mantequilla, tiene una mejor calidad que cada una de ellas por
separado debido a que se complementan sus concentraciones de algunos aminoácidos
esenciales; por ejemplo la tirosina más la alanina abundan comparativamente más en la
caseína y la cisteína más la metionina más en las proteínas del suero del queso.
En los niños lactantes tiene cierta importancia mantener su ingestión proteica a niveles
bajos para que la carga renal de soluto también lo sea. Si una parte de los aminoácidos
absorbidos no se retiene para atender el crecimiento sino que se metaboliza, el
contenido de la urea aumenta y los niños tienen problemas para eliminarla.
El mayor contenido de caseína y de fosfato cálcico de la leche actúan como tampones
en el estómago de los niños e impiden la obtención del pH necesario para la digestión
gástrica de la proteína; por esto se recomiendan productos lácteos fermentados en la
dieta de los infantes con el fin de mantener bajo el pH del estómago.

1.3.2.9 Vitaminas

Dentro de las propiedades nutricionales del suero se encuentran las vitaminas, que son
sustancias orgánicas que en cantidades vestigiales permiten el crecimiento,
mantenimiento y funcionamiento del organismo, el cual es generalmente incapaz de
sintetizarlas.
Aunque la leche contiene la mayoría de las vitaminas en estado fresco, los tratamientos
térmicos que recibe la crema al ser pasterizada para la elaboración de la mantequilla
inducen fuertes pérdidas en las vitaminas más termosensibles (principalmente las
hidrosolubles). Las vitaminas liposolubles (A y D) se encuentran generalmente
interaccionando con los glóbulos de grasa principalmente en la película que los recubre,
mientras que las hidrosolubles se localizan en el suero lácteo.
Vitamina A. Se presenta en la leche como retinol, como ésteres de retinol y como
carotenos; su contenido depende de la cantidad de carotenoides del pasto.
Vitamina D. En los vegetales existe la denominada D2 que se forma por irradiación UV
del ergosterol. La D3 se origina en los animales por irradiación UV del 7-
dehidrocolesterol, especialmente en la piel.

1.3.2.10 Cenizas (minerales)

Se conoce como cenizas, el producto resultante de la incineración del extracto seco de


un alimento expresado en porcentaje. Dicho proceso destruye la materia orgánica
cambiando su naturaleza, obteniéndose de esta manera el contenido de componentes
inorgánicos (minerales). Dentro de los minerales presentes en el suero de mantequilla
se encuentran aquellos que también están presentes en la leche como el calcio,
magnesio, fósforo, potasio, hierro, etc.
Casi todas las sales de la leche se encuentran en el suero lácteo y las micelas de
caseína; mientras que una cantidad muy pequeña se encuentra unida a los glóbulos
Revisión bibliográfica 31

grasos. Esto indica que se recuperan en un gran porcentaje en el suero de la


mantequilla, ya que este incluye el suero lácteo y las micelas de caseína.
La determinación de las cenizas da una idea de contenido total de materias minerales
en un producto.

Cuadro 5. Distribución de algunas sales en la leche y sus requerimientos diarios en


adultos y niños
Niños
mg/100g de Adultos
Compuestos 7-10 años
leche (mg/día)
(mg/día)
Magnesio 12,10 250 300
Calcio 117,70 800 900
Fósforo 95,10 800 900
Hierro 0,05 10 15
Fuente: BADUI, Salvador. Química de los Alimentos. México : Alhambra Mexicana, 1996.
NESTLÉ, La adolescencia. En : Anales Nestlé. México. Vol. 53 No. 3 (1995).

En la leche, el hierro está ligado a la membrana proteica de los glóbulos grasos y es el


mineral con mayor interés nutritivo; el calcio se encuentra en su mayor parte (70%), en
forma coloidal unido a las caseínas mediante el fosfato correspondiente. Por su parte el
50% del fósforo total se encuentra esterificado a las fosfoserinas de las caseínas.
Valor nutricional: Los elementos minerales desempeñan muchas funciones importantes
en el organismo. Por ejemplo el calcio y el fósforo ejercen funciones estructurales en los
huesos y dientes. Muchas enzimas necesitan activadores metálicos como Mg, Zn, Fe,
Cu, Mn y Mo. El cobalto es un componente esencial de la vitamina B12 y el hierro, de la
hemoglobina. Los minerales son constituyentes importantes de las soluciones tampón y
contribuyen mucho al mantenimiento del pH, fuerza iónica y presión osmótica de los
líquidos y tejidos corporales.
La leche y por tanto el suero de la mantequilla proporciona virtualmente todos los
minerales mayoritarios y minoritarios requeridos por la especie humana. En cuanto al
calcio, este se absorbe muy bien en el intestino y su absorción está relacionada con la
del fosfato; la proporción realmente grande de Ca/P del suero de la mantequilla es muy
ventajosa, especialmente en los ancianos, para prevenir la osteoporosis excesiva.

1.3.2.11 Fibra dietaria

Se define como el grupo de polisacáridos estructurales no aprovechados


metabólicamente por los organismos monogástricos, incluyendo al hombre. Están
constituidos por celulosa, lignina y pentosas. La función principal de la fibra es que tiene
la capacidad de hincharse al absorber agua y por lo tanto de aumentar el volumen de la
materia fecal; esto provoca un incremento en los movimientos peristálticos del intestino,
facilita el tránsito, la distensión intestinal y consecuentemente la defecación. Si se
excede en su consumo puede causar diarreas. La fibra total se refiere a la suma de la
fibra dietaria soluble e insoluble.
Revisión bibliográfica 32

1.3.3 Ensayo enzimático

Dentro de los ensayos enzimáticos se realiza la prueba de la fosfatasa, cuyo resultado


no corresponde a una propiedad fisicoquímica. Este ensayo tiene por objeto comprobar
la total destrucción de las enzimas fosfatídicas durante el tratamiento térmico de los
productos lácteos. Es bueno anotar que estas enzimas son más difíciles de destruir por
la acción del calor que el bacilo de la tuberculosis. Se aplica para el suero como materia
prima y al producto terminado para comprobar la pasterización de la crema y la del
producto respectivamente.

1.3.4 Características microbiológicas del suero de la mantequilla

Como resultado de la pasterización de la crema se destruye un gran número de


bacterias además de las patógenas existentes en la leche cruda que se descrema. Sin
embargo algunas bacterias lácticas no patógenas pero sí fermentativas permanecen,
razón por la cual se enfría de 4 a 8ºC para evitar la propagación de estas. Además el
suero de mantequilla puede contaminarse en su paso por los equipos con bacterias
coliformes y levaduras (especies de Saccharomyces). El riesgo de esta contaminación
se puede reducir casi al mínimo limpiando y desinfectando escrupulosamente todas las
máquinas y todos los aparatos y recipientes empleados en su obtención. La capacidad
de conservación del suero se puede alargar pasterizándolo a 60ºC por 15 segundos en
un intercambiador de placas8.
Dentro de la flora contaminante que puede existir en el suero de mantequilla se
encuentran microorganismos específicos como:

1.3.4.1 Staphylococcus aureus

Es la única especie patógena que se conoce hoy en día dentro del género de los
Staphylococcus. Estos microorganismos son aerobios y anaerobios facultativos;
provocan una fermentación acidificante de la glucosa con un descenso acusado de pH
(hacia 4,3 y 4,5) y actúan en una amplia zona de pH, de 4,2 a 9,3. La presencia de
Staphylococcus aureus en alimentos debe interpretarse como indicativo de
contaminación a partir de la piel, boca y fosas nasales de los manipuladores de
alimentos, además de material, equipos sucios y materias primas de origen animal
contaminadas. Pueden provocar enfermedades como neumonía, osteomielitis, carditis,
meningitis y artritis.

1.3.4.2 Hongos y levaduras

Los hongos y levaduras son microorganismos eucariotas, aerobios que se desarrollan


en casi cualquier medio de cultivo y que se ponen de manifiesto cuando existen
condiciones desfavorables para el crecimiento bacteriano como medios ácidos. En los
productos lácteos se pueden encontrar hongos de la clase Phycomycetos,

8
SPREER, Edgar. Lactología Industrial. Zaragoza : Acribia, 1991. p. 459.
Revisión bibliográfica 33

Ascomycetos (aspergillus y penicillium) e Imperfectos. Aunque la mayor parte de los


hongos son inocuos para los humanos, algunas 50 especies causan enfermedades
como micosis y alergias o intoxicaciones (micotoxinas). Las levaduras transforman
azúcares en alcohol. Se clasifican como Ascomycetos no formadores de micelios;
dentro de los más importantes se encuentra el género Saccharomyces fragilis y
Saccharomyces lactis, presentes en leches fermentadas.

1.3.4.3 Coliformes

Los coliformes son microorganismos indicadores utilizados para determinar calidad


sanitaria. Se refiere a aquella población formada por bacilos Gram-, aerobios y
anaerobios facultativos, no formadores de esporas. Fermentan la lactosa con
producción de ácido láctico y trazas de otros productos (ácido acético, ácido fórmico,
CO2, etc.) en presencia de sales biliares dando origen a olores y sabores
desagradables.
Los coliformes fecales representan una población en la que se presume una alta
proporción de Escherichia coli. Esta enterobacteria es un indicador universal de
contaminación fecal; produce ácido acético y fórmico, CO2 y H2 además de ácido láctico
en la fermentación de la lactosa; es causante de infecciones disentéricas y de las vías
urinarias en personas mayores.

1.3.4.4 Mesófilos

Los mesófilos son bacterias, levaduras y mohos que crecen óptimamente en un rango
de temperatura de 30 a 37ºC. Ciertas especies se desarrollan en presencia de oxígeno
(aerobios), otras en su ausencia (anaerobios) y alguna proliferan con o sin oxígeno
(anaerobios aerotolerantes). El recuento de mesófilos es útil como grupo indicador para
evaluar la calidad microbiológica de los alimentos, determinar condiciones inadecuadas
de almacenamiento, y para medir la eficacia de tratamientos térmicos o de sanitización.
Sin embargo dicho recuento no es útil en productos fermentados, ya que en ellos es
deseable una proliferación microbiana y el análisis no diferencia entre esta y la flora
indeseable; entonces se determina el grado de contaminación para estos productos por
el recuento de coliformes totales.

1.4 BIOTECNOLOGÍA

La biotecnología no es, en sí misma, una ciencia; es un enfoque multidisciplinario que


involucra varias disciplinas y ciencias (biología, bioquímica, genética, virología,
agronomía, ingeniería, química, medicina y veterinaria entre otras). En términos
generales biotecnología es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de
organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre. Como tal, la
biotecnología ha sido utilizada por el hombre desde los comienzos de la historia en
Revisión bibliográfica 34

actividades tales como producción de bebidas alcohólicas, productos lácteos


fermentados, los hongos comestibles, el pan, la proteína unicelular, etc.
La biotecnología moderna está compuesta por una variedad de técnicas derivadas de la
investigación en biología celular y molecular, las cuales pueden ser utilizadas en
cualquier industria que utilice microorganismos o células vegetales y animales.
La biotecnología se aplica actualmente en sectores tan diversos como la salud animal y
humana, agroalimentación, suministros industriales, producción de energía y protección
del medio ambiente.

1.5 BACTERIAS LÁCTICAS

Las bacterias más importantes en los productos lácteos, tanto por sus actividades
bioquímicas como por su número son aquellas que fermentan la lactosa dando una
proporción elevada de ácido láctico en los productos de degradación y que solo son
débilmente proteolíticas. Pertenecen a la familia de Lactobacillaceae y
Streptococcaceae, es decir que son consideradas un grupo único que contiene cocos y
bacilos.
Estas bacterias se caracterizan como Gram+, comúnmente no móviles, no esporuladas
que producen ácido láctico como un producto principal o único del metabolismo
fermentativo. Los miembros de este grupo carecen de porfirinas y citocromos, no
realizan fosforilación por transporte de electrones y de allí que reciban su energía solo
por fosforilación a nivel de sustrato. Todas las bacterias acidolácticas crecen de manera
anaeróbica. Sin embargo, a diferencia de muchos, la mayor parte de ellas no son
sensibles al oxígeno y pueden crecer en su presencia o ausencia; por lo tanto, son
anaeróbios aerotolerantes.
La mayoría de las bacterias acidolácticas pueden obtener energía solo de los
carbohidratos y compuestos relacionados, y de allí que estén restringidos a hábitats en
que existen azúcares. Por lo general, tiene una capacidad biosintética limitada y sus
requerimientos nutricionales complejos incluyen necesidades de aminoácidos,
vitaminas, purinas y pirimidinas.
Una diferencia importante entre los subgrupos de dichas bacterias se basa en la
naturaleza de los productos que se forman en la fermentación de los azúcares. Un
grupo denominado homofermentativo que producen solo ácido láctico y otro
heterofermentativo que produce además otros compuestos.

1.5.1 Importancia de las bacterias lácticas

El consumo de ciertas bacterias es benéfico para nuestro organismo. Por ejemplo los
productos fermentados con cultivos activos, favorecen el establecimiento de bacterias
lácticas que ayudan al mantenimiento del tracto digestivo facilitando la absorción de
nutrientes y evitando el establecimiento de patógenos. Se dice entonces que estas
bacterias y levaduras tienen una acción probiótica y se definen como un grupo de
Revisión bibliográfica 35

microorganismos vivos que tienen un efecto benéfico en la prevención de ciertas


condiciones patológicas9.
Algunos beneficios generados por dichos microorganismos a la salud del hombre son:

• Aumentar la capacidad inmunológica contra infecciones y la habilidad de lucha


contra virus.
• Aumentar la respuesta inmunológica.
• Reducir el crecimiento de ciertas bacterias que producen carcinogénicos.
• Bajar la presión sanguínea por la acción proteolítica en la caseína durante la
fermentación.
• Reducir la incidencia de infecciones vaginales e infecciones urinarias.
• Aumentar la excreción de las sales biliares e inhibir la enzima necesaria para la
producción de colesterol, bajando los niveles del mismo en la sangre.
• Prevenir los síntomas provocados por la dermatitis atópica en niños.
• Mejorar la digestión de la lactosa reduciendo los malestares como diarrea, gases
e inflamación estomacal que provoca la intolerancia a este azúcar.

Probablemente no todas las variedades de probióticos tendrán el mismo efecto, se


diferencian en su capacidad de adherencia al epitelio intestinal y de regulación del
sistema inmunológico.
La producción de ácido láctico y consecuente descenso del pH generado por las
bacterias acidolácticas, proporciona los siguientes beneficios al producto:

• Protección de las sustancias alimenticias debida a la inhibición de las bacterias


de la putrefacción en medio ácido.
• Establecimiento de las condiciones fisicoquímicas favorables a diversas
transformaciones en la industria láctea; desuerado de las cuajadas de quesería,
elaboración de mantequilla.
• Fermentación láctica “aromatizante” que permite la obtención de productos
ácidos con un sabor deseado: nata, mantequilla, yogur, etc.
• Propiedades higiénicas resultantes de la acción antiséptica del ácido láctico en el
intestino.
• Producción industrial de ácido láctico.
Otras actividades que pueden tener efectos útiles o perjudiciales son:
• Producción de enzimas que intervienen en la degradación de las proteínas, en
especial de la caseína en el curso de la maduración de los quesos.
• Producción de sustancias inhibidoras responsables de la selección de las
especies.
• Producción de viscosidad, de gas (hinchamiento), de manchas de moho, etc.

9
SANDERS, P. Probíoticos. En www.google.com/probióticos/html. (Mayo 5 de 2001)
Revisión bibliográfica 36

1.5.2 Género Streptococcus

Este género contiene una amplia variedad de especies con hábitats muy diferentes,
cuyas actividades son de importancia práctica considerable para el hombre. Algunos
miembro son patógenos para personas y animales. Como productores de ácido láctico,
ciertos Streptococcus desempeñan papeles importantes en la producción de leche
agria, de ensilados y otros productos fermentados. Para distinguir los Streptococcus
generalmente no patógenos de las especies patógenas para el hombre, dicho género
se ha divido en dos subgéneros. El género Lactococcus contiene Streptoccocus
significativos en la industria de lácteos (p.ej. Lactococcus lactis ss. lactis y Lactococcus
lactis ss. cremoris), en tanto que el género Enterococcus se ha creado para agrupar los
Streptococcus en primer lugar de origen fecal.
Los Lactococcus tienen como hábitats las plantas y productos lácteos, sobreviven a
temperaturas de 63ºC por 30 segundos y presentan un buen crecimiento a 10ºC pero
su optimo desarrollo se da a 30ºC, lo que los clasifica como organismos mesófilos. El
rango de pH en el que se desarrollan es de 9,3 hasta 4,2 aproximadamente.
Las bacterias utilizadas para la fermentación del suero de mantequilla en el proyecto
son Lactococcus lactis ss. lactis y Lactococcus lactis ss. cremoris que son
principalmente responsables de fermentar lactosa, glucosa y galactosa pero no
sacarosa y maltosa, para generar acidez en forma de ácido láctico únicamente
(homofermentativos). En caso de buscar aromas significativos en el producto, se utilizan
bacterias del género Leuconostoc mesenteroides ss. cremoris o en raras ocasiones la
cepa diacetylactis de la especie Lactococcus lactis, que son responsables de la
producción de diacetilo a partir del citrato presente en el suero.

1.6 FERMENTACIÓN

En su aspecto bioquímico es un proceso anaerobio que genera energía en el que los


compuestos orgánicos actúan como dadores de electrones y aceptores terminales de
electrones. En su aspecto práctico la fermentación es un proceso destinado a la
obtención de un producto mediante el cultivo masivo de microorganismos.
El potencial de la fermentación es tan variado como los mismos microorganismos, pero
es necesario conocer estos microorganismos, controlar su metabolismo y crecimiento y
manejarlos a gran escala.
Hay muchos tipos diferentes de fermentación, pero en condiciones fermentativas
solamente se efectúa una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto
orgánico y, por consiguiente, sólo una pequeña cantidad de la energía potencial
disponible se libera. La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción
posterior de un compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato
inicial fermentable; así, no se requiere un aceptor de electrones suministrado
externamente.
Revisión bibliográfica 37

El ATP se produce en las fermentaciones por un proceso que se llama fosforilación a


nivel de sustrato. En dicho proceso, el ATP se sintetiza durante etapas enzimáticas
específicas en el catabolismo del compuesto orgánico.
Un ejemplo de fermentación es el catabolismo de la glucosa por una bacteria del ácido
láctico:
glucosa 2 ácido láctico
C6H12O6 2C3H6O3

Nótese que esta es una reacción balanceada y que el producto, ácido láctico, tiene la
misma proporción de hidrógeno y oxígeno que la glucosa. La energía liberada en esta
fermentación es de 121,5 kJ/mol y se conserva por fosforilaciones a nivel de sustrato en
forma de enlaces fosfato de alta energía en el ATP.
El crecimiento de un microorganismo está determinado, entre otros factores, por la
cantidad de energía que pueda obtener de la degradación de los nutrientes. Bajo estos
supuestos la fermentación es un proceso menos eficaz energéticamente que la
respiración aerobia, ya que parte de la energía presente en la sustancia orgánica
descompuesta está todavía presente en los compuestos finales, como en el etanol o el
ácido láctico.
Todos los pasos de la fermentación pueden resumirse en un esquema general. Se trata
de la degradación de un azúcar hasta el producto intermedio central ácido pirúvico, del
cual se originan los diversos productos de la fermentación. El paso del azúcar al ácido
pirúvico presenta una oxidación. Algunos productos de degradación del azúcar ceden
hidrógeno, que es captado por un coenzima específica (NAD+ o NADP+) para ser
empleado posteriormente en la reducción del propio ácido pirúvico o de sus productos
de degradación o transformación.
La fermentación ácido láctica se emplea casi desde tiempo tan antiguo como la
fermentación alcohólica para la preparación de diversos productos. Este proceso
comienza con la hidrólisis de la lactosa presente en la leche. La hidrólisis de este
azúcar es efectuada por la β-galactosidasa o lactasa, la cual mediante la inclusión de
una molécula de agua rompe el enlace glucosídico (1-4) que une los dos
monosacáridos (figura 5).

CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH


Lactasa
+
H2O

Lactosa Galactosa Glucosa

Figura 5. Hidrólisis de la lactosa por la β-galactosidasa


Fuente: GARCÍA, Garibay, QUINTERO, Ramírez, LÓPEZ, Munguía. Biotecnología alimentaria.
México : Limusa, 1993.
Revisión bibliográfica 38

La galactosa debe sufrir un proceso de isomerización a glucosa por la acción


combinada de cuatro enzimas (galactoquina, UDP galactosa pirofosforilasa, UDP
glucosa C4 epimerasa y galactosa fosfato uridil trasferasa), para actuar como sustrato
en la fermentación acidoláctica. Entonces la transformación de lactosa en ácido láctico
se da de la siguiente manera:
C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6
lactosa glucosa galactosa

C6H12O6
glucosa

2 C3H6O3 2 C3H6O3
ác. láctico ác. láctico

Las bacterias acidolácticas degradan la glucosa que resulta de la hidrólisis de la lactosa


y llevan a cabo la conversión de la galactosa a glucosa para su posterior degradación
por el proceso de glucólisis.
En la glucólisis (proceso posterior a la hidrólisis de la lactosa) se suceden una serie de
reacciones por medio de las cuales se convierte una molécula de glucosa en dos
moléculas de piruvato produciendo ATP. Cada reacción es regulada por una enzima
específica, y en cada reacción hay una ganancia neta de dos moléculas de ATP. La
glucólisis no requiere de oxigeno y puede realizarse en condiciones aerobias o
anaerobias. La ruta para la degradación de la glucosa y la fructosa es llamada Embden-
Meyerhof-Parnas (EMP o glucólisis).
La energía obtenida en los procesos de fermentación, que las células aprovechan para
las reacciones endergónicas, se acumula en forma de ATP. La energía calorífica que se
produce simultáneamente no es utilizable por la célula y carece de significado
bioquímico. Parte de la energía del ATP se emplea en la fosforilación de las hexosas,
que constituye un paso previo para que comience el metabolismo de los hidratos de
carbono. Tras esta fosforilación, el ATP queda convertido en ADP. En presencia de
fosfato inorgánico (Pi) este ADP se transforma nuevamente en ATP mediante la energía
liberada en el proceso de degradación de las hexosas a ácido pirúvico. Con menor
frecuencia se obtiene también energía en forma de ATP en las reacciones que
conducen desde el ácido pirúvico a los productos finales de la fermentación. En la
glucólisis se presenta una serie de reacciones, cada una catalizada por una enzima
específica.

• La glucólisis comienza con una reacción de preparación, en la cual se activa la


glucosa. La glucosa recibe un grupo fosfato de una molécula de ATP. El ATP es
fuente de energía y de fosfatos necesarios para unir el fosfato a la molécula de
glucosa. Una vez se gasta el ATP, se convierte en ADP y se une a la reserva de
ADP en la célula, hasta que se convierte de nuevo en ATP. Esta reacción la cataliza
la hexocinasa. La glucosa fosforilada se llama glucosa 6-fosfato. La fosforilación de
la glucosa le da mayor reactividad química. La carga eléctrica del grupo fosfato evita
que la glucosa salga de la célula, ya que la membrana celular es impermeable a
iones.
Revisión bibliográfica 39

• La glucosa 6-fosfato vuelve a arreglar sus átomos de hidrógeno y oxígeno, otra


reacción de preparación, catalizada por una isomerasa. En esta reacción, la glucosa
6-fosfato se convierte en su isómero fructosa 6-fosfato.
• Posteriormente otra molécula de ATP dona un fosfato a la molécula, formando
fructosa-1,6 difosfato. Hasta aquí se han invertido dos moléculas de ATP sin que se
haya producido uno solo. Los grupos fosfatos se unen a los carbonos 1 y 6 mediante
enlaces éster; la molécula se encuentra lista para dividirse.
• La fructosa 1,6 difosfato se divide, mediante una enzima aldolasa, en dos azúcares
de tres carbonos, el gliceraldehído 3-fosfato (GAL3P) y la dihidroxiacetona fosfato.
Esta última puede convertirse enzimáticamente en su isómero, el gliceraldehído 3-
fosfato, para su posterior metabolismo en la glucólisis. Aunque la isomerasa
interconvierte estos azúcares, sólo el GAL3P continúa en la secuencia glucolítica.
Esto desvía el equilibrio en dirección del GAL3P.
• El GAL3P reacciona con un grupo SH (sulfihidrilo) de la enzima gliceraldehído 3-
fosfato deshidrogenasa, formando un grupo H-C-OH que puede deshidrogenarse
con el NAD+ como aceptor. El producto de esta reacción es el fosfoglicerato, que
permanece unido a la enzima. La reacción exergónica está acoplada a otra reacción
que produce un enlace energético del fosfato con el carbono uno. En esta reacción
el fosfoglicerato reacciona con un fosfato inorgánico del citoplasma para formar 1,3-
difosfoglicerato, que es liberado por la enzima. En esta reacción de oxidorreducción,
el GAL3P se convierte en difosfoglicerato, y el grupo fosfato recién agregado está
unido por un enlace energético.
• El fosfato energético reacciona con el ADP para formar ATP. Esta transferencia de
un fosfato energético de un compuesto a la molécula de ATP se denomina
fosforilación a nivel de sustrato.
• El 3-fosfoglicerato se arregla en 2-fosfoglicerato mediante un cambio enzimático de
la posición de su grupo. Esta es una reacción de preparación.
• Posteriormente, en una reacción poco usual, se genera un fosfato energético, por la
eliminación de agua; es decir, en una reacción de deshidratación, en lugar de
generarse por la eliminación de un hidrógeno (deshidrogenación). El producto de
esta reacción es el fosfoenolpiruvato (PEP). El enlace fosfato energético del PEP es
el segundo de este tipo formado a nivel del sustrato en el metabolismo de la glucosa
al piruvato.
• Cada una de las dos moléculas de PEP pueden transferir su grupo fosfato al ADP
para producir ATP y piruvato.
Por la deshidrogenación del NADH que viene de la producción del ácido 1,3-
difosfoglicérico se genera una reducción del piruvato a ácido láctico.
A continuación se describe la diferencia existente entre los procesos homo y
heterofermentativos.
Revisión bibliográfica 40

Homofermentación y Heterofermentación

Una diferencia importante entre los subgrupos de las bacterias acidolácticas se basa en
la naturaleza de los productos que se forman en la fermentación de los azúcares. Un
grupo, denominado homofermentativo, produce virtualmente un único producto de
fermentación, el ácido láctico, mientras que el otro grupo denominado
heterofermentativo produce otros productos (en particular etanol y CO2). Las cepas de
Lactobacillus y Sporolactobacillus fermentan las hexosas principalmente a ácido láctico,
con trazas de otros productos como ácidos volátiles, etanol, ácido fumárico y dióxido de
carbono.
Las vías abreviadas para la fermentación de glucosa por un organismo homo o
heterofermentativo aparecen en la figura 6. Las diferencias observadas en los
productos de fermentación son determinadas por la presencia o ausencia de la enzima
aldolasa, una de las enzimas clave en la glucólisis.
Los heterofermentadores carentes de aldolasa no pueden descomponer el difosfato
hexosa a fosfato triosa. En lugar de ello, oxidan glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconato y
entonces descarboxilan esto a pentosa fosfato, que se transforman en triosa fosfato y a
acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolosa. La triosa fosfato se convierte por
último en ácido con la producción de un mol de ATP, mientras el acetilfosfato acepta
electrones a partir de NADH generando durante la producción de pentosa fosfato, y así
se convierte en etanol sin producción de ATP. Debido a esto, los heterofermentadores
producen solo un mol de ATP a partir de glucosa, en lugar de dos moles, como los
homofermentadores. Esta diferencia en el producto de ATP a partir de glucosa refleja el
hecho de que los homofermentadores producen el doble de masa celular que los
heterofermentadores de la misma cantidad de glucosa. Dado que los
heterofermentadores descarboxilan 6-fosfoglucanato, producen CO2 como un producto
fermentativo, mientras que los homofermentadores producen poco o nada de CO2;
entonces, una forma simple de detectar un heterofermentador es observar la
producción de CO2 en cultivos de laboratorio.
A nivel enzima, los heterofermentadores se caracterizan por falta de aldolasa y la
presencia de fosfocetolasa. Muchas cepas de heterofermentadores pueden utilizar
oxígeno como aceptor de electrones con una flavoproteína que sirve como donador de
electrones. En esta reacción, la mitad de NADH generada por la oxidación de la glucosa
a ribosa es transferida a una flavina y en O2. El acetilfosfato puede entonces convertirse
en acetato en lugar de ser reducido a etanol y se sintetiza un ATP adicional.
Revisión bibliográfica 41

Homofermentativa Heterofermentativa
glucosa
glucosa
ATP
ATP
ADP
ADP A glucosa 6-fosfato
C NAD
glucosa 6-fosfato T
NADH
I
V ácido 6-fosfoglucónico
A NAD
fructosa-1, 6-fosfato C NADH
I
Ó ribosa 5-fosfato + CO2
ATP
N pentosas
ADP
xilulosa 5-fosfato
Pi
fructosa 1,6-difosfato
aldolasa fosfocetolasa

gliceraldehído + dihidroxiacetona gliceraldehído + acetilfosfato


3-fosfato fosfato 3-fosfato NADH
Pi NAD Pi NAD
NAD
NADH NADH

ácido 1,3-difosfoglicérico acetaldehído


ácido 1,3-difosfoglicérico
NADH
ADP ADP
O
NAD
ATP X ATP
I
ácido 3-fosfoglicérico D ácido 3-fosfoglicérico etanol
A
C
I
ácido 2-fosfoglicérico Ó
N ácido 2-fosfoglicérico

H2O H2O

fosfoenolpiruvato fosfoenolpiruvato
ADP ADP
Pi Pi
ATP ATP

piruvato piruvato
NADH NADH
NAD NAD

ácido láctico ácido láctico


Figura 6. Esquema de la fermentación de la glucosa
Fuente: BROCK, Thomas y MADIGAN, Michael. Microbiología. México : Prentice Hall, 1993.
Revisión bibliográfica 42

1.6.2 Fermentación discontinua

Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un sistema
cerrado. A tiempo cero t=0, la solución esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas
de fermentación. El crecimiento de un microorganismo está condicionado a la
conjunción de diferentes factores (sustancias nutritivas) y condiciones fisicoquímicas
como la temperatura, el pH y la aireación entre otros. La composición del medio de
cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia
generalmente en forma continua como resultado del metabolito de las células.
Después de la inoculación de una solución nutritiva estéril con microorganismos y su
cultivo en condiciones fisiológicas se observan cuatro fases típicas de crecimiento: fase
de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte.

1.6.2.1 Fase de latencia

Cuando las células se transfieren de un medio a otro no existe inicialmente aumento en


el número de células, aunque la masa celular puede cambiar. Durante la fase de
latencia, los microorganismos se adaptan a su nuevo ambiente. Debido a esta
transferencia al nuevo medio probablemente serán alterados por las células del inóculo
varios parámetros: cambios en el valor del pH, aumento en el suministro de nutrientes,
descenso en los inhibidores de crecimiento. Fuera de la célula pueden difundir
cofactores esenciales y las enzimas del metabolismo primario deben ajustarse a las
nuevas condiciones.
Además, la condición fisiológica del inóculo es crucial respecto de la longitud de la fase
de latencia. Si el cultivo que se va utilizar como inóculo se encuentra todavía en la fase
logarítmica, puede no existir período de latencia y el crecimiento puede comenzar
inmediatamente. Sin embargo el inóculo que se toma de un cultivo en el que se ha
detenido el crecimiento debido a una limitación de un substrato necesita más tiempo
para adaptarse a la nueva solución de nutrientes.

1.6.2.2 Fase logarítmica

Al final de la fase de latencia las células se han adaptado a las nuevas condiciones de
crecimiento. El crecimiento de la masa celular puede ahora ser descrito
cuantitativamente en función de la duplicación del número de células por unidad de
tiempo o por la duplicación de la biomasa por unidad de tiempo. Representando el
número de células o la biomasa frente al tiempo en una gráfica semilogarítmica se
obtiene una línea recta, de ahí el nombre de «fase logarítmica».
Aunque las células alteran el medio debido a la toma de substratos y la secreción de
productos metabólicos, la velocidad de crecimiento es independiente de la
concentración de substrato en tanto que exista exceso del mismo.
Revisión bibliográfica 43

1.6.2.3 Fase estacionaria

Tan pronto como el substrato es metabolizado o se han formado sustancias tóxicas, el


crecimiento desciende o se detiene completamente. La biomasa aumenta sólo
gradualmente o permanece constante durante esta fase estacionaria, aunque la
composición de las células puede cambiar. Debido a la lisis nuevos substratos
(carbohidratos, proteínas) pueden servir como fuentes de energía para el crecimiento
lento de los supervivientes. Los distintos metabolitos formados en las fase estacionaria
son frecuentemente de gran interés biotecnológico.

1.6.2.4 Fase de muerte

En esta fase las reservas de energía de las células se agotan. Cuando se representan
en forma semilogarítmica los supervivientes frente al tiempo, puede ser obtenida una
línea recta, lo indica que las células mueren a una velocidad exponencial.
La longitud de tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte dependen del
organismo y del proceso utilizado. En los procesos comerciales la fermentación
frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica o antes de que comience la
fase de muerte.
Fase logarítmica
Iog. del número de células

Fase estacionaria
Fase de latencia

Fase de muerte

tiempo
Figura 7. Curva de proliferación típica de una población bacteriana
Fuente: GARCÍA, Garibay, QUINTERO, Ramírez, LÓPEZ, Munguía. Biotecnología alimentaria.
México : Limusa, 1993.

1.7 LECHES FERMENTADAS

Los alimentos fermentados son aquellos cuyo procesamiento involucra el crecimiento y


la actividad de microorganismos. Existe una gran variedad de este tipo de alimentos en
Revisión bibliográfica 44

todo el mundo. Según la norma 777 del ICONTEC, la definición de leche fermentada es
la siguiente:
Producto lácteo higienizado obtenido por fermentación de la leche por la acción de
cultivos lácteos específicos, con o sin adición de derivados lácteos.
La fermentación de la leche para la elaboración de diversos productos es una práctica
muy antigua, la cual seguramente se originó sin intención durante el almacenamiento
del líquido. Existe una amplia variedad de leche fermentadas, en las que interviene un
gran número de especies de bacterias lácticas y algunas levaduras. En ocasiones es
difícil definir algunos de estos productos debido a su gran número ya que se elaboran
de diferentes formas y con distintos tipos de materias primas, este es el caso del
buttermilk, bebida láctea fermentada con bacterias productoras de ácido láctico a base
de suero de mantequilla y el jocoque, bebida igualmente fermentada a base de leche
descremada.
La transformación de la leche en estos productos fermentados representa varias
ventajas, de las cuales la más evidente es la conservación, ya que tienen una vida de
anaquel más larga que la de la leche natural. Además presentan menor riesgo de
contagio de toxiinfecciones que el producto fresco, debido a compuestos
antimicrobianos producidos por las bacterias que intervienen en la fermentación que
inhiben el desarrollo de microorganismos patógenos y productores de toxinas. Desde el
punto de vista nutricional, las proteínas tienen mayor valor biológico debido a la
prehidrólisis que sufren por las proteasas producidas por las bacterias lácticas. También
la grasa y la lactosa resultan más digeribles en estos productos que en la leche fresca
por acción de las enzimas microbianas. Por otra parte la presencia de algunas bacterias
lácticas en el tracto intestinal, contribuyen a un adecuado balance de la flora intestinal
del hombre y se definen como organismos probióticos.
El buttermilk o suero de la mantequilla es una bebida refrescante que se obtiene como
producto de la elaboración de la mantequilla con crema ácida o acidificando el suero si
este proviene de crema dulce. Se consume natural o con adición de sabores.
La norma 777 del ICONTEC tiene como objeto establecer los requisitos que debe
cumplir las leches fermentadas como: yogur, kumis, leche cultivada y las bebidas
lácteas a base de leche fermentada, destinadas al consumo directo o a su elaboración
posterior.
Algunos productos fermentados de interés para comparar con el producto elaborado en
el proyecto son:
Kumis: producto obtenido a partir de la leche higienizada o de una mezcla higienizada
de esta con derivados lácteos, fermentado por la acción de Lactococcus lactis ss.
cremoris y Lactococcus lactis ss. lactis, los cuales deben ser viables, abundantes y
activos en el producto hasta el final de su vida útil.
Bebida láctea a base de leche fermentada: producto lácteo de consistencia fluida
obtenida a partir de la leche fermentada mezclada con otros derivados lácteos e
ingredientes higienizados.
Yogur: Producto obtenido a partir de leche higienizada o de una mezcla higienizada de
esta con derivados lácteos, fermentada por acción de Bifidobacterium o Lactobacillus
Revisión bibliográfica 45

acidofilus u otros cultivos lácticos inocuos los cuales deben ser viables, abundantes y
activos en el producto hasta el final de su vida útil.

A continuación se exponen las parámetros de control de calidad para las leches


fermentadas que determina el ICONTEC en su norma 777; además se muestran las
propiedades que no se tienen en cuenta en dicha norma encontradas en bibliografía
para el yogur.
La prueba de la fosfatasa se aplica al producto terminado para garantizar su inocuidad.
Debe ser negativa según la norma 777 del ICONTEC para la comprobación de la
pasterización de la leche con que se fabrican los productos fermentados.
La densidad por su parte no es un parámetro de control de calidad para productos
fermentados y su valor es estipulado por el fabricante.
El valor de la materia grasa es un requisito fisicoquímico de la norma 777 del ICONTEC
al igual que el contenido de proteína y el porcentaje de acidez (cuadro 6). Esta última
propiedad está relacionada directamente con el pH del cual no se tiene especificación
en la norma; para el yogur bajo en grasa (0,5 - 1%) se encuentra entre 3,7 y 4,7.10
En cuanto a los sólidos totales el porcentaje para el yogur bajo en grasa es de 14% y
los solubles, con un porcentaje de grasa de 0,5% serían del 13,5%. El contenido de
lactosa debe ser aproximadamente de 3,0 a 4,5%.11
Entre los minerales el calcio se presenta en el yogur con un 0,12%, fósforo con 0,095%
y 5 x 10-5% de hierro.12
Los requisitos fisicoquímicos y microbiológicos para las leches fermentadas dictados
por el ICONTEC (norma 777) son:

Cuadro 6. Requisitos fisicoquímicos de las leches fermentadas


Requisitos
Materia grasa (%p/p) 0,5% máximo (yogur, kumis, leche cultivada)
yogur, kumis, leche cultivada 2.6% mínimo
Proteína láctea (%p/p)
leches fermentadas 2,8% mínimo
Acidez titulable (ác. láctico %p/p) 0,6% mínimo
Fosfatasa negativa
Fuente: NTC 777 : 1994, Derivados lácteos, leches fermentadas.

En el cuadro 7 se presentan los requisitos microbiológicos estipulados, de igual forma,


por la norma 777 del ICONTEC para leches fermentadas.

10
GARCÍA, Garibay, QUINTERO, Ramírez, LÓPEZ, Munguía. Biotecnología alimentaria. México:
Limusa, 1993. p. 167
11
TETRA PAK. Manual de Industrias Lácteas. Madrid : Iberia, 1996. p. 244
12
CHARLEY, Helen. Tecnología de alimentos. México : Limusa, 1997. p. 381
Revisión bibliográfica 46

Cuadro 7. Requisitos microbiológicos para leches fermentadas


Requisitos n m M c
Coliformes NMP/ml (30ºC) 3 10 100 1
Coliformes fecales NMP/ml (45ºC) 3 0 - 0
Recuento de mohos y levaduras UFC/ml 3 200 500 1
Fuente: NTC 777 : 1994, Derivados lácteos, leches fermentadas.

donde:
n: número de muestras
m: número máximo permisible para identificar nivel de buena calidad
M: número máximo permisible para identificar nivel de aceptable calidad
c: número máximo de muestras permisibles con resultados entre m y M

La designación de las leches fermentadas se hace teniendo en cuenta el contenido de


grasa de la siguiente manera:
- Entera
- Parcialmente descremada
- Descremada
Y según se le adicione o no edulcorante:
- Con dulce
- Sin dulce
La norma GTC 3 del ICONTEC, en la parte I y II describe los procedimientos que se
deben seguir para la realización de pruebas de control de calidad fisicoquímicas y
microbiológicas respectivamente.

1.8 ADITIVOS ALIMENTARIOS

«Se entiende por aditivo alimentario toda sustancia que se consume normalmente,
aunque tenga carácter alimenticio y que no sea usada normalmente como ingrediente
característico de un alimento; tenga o no tenga valor nutritivo se añade
intencionalmente a un alimento con un fin tecnológico u organoléptico, en cualquier fase
de fabricación, de la transformación, del tratamiento, del acondicionamiento, del
envasado, del transporte o del almacenamiento del referido alimento y que pueda
afectar o afecte directa o indirectamente su incorporación a la de sus derivados en el
alimento o pueda afectar de otra manera las características de dicho alimento. La
expresión no se aplica ni a los contaminantes ni a las sustancias añadidas a los
alimentos con el objeto de mantener o mejorar sus propiedades nutritivas». (MULTON,
1993, 23).

Justificación del empleo de los aditivos. Desde principios de siglo (1905) se


investigaba para identificar y valorar lo que se llamaban "productos químicos", términos
que parecían apropiados puesto que se trataba de sustancias sin valor nutritivo, de
estructura química, esencialmente colorantes y conservadores.
Revisión bibliográfica 47

Ahora bien, muchos de estos productos químicos no han sido producidos naturalmente.
La mayoría son productos de síntesis o de la extracción purificada de sustancias cuyos
efectos se habían observado anteriormente. Hay una cierta continuidad en el empleo a
pequeñas dosis de productos que se "añaden" al alimento base para prolongar su
conservación, mejorar su valor nutritivo, resaltar su presentación y para aumentar en fin,
la diversidad de preparaciones alimenticias.

Colorantes Alimentarios. La coloración constituye un factor importante y a veces


decisivo en la elección que el consumidor va a hacer, pues la coloración es un elemento
inmediatamente accesible para la evaluación de la calidad de un alimento; en efecto, el
color está frecuentemente relacionado con la madurez, con la presencia de impurezas,
con la puesta en marcha adecuada o defectuosa de un tratamiento tecnológico, a malas
condiciones de almacenamiento, a un principio de alteración de microorganismos, etc.

Se debe pues considerar a los colorantes como aditivos alimentarios, como los aditivos
menos indispensables, sobre todo si se les compara con los conservadores o con los
agentes de textura cuyas necesidades son más fáciles de justificar.
En tecnología se buscará obtener un poder colorante seguro, estable, reproductible y
eficaz; se tendrá interés en utilizar unas dosis lo más débiles posibles por la solubilidad
del colorante y por su capacidad de fijarse a las moléculas del alimento. Los aspectos
de inocuidad interesan evidentemente a todo el mundo, y más directamente al
consumidor que rehúsa el menor riesgo para un aditivo que le parece a veces inútil. Las
mentalidades pueden variar en una población o según los países.

Espesantes. Los espesantes alimentarios son macromoléculas que se disuelven o


dispersan fácilmente en el agua para producir un aumento en la viscosidad de los
productos. Además dicho poder espesante ha sido ampliado con otras propiedades
como la estabilización de suspensiones y emulsiones, poder de retención de agua,
poder suavizante entre otros.

Estabilizantes. A diferencia de los espesantes, los estailizantes se definen como


sustancias destinadas a prevenir en los alimentos cualquier cambio fisicoquímico.
Cumplen con la función de mantener la homogeneidad del producto.
Dentro de los estabilizantes y espesantes utilizados como aditivos en la elaboración de
leches fermentadas, se encuentran la metil celulosa, carboximetilcelulosa,
hidroxipropilcelulosa, carragenina (incluye Furcellaran y sus sales de sodio y potasio),
musgo irlandés, goma guar, xantano, arábiga, caraya, gellan, entre otros. 13 La
concentración máxima de estos aditivos permitada para leches fermentadas es de 5
g/kg, ya sea solos o combinados.

13
Propuesta de la comisión nacional de alimentos. En www. anmat.gov.ar/capt8-4.html (Junio de 2001)
CAPÍTULO 2

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 MATERIALES

Las pruebas fisicoquímicas y microbiológicas se llevaron a cabo en los laboratorios de


fisicoquímica y microbiología de la empresa Coolechera (Barranquilla), haciendo uso de
los equipos y materiales en buen estado y calibrados allí existentes.
La determinación de las proteínas, contenido de lactosa, vitaminas y minerales fueron
llevadas a cabo en el laboratorio de Investigación de la Universidad de la Sabana, en el
laboratorio de análisis de alimentos Asinal Ltda. y Biocontrol Ltda. respectivamente.
Los equipos y materiales utilizados para cada uno de los ensayos fisicoquímicos
comprenden:
• Agitador magnético
• Balanza analítica Sartorius BP221S (± 0,0001)
• Baño termostatado 1 Dies Ero Electronic
• Buretas Pirex de 25 ml (± 0,1 ml)
• Butirómetros Dr. N. Gerber milk-lait 65ºC ISO DP 488
• Centrífuga Dr. N. Gerber Original
• Crisoles y cápsulas de porcelana
• Erlenmeyers Pyrex de 1.000 ml
• Estufa WTB Binder
• Jarras de plástico
• Licuadora Oster
• Matraz aforado Pyrex de 250 ml
• Mufla
• Papel filtro
• Pinza metálica
• Pipetas Pyrex de 10 ml
• Pipetas aforadas Pyrex de 11 ml
• Potenciómetro ORION model 550
• Probetas Pyrex de 200 ml
• Refractómetro Polskie No. 96534
• Scrubber B-414 BÜCHI
• Termolactodensímetro N. Quevenne. Tp. 15ºC
• Unidad de destilación BÜCHI B-324
• Unidad de digestión 435 BÜCHI

48
Materiales y Métodos 49

• Vasos de precipitado Pyrex de 40 ml


Los equipos y el material necesarios para la realización de las pruebas microbiológicas
comprende:
• Autoclave Sterilmatic Market Forge
• Asas de siembra
• Baño termostatado Dies
• Cajas de petri Pyrex
• Campanas de Durham
• Erlenmeyers Pyrex de 1.000 ml
• Incubadora Imperial III
• Mecheros de gas
• Pipetas Pyrex de 10, 5 y 1 ml
• Tubos de ensayo Pyrex de dilución
• Tubos de ensayo Pyrex tapa rosca
Materiales y Métodos 50

2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

A continuación se presenta un diagrama de flujo con los pasos a seguir en la


elaboración de la bebida, desde la obtención de la materia prima, hasta la evaluación
nutricional del producto terminado.

Toma de muestra

Realización de pruebas preliminares: determinación de


pH, sólidos solubles y mesófilos, en la fermentación
con el cultivo comercial

Caracterización microbiológica del suero: Caracterización fisicoquímica del


siembra de tres diluciones de la muestra suero: determinación de fosfatasa,
(10-1,10-2,10-3) para recuento de mesófilos densidad, pH, acidez, grasa, sólidos
aerobios, Staphylococcus aureus, hongos solubles y sólidos totales, por
y coliformes, por triplicado triplicado; proteínas y lactosa

Seguimiento de la fermentación acidoláctica con el cultivo comercial y realización de la


curva de crecimiento: determinación de pH y recuento de bacterias acidolácticas

Realización de la bebida: mezcla de los ingredientes, homogenización y


pasterización a 60ºC por 15 segundos

Análisis organoléptico de las tres formulaciones definitivas por medio de


una prueba de aceptación por consumidores

Caracterización microbiológica de la Caracterización fisicoquímica de la


bebida: siembra de tres diluciones de la bebida: determinación de fosfatasa,
muestra (10-1,10-2,10-3) para recuento de densidad, pH, acidez, grasa, sólidos
mesófilos, Staphylococcus aureus, solubles y sólidos totales, por
hongos y coliformes, por triplicado triplicado; proteínas y lactosa

Realización de pruebas nutricionales: determinación de cenizas, minerales


(Ca, P y Fe), vitaminas (A y D3) y fibra dietaria (soluble e insoluble)

Figura 8. Diagrama de flujo del diseño experimental


Materiales y Métodos 51

Para la caracterización del suero de mantequilla se toma una muestra por día durante
cuatro días para ser analizadas fisicoquímica y microbiológicamente por triplicado,
obteniendo así un tamaño de muestra de 12 observaciones. Dichos datos conforman un
espacio muestral continuo y por tanto son variables aleatorias continuas. La validación
estadística de los datos obtenidos en la caracterización fisicoquímica tanto del suero
como de la bebida terminada, incluye la realización de los histogramas de frecuencia, la
determinación de la media aritmética, varianza y desviación estándar muestral de cada
parámetro medido. Además se aplica una estimación por intervalos de confianza para
determinar los límites de confianza del 95%.
Los resultados de la pruebas microbiológicas se presentan como un intervalo de
confianza del 95% de las muestras sembradas por triplicado:

n x ± 1.96 (n x)
Intervalo de confianza (95%) =
n

donde: n = número de siembras para una muestra


x = media de cada muestra sembrada por triplicado
De igual forma se utiliza esta ecuación para realizar la curva de crecimiento del cultivo
comercial, para lo cual se siembra por triplicado como se explica en la metodología.
A los resultados de los parámetros fisicoquímicos se les aplican los siguientes
estadísticos.
La media aritmética o simplemente media se define como:

∑X i
X = i =1

La varianza muestral se define como:


n

∑(X i − X )2
S2 = i =1

n −1

La desviación estándar muestral se define como:

∑(X i − X )2
S= = i =1

n −1

Los límites de confianza del 100 x (1 - α)% con n – 1 grados de libertad se definen
como:
Linferior = X – t α/2 S / n Lsuperior = X + tα/2 S / n
Materiales y Métodos 52

donde: X : media muestral de la variable aleatoria


n: número de observaciones del espacio muestral
El valor de tα/2 se lee en la tabla de la distribución t de Student.14 Los valores de los
límites de confianza no se pueden tomar como resultados contundentes para el análisis
de las características fisicoquímicas poblacionales del suero de mantequilla utilizado.
Sin embargo son válidos para efectos del análisis de este proyecto, ya que reflejan las
características muestrales del suero.
La determinación de proteínas y lactosa no se incluye en la evaluación estadística de la
caracterización fisicoquímica ya que se realizan una vez para materia prima y otra para
producto terminado. Las pruebas nutricionales se realizan una vez y solo aplican para
producto terminado.

2.3 METODOLOGÍA

En este apartado se describen los ensayos fisicoquímicos y microbiológicos que se


practican en la caracterización del suero como materia prima. Además se explica
detalladamente el procedimiento que se sigue en la elaboración, caracterización y
evaluación nutricional de la bebida fermentada.

2.3.1 Materia prima

La materia prima objeto de investigación y transformación es el suero producto de la


elaboración de la mantequilla con crema pasterizada y no cultivada, obtenido en la
empresa Coolechera ubicada en la ciudad de Barranquilla.
Inicialmente se pretendió trabajar con el suero de mantequilla de la empresa Algarra
S.A. (Zipaquirá), como se planteó en el anteproyecto. Lo anterior no fue posible debido
a que este subproducto proviene de crema acidificada por exposición al ambiente, lo
que provocaba un pH no apropiado para aplicar un proceso de fermentación (aprox.
4,3).
El equipo de elaboración de la mantequilla es continuo; contiene desde los tanques de
almacenamiento de crema cruda (no pasterizada) hasta la empacadora de mantequilla.
La producción de este derivado depende de la demanda y de la cantidad de crema
producida para la obtención de leche descremada. No se procesa de forma
preestablecida, aunque se realiza casi diariamente, produciendo un volumen de suero
de 4.200 lt diarios en promedio.
Para la toma de muestra se flamea la boquilla de salida del suero con un algodón
impregnado en alcohol, previamente encendido y sostenido por unas pinzas metálicas.
El suero se toma lo más cerca posible de su salida del equipo en erlenmeyers estériles
de 1.000 ml de capacidad.

14
LARSON, Jarold. Introducción a la teoría de probabilidades e inferencia estadística. México : Limusa,
1994. Tabla 5, p. 438.
Materiales y Métodos 53

2.3.2 Realización de pruebas preliminares

Con las pruebas preliminares se busca comprobar si el cultivo comercial se comporta


de acuerdo con los parámetros de tiempo de fermentación y pH estipulado en la ficha
técnica.
Para disolver el sobre de cultivo deshidratado, se pasterizan 200 ml de suero de
mantequilla a 80ºC por 20 segundos y se provoca un descenso de la temperatura
colocando el recipiente (erlenmeyer) con suero pasterizado en un baño de agua con
hielo. Se mide la temperatura del contenido con un termómetro previamente
desinfectado con alcohol al 75% y cerca de un mechero; cuando esta llega a ser de
35ºC se disuelve el sobre de cultivo 992 (Ver Anexo E) agitando vigorosamente como
se recomienda por los proveedores (Interenzimas S.A). Del cultivo disuelto se toman 4
ml para inocular 1 lt de suero que se coloca en un baño termostatado a 30ºC. Se toman
100 ml del litro inoculado como control para medir pH y sólidos solubles. El resto se
emplea para sembrar en medio Plate Count Agar y realizar el recuento de mesófilos.
Dichas mediciones y siembras se realizan cada hora hasta completar ocho horas de
fermentación.
La medición de pH y la siembra para el recuento total de microorganismos se realizan
de acuerdo con la norma GTC 3 parte I y II como se indica en la caracterización
fisicoquímica y microbiológica respectivamente. Los sólidos solubles se determinan con
un refractómetro portátil de la siguiente manera: se coloca una pequeña muestra en el
cristal previamente limpiado con alcohol, se tapa, se ubica cerca una fuente lumínica y
se lee el porcentaje de sólidos solubles en la escala.

2.3.3 Ensayo enzimático

El único ensayo enzimático realizado es la prueba de fosfatasa. Se determina de


acuerdo con la norma GTC parte I del ICONTEC y se aplica a todas la muestras que
posteriormente se caracterizan tanto fisicoquímica como microbiológicamente.
Fosfatasa. El ensayo se basa en comprobar la acción de la muestra que se analiza en
un medio amortiguado, sobre el p–nitrofenilfosfato disódico. En presencia de fosfatasa
este último es hidrolizado y el p–nitrofenol liberado comunica una coloración
amarillenta. Esta prueba se le aplica al suero crudo para comprobar la efectividad en
pasterización de la crema.
Reactivos empleados
• Solución amortiguadora de sustrato
• Carbonato de sodio anhidro 3,5 g
• Bicarbonato de sodio 1,5 g
• Agua 1,0 lt
Materiales y Métodos 54

Preparación de la solución amortiguada de sustrato: se disuelven 0,15 g de p-


nitrofenilfosfato disódico en cantidad suficiente de solución amortiguadora para
completar 100 ml. La solución debe rechazarse se está ligeramente coloreada. Puede
conservarse hasta por una semana, protegida de la luz.
Procedimiento: la muestra se lleva a temperatura ambiente; si presenta evidencia de
coloración o que está acidificada, no puede someterse a este ensayo.
Se colocan 5 ml de solución amortiguada de sustrato en dos tubos de ensayo que serán
la muestra y el blanco; se tapan y se llevan al baño termostatado a 37ºC, por tres
minutos. Se agrega 1 ml exacto de suero a uno de los tubos, se tapa, se mezcla bien y
se mantienen por dos horas a 37ºC. Se retiran los tubos del baño termostatado y se
observa inmediatamente el color.
Interpretación de los resultados: si el color de la muestra se mantiene inalterado (igual
al del blanco), la prueba para fosfatasa es negativa, pero si presenta color amarillo de
intensidad variable, la prueba es positiva.

2.3.4 Caracterización fisicoquímica y microbiológica de la materia prima

Para la caracterización microbiológica y fisicoquímica del suero como materia prima se


toman 2 lt de muestra por día de producción. Esta es llevada al laboratorio de
microbiología para realizar las pruebas pertinentes por triplicado, después de lo cual es
transportada al laboratorio de fisicoquímica donde se culmina con los análisis de este
tipo, también por triplicado.
Cuando se hable de muestra se refiere al volumen de suero tomado en un día de
producción y se realizan tres ensayos de cada prueba por muestra (triplicado).
Los ensayos fisicoquímicos y microbiológicos se realizan de acuerdo con la
metodología estipulada en la norma GTC 3 parte I y II del ICONTEC respectivamente,
exceptuando el ensayo de proteínas y lactosa que se llevan a cabo en el laboratorio de
la Universidad de acuerdo con las normas AOAC y en el laboratorio Asinal Ltda. con las
normas del ICONTEC respectivamente.

2.3.4.1 Pruebas fisicoquímicas

A continuación se presentan los procedimientos de la pruebas fisicoquímicas realizadas


a la materia a la materia prima.

2.3.4.1.1 Densidad. Se determina utilizando un termolactodensímetro flotante. Esta


aparato desplaza su propio peso de fluido y la densidad se lee en la escala del cuello, la
cual posee un rango estrecho de medidas para proporcionar mayor exactitud. En el
termómetro que incluye el aparato se lee la temperatura de la muestra.
Procedimiento: la muestra de suero se enfría previamente en la nevera y se vierte una
cantidad suficiente en una probeta en posición inclinada para luego introducir el
lactodensímetro de manera vertical. Se espera a que el líquido alcance la temperatura a
Materiales y Métodos 55

la cual esta graduado el lactodensímetro (15ºC). Se provoca un ligero movimiento de


rotación y se deja reposar un minuto para hacer la lectura.
Expresión de resultados: los grados lactodensimétricos corresponden a la segunda y
tercera cifra decimal del valor de la gravedad específica del suero; es decir, si el valor
leído en la columna del lactodensímetro es 30, entonces la densidad es 1,030 g/ml.
En caso de que la muestra de suero no se encuentre a 15ºC, se debe corregir el valor
leído de la siguiente manera.

L (15ºC) = Lt + 0,24 (t – 15)

donde:
L (15ºC): densidad corregida
Lt: densidad leída a la temperatura t

2.3.4.1.2 Acidez. Se valora la acidez del suero de la mantequilla con una base (NaOH)
en presencia de fenolftaleína como indicador y se calcula el porcentaje de ácido láctico
en la solución.
Procedimiento: se colocan 10 ml de suero en un beacker de capacidad suficiente, que
permita un ligero movimiento de rotación. Se le agrega una cantidad pequeña de
fenolftaleina (4 gotas) y se titula con NaOH 0,1 N, previamente colocado en una bureta,
hasta color rosado permanente.
Valoración del hidróxido de sodio: se seca una cantidad de ftalato ácido de potasio
analítico aproximadamente dos horas a 110ºC, y se deja enfriar en un desecador. Se
pesa una muestra de 0,5 g y se disuelve en 100 ml de agua destilada. Se adicionan dos
gotas de fenolftaleína y se titula con solución de hidróxido de sodio a valorar.
La relación de equivalentes en la neutralización es 1:1. La normalidad de la solución de
ácido clorhídrico se calcula de la siguiente manera:

NNaOH= (0,5/204,2) x 1000 / VNaOH

donde: NNaOH = normalidad del NaOH (equivalentes por litro)


VNaOH = volumen de NaOH requerido en la titulación (ml)
204,2 = peso molecular del Ftalato ácido de potasio (g/mol)
Expresión de resultados de acidez:

% de ácido láctico = ºDor / 100

donde: º Dor = ºSH x 2,25


º SH = ml de NaOH gastados en la titulación de 10 ml de suero

2.3.4.1.3 pH. Se utiliza un potenciómetro. El principio de dicho aparato se basa en que


cuando ciertos electrodos son sumergidos en una disolución, se produce un voltaje
relacionado directamente con el pH de la disolución. La lectura se hace en el tablero
electrónico.
Materiales y Métodos 56

Procedimiento: se coloca el potenciómetro en el modo de pH y se introduce una tercera


parte del electrodo en una cantidad suficiente de muestra para leer en la pantalla digital
el resultado de pH.

2.3.4.1.4 Sólidos totales. Se determina el porcentaje de sólidos totales del suero con la
diferencia de pesos entre la muestra y la materia libre de humedad obtenida después
de la desecación a 100ºC.
Procedimiento: se seca la cápsula destapada junto con la tapa a 100ºC, se deja enfriar
en el desecador y se pesa. Se colocan 5 ml de suero, previamente homogeneizado y
llevado a 20ºC. Se tapa la cápsula y se pesa para determinar la diferencia de pesos de
la muestra. Se coloca la cápsula destapada sobre un baño de vapor por 30 minutos. Se
pasa sin taparla a una estufa y se calienta a 80ºC por 2 horas. Se cubre la cápsula con
la tapa y se pasa a un desecador, donde se deja enfriar y se pesa. Se regresa a la
estufa y se mantiene destapada, en las mismas condiciones, por otras 2 horas. Se deja
enfriar tapada en el desecador y se pesa.
Expresión de resultados:
Sólidos totales (% p/p) = (P1/P) x 100

donde: P1: Peso del residuo = peso del crisol + muestra seca
P: Peso de la muestra = peso del crisol + muestra

2.3.4.1.5 Sólidos solubles. Se calcula el porcentaje de sólidos solubles con la diferencia


entre el porcentaje de sólidos totales y el porcentaje de grasa.
Expresión de resultados:
% Sólido soluble = E - G
donde: E: Porcentaje de extracto seco
G: Porcentaje de grasa

2.3.4.1.6 Lactosa. El contenido de lactosa se determina después de la


desproteinización del suero por un método indirecto, en al cual se valora la cantidad de
halógeno (yoduro de potasio) reducido, en el curso de una reacción entre la lactosa y
una combinación de yoduro de potasio cloramina T. Se expresa como porcentaje de
lactosa monohidratada.
El procedimiento para el análisis de la lactosa es el establecido por las normas
ICONTEC (GTC 3 parte I) y se lleva a cabo por el laboratorio Asinal Ltda.

2.3.4.1.7 Grasa. Para la determinación del porcentaje de grasa se emplea el método


de Gerber. El principio de este método se basa en la liberación de la grasa total por
disolución de las sustancias proteicas, se separa por centrifugación y, posteriormente,
se determina volumétricamente.
Reactivos empleados
• Ácido Sulfúrico al 91%
• Alcohol isoamílico
Materiales y Métodos 57

Procedimiento: Se ponen en el butirómetro 10 ml de ácido sulfúrico de 90-91% y se


agregan 11 ml de suero, previamente homogeneizado; debe procederse lentamente
para que no se mezcle, observándose claramente la separación de las dos capas. Se
agrega 1 ml de alcohol isoamílico y se tapa el butirómetro. Se envuelve este en un paño
y se agita fuertemente hasta la total disolución de la fase proteica del suero. A
continuación se centrifuga por 5 a 10 minutos con el tapón hacia abajo. Se pasa el
butirómetro en la misma posición, al baño termostatado a 65ºC, donde se deja de 5 a
10 minutos manteniendo el nivel de agua por encima de la columna de grasa del
butirómetro. Para leer, se presiona el tapón de caucho hasta que la base de la columna
de grasa quede al nivel de una división principal y se lee la altura de dicha columna.
Expresión de resultados: la altura de la columna de grasa da el porcentaje (p/p) de
grasa en el suero.

2.3.4.1.8 Nitrógeno total y proteínas. Se entiende por proteínas del suero el contenido
de N2 total, determinado por el método de Kjeldahl, multiplicado por el factor 6,38. Una
determinada cantidad pesada de muestra (suero), se calienta con H2SO4 en presencia
de un catalizador, hasta la eliminación total de la materia orgánica para transformar el
nitrógeno orgánico en nitrógeno amoniacal. El amoniaco se libera por adición de NaOH,
se destila y se recoge en un volumen conocido de un ácido (ácido bórico). Una vez la
destilación es completa se realiza la titulación con un ácido valorado (ácido clorhídrico).

Los reactivos empleados son:


• Solución de hidróxido de sodio al 32% p/v
• Ácido sulfúrico concentrado 97% analítico
• Pastillas para Kjeldahl (catalizador)
• Solución de ácido bórico al 2% p/v
• Solución de ácido clorhídrico 1N
• Indicador Taschiro

Reacciones

Muestra + H2SO4 (NH4)2SO4 + CO2 + H2O


suero ácido sulfúrico sulfato de amonio dióxido de carbono

(NH4)2SO4 + 2NAOH 2NH3 + Na2SO4 + 2 H20


sulfato de amonio hidróxido de sodio amoniaco sulfato de sodio

2NH3 + 2H3BO3 2H2BO3- + 2NH4+


amoniaco ácido bórico ion dihidrógeno borato ion amonio

2H3BO3- + 2HCL 2H3BO3 + 2CL-


ion dihidrógeno borato ácido clorhídrico ácido bórico
Materiales y Métodos 58

Digestión: Se enciende la unidad de digestión 435 BÜCHI previamente con el fin de que
se vaya calentando. Se pesan aproximadamente 8, 10 y 12 g de la muestra (cantidad
mínima para determinación de proteínas en lácteos, por Kjeldahl), y un gramo de urea
como medio de control. Luego se colocan en los tubos y se les agregan 20 ml de ácido
sulfúrico concentrado y una pastilla de catalizador a cada uno. Posteriormente se arma
la gradilla con los tubos y la flauta receptora de vapores, se ubica en el digestor y se
enciende la llave de agua y el Scrubber B-414 BÜCHI (receptor de vapores). El proceso
se lleva a cabo durante una hora aproximadamente. La nubosidad que se forma en los
tubos durante el proceso se debe mantener más o menos en la mitad de los mismos, si
se excede, entonces se deberá disminuir la temperatura del equipo. El calentamiento se
detiene cuando la muestra adquiera un color verde manzana brillante. Se retira la
gradilla con los tubos y se dejan enfriar a temperatura ambiente.
Destilación: Una vez la muestra se encuentre a temperatura ambiente, se enciende la
llave de agua y la unidad de destilación BÜCHI B-324. Se verifica que el equipo se
encuentre en el método adecuado, el cual incluye el suministro de volúmenes de 50 ml,
80 ml y 75 ml, de agua destilada, NaOH al 32% y H3BO3 al 2% respectivamente. El tubo
con la muestra y el erlenmeyer receptor se colocan en el equipo, para dar comienzo al
proceso; este se lleva a cabo durante 5 minutos, después de los cuales, el equipo se
detendrá automáticamente. El amoniaco destilado y recogido en solución de ácido
bórico será posteriormente titulado.
Titulación: Se titula con solución valorada de HCL 1N hasta cambio de color verde a
azul violeta, utilizando como indicador dos gotas de Taschiro.

• Cálculo del contenido total de nitrógeno y porcentaje de proteínas de la muestra

Según la estequiometría de las reacciones:

34 g NH 3 121,64 g H 2 BO3− 72,9 g HCL 1equ. HCL 1.000 ml


NM × × × −
× × = VHCL
28 g Nit 34 g NH 3 121,64 g H 2 BO3 36,45 g HCL N HCL

VHCL × N HCL NM
∴ NM = → %NM = × 100 → % Pr oteínas = % N M × 6,38
71,43 WM

donde: NM = contenido de nitrógeno de la muestra (g)


VHCL = volumen de HCL gastados en la titulación (ml)
NHCL = normalidad de HCL (equivalentes por litro)
71,43 = constante obtenida a partir de la estequiometría de las reacciones
WM = peso de la muestra (g)
6,38 = factor para determinación de proteínas en lácteos

2.3.4.1.8.1 Curvas de calibración: en la realización de las curvas de calibración para el


método Kjeldahl se calculó el porcentaje de error de exactitud para la digestión,
destilación y titulación.
Materiales y Métodos 59

2.3.4.1.8.1.1 Titulación: para determinar el error de exactitud en la titulación, se midió el


volumen de una gota de ácido clorhídrico 1N de la siguiente manera: se llenó una
bureta de 10 ml y se abrió la llave para dejar caer 10 gotas en un vaso de precipitado,
estableciendo así la variación del volumen del ácido en la bureta. Esta operación se
realizó por triplicado. Los volúmenes obtenidos (ver cuadro 8) se promediaron y este
valor se dividió entre 10 y así se obtuvo el volumen de una gota.

Cuadro 8. Volumen de 10 gotas de HCL 1N en una bureta de 10 ml


Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Promedio
Volumen de diez gotas de HCL 1N (ml)
0,45 0,45 0,45 0,45

Volumen de una gota = 0,45 ml/10 gotas = 0,045 ml / gota


Para las titulaciones realizadas, el cambio bien definido de color hacía que el error por
exceso o defecto en la neutralización fuera de una sola gota. El peso de nitrógeno que
se titularía con este volumen de ácido sería de 6,3 x 10-4g de N.

N = VHCL x NHCL / 71,43 = 0,045 ml x 1N / 71,43 = 6,3 x 10-4g de nitrógeno

Por lo tanto en cada titulación se pudo determinar el contenido de nitrógeno presente en


la muestra ±0,00063 g.
Se debe tener en cuenta que entre menor sea la dilución del ácido empleado, menor
será el error en el que se incurra en la titulación.

2.3.4.1.8.1.2 Destilación y titulación: se pesaron dos gramos de sulfato de amonio y se


secaron en la estufa a 105ºC durante una hora. Luego se pesaron 0,9428 g de sulfato
de amonio seco para preparar 250 ml de solución en un matraz aforado de 250 ml. De
esta manera cada mililitro contenía 0,0008 g de nitrógeno.
Para elaborar la curva de calibración se tomaron volúmenes de 4, 6, 12, 16, y 20 ml de
la solución de sulfato de amonio medidos en una bureta, los cuales contenían
respectivamente 0,0032, 0,0064, 0,0096, 0,0128 y 0,016 g de nitrógeno. Cada uno de
estos volúmenes se destilaron en la unidad BÜCHI B-324, mediante el método de
trabajo preestablecido en el equipo, el cual emplea volúmenes de 50 ml, 80 ml y 75 ml
de agua destilada, NaOH al 32% y H3BO3 al 2% respectivamente. El proceso se lleva a
cabo durante cinco minutos. Posteriormente se tituló el amoniaco desprendido en la
solución de ácido bórico utilizando como indicador dos gotas de taschiro. Este
procedimiento se realizó por triplicado para cada volumen de la solución de sulfato de
amonio y se obtuvo el promedio de los mismos (Ver Anexo A) para efecto de los
siguientes cálculos.
El volumen de 12 ml de la solución de sulfato de amonio, se toma como ejemplo para
mostrar la manera como se realización los cálculos.
Cálculo del nitrógeno recuperado
NRE = VE x N / 71,43 = 6,8ml x 0,0996N / 71,43 = 0,00948 g de nitrógeno
donde: NRE = nitrógeno recuperado (g)
Materiales y Métodos 60

VE = valor experimental del volumen de HCL requerido en la titulación (ml)


N = normalidad del HCL valorado para titulación (equivalentes por litro)

Cálculo del porcentaje de recuperación de nitrógeno

N RE 0,00948
% N RE = × 100 = × 100 = 98,75%
VSA × C NSA 12 × 0,0008

Donde: %NRE = porcentaje de recuperación de nitrógeno


NRE = nitrógeno recuperado (g)
VSA = volumen de solución de sulfato de amonio (ml)
CNSA = concentración de nitrógeno en la solución de sulfato de amonio (gN /ml)

Cálculo del error de exactitud


N RT − N RE 12 × 0,0008 − 0,00948
% EE = × 100 = × 100 = 1,25%
N RT 12 × 0,0008

donde: %EE = error de exactitud


NRT = nitrógeno teórico en el volumen empleado de solución de (NH4)2SO4 (g)
NRE = nitrógeno recuperado (g)
Para el resto de los volúmenes se realizaron los mismos cálculos y los resultados se
encuentran consignados en el cuadro 9.

Cuadro 9. Porcentajes de error de exactitud obtenidos con la curva de calibración para


el método de Kjeldahl (destilación)
Vol. solución Sulfato de % Error de
NRT (g) NRE (g) % NRE
Sulfato de amonio (ml) amonio (g) Exactitud
0 0,00000 0,0000 0,00000 0,00 0,00
4 0,01508 0,0032 0,00311 97,19 2,81
8 0,03016 0,0064 0,00631 98,59 1,41
12 0,04525 0,0096 0,00948 98,75 1,25
16 0,06034 0,0128 0,01265 98,83 1,17
20 0,07542 0,0160 0,01585 99,06 0,94

El error de exactitud está entre 0 y 2,8%.

La curva de calibración obtenida para la destilación se presenta en la Gráfica 1.


Materiales y Métodos 61

Gráfica 1. Curva de calibración para la destilación en el método de


Kjeldahl
0,018
Contenido de nitrógeno

0,015
0,012
0,009
(g)

0,006
0,003
0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
Peso de sulfato de amonio (g)
Cont. Teórico de nitrógeno (g) Cont. Experimental de nitrógeno (g)

Figura 9. Curva de calibración para la destilación en el método de Kjeldahl

2.3.4.1.8.1.3 Digestión, destilación y titulación: Para este apartado se lleva a cabo el


mismo procedimiento del numeral 2.3.3.1.9.1 utilizando urea pura previamente secada
en estufa a 105ºC durante dos horas.
Se tomaron muestras de urea que tuvieran un contenido de nitrógeno entre 0 y 0,65 g
ya que debido a el contenido de nitrógeno reportado en la bibliografía los volúmenes de
muestra a manejar (suero) se encontraban dentro de este rango. (Ver Anexo B)
El peso de 0,8571 g de urea, se toma como ejemplo para mostrar la manera como se
realizaron los cálculos.

Cálculo del nitrógeno recuperado


NRE = VE x N / 71,43 = 29,07ml x 0,9677N / 71,43 = 0,39383 g de nitrógeno

donde: NRE = nitrógeno recuperado (g)


VE = valor experimental del volumen de HCL requerido en la titulación (ml)
N = normalidad del HCL valorado para titulación (equivalentes por litro)

Cálculo del porcentaje de recuperación de nitrógeno

N RE 0,39383
% N RE = × 100 = × 100 = 98,46%
WU × 0,4667 0,8571 × 0,4667

donde: %NRE = porcentaje de recuperación de nitrógeno


NRE = nitrógeno recuperado (g)
WU = peso medido de urea (g)
0,4667 = fracción de nitrógeno contenido en la urea
Materiales y Métodos 62

Cálculo del error de exactitud

N RT − N RE 0,8571 × 0,4667 − 0,39383


% EE = × 100 = × 100 = 1,54%
N RT 0,8571 × 0,4667

donde: %EE = error de exactitud


NRT = nitrógeno teórico en el peso medido de urea (g)
NRE = nitrógeno recuperado (g)

Para el resto de los pesos medidos de urea se realizaron los mismos cálculos y los
resultados se encuentran consignados en el cuadro 10.

Cuadro 10. Porcentajes de error de exactitud obtenidos con la curva de calibración


para el método de Kjeldahl (digestión, destilación y titulación)
Peso de urea medido (g) NRT (g) NRE (g) % NRE % Error de Exactitud
0,0000 0,00 0,19644 98,22 1,78
0,4286 0,20 0,24792 98,25 1,75
0,5357 0,25 0,29493 98,31 1,69
0,6428 0,30 0,34451 98,43 1,57
0,7500 0,35 0,39383 98,46 1,54
0,8571 0,40 0,44341 98,54 1,46
0,9643 0,45 0,49313 98,63 1,37
1,0714 0,50 0,54285 98,70 1,30
1,1786 0,55 0,59243 98,74 1,26
1,2857 0,60 0,64256 98,86 1,14

El error de exactitud está entre 1,14 y 1,78%.

La curva de calibración obtenida para la digestión, destilación y titulación se presenta


en la Gráfica 2.
Materiales y Métodos 63

Gráfica 2. Curva de calibración para la digestión, destilación y


titulación en el método de Kjeldahl
0,7
Contenido de nitrógeno (g) 0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5
Peso de la urea (g)
Cont.Teórico de nitrógeno Cont. Experimental de nitrógeno

Figura 10. Curva de calibración para la digestión, destilación y titulación en el


método de Kjeldahl

De acuerdo con las condiciones de trabajo del equipo, se genera menor error de
exactiud con la utilización de mayores cantidades de muestra (en peso). Ver cuadro 9 y
10.

2.3.4.2 Pruebas microbiológicas

Se realizan tres diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) de la muestra y se siembran por triplicado
en los diferentes medios de cultivo. Los procedimientos del proyecto difieren de los
descritos en la norma GTC 3 parte II del ICONTEC en la utilización de medios
deshidratados y la expresión de resultados es dada en unidades formadoras de
colonias por mililitro (UFC/ml).

2.3.4.2.1 Recuento de microorganismos mesófilos aerobios: el medio de cultivo PCA


(Plate Count Agar) contiene todos los nutrientes en cantidades suficientes para el
desarrollo de microorganismos mesófilos aerobios y anaerobios aerotolerantes viables
sin sustancias inhibitorias (Ver Anexo C).
Procedimiento: se mezclan 22,5 g del medio deshidratado PCA en 1 lt de agua y se
esteriliza en autoclave a 121ºC por 15 minutos para luego dejar enfriar hasta 45ºC y
mantener a esta temperatura en el baño termostatado hasta su utilización.
Se colocan 9 ml de agua peptona como diluyente en tres tubos de ensayo para realizar
las diluciones; al primero se le adiciona 1 ml de la muestra, al segundo 1 ml de la
primera dilución y al tercero 1 ml de la segunda dilución. En cada caja de petri se coloca
1 ml de las diferentes disoluciones decimales. Inmediatamente se adicionan a cada caja
de 12 a 15 ml del medio de cultivo previamente fundido. Se tapan las cajas, se mezclan
Materiales y Métodos 64

cuidadosamente el inóculo con el medio fundido y se dejan enfriar en posición


horizontal. El tiempo transcurrido entre la preparación de la primera dilución y la mezcla
del inóculo con el medio no debe exceder de 15 minutos. Una vez solidificado el
contenido de las cajas, se invierten y se incuban a 37ºC por 24 horas.
Conteo de colonias: las colonias se cuentan una vez terminado el período de
incubación en forma manual. Se tienen en cuenta las cajas que presentan de 30 a 300
colonias. La lectura de las cajas se efectúa solo por personal autorizado de la empresa
y se realiza de la siguiente manera:
Se colocan las cajas contra la luz artificial y se cuenta el número de colonias en la
dilución en la que el conteo sea más viable y rápido para cada ensayo. Por ejemplo si
en la dilución 10-1 hay más de 300 colonias, entonces se cuentan la caja con dilución
10-2. Se reportan como número de UFC multiplicado por la dilución en la que fueron
leídas.
Ejemplo: Si se leen 30 colonias en una caja cuya dilución es 10-2
Entonces, No. de colonias leídas x 102 = 3 x 103 UFC/ml

2.3.4.2.2 Recuento de hongos y levaduras: El medio de cultivo YGC (Yeast Extract


Glucose Chloramphenicol Agar FIL-IDF) contiene cloranfenicol para la represión de la
flora bacteriana acompañante (Ver Anexo C).
Procedimiento: se disuelven 40 g del medio deshidratado YGC en 1 lt de agua y se
esteriliza en autoclave a 121ºC por 15 minutos para luego dejar enfriar hasta 45ºC y
mantener a esta temperatura.
Se siembran las muestras como se mencionó para el medio anterior y se incuba a 25ºC
durante 4 días para hacer la correspondiente lectura.
Conteo de colonias: se realiza el conteo y se calcula el número de UFC/ml como se
mencionó en el numeral 2.3.3.2.1.

2.3.4.2.3 Número más probable (NMP) de coliformes totales y confirmación de


coliformes fecales

Recuento de coliformes totales (NMP): la bilis y el verde brillante del medio BRILLA
(Brilliant-green Bile Broth) inhiben notablemente el crecimiento de la flora indeseable
acompañante, incluso clostridios degradadores de la lactosa (Ver Anexo C). La
fermentación de la lactosa con formación de gas es un indicativo de la presencia de E.
coli y se evidencia con la campana de Durham. Los restantes coliformes fecales
también crecen en este medio, pero casi siempre sin formación de gas.
Procedimiento: se mezclan 40 g de caldo medio BRILLA en 1 lt de agua y se sirven 10
ml en cada tubo de ensayo tapa rosca depositando campanas de Durham en su interior.
Se esterilizan a 121ºC por 15 minutos en el autoclave.
Se siembran tres tubos con 1 ml de cada una de las diluciones preparadas (10-1, 10-2,
10-3) y se incuban a 37ºC por 24 horas.
Materiales y Métodos 65

Interpretación: se registran los tubos turbios y se busca en la tabla el NMP de coliformes


totales por gramo. Se observa la producción de gas en las campanas, teniendo en
cuenta estos tubos como posibles resultados positivos de coliformes fecales.
Ejemplo: si se leen 3 tubos positivos en la primera dilución , 2 en la segunda y 1 en la
tercera.
Se lee en la tabla15 como: 3 2 1 = 150 NMP/ml

Confirmación de coliformes fecales: el medio de confirmación SIM demuestra la


formación de sulfuro e indol (Ver Anexo C).
Procedimiento: se prepara el medio SIM disolviendo 30 g del medio deshidratado en 1lt
de agua. Se distribuye en tubos hasta cuatro centímetros de altura; se esteriliza a
121ºC por 15 minutos y se deja solidificar en posición vertical.
Se siembran por picadura los tubos positivos con producción de gas (recuento de
coliformes totales) en la capa superior del medio de cultivo. Se incuban a 37ºC durante
24 horas y se lee el resultado.
Interpretación de resultados: se determina la movilidad por la presencia de una turbidez
difusa del medio al rededor del canal. La formación de sulfuro se evidencia con el
ennegrecimiento de la zona de crecimiento y la formación de indol da lugar con la
aplicación del reactivo de Kovac’s generando una coloración rojo oscuro.
La formación de indol no es exclusiva E. Coli, otros microorganismos como por ejemplo
Edwardsiella también convierten el triptófano de las proteínas en indol; por lo que este
método ha sido desplazado por otros más específicos para la confirmación de
coliformes fecales. Actualmente se utiliza el medio Fluorocult, en el cual se detecta la
presencia de E. Coli por fluorescencia al iluminarse con luz UV.
El método de confirmación por medio de siembra en medio SIM es el utilizado por la
empresa Coolechera y no fue posible la utilización de uno más adecuado y actualizado.

2.3.4.2.4 Recuento de Staphylococcus: el medio de cultivo BP (Baird Parker) contiene


cloruro de litio y telurito para la inhibición de la flora acompañante, en tanto que el
piruvato y la glicocola actúa favoreciendo selectivamente el crecimiento de
Staphylococcus (Ver Anexo C). Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en
yema de huevo, las colonias de dichos microorganismos muestran las características
diagnosticadas por lipólisis y proteólisis, se producen halos y anillos característicos y
debido a la reducción del telurito a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reacción
con la yema de huevo y la reducción del telurito se presentan con notable paralelismo
con la coagulasa positiva y por tanto se utilizan como índice de esta última.
Procedimiento: se disuelven 58 g del medio deshidratado BP en 0,95 lt de agua para
esterilizar por 15 minutos a 121ºC. Luego se enfría hasta 45ºC y se añaden 50 ml de
yema de huevo, se agita para que mezclen los ingredientes y se deja en el baño
termostatado a 45ºC hasta el momento de su utilización.

15
ROBERTS, Diane, HOOPER, William. Microbiología práctica de los alimentos. Zaragoza : Acribia,
1995. Tabla 5-3, p. 120.
Materiales y Métodos 66

Se realizan las diluciones respectivas y usando pipetas capilares se siembra 0,1 ml de


cada una de estas en cajas de petri para extender el líquido sobre la superficie con
ayuda de un asa; se incuba a 37ºC durante 48 horas. Después se seleccionan las
placas que contengan entre 30 y 300 colonias negras y brillantes, con bordes reducidos
blancos que aparezcan rodeados de zonas claras que contrastan con el medio opaco.
Estas colonias evidencian la presencia de Staphylococcus aureus, aunque pueden
encontrarse colonias negras, lustrosas, irregulares y opacas alrededor que representan
otro tipo de Staphylococcus como S. epidermidis.
Conteo de colonias: se cuentan las colonias de igual forma que para los otros medios
en agar, pero el resultado se expresa de la siguiente manera:

Ejemplo: si se leen 30 colonias en una caja cuya dilución es 10-2


Entonces: No. de colonias leídas x 102 x 10 = 3 x 104 UFC/ml

2.3.5 Seguimiento de la fermentación acidoláctica (realización de la curva de


crecimiento)

Para obtener la curva de crecimiento de las bacterias acidolácticas del cultivo, se


procede como se explica en las pruebas preliminares (apartado 2.3.2), fermentando por
triplicado. En este caso solo se determina el pH y el recuento de bacterias acidolácticas
(agar MRS) de la siguiente manera: cada media hora durante las tres primeras horas,
cada hora durante las siguientes nueve horas, cada dos horas durante las siguientes
ocho horas, y por último cada cuatro horas hasta completar 56 horas. Esta fermentación
se realiza por triplicado y los resultados de cada medición y siembra se promedian.
Para obtener la curva de crecimiento del cultivo , se grafica el intervalo de confianza del
95% calculado como en las pruebas microbiológicas (apartado 2.2).
Recuento de bacterias acidolácticas: El medio de cultivo MRS (MAN, ROGOSA y
SHARPE) contienen los nutrientes necesarios para el enriquecimiento, cultivo y
aislamiento de todas las especies de lactobacillos. Dado que solo posee muy poca
selectividad, también crecen otras especies de microorganismos lácticos (Ver anexo C).
Procedimiento: se mezclan 62 g del medio deshidratado en 1 lt de agua y se esteriliza
en el autoclave por 15 minutos a 118ºC.
La siembra y lectura se realiza de igual forma que para el recuento de mesófilos
(apartado 2.3.3.2.1); se incuban las cajas a 37ºC por 3 días.

2.3.6 Elaboración de la bebida

En la elaboración de la bebida se establecen diferentes formulaciones, algunas por


recomendación de ciertos proveedores de ingredientes y equipos de Coolechera y otras
por los estudiantes a cargo del proyecto.
Se realizan diferentes formulaciones con el objetivo de determinar la mejor composición
porcentual de los ingredientes involucrados y no se busca establecer el mejor sabor
agregado, por lo que se escogió uno de los tres sabores contemplados en el
anteproyecto. Se opto por el de maracuyá, ya que se trata de una bebida innovadora y
Materiales y Métodos 67

se pretende causar impacto en los consumidores empleando un sabor poco usual en


productos fermentados.
La formulación inicial (cuadro 11) fue planteada por el señor Joaquín Shifino, gerente
de la empresa Sabores Ltda., actual proveedor de estabilizantes de Coolechera. Dicha
empresa ofrece saborizantes (Ver Anexo F) y colorantes (Ver Anexo G) como
ingredientes de la bebida láctea a base de suero proporcionado la siguiente
formulación.

Cuadro 11. Formulación propuesta por la empresa Sabores Ltda.


Ingredientes Contenido (%)
Suero 92,65
Azúcar 4,75
Colorante 0,10
Saborizante 2,50
Fuente: Empresa Sabores Ltda.

Se realiza un primer ensayo con la anterior formulación agregando saborizante de


maracuyá. La no aceptación por parte de los consumidores de dicha formulación
conlleva a considerar nuevas propuestas que sugieren la utilización de pulpa natural.
A continuación se describe la elaboración de la bebida con sus formulaciones definitivas
y utilizando las pulpas de la empresa Prado Fruit Ltda. (Ver Anexo H)

Se fermentan 500 ml de suero

Se pesa el suero fermentado para determinar las


cantidades de los demás ingredientes (%p/p)

Se pesan y se agregan los demás ingredientes

Se homogenizan los ingredientes

Se pasteriza (60ºC por 15 seg.) la bebida y se refrigera

Se toman tres erlenmeyers cada uno con 500 ml de suero de mantequilla fermentado
cuando alcanzan un pH de 4,6 aproximadamente. Se coloca y pesa el contenido en una
jarra tarada y previamente desinfectada con alcohol (al 75%); de acuerdo con dicho
peso se hacen los cálculos de las cantidades necesarias de los demás ingredientes
(azúcar, agua y pulpa) para las tres formulaciones planteadas (cuadro 12). El agua que
se utilizó para la elaboración de la bebida es agua potable, empleada por la empresa
para la elaboración de jugos y gelatina.
La formulación A fue adoptada por recomendación del señor Dückinghaus, gerente de
la empresa Nocado-Schwarte GMBH, encargada de la instalación del equipo continuo
de mantequilla en la empresa Coolechera. Esta empresa alemana también comercializa
Materiales y Métodos 68

pulpas naturales y realiza maquilas de diferentes productos lácteos como suero de


mantequilla fermentado. Ofrecen la formulación de la bebida que ellos desarrollan con
un criterio basado en la experiencia y buscando convertirse en futuros proveedores de
pulpa para Coolechera. La pulpa empleada en dicha formulación no pudo ser adquirida
para efectos de la elaboración de la bebida del proyecto por efectos de tiempo de
pedido, entrega y costos.
Al criterio de los estudiantes responsables del proyecto la formulación A era demasiado
dulce y viscosa, por lo que se decidió disminuir la cantidad de azúcar y aumentar el
contenido de agua en una segunda formulación (B). Como alternativa, se realizó la
tercera formulación (C), con el fin de obtener una bebida más ligera de sabor y destacar
el carácter refrescante.
La formulación B se realizó con la misma cantidad de pulpa, disminuyendo el porcentaje
de azúcar en un 1% y aumentando el de agua en un 5% con respecto a la formulación
A. En la C se disminuyó el porcentaje de azúcar en un 2% y el de pulpa en un 1% con
respecto a la A. El porcentaje de agua para esta se mantuvo en la misma proporción
con respecto al suero que en la formulación B.
En el cuadro 12 se observan con claridad las proporciones en que se encuentran los
ingredientes para cada una de las formulaciones planteadas.

Cuadro 12. Formulaciones planteadas para la bebida


Ingredientes Formulación A (%) Formulación B (%) Formulación C (%)
Suero 79,0 75,0 76,6
Agua potable 10,0 15,0 15,4
Pulpa 4,5 4,5 3,5
Azúcar 6,5 5,5 4,5

Se homogenizan los ingredientes en la licuadora y se pasterizan a 60ºC por 15


segundos, luego se refrigera la bebida para la realización de las pruebas sensoriales.

2.3.7 Análisis organoléptico

Cuando se tienen las tres formulaciones de sabor a maracuyá se realiza la selección


de la mejor formulación planteada para la bebida, mediante una prueba de aceptación
de consumidores, con la cual se califica cada producto en términos de cuanto gusta o
desagrada.
Cada uno de los miembros del grupo de panelistas no entrenados, probará las
muestras del producto terminado y anotará su respuesta en el formulario destinado para
este fin. Las posibilidades de puntuación van desde gustar mucho hasta no gustar nada
y con estas podemos calcular la puntuación media de la muestra. El formulario se
encuentra en el Anexo D.
Materiales y Métodos 69

2.3.8 Caracterización de la bebida terminada

Después de ser escogida la mejor formulación para la bebida, se realiza su


caracterización fisicoquímica y microbiológica evaluando las mismas propiedades que
para el suero crudo y siguiendo los mismos procedimientos. La determinación de la
densidad es el único parámetro que se obtiene de manara diferente, a continuación se
explica el procedimiento.

Densidad aparente
La densidad aparente de la bebida se determina como la relación entre el peso de una
muestra y el volumen que esta ocupa, ya que el rango de la escala del lactodensímetro
no incluye valores para densidades mayores de 1,042 g/ml y no se cuenta con otro
aerómetro en la empresa Coolechera.
Además de dicha caracterización se realizan las pruebas nutricionales a la bebida.

2.3.8.1 Pruebas nutricionales

A la bebida terminada y caracterizada fisicoquímica y microbiológicamente se le


realizan las pruebas nutricionales que incluyen la determinación del contenido de
cenizas, minerales (Fe, Ca y P), vitaminas (A y D3) y fibra dietaria (soluble e insoluble).

2.3.8.1.1 Cenizas (minerales): se obtiene el porcentaje de cenizas por diferencia de


pesos entre los sólidos totales y la muestra calcinada a 550ºC.
Procedimiento: trabajando sobre el extracto seco se comienza a calcinar sobre una
llama pequeña o en la mufla, calentando progresivamente y se termina la calcinación a
la temperatura de 550ºC hasta que este libre de materia carbonosa. Se deja enfriar en
desecador y se pesa.
Expresión de resultados:
% de cenizas = (P1 - P2 /P) x 100

donde:
P1 = Peso de cápsula con cenizas (g)
P2 = Peso de cápsula vacía (g)
P = Peso de suero utilizado (g)

Dentro de los minerales se determina la composición porcentual de los siguientes:


Fósforo: las materias orgánicas de la leche se destruyen por mineralización en seco
(incineración). El fósforo se determina clorimétricamente reduciendo el fosfomolibdato
de amonio con diaminofenol y midiendo la densidad óptica de la solución obtenida.
Calcio: el calcio total se lleva a disolución por la precipitación de las materias proteicas
con ácido tricloroacético. El calcio contenido en el filtrado es precipitado bajo la forma
de oxalato cálcico que se separa por centrifugación y se valora con permanganato
potásico.
Materiales y Métodos 70

Hierro: el método para la determinación del hierro se basa en la reacción, en solución


acuosa, de la 1,10 fenantrolina con el ión Fe++, para formar un complejo de color
anaranjado rojizo.
El procedimiento que se lleva a cabo para el análisis de los minerales Fe, P, Ca es el
establecido por las normas ICONTEC y es desarrollado por el laboratorio Asinal Ltda.

2.3.8.1.2 Vitaminas

Vitamina A: la muestra es saponificada y luego extraída con tres porciones de éter de


petróleo, la fase orgánica es lavada hasta fin de alcalinidad con agua. Luego el extracto
de éter es evaporado en rotavapor. El extracto evaporado es reconstituido en fase móvil
luego es filtrado por membrana de 0,45 µm e inyectado en el sistema cromatográfico.
El procedimiento que se lleva a cabo para el análisis de la vitamina A es el establecido
por las normas suizas ISO 2000, y es desarrollado por el laboratorio Biocontrol Ltda.

Vitamina D3: la muestra es saponificada y luego extraída con tres porciones de éter de
petróleo, la fase orgánica es lavada hasta fin de alcalinidad con agua. Luego el extracto
de éter es evaporado en rotavapor. El extracto evaporado es reconstituido en metanol y
pasado a través de una columna RP 18 (columna de limpieza) y se recoge la fracción
diluida de la columna, comprendida entre tres minutos antes y tres minutos después del
tiempo de retención establecido con el estándar.
La fracción colectada es evaporada con nitrógeno y reconstituida en hexano para luego
ser inyectada en el sistema cromatográfico.
El procedimiento que se lleva a cabo para el análisis de la vitamina D3 es el establecido
por las normas americanas AOAC, y es desarrollado por el laboratorio Biocontrol Ltda.

2.3.8.1.3 Fibra dietaria (insoluble y soluble)

La muestra es sometida a una digestión enzimática primero con amilasa en buffer MES-
TRIS pH 8,2 incubando a 95-100ºC, en baño de agua. Luego con proteasa a 60ºC y por
último con amiloglucosidasa a pH 4,0-4,7 a 60ºC.
Para la determinación de la fibra dietaria insoluble se filtra el digerido enzimático a
través de crisol Gooch por duplicado (previamente tarado con una capa de celita) y el
residuo se lava con agua caliente, luego con etanol y por último acetona. Se determina
cenizas y proteína en los residuos del filtrado.
Para la fibra dietaria soluble se recoge el filtrado que pasa a través del crisol Gooch y
se le adiciona etanol al 95%, se deja en reposo para formar precipitado. Este es filtrado
a través de crisol Gooch y se realizan los mismos lavados que para la fibra dietaria
insoluble.
La fibra dietaria total es la suma de la insoluble más la soluble.
El procedimiento que se lleva a cabo para el análisis fibras solubles e insolubles es el
establecido por las normas americanas AOAC, y es desarrollado por el laboratorio
Biocontrol Ltda.
CAPÍTULO 3

ANÁLISIS DE RESULTADOS

En este capítulo se presentan los resultados en cuadros ordenados, gráficas requeridas


y comentarios cualitativos obtenidos en las diferentes pruebas fisicoquímicas,
microbiológicas y nutricionales realizadas para el suero como materia prima y a la
bebida como producto terminado. Además se muestra la gráfica de la curva de
crecimiento de las bacterias acidolácticas del cultivo empleado para la fermentación, así
como la calificación de la evaluación organoléptica realizada a los consumidores. Los
resultados serán presentados en el orden en que fueron obtenidos y se analizan
inmediatamente después de su presentación en el apartado correspondiente.

3.1 PRUEBAS PRELIMINARES

Con las pruebas preliminares se ratificó que el cultivo comercial empleado presenta el
comportamiento descrito en su ficha técnica. La cantidad de cultivo añadida en la
inoculación del suero fue la necesaria para que el producto alcanzara un pH de 4,6 en
un tiempo de 7 a 8 horas.
El sobre de cultivo viene dado para inocular 50 lt (Ver Anexo E). Si se disuelve en 50
ml, entonces se requeriría 1ml como inóculo para 1 lt de suero; si se disuelve en 200 ml
se requieren 4 ml como inóculo para 1 lt de suero.

1ml de inóculo
× 200ml de cultivo disuelto = 4ml de inóculo
50ml de cultivo disuelto

Los resultados de pH, recuento de mesófilos y sólidos solubles (por refractometría) de


la muestra fermentada por triplicado se muestran en el cuadro 13.

Cuadro 13. Valores de pH, recuento de mesófilos y porcentaje de sólidos solubles en la


fermentación preliminar
Tiempo Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3
(h) pH UFC/ml %S.S pH UFC/ml %S.S pH UFC/ml %S.S
2
0 6,78 1,0 x 10 9,0 6,80 3,5 x 102 8,8 6,79 2,4 x 102 8,8
1 6,59 1,2 x 102 8,8 6,58 3,7 x 102 8,8 6,57 2,2 x 102 8,8

71
Análisis de resultados 72

2 6,57 1,1 x 102 8,8 6,57 3,8 x 102 8,8 6,55 6,5 x 102 8,5
3 6,47 3,6 x 102 8,5 6,46 6,0 x 102 8,5 6,48 7,0 x 102 8,5
4 6,22 7,8 x 102 8,5 6,25 6,2 x 102 8,5 6,23 9,8 x 102 8,5
5 5,82 9,0 x 102 8,2 5,81 9,8 x 102 8,5 5,84 1,0 x 103 8,5
6 5,44 1,1 x 103 8,2 5,39 1,5 x 103 8,2 5,41 1,2 x 103 8,2
7 4,90 1,2 x 103 8,2 4,91 1,6 x 103 8,2 4,93 1,3 x 103 8,2
8 4,70 1,2 x 103 7,0 4,63 3,4 x 103 7,5 4,68 2,1 x 103 7,5

El promedio del pH a las ocho horas de fermentación es de 4,67.

Con las pruebas preliminares se buscaba determinar si el cultivo comercial seguía el


comportamiento para fermentación de leche, descrito en la ficha técnica del mismo.
En el inicio (t=0) la población corresponde a microorganismos de la flora normal del
suero crudo que llegan a este por contaminación de los equipos, del ambiente y aún de
la crema pasterizada, ya que el fin de este proceso térmico es destruir los
microorganismos patógenos y no eliminar la flora en su totalidad. Con la medición del
pH se buscaba comprobar, que a través del tiempo, las bacterias ácidolácticas del
cultivo degradan la lactosa del suero de mantequilla produciendo prácticamente sólo
ácido láctico; ácido que a su vez se disocia aumentando el potencial de iones hidronio y
provocando una disminución en el pH de la muestra fermentada. El cultivo comercial
presentó un periodo de activación de tres horas, tiempo en el cual las bacterias se
encuentran en su fase de latencia, adaptándose a las condiciones del cultivo. Después
de dicho periodo, se puede observar un descenso significativo del pH (tercera hora 6,47
a cuarta hora 6,23), etapa en la cual las bacterias lácticas se encuentran en
crecimiento. Con el recuento de mesófilos se muestra la tendencia de crecimiento de
los microorganismos durante la fermentación. Dicho conteo proporciona el número total
de mesófilos, pero no incluye el total de la población de las bacterias acidolácticas del
cultivo, ya que este no es el medio (PCA) específico para el desarrollo de las mismas.
Se verificó que la cantidad de cultivo inóculo estipulada por los proveedores era la
necesaria para que el suero de la mantequilla llegara a un pH de 4,6 en
aproximadamente ocho horas de fermentación, como se estipula en la ficha técnica.
Esto indica que, aunque el cultivo fue creado para fermentar leche en la producción de
kumis, se comportó de igual manera en la fermentación del suero.
Los datos obtenidos en la refractometría muestran la tendencia que sigue el contenido
de los sólidos solubles en la fermentación del suero. Al inicio, el valor de dicho
parámetro, corresponde a todos los componentes presentes en su estado original,
exceptuando el contenido de grasa. Conforme transcurre la fermentación este valor
decrece a partir de la tercera hora y hasta la octava, de 8,5% a 7,5%, indicando que
disminuye el contenido de alguno de dichos componentes. Entre estos, la lactosa es el
compuesto de mayor influencia en el descenso de los sólidos solubles, ya que actúa
como sustrato de las bacterias acidolácticas para su biosíntesis, proceso en el cual la
mayor parte de lactosa degradada pasa a ser ácido láctico.
Análisis de resultados 73

3.2 CARACTERIZACIÓN DE LA MATERIA PRIMA

3.2.1 Pruebas microbiológicas

En un principio, los resultados de las primeras pruebas microbiológicas no fueron los


esperados. A pesar de que no hubo presencia de Staphylococcus, el recuento de
coliformes fue relativamente elevado; aunque sin fecales. Además se presentaron
algunos hongos indeseados.
A continuación se presenta un ejemplo de cálculo para los intervalos de confianza del
95% para los conteos en placa. Para la muestra 1 (cuadro 14) se tienen los siguientes
conteos de mesófilos aerobios por triplicado (cada ensayo se leyó en la dilución en que
mejor se pudo realizar el conteo).

Ensayo Conteo entonces UFC/ml


1 50 colonias en dilución 10-3 50 x 103 = 5,0 x 104
2 35 colonias en dilución10-3 35 x 103 = 3,5 x 104
3 240 colonias en dilución 10-2 240 x 102 = 2,4 x 104

El intervalo de confianza del 95% se determina de la siguiente manera:

3 × 3,63 × 104 ± 1,96 (3 × 3,63 × 104 )


ic (95%) = = 3,61 × 104 a 3,65 × 104 UFC / ml
3

Para hallar el NMP de coliformes totales, se toman los resultados de una siembra.
Dilución 10-1 tubos positivos 3
Dilución 10-2 tubos positivos 0
Dilución 10-3 tubos positivos 0
Entonces para 3 0 0 se lee en la tabla NMP/ml = 23
Esta lectura se realiza por triplicado a cada muestra y se reportan los valores de NMP
extremos (menor a mayor) obtenidos en los tres ensayos. Para el recuento de hongos y
levaduras también se utiliza la técnica de los intervalos.

Cuadro 14. Resultados de la pruebas microbiológicas iniciales de la materia prima


Recuento de mesófilos aerobios NMP de Coliformes Hongos
Muestra
(UFC/ml) totales/ml (UFC/ml)
1 3,61 x 104 a 3,65 x 104 23 a 75 1,4 x 103 a 1,5 x 103
2 2,07 x 104 a 2,48 x 104 28 a 93 4,8 x 103 a 5,0 x 103

Se decidió entonces, por parte de la empresa, revisar el procedimiento de lavado del


equipo; se aumentó la concentración de la soda en un 20% y el tiempo de lavado en 10
minutos. Los resultados posteriores se muestran en el cuadro 15.
Análisis de resultados 74

Después de los cambios en el procedimiento de lavado de la máquina, la siembra en el


medio específico para Staphylococcus siempre fue negativa al igual que el recuento de
hongos y levaduras. De la misma manera no hubo presencia de coliformes fecales.

Cuadro 15. Resultados de la caracterización microbiológica de la materia prima


Recuento de mesófilos aerobios
Muestra NMP de Coliformes totales/ ml
(UFC/ml)
1 7,3 x 102 a 6,7 x 102 <3
2 3,6 x 102 a 3,2 x 102 9 a 43
3 7,6 x 102 a 4,5 x 102 4 a 9
4 1,9 x 102 a 2,3 x 102 <3

Las pruebas microbiológicas iniciales realizadas a la materia prima ponen en evidencia


una contaminación del suero en su paso por los equipos. Si se compara el recuento de
mesófilos aerobios y coliformes totales con los niveles permitidos para la leche
pasterizada de buena calidad (5 x 104 UFC/ml y 11 NMP respectivamente)16, se
observa que los recuentos se encuentran en dichos límites o los sobrepasan. Este
factor de contaminación podría influir en el proceso de fermentación; los coliformes, que
crecen a pH ácidos (hasta menores de 5,0) como las bacterias lácticas, competirían con
estas por el sustrato, ya que también degradan la lactosa a ácido láctico produciendo
además compuestos indeseables como ácido acético, CO2, etanol, etc.
Una vez realizadas las modificaciones en el proceso de lavado se caracterizó
microbiológicamente el suero, y se observó una disminución aproximada de la
contaminación de la siguiente manera: por mesófilos aerobios en un 98%, por
coliformes en un 83% y por hongos y levaduras en un 100%. Estos niveles de
recuentos son aceptables si se comparan con los máximos permitidos para leche
pasterizada en la norma 506 del ICONTEC. La ausencia de Staphylococcus aureus y
coliformes fecales permite la utilización de la materia prima para un proceso de
transformación sin una previa pasterización. Esta baja contaminación se explica porque
el suero proviene de crema pasterizada y de un equipo hermético y desinfectado, lo que
se ratifica con la ausencia de hongos y levaduras.

3.2.2 Ensayo enzimático

La prueba de fosfatasa fue siempre negativa, ya que le suero de mantequilla proviene


de crema pasterizada; proceso en cual se destruye la enzima.

16
NTC 506: 1993, Productos lácteos, leche entera pasterizada.
Análisis de resultados 75

3.2.3 Pruebas fisicoquímicas

A continuación se presenta un ejemplo de cálculo de cada prueba fisicoquímica para la


muestra 1 en el ensayo número 1. Todos los resultados se muestran en el cuadro 30
del anexo L.

• Densidad: lectura del lacodensímetro a 15ºC: 32, entonces densidad = 1,032 g/ml
• pH: lectura registrada por el potenciómetro: 6,73
• Acidez: Se gastaron 6,6 ml de NaOH 0,1N en la titulación de 10 ml de suero
º SH = 8,2 ml
º Dor = 8,2 ml x 2,25 = 18,45 ºDor
% de ácido láctico = 18,45 / 100 = 0,184%
• Grasa: Lectura de la columna del butirómetro = 0,6% de grasa
• %Sólidos totales: Peso del crisol = 76,1310 g
Peso del crisol + la muestra = 81,1349 g
Peso del crisol + la muestra seca = 76,6009 g

76,6009 − 76,1310
% S .T = × 100 = 9,39%
81,1349 − 76,1310

• % Sólidos solubles = 9,39 - 0,6 = 8,79%

Las dispersión de cada una de las propiedades fisicoquímicas del la materia prima se
presentan a continuación.

1,0335
densidad (g/ml)

1,0330
1,0325
1,0320
1,0315
1,0310
1,0305
0 1 2 3 4
muestra

Figura 11. Dispersión para los datos de densidad del suero


Análisis de resultados 76

0,20

acidez(% ác. láctico)


0,19

0,18

0,17

0,16
0 1 2 3 4
muestra

Figura 12. Dispersión para los datos de acidez del suero

7,1

7,0
pH

6,9

6,8

6,7
0 1 2 3 4
muestra

Figura 13. Dispersión para los datos de pH del suero

0,9
0,8
grasa (%)

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0 1 2 3 4
muestra

Figura 14. Dispersión para los datos de grasa del suero


Análisis de resultados 77

9,5

sólidos solubles (%)


9,0

8,5

8,0
0 1 2 3 4
muestra

Figura 15. Dispersión para los datos de sólidos solubles del suero

10,0
sólidos totales (%)

9,5

9,0

8,5
0 1 2 3 4
muestra

Figura 16. Dispersión para los datos de sólidos totales del suero

Los datos de las propiedades fisicoquímicas obtenidos para cada muestra presentan
diferencias, ya que el suero tomado en los distintos días de producción no tiene
exactamente las mismas características, aunque el proceso esté estandarizado. En
ninguno de los casos dichas diferencias son significativas. En cuanto a las replicaciones
realizadas para cada muestra, es decir la medición de los parámetros por triplicado, se
observa poca desviación en los valores indicando que existe precisión en los resultados
obtenidos.
Los resultados de los estadígrafos (cuadro 16), para las propiedades fisicoquímicas se
obtienen a partir de los datos del cuadro 30 contenido en el anexo L. Se presenta un
ejemplo para los cálculos de la densidad.

1,032 + 1,031 + .... + 1,031


Media aritmética X = = 1,0319 g/ml
12
Análisis de resultados 78

(1,032 − 1,0319) 2 + ... + (1,031 − 1,0319) 2


Varianza S2 = = 6,288 x 10-7(g/ml)2
12 − 1

Desviación estándar S = 6,897 × 10−7 = 7,929 x 10-4 g/ml

Límite de confianza inferior del 95% Linferior = 1,0319 – 2,201 x (7,929 x 10-4 / 12 )
= 1,0314 g/ml

Límite de confianza superior del 95% Linferior = 1,0319 + 2.201 x (7,929 x 10-4 / 12 )
= 1,0324 g/ml

Cuadro 16. Resultados de los estadígrafos para la caracterización fisicoquímica de la


materia prima
Densidad Acidez Grasa Sólidos Sólidos
pH
(g/ml) (%ác. láctico) (%) Solubles (%) Totales (%)
Media 1,0319 6,87 0,176 0,67 8,718 9,384
Varianza 6,3 x 10-7 0,012 9,1 x 10-5 0,011 0,089 0,090
Desviación 7,9 x 10-4 0,110 9,5 x 10-3
0,103 0,298 0,301
Límites de confianza del 95%
Inferior 1,0314 6,799 0,169 0,601 8,529 9,193
Superior 1,0324 6,939 0,182 0,732 8,907 9,575

El plasma de la leche corresponde a la parte magra de la misma, es decir todo su


contenido menos la materia grasa; lo que seria el suero de la mantequilla si se lograra
separar en su totalidad la grasa de la crema. Aunque esto no sucede en la realidad, el
suero posee muy poca grasa y un alto contenido de sólidos solubles. Estos últimos se
presentan con un rango de 8,5 a 8,9, el cual se halla como los límites de un intervalo de
confianza del 95%.
El porcentaje promedio de los sólidos solubles en el suero de mantequilla es muy
cercano al porcentaje presente en la leche. Esto confirma que la mayoría de estos
componentes como lo son las proteínas, vitaminas, minerales y lactosa entre otros,
pasan a ser parte del suero en la misma proporción en que se encuentran en la leche,
mientras que la grasa es removida de la crema en el proceso de batido para hacer parte
casi en su totalidad de la mantequilla. Se evidencia entonces que la mantequilla tiene
una baja proporción de sólidos solubles, correspondientes a un 2% de su composición.
El contenido de acidez del suero (0,169 - 0,182%) se encuentra en el límite de los
valores de la acidez máxima para la leche pasterizada (0,18% ácido láctico)17. Este
valor se justifica porque la acidez de la leche pasterizada en la empresa Coolechera es
de 0,178%, indicando que se acidifica en el transporte hasta planta. La empresa se
encuentra en la ciudad de Barranquilla donde la temperatura promedio es de 29ºC; la
leche es recolectada en cantinas y desde el momento del ordeño hasta el descargue en
la planta pueden transcurrir hasta seis horas. Entonces la flora normal de la leche

17
NTC 506: 1993, Productos lácteos, leche entera pasterizada.
Análisis de resultados 79

encuentra en ella un medio óptimo para su desarrollo, proceso en el cual transforman


lactosa en su mayor parte a ácido láctico.
Otro factor que provoca un aumento en el valor de la acidez es el tiempo que tarda la
crema en los tanques de almacenamiento cuando no hay un batido inmediato; esto
ocurre cuando se descreman grandes volúmenes de leche para cubrir la demanda de
leche descremada y la crema de dicha producción debe esperar entre uno y dos días
para ser batida. Aunque el almacenamiento es a bajas temperaturas (10ºC), proliferan
microorganismos psicrófilos como Pseudomonas (ss. fluorescens y ss. fragi) y
Leuconostoc cremoris, además de bacterias mesófilas como S. lactis que crecen en un
rango de 10 a 37ºC. Estas desempeñan la misma función de degradación de la lactosa.
Dicho valor de la acidez se ve reflejado en un intervalo de pH de 6,80 a 6,94, el cual es
apropiado para iniciar un proceso de fermentación, ya que es el óptimo para el
desarrollo de las bacterias ácidolácticas. Esta propiedad tiene un valor de desviación
estándar de 0,11, es decir que los valores medidos se diferencian de la media en esta
cantidad. En general las desviaciones de todas las propiedades determinadas para el
suero crudo indican precisión en los datos.
Al sumar el contenido de grasa a los sólidos solubles se obtiene el porcentaje de
sólidos totales cuyo rango se encuentra entre 9,2 y 9,6% y difieren en solo un 7% de los
sólidos solubles, ya que lo único que diferencia estas propiedades es el bajo contenido
de grasa. Esta tiene un valor entre 0,60 y 0,73% y depende de la eficiencia del equipo
así como del porcentaje de grasa que contenga la crema. Si en un equipo continuo se
procesa 1kg de crema con 40% de grasa, produce 485 g de mantequilla con 82% de
grasa y 515 g de suero con 0,44% de grasa.18 En las mismas condiciones de trabajo, un
aumento del 0,5% de grasa en la crema se refleja en un porcentaje de grasa de 1,1%
en el suero. Lo anterior indica que pequeñas variaciones en las condiciones de entrada
provocan grandes diferencias en el contenido de grasa del suero porque la mantequilla
siempre tendrá un porcentaje de grasa de 82% (estandarizado). Dichas diferencias se
manifiestan en un valor de desviación estándar de 0,1, lo cual es significativo ya que los
datos obtenidos son del orden de 0,67%.
La densidad depende del contenido de grasa y de los sólidos solubles. El primero
provoca una disminución ya que su densidad es de 0,91 a 0,95 g/lt19 y los sólidos
solubles un aumento, que se refleja en una alta densidad del suero de 1,0314 a 1,0324
g/ml. En este caso el contenido de grasa no influye significativamente en esta
propiedad, ya que es muy bajo (aprox. 0,6%).

• Contenido de lactosa del suero crudo = 49 g/lt (Ver Anexo I)

49 g / lt
× 100 = 4,75% de lactosa
1032 g / lt

18
PETERS, K. H., Fettdestabilisierung in Rahm. En: Kieler Milchwoche. Bremen. (mayo de 1993).
19
WALSTRA, Pieter y JENNESS, Robert. Química y física lactológica. España : Acribia, 1987.
Análisis de resultados 80

A continuación se determina el porcentaje de lactosa que posee el suero y el que


permanece en la mantequilla en el proceso de batido de la crema.
Se tienen 100 g de crema, de los cuales se obtienen 51,5 g de suero y 48,5 g de
mantequilla.

4,75 g de lactosa
51,5 g de suero × = 2,45 g de lactosa / 51,5 g de suero de 100 g de crema
100 g de suero

0,4 g de lactosa
48,5 g de mant. × = 0,19 g de lactosa / 48,5 g de mant. de 100 g de crema
100 g de mantequilla

Entonces el contenido de lactosa en la crema es:

2,45 + 0,19 = 2,64 g de lactosa / 100 g de crema

0,19
∴ × 100 = 7,2% de lactosa
2,64

Un 7,2% de la lactosa presente en la crema permanece en la mantequilla; el 92,8%


pasa al suero de mantequilla.

La lactosa con un 4,75% conforma el 54,4% de los sólidos solubles (8,72%) del suero
de la mantequilla. Su contenido se encuentra en el rango de los valores teóricos
estipulados para el suero proveniente de crema dulce o de crema cultivada (4 - 5%)20.
Este azúcar se encuentra aproximadamente en la misma proporción que en la leche
(4,5 - 5,0%)21, debido a que solo un 7,2% de la lactosa de la crema permanece en la
mantequilla después del batido, en la que contribuye con un 0,4%22.

• Contenido de nitrógeno total y porcentaje de proteínas del suero crudo

Ejemplo: muestra 10,0104 g

3,7 × 1 0,0518
NM = = 0,0518 g de nitrógeno → %NM = × 100 = 0,5174%
71,43 10,0104

% Pr oteínas = 0,5174 × 6,38 = 3,3%

Para la verificación del buen funcionamiento del equipo y correcta metodología se


determina el nitrógeno recuperado de la urea como medio de control:

20
Milcherzeugnisse. En : Ausbildung im molkereifach. Berlin. Vol. 15, (abril de 1994).
21
BADUI, Salvador. Química de los Alimentos. México : Alhambra Mexicana, 1996.
22
TETRA PAK. Manual de industrias lácteas. Madrid : Iberia, 1996.
Análisis de resultados 81

Cálculo del nitrógeno recuperado:

NRE = 33,17ml x 1N / 71,43 = 0,4644 g de nitrógeno

Cálculo del porcentaje de recuperación de nitrógeno:


0,4644
% N RE = × 100 = 99,51%
1 × 0,4667
Cálculo del error de exactitud:
%E.E = 1-0,9951 = 0,49%

Confirmación del error de exactitud: remitirse a la gráfica 2. Curva de calibración para el


método Kjeldahl (digestión, destilación, titulación)

Cuadro 17 Volúmenes de HCL 1N empleados en la titulación para la determinación del


porcentaje de proteínas de la materia prima
Volumen de HCL 1N empleado en la titulación
Muestra Muestra Cont. NT Proteínas
(ml)
(ml) (g) (g) (%)
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Prom.
7,8 8,0496 2,9 3,0 2,9 2,93 0,0410 3,25 ± 0,06
9,7 10,0104 3,7 3,7 3,7 3,70 0,0518 3,30 ± 0,00
11,7 12,0744 4,3 4,4 4,4 4,37 0,0612 3,23 ± 0,06
1g Urea (control) 33,0 33,0 33,5 33,17 0,4644 Prom. 3,26%

Uno de los componentes que hace parte de los sólidos solubles es el contenido de
proteínas cuyo valor (3,26%) se encuentra en los rangos teóricos estipulados tanto para
el suero como para la leche. Lo mismo ocurre con la lactosa cuya proporción en el
suero es prácticamente la misma que en la leche. Sin embargo un 17,6% de los sólidos
solubles de la crema pasan en el proceso de batido a la mantequilla donde contribuyen
con un 2%23 siendo el porcentaje de proteínas en la mantequilla de tan solo 0,7%.
En general los rangos teóricos de las diferentes propiedades fisicoquímicas hallados
para el suero de mantequilla son bastante amplios así como para la leche, ya que son
productos cuya composición depende mucho de la raza de los animales, la
alimentación, el clima y los estándares de calidad del país donde se produzcan y
procesen. Además, las características del suero dependen del tipo de equipo utilizado
(continuo o discontinuo) para la elaboración de la mantequilla.

23
Milcherzeugnisse. En : Ausbildung im molkereifach. Berlin. Vol. 15, (abril de 1994).
Análisis de resultados 82

3.3 SEGUIMIENTO DE LA FERMENTACIÓN ACIDOLÁCTICA

En el cuadro 32 del Anexo M se presentan los resultados del recuento de bacterias


acidolácticas y el descenso en el pH del producto fermentado con respecto al tiempo.
La temperatura de fermentación se mantuvo siempre en 30ºC.
En la realización de la curva de crecimiento se gráfica el intervalo de confianza del 95%
del recuento de bacterias acidolácticas (en escala logarítmica).

Curva de crecimiento de las bacterias acidolácticas del cultivo 992


bacterias (UFC/ml)
log. recuento de

pH
Tiempo (horas)

Figura 17. Curva de crecimiento de las bacterias acidolácticas del cultivo comercial (992)

El crecimiento de las bacterias se da durante las primeras ocho horas de fermentación


desde 7 UFC/ml (hora 1) a 5,6 x 103 UFC/ml (hora 8). La tasa de crecimiento se
determina de la siguiente manera.

log Nt − log No log 5,6 × 103 − log 7,0


γ = = = 1,4 multiplicaciones por hora
log 2 × (t − to ) log 2 × (8 − 1)

donde: Nt = número de bacterias en el tiempo t


N0 = número de bacterias iniciales

Entonces el tiempo de generación es:

1 1
g= = = 0,7 horas = 42 min utos
γ 1,4
Análisis de resultados 83

De igual forma se determina la tasa de muerte con una población de 9,5 x 102 UFC/ml
(hora 18) a 10 UFC/ml, desde la hora 18 donde empieza la disminución de las bacterias
viables hasta la 52, en la cual se presenta el último recuento.

log Nt − log No log 9,5 × 10 2 − log10


γ = = = 0,2 muertes por hora
log 2 × (t − to ) log 2 × (52 − 16)

En la obtención de la curva de crecimiento de las bacterias acidolácticas del cultivo


(992) en el proceso de fermentación, el pH tiene una disminución de 2,4% en al primera
hora y hasta la tercera su valor es casi constante como el recuento de las mismas. La
pequeña disminución se debe a la producción de ácido por dichas bacterias, que se
encuentran en un proceso de crecimiento celular (anabolismo) para lo cual necesitan
lactosa como fuente de energía. Este crecimiento no indica una reproducción de las
bacterias ya que estas se encuentran en el estado de latencia donde apenas se
adaptan al medio de cultivo; en la gráfica de la curva de crecimiento se presenta una
línea recta horizontal que indica la no proliferación de microorganismos.
Desde la tercera hora y hasta la octava comienzan a degradar la lactosa, sustrato
necesario para su desarrollo y reproducción; se observa un descenso significativo del
pH a una rata promedio de 0,4/hora por la producción de ácido láctico y trazas otros
compuestos (p. ej. ácido acético). En la curva de crecimiento se presenta esta etapa
como una línea recta con pendiente positiva ya que su crecimiento es exponencial, con
una tasa de crecimiento de 1,4 multiplicaciones por hora lo que indica que se duplican
cada 42 minutos (tiempo de generación).
A partir de la novena hora y durante aproximadamente ocho horas el pH se mantiene
prácticamente constante con un valor promedio de 4,15. Los microorganismos detienen
o disminuyen su crecimiento y reproducción por la producción de sustancia tóxicas
como el ácido láctico, que traen como consecuencia una valor del pH (4,15) en el cual
es menos viable su desarrollo. Una línea horizontal representa esta fase demostrando
la estacionalidad de las bacterias en la curva de crecimiento. A continuación se da la
fase de muerte en la cual la viabilidad de las bacterias disminuye lentamente por el
agotamiento de reservas energéticas en las células. La muerte se da también en forma
exponencial con una tasa de 0,2 muertes por hora, lo que indica que en cuatro horas
solo aproximadamente la mitad de los microorganismos permanecen viables. Por
ejemplo a las 20 horas el recuento era de 8,1 x 102 UFC/ml y a las 24 horas era de 5,0 x
102. El pH permanece constante por la detención en la producción de ácido láctico.
Después de 56 horas aproximadamente ya no hay presencia de bacterias.

3.4 REALIZACIÓN DE LA BEBIDA Y ANÁLISIS ORGANOLÉPTICO DE


LAS FORMULACIONES

Para la primera formulación con saborizante de maracuyá (Sabores Ltda.), de acuerdo


con el peso de 500 ml de suero fermentado, se calcularon los pesos de los demás
ingredientes por su proporción en porcentajes. Así:
Análisis de resultados 84

510,20 x 0,0475/ 0,9265 = 26,16 g de azúcar


510,20 x 0,001/ 0,9265= 0,55 g de colorante
510,20 x 0,025 / 0,9265= 13,77 g de pulpa

Cuadro 18. Cantidades de los ingredientes de la formulación de Sabores Ltda.


Ingredientes Cantidad (g)
Suero 510,20
Azúcar 26,16
Colorante 0,55
Saborizante (Maracuyá) 13,77

A continuación se presentan los resultados del análisis organoléptico por medio de la


prueba de aceptación por consumidores para la formulación de Sabores Ltda.

Cuadro 19. Resultados de la prueba de aceptación para la bebida con sabor a


maracuyá elaborada con la formulación de Sabores Ltda.

Consumidor Calificación
1 3
2 2
3 2
4 3
5 2
6 1
7 2
8 2
Promedio 2,1

La opinión generalizada de los consumidores fue que la bebida tenía un sabor artificial,
fuerte y no agradable.
En primera instancia se buscaba probar los productos ofrecidos por la empresa Sabores
Ltda. realizando la bebida con la pulpa de maracuyá. En la aplicación de una prueba
hedónica el 100% de los consumidores rechazó la bebida comentando un sabor
artificial que hace evidente la presencia de sustancias naturales idénticas y sintéticas.
Se decidió prescindir de los saborizantes y colorantes de dicha empresa. Esto no indica
que sus productos son de mala calidad porque de hecho han sido utilizados por la
empresa Coolechera con muy buenos resultados; simplemente no se ajustaron a la
bebida. No se consideraron entonces alternativas de diferentes formulaciones con
saborizantes y en su lugar se evaluaron otras propuestas que incluían la utilización de
pulpas naturales.
Para las formulaciones definitivas con pulpas (Prado Fruit Ltda.) A, B y C, de acuerdo
con el peso de 500 ml de suero fermentado, se calcularon los pesos de los demás
ingredientes por su proporción en porcentaje.
Inicialmente se realizó la bebida con la formulación A y por criterio propio, luego de una
degustación personal, se hizo el planteamiento de las otras dos (B y C).
Análisis de resultados 85

Ejemplo: Formulación A

508,16 x 0,1 / 0,79 = 64,32 g de agua potable


508,16 x 0,045/ 0,79 = 28,95 g de pulpa
508,16 x 0,065 / 0,79 = 41,81 g de azúcar

De la misma manera se realizaron los cálculos para las otras dos formulaciones
(cuadro 20).

Cuadro 20. Cantidades en peso de los ingredientes para cada formulación


Ingredientes Formulación A (g) Formulación B (g) Formulación C (g)
Suero 508,16 505,62 507,36
Agua potable 64,32 101,12 102,00
Pulpa 28,95 30,34 23,18
Azúcar 41,81 37,07 29,80

A partir de la formulación A propuesta por el señor Dückinghaus, gerente de la empresa


Nocado – Schwarte GMBH se obtuvieron las otras dos. Las formulaciones B y C surgen
después de la degustación personal de la A y poseen variaciones que se esperaba
fueran del agrado de los consumidores. Se disminuyó el porcentaje de azúcar en las
formulaciones B y C porque se obtuvo un dulzor muy pronunciado en la A. Esto se debe
a que, tal vez, las pulpas utilizadas en la empresa Nocado – Schwarte no contienen
edulcorantes y las empleadas en el proyecto sí (Prado Fruit). Aunque se intentó obtener
información sobre las pulpas alemanas, la empresa insistió en al utilización de las
ofrecidas por Prado Fruit; evidentemente porque los precios son accesibles y en un
futuro se piensa llevar la bebida a un proceso industrial para su comercialización. A
pesar de que dichas pulpas no fueron diseñadas para saborizar bebidas fermentadas,
su composición se ajustó a los resultados esperados.
Los componentes de las pulpas de Prado Fruit incluyen estabilizantes (CMC) que
ayudan a integrar la pulpa con el medio de dispersión (suero de mantequilla
fermentado) impidiendo la separación. Además contiene colorantes naturales
permitidos que ayudan a hacer de la bebida un producto llamativo para el consumo. La
cantidad de este aditivo contenido en la pulpa fue suficiente para colorar la bebida
adecuadamente.
A continuación se presentan las calificaciones otorgadas por los panelistas no
entrenados obtenidas para cada una de las formulaciones de la bebida (A, B y C).
Análisis de resultados 86

Cuadro 21. Resultados de la prueba de aceptación para las formulaciones de la bebida


utilizando pulpa de maracuyá de Prado Fruit Ltda.
Consumidor Formulación A Formulación B Formulación C
1 A 6 9 8
2 A 5 8 7
3 A 4 7 6
4 N 5 8 5
5 A 4 8 6
6 N 6 9 6
7 N 4 7 6
8 A 5 8 7
9 A 6 9 7
10 A 5 7 5
11 N 3 6 5
12 A 5 9 7
Promedio niños 4,50 7,50 5,50
Promedio adultos 5,00 8,12 6,62
Promedio total 4,83 7,92 6,25
A: Adultos
N: Jóvenes (10-15 años)

No hubo diferencias significativas entre las opiniones de jóvenes y adultos ya que el


promedio de las calificaciones dadas por los jóvenes es muy cercano al proporcionado
por los adultos. Por ejemplo, para la formulación A el promedio de calificación de los
jóvenes es de 4,5, y el de los adultos es de 5,0.
A continuación se presentan los comentarios sobre la bebida, los cuales fueron
unificados arbitrariamente en opiniones similares sobre las tres formulaciones por parte
de los panelistas no entrenados.
Formulación A: demasiado dulce, muy viscosa y de sabor fuerte. En general se detectó
que se trata de una bebida con sabor a maracuyá.
Formulación B: sabor agradable, dulzor apropiado, viscosidad adecuada. En general se
detectó que el sabor es de maracuyá.
Formulación C: sabor no tan agradable y simple, viscosidad adecuada. En general no
se detectó el tipo de sabor de la bebida.
En general los comentarios en cuanto a la formulación A, se refirieron al alto contenido
de dulce lo cual rechazaron tanto jóvenes como adultos. Otro factor decisivo fue la
viscosidad, de la cual comentaron que era muy alta y no proporcionaba una sensación
de frescura. De la formulación B se obtuvieron los mejores comentarios; hubo
unanimidad de opinión en que era la mejor alternativa, debido a su buen contenido de
dulce y apropiada viscosidad. Sobre la formulación C el inconveniente se debió a la no
identificación del sabor de la pulpa y se comentó en general que era muy simple. Esto
se debió al bajo contenido de pulpa y azúcar añadido.
Análisis de resultados 87

Las calificaciones arrojadas por las pruebas de aceptación de cada una de las tres
formulaciones son notablemente diferentes. La formulación B se escogió como la mejor
opción por tener el mayor promedio de aceptación, teniendo en cuenta que hubo poca
variabilidad entre las calificaciones obtenidas para cada una de las formulaciones.

3.5 CARACTERIZACIÓN DE LA BEBIDA TERMINADA

Después de ser escogida la formulación B como la mejor, se realizó su caracterización


fisicoquímica, microbiológica y nutricional.
A la bebida realizada no se le puede denominar como kumis, yogur o leche cultivada,
ya que estos productos se elaboran a base de leche y no de suero de mantequilla. Sin
embargo sus propiedades concuerdan con las estipuladas en la normatividad de
productos lácteos fermentados, lo que la clasifica como una leche fermentada.
De acuerdo con la teoría de clasificación para bebidas fermentadas24, la bebida en
cuestión se designa como:
Bebida láctea fermentada, descremada con dulce.
Teniendo en cuenta las definiciones dadas de los productos lácteos fermentados
existentes en Colombia, la bebida puede definirse como un producto lácteo de
consistencia fluida obtenida a partir de suero de mantequilla fermentado por la acción
de Lactococcus lactis ss. lactis y Lactococcus lactis ss. cremoris con adición de
ingredientes higienizados.
En la elaboración de la bebida se toma el suero fermentado con un pH aproximado de
4,6, momento en el cual las bacterias acidolácticas se encuentran terminando su fase
de crecimiento. A partir de este momento el pH empieza a ser casi constante mostrando
que no hay producción significativa de ácido láctico. El recuento constante de bacterias
acidolácticas ratifica que, aunque no hay crecimiento exponencial, las bacterias están
vivas y su carácter probiótico se conserva en el producto. Al final de la elaboración de la
bebida el pH promedio es de 4,15; su disminución se debe a la aplicación de la pulpa
que contiene un pH de 2,70 ± 0,02.

3.5.1 Pruebas microbiológicas

Cuadro 22. Resultados de la pruebas microbiológicas de la bebida terminada sin


pasterizar
Recuento de mesófilos NMP de Coliformes
Muestra Hongos (UFC/ml.)
(UFC/ml) totales/ml
1 5,7 x 103 a 6,3 x 103 2,4 x 102 a 4,6 x 102 1,0 x 103 a 1,2 x 103
2 9,3 x 103 a 10,0 x 103 2,4 x 102 a 1,1 x 103 1,1 x 103 a 1,2 x 103

24
NTC 777.Derivados lácteos, leches fermentadas. 1994.
Análisis de resultados 88

Por el alto contenido en coliformes, aunque no hubo presencia de fecales, se vio la


necesidad de pasterizar la bebida terminada con el fin de garantizar la inocuidad del
producto.
Después de la pasterización, los resultados de los medios YGC y BP específicos para
hongos y Staphylococcus respectivamente, fueron siempre negativos.

Cuadro 23. Resultados de la caracterización microbiológica de la bebida terminada


pasterizada
Muestra Recuento de mesófilos (UFC/ml) NMP de Coliformes totales/ ml
1 2,6 x 102 a 3,0 x 102 <3
2 3,6 x 102 a 3,9 x 102 3 a 15
3 3,8 x 102 a 4,9 x 102 3 a 9
4 4,5 x 102 a 5,9 x 102 3 a 93

En la caracterización de la bebida fermentada se determina la inocuidad microbiológica


solo por el conteo de coliformes. Esto se debe a que en este producto existen bacterias
acidolácticas (anaerobias aerotolerantes) pertenecientes al cultivo, además de los
mesófilos aerobios contaminantes y el análisis en el medio PCA no diferencia entre
estos.
Las pruebas microbiológicas arrojaron un alto contenido de coliformes totales, además
de hongos y levaduras. La norma 777 del ICONTEC para leches fermentadas estipula
valores máximos para recuento de coliformes, hongos y levaduras para productos de
mediana calidad (100 NMP y 500 UFC/ml) que en este caso se sobrepasaron. Esta
contaminación se debió a las condiciones de elaboración de la bebida, donde se
utilizaron implementos como jarras de plástico y una licuadora para la homogenización.
Aunque habían sido previamente desinfectados, la contaminación del ambiente y las
bacterias que permanecen después de la desinfección, provocaron este acusado
aumento de coliformes en 10 veces más que lo permitido por el ICONTEC y de hongos
y levaduras en aproximadamente el doble. Por este motivo se decidió pasterizar la
bebida terminada a 60ºC por 15 segundos, como se recomienda en la teoría;
temperatura a la cual no mueren las bacterias ácidolácticas, ya que resisten una
temperatura de 63ºC por 30 segundos25. El interés de conservarlas radica en su acción
probiótica que favorece la salud de los consumidores. Los niveles de contaminación
bajaron significativamente en la caracterización de la bebida pasterizada en
aproximadamente un 97% para coliformes y en un 100% para hongos y levaduras, de
igual forma no hubo presencia de Staphylococcus aureus, indicando la eficiencia de la
pasterización. En cuanto a los mesófilos, el recuento disminuyó en un 95% después de
la pasterización. La carga microbiana, después de dicho proceso, corresponde a
microorganismos que no mueren en la pasterización y algunas bacterias lácticas
desarrolladas en la fermentación que crecen en este medio de cultivo (no específico
para ellas).

25
SPREER, Edgar. Lactología Industrial. Zaragoza : Acribia, 1991.
Análisis de resultados 89

3.5.2 Pruebas fisicoquímicas

En el cuadro 31 del anexo L se encuentran todos los resultados de las pruebas


fisicoquímicas realizadas a la bebida terminada. Se presenta un ejemplo del cálculo de
la densidad para el ensayo 1 de la muestra 1, ya que se determina de distinta forma
que en el suero. La prueba de fosfatasa resultó siempre negativa.

• Cálculo de la densidad aparente

5,295 g
densidad = = 1,059 g / ml
5ml

Las dispersiones para cada uno de los parámetros fisicoquímicos se presentan a


continuación.

1,065
densidad (g/ml)

1,060

1,055

1,050

1,045
0 1 2 3 4
muestra

Figura 18. Dispersión para los datos de densidad de la bebida terminada

0,70
acidez (% ác. láctico)

0,65

0,60

0,55

0,50
0 1 2 3 4
muestra

Figura 19. Dispersión para los datos de acidez de la bebida terminada


Análisis de resultados 90

4,4

4,3
pH
4,2

4,1

4,0
0 1 2 3 4
muestra

Figura 20. Dispersión para los datos de pH de la bebida terminada

0,7

0,6
grasa (%)

0,5

0,4

0,3
0 1 2 3 4
muestra

Figura 21. Dispersión para los datos de grasa de la bebida terminada

16,0
sólidos solubles (%)

15,5

15,0

14,5

14,0
0 1 2 3 4
muestra

Figura 22. Dispersión para los datos de sólidos solubles de la bebida terminada
Análisis de resultados 91

16,5

sólidos totales
16,0

15,5

15,0

14,5
0 1 2 3 4
muestra

Figura 23. Dispersión para los datos de sólidos totales de la bebida terminada

A partir de los datos del cuadro 31 del anexo L se realizan los estadígrafos contenidos
en el cuadro 25.

Cuadro 24. Resultados de los estadígrafos para la caracterización fisicoquímica de la


bebida terminada
Densidad Acidez Grasa Sólidos Sólidos
pH
(g/ml) (%ác. láctico) (%) Solubles (%) Totales (%)
Media 1,056 4,15 0,621 0,483 15,31 15,80
Varianza 2,2 x 10-5 0,011 0,004 5,6 x 10-3 0,171 0,197
Desviación 4,7 x 10-3 0,105 0,060 0,075 0,414 0,444
Límites de confianza del 95%
Inferior 1,053 4,083 0,584 0,436 15,050 15,514
Superior 1,059 4,217 0,659 0,531 15,576 16,080

De acuerdo con los datos obtenidos en los estadígrafos de la caracterización


fisicoquímica, las desviaciones de cada parámetro muestran precisión en los resultados
obtenidos. En el caso de la densidad que se determina como el peso de una muestra
sobre su volumen existe un error experimental de paralaje al leer el volumen, por lo que
la desviación en la bebida es 48% mayor que la desviación para el suero crudo. Este
comportamiento se evidencia en la gráfica de dispersión para la densidad, en la cual los
valores obtenidos para cada muestra son precisos pero varían significativamente entre
las diferentes muestras (de 0,6 a 0,5 g/ml). En cuanto a las gráficas de dispersión de los
demás parámetros se observa de igual forma, precisión en las repeticiones de una
muestra, mientras que los datos obtenidos para cada muestra no reportan diferencias
significativas entre sí.
Al igual que otras leches fermentadas realizadas en la empresa Coolechera como el
yogur líquido (pH de 4,1 a 4,3)26, el pH de la bebida es de 4,08 a 4, 21.

26
Documentos de la empresa Coolechera de la elaboración del yogur líquido.
Análisis de resultados 92

El rango de sólidos solubles (15,0 a 15,6%) aumenta aproximadamente en un 41,6%


con respecto al suero crudo por los ingredientes contenidos que forman parte de esta
propiedad como la pulpa y el azúcar.
La bebida debe permanecer refrigerada (<10ºC) con el fin de inhibir el desarrollo de los
microorganismos y ser agradable al consumidor como producto refrescante. La bebida
fermentada refrigerada a bajas temperaturas tiende, no obstante, a experimentar una
separación de las fases cuando su contenido de aire es elevado, como en este caso
debido a la homogenización. Esto se debe a que la refrigeración hace que se
incremente la viscosidad y esto provoca que las burbujas de aire, en su ascenso hacia
la superficie, arrastren consigo las micelas de caseína. En cuanto a la precipitación de
proteínas, este factor no afecta la estabilidad de la bebida, ya que en el momento de su
homogenización la gran mayoría han precipitado. Con la pasterización de la crema
(95ºC) se desnaturalizan todas las proteínas del suero de la mantequilla causando la
precipitación del complejo caseínas-proteínas del suero a un pH de 5,0. Desde este
momento y hasta llegar a un pH de 4,6, en el que se toma el suero para la elaboración
de la bebida, la precipitación se ha dado en casi un 100%. En caso de que continúe
este fenómeno de insolubilización, sería despreciable, ya que no se perciben grumos en
la bebida.
Aunque el CMC se clasifica como espesante27, en este caso los proveedores de la
pulpa utilizada en la elaboración de la bebida, incluyen este polisacárido como
estabilizante de dicha pulpa por la cantidad en que se presenta. Esta es suficiente para
causar una estabilidad entre el suero fermentado y la pulpa añadida.

• Contenido de lactosa de la bebida = 44,1 g/lt (Ver anexo J) y la disminución con


respecto al contenido inicial es del 12%.

44,1g / lt 4,75 − 4,18


× 100 = 4,18% de lactosa × 100 = 12%
1056 g / lt 4,75

La producción neta de ácido láctico se halla con la diferencia entre el contenido inicial y
final de lactosa.

4,75% - 4,18% = 0,57% de lactosa.

Peso molecular :
lactosa = 342,3 g/mol
glucosa = 180,2 g/mol
galactosa = 180,2 g/mol
ác. láctico = 90,1 g/mol

De acuerdo con la estequiometría de la reacción 1 mol de lactosa produce 4 moles de


ácido láctico.

27
MULTON, J.L. Aditivos y auxiliares de fabricación en las industrias agroalimentarias.
Análisis de resultados 93

1mol lactosa 4mol ác.láctico 90,1g


0,57 g lactosa × × × = 0,60% ác..láctico
342,3 g 1mol lactosa 1mol ác.láctico

Con respecto a la acidez, la cantidad de ácido láctico producido es:

0,62% - 0,18% = 0,44 % de ác. láctico

Este contenido de ácido corresponde a 0,42% de lactosa degradada.

1mol ác.láctico 1mol lactosa 342,3 g


0,44 g ác.láctico × × × = 0,42% lactosa
90,1g 4mol ác.láctico 1mol lactosa

En cuanto a la lactosa se evidencia una disminución en su contenido por efectos de la


fermentación. La disminución es de un 12% con respecto al contenido inicial; en el
producto fermentado es de 4,18% que corresponde a los rangos establecidos para el
yogur (3,0 a 4,5%) lo que hace de la bebida un producto más digerible que la leche para
personas intolerantes a la lactosa. Dicha baja en el contenido de lactosa provoca un
aumento proporcional en el contenido de ácido láctico, incrementando la acidez en un
rango de 0,58 a 0,66%; esta propiedad se encuentra en el límite del valor mínimo de la
acidez para leches fermentadas (0,6%) indicando que tiene el nivel de fermentación que
se requiere como norma en Colombia.
La diferencia entre el contenido de lactosa en el suero y la bebida es de 0,57% sin tener
en cuenta el error exactitud de dicha determinación, no proporcionado por el laboratorio
Asinal Ltda. Este valor corresponde a 0,60% de ácido láctico producido en la
fermentación. Si se determina la diferencia entre la acidez final e inicial del producto, el
ácido láctico producido es de 0,44%, pero si se tiene en cuenta la desviación de los
datos, la máxima diferencia entre la acidez del suero y la bebida (lím. mayor de la
bebida – lím. menor del suero) es de 0,49%. Por consiguiente la diferencia entre la
cantidad de ácido calculada por medio de la lactosa y por medio de la acidez es de
aproximadamente 0,11% de ácido láctico. Esto se debe a que la acidez de la bebida en
su caracterización siempre fue medida inmediatamente después de su elaboración,
mientras que el contenido de lactosa fue determinado dos días después, debido a la
carencia de laboratorios para este fin en Barranquilla. En el transporte se rompió en
varias ocasiones la cadena de frío, por ejemplo después de la elaboración no se
refrigeró de inmediato y permaneció a 28ºC (temp. Barranquilla) por aproximadamente
dos horas. Aunque se envío con gel refrigerante, a su llegada a Bogotá ya tenía una
temperatura aproximada de 15ºC. Esto indica que la bebida fue sustrato para coliformes
presentes en ella que degradaron lactosa disminuyendo su contenido un poco más para
incrementar la acidez en aproximadamente 0,11% más.

• Contenido de nitrógeno total y porcentaje de proteínas de la bebida terminada

Ejemplo: muestra 10,032 g


Análisis de resultados 94

3,1 × 1 0,0434
NM = = 0,0434 g de nitrógeno → %NM = × 100 = 0,4326%
71,43 10,032

% Pr oteínas = 0,4326 × 6,38 = 2,76%

Para la verificación del buen funcionamiento del equipo y correcta metodología se


determina el nitrógeno recuperado de la urea como medio de control:

Nitrógeno recuperado (NRE)= 0,46 g de nitrógeno


Porcentaje de recuperación de nitrógeno (%NRE) = 99%

Error de exactitud (%E.E) = 1%

Confirmación del error de exactitud: remitirse a la gráfica 2. Curva de calibración para el


método Kjeldahl (digestión, destilación, titulación)

Cuadro 25. Volúmenes de HCL 1N empleados en la titulación para la determinación del


porcentaje de proteínas de la bebida terminada
Volumen de HCL 1N empleado en la titulación
Muestra Muestra Cont. NT Proteínas
(ml)
(ml) (g) (g) (%)
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Prom.
7,6 8,0256 2,5 2,5 2,4 2,47 0,0345 2,75 ± 0,06
9,5 10,0320 3,0 3,2 3,1 3,10 0,0434 2,76 ± 0,10
11,4 12,0384 3,7 3,6 3,7 3,67 0,0513 2,72 ± 0,06
1g Urea (control) 33,5 33,0 32,5 33,0 0,4620 Prom. 2,74%

De acuerdo con el contenido porcentual de proteínas en la bebida, la cantidad de este


nutriente en un vaso de 250 ml sería de:

250 ml × 1,056 g / ml = 264 g de producto

264 g de producto
2,74 g de proteína × = 7,23 g de proteína por vaso
100 g de producto
En cuanto al contenido de proteínas, se observa una disminución en la bebida de un
16% con respecto al suero crudo a causa de la dilución realizada (adición de un 15% de
agua). De acuerdo con el factor de dilución de 0,85 el contenido de proteínas final
esperado sería de 2,77% pero el valor obtenido en la práctica fue de 2,74% cuyo rango
va de 2,71 a 2,76% (con el 1% de error de exactitud). Esta diferencia se explica por
errores de experimentación en la elaboración de la bebida, en el momento de hacer la
dilución. Por ejemplo si en la dilución se agrega 1 ml más de agua, a la misma cantidad
de suero (adición de 15,2% de agua), el factor de dilución sería de 0,848 y el contenido
de proteína en la bebida sería de 2,76%. De igual forma los rangos obtenidos para la
grasa fueron menores que los teóricos esperados. El rango esperado con el factor de
dilución era de 0,51 a 0,62% y en la experimentación resultó ser de 0,44 a 0,53%. No
Análisis de resultados 95

existe otra razón que explique este descenso, ya que no hay reacciones de
degradación lipídica; los microorganismos de fermentación no degradan la grasa y una
oxidación no es posible en tan corto tiempo de proceso. En cuanto a las proteínas, si
existiera alguna reacción de degradación proteica, no sería posible distinguirla porque
el resultado de la prueba arroja el contenido de nitrógeno total de la muestra y un
cambio en la estructura de las mismas no afecta dicho contenido.
La bebida proporciona 7,23 g de proteína por vaso y un adulto requiere 38,5 g de
proteína por día, lo que indica que si ingiere dos vasos al día, supliría aproximadamente
el 37,6% de sus requerimientos proteicos totales, teniendo en cuenta que no todas las
proteínas son digeribles. De igual forma para el niño que necesita 44,8 g/día, con la
misma cantidad consumida, supliría el 32,3% de sus requerimientos diarios.

3.5.3 Pruebas nutricionales

En el anexo J se presenta la copia de los resultados de las pruebas de lactosa, Fe, Ca y


P, realizadas por el laboratorio Asinal Ltda. y en el anexo K la copia de los resultados
de vitamina A, vitamina D3 y fibra soluble e insoluble, realizadas por el laboratorio
Biocontrol Ltda.

Tabla 3. Resultados de las pruebas nutricionales por 100 g


Parámetro nutricional Cantidad (100g)
Vitamina A 99,7 UI
Vitamina D 15,1 UI
Cenizas 0,601
Calcio 0,06
Fósforo 0,06
Hierro 2,4 x 10-5
Fibra dietaria insoluble 2,0
Fibra dietaria soluble 0,1

En cuanto a la evaluación nutricional, el contenido de cenizas en el producto (0,601%)


permite conocer su valor en el suero crudo. De acuerdo con el factor de dilución (0,85)
el porcentaje de cenizas en el suero crudo sería de 0,71%, lo que indica que en el
proceso de fermentación no existen pérdidas de minerales, ya que la leche los
contienen en la misma proporción28. Contrastando dicho porcentaje con el de la
mantequilla que es de 0,15% se evidencia la permanencia del material mineral, casi en
su totalidad, en el suero durante el proceso de batido. Esto se refleja en las cantidades
porcentuales de Ca, P y Fe (0,06, 0,06 y 2,4 x 10-5%) que resultan ser
aproximadamente el 50% de los contenidos de cada uno de ellos en el yogur29. La
dilución de la bebida terminada causaría una disminución de los valores teóricos de Ca
a un 0,10%, del P a un 0,081% y del Fe a un 4,2 x 10-5% si no existieran pérdidas en el

28
BADUI, Salvador. Química de los Alimentos. México : Alhambra Mexicana, 1996.
29
CHARLEY, Helen. Tecnología de alimentos. México : Limusa, 1997.
Análisis de resultados 96

batido. Entonces la diferencia entre lo que baja por dilución y lo que realmente contiene
la bebida es la parte que permanece en la mantequilla (0,04% de Ca, 0,021% de P y
1,8 x 10 –5% de Fe).
Las vitaminas evaluadas en la bebida, representativas de los productos lácteos, son
liposulubles, lo que explica su bajo contenido en el suero (A = 99,7 UI/100g y D3 = 15,1
UI/100g) comparándolo con el contenido de dichas sustancias en la mantequilla
(A = 2.500 UI/100g y D3 = 55 UI/100g). Esto comprueba que permanecen casi en su
totalidad ligadas a los glóbulos grasos.

3.6 COSTOS APROXIMADOS DE PRODUCCIÓN DE LA BEBIDA

• Costos de energía
En el cuadro 26 se presenta los costos de la energía para la realización de la bebida.
Cada equipo tiene una potencia teórica máxima de trabajo. Se expresa el rendimiento
que cada uno experimenta en la producción de yogur líquido y se adopta este
porcentaje también para la producción de la bebida; esto da el consumo de energía real
y de acuerdo con el tiempo que funcionaría cada uno, se determina el costo de energía
total.

Cuadro 26. Costo por consumo de energía para el procesamiento de 4.200 lt de suero
Consumo de energía (kW) Precio energía $130/kWh
Equipo
Potencia (kW) Rend. % Consumo (kW) Tiempo (h) Valor total ($)
Homogenizador 46 70 32,20 0,42 1.758
Agitador tanque 5 65 3,25 7,00 2.957
Pasterizador 17 75 12,75 0,42 696
Compresores 154 75 115,50 0,42 6.306
Envasadora 32 65 20,80 5,00 13.520

Ejemplo de cálculo: homogenizador


0,42 h x 32,2 kW x $130/ kWh = $1.758/4.200 lt
El costo total por consumo de energía = $25.237/4.200 lt, es decir $1,502/250 ml
• Costos de mano de obra
La hora de trabajo tiene un costo de $2.800. Se emplea un operario durante una hora
para la puesta en marcha de la fermentación y una hora para la mezcla de los
ingredientes, pasterización y homogenización. Por último se requiere un operario
durante cinco horas para el envasado, para un total de siete horas de trabajo en el
procesamiento de 4.200 lt de suero.
El costo total por mano de obra = 7 h x $2.800 = $19.600/4.200lt, es decir, $1,17/250 ml
Análisis de resultados 97

• Costos de ingredientes y empaque

Cuadro 27. Costo de ingredientes y empaque empleados en la elaboración de 250 ml


de la bebida fermentada
Precio Cant. Requerida Costo total Costo de empaque
Ingredientes
($/kg) (g) ($/250 ml) ($/unidad)
Pulpa 2.750 11,88 32,67 Vaso 59,52
Azúcar 1.390 14,52 20,18 Foil 17,81
Agua 2,32 39,60 0,092 Total 77,33

Ejemplo de cálculo: Pulpa


Peso de 250 ml de la bebida: 250 ml x 1,056 g/ml = 264 g
264 g x 0,045 = 11,88 g de pulpa requerida
0,01188 kg de pulpa x $2.750 = $32,67

El costo total por ingredientes = $52,94/250 ml


El costo total por empaque = $77,33/unidad de 250 ml.
El empaque se refiere a un vaso plástico de polietileno de alta densidad, de color
blanco y opaco, que no permita la visualización del contenido y refleje la luz. En la
impresión se debe incluir la leyenda “ Agitar antes de consumir” para que la bebida, que
ha sufrido una separación de fases, sea homogénea al momento de su consumo.
El costo del cultivo necesario para la fermentación es de $4.000/50lt, es decir de
$20/250 ml

• El costo total de producción de 250 ml de la bebida es de = $152,94 ≅ $153

En la empresa Coolechera el costo de producción de un yogur con la misma


presentación y cantidad que tiene la bebida es de $240. Entonces, los costos de
elaboración de la bebida son 36% menores que para este producto; la causa de dicha
economía se debe principalmente a que la materia prima (suero de mantequilla) no
tiene costo alguno. En el mercado, el yogur de Coolechera (250 ml), se comercializa
con un precio aproximado de $900, lo que genera un margen de ganancia del 375%
para la empresa. La bebida podría ser vendida con un margen de ganancia del 100% (a
$306) y seguiría siendo económica con respecto a otros productos lácteos fermentados,
por ejemplo la diferencia con el precio del yogur sería de $594. Si el gobierno decidiera
subsidiar la producción de la bebida con fines sociales, esta podría ser adquirida por los
sectores menos favorecidos a un precio de costo ($153), con lo cual se estaría
contribuyendo a la disminución de la desnutrición en nuestro país.
CONCLUSIONES

• Las propiedades fisicoquímicas del suero de mantequilla obtenido a partir de crema


dulce en la empresa Coolechera se encuentran dentro de los rangos teóricos
estipulados para dicho producto y los resultados del análisis microbiológico no
sobrepasan los límites definidos por la norma 506 del ICONTEC para leche
pasterizada.
• El cultivo 992 de la empresa Interenzimas S.A. que contiene las bacterias lácticas
Lactococcus lactis ss. lactis y Lactococcus lactis ss. cremoris fermentan el suero de
la mantequilla presentando el mismo comportamiento que en la fermentación de
leche con el tiempo y dosificación estipulados en la ficha técnica.
• Las etapas de la fermentación discontinua del suero de la mantequilla se observan
en la gráfica de la curva de crecimiento. La degradación del suero por las bacterias
lácticas produce ácido láctico, aumentando la acidez del medio y provocando la
muerte de las mismas que no se reproducen en un pH menor de 4,6.
• Las pulpas naturales de la empresa Prado Fruit Ltda. saborizaron el suero
fermentado con resultados positivos en las pruebas organolépticas aplicadas a
consumidores.
• Las propiedades fisicoquímicas y microbiológicas de la bebida terminada
pasterizada se ajustan a los parámetros establecidos en la norma 777 del ICONTEC
para productos fermentados. La disminución en el contenido de lactosa haría de la
bebida un producto más digerible para personas intolerantes a la misma. Si se
asume que la cantidad de proteína contenida en el producto es completamente
digerible, esta satisfacería en un 37,6% las necesidades proteicas de un adulto por
día y en un 32,3% las de un niño, si se ingieren dos vasos al día.
• El costo de producción de la bebida si se realizara en al empresa Coolechera sería
de $153; un 36% menos que los incurridos en la realización del yogur saborizado en
la misma empresa ($240) lo que confirma la economía que representa el ahorro de
la materia prima.

98
RECOMENDACIONES

• Se podría ensayar la fermentación con un cultivo comercial que produzca aromas u


otros productos además de ácido láctico, para determinar su incidencia en el
consumidor. Estos cultivos pueden incluir una mezcla de Lactococcus lactis ss. lactis
y Leuconostoc mesenteroides ss. cremoris para la producción de ácido láctico y
aromas o una combinación de Lactococcus lactis ss. lactis o cremoris con levaduras
como Saccharomyces lactis para la producción de ácido láctico y alcohol. Esta
ultima flora se utiliza con frecuencia para la producción de kumis.
• Para la dilución de la bebida se debería ensayar la adición de suero dulce de queso
o mantequilla e incluso de leche descremada en lugar de agua. Esto aumentaría el
valor nutritivo como el contenido de vitaminas y minerales del producto pero a la vez
el contenido de lactosa. Se debe determinar si este último es significativo y realizar
pruebas sensoriales para observar si existen diferencias entre los tipos de diluciones
y escoger la mejor opción.
• Se debería ensayar con pulpas de diferentes sabores o combinaciones de estas,
incluso la utilización de sabores vegetales, como se ha venido haciendo para la
elaboración de bebidas a base de agua refrescantes por empresas como Parmalat.
Por ejemplo una combinación de naranja, limón y mandarina o piña, naranja y
zanahoria.
• La utilización de estabilizantes de distintos tipos que no provoquen un aumento
acusado en la viscosidad del producto como por ejemplo la goma xantan, debería
ser evaluada. Esto con el fin de definir si ayudan o no a la estabilidad de la
dispersión y la separación de fases que se da al dejar en reposo la bebida.
• El empaque de la bebida puede ser cambiado para utilizar uno más moderno y
llamativo que pueda competir en el mercado con otros productos, teniendo en
cuenta el incremento en los costos de producción.
• Se podría enriquecer la bebida con vitaminas como A y D que son características de
la leche y se encuentran en baja proporción por ser liposolubles. Además se pueden
adicionar minerales como los ya presentes en el producto para darle un mayor valor
nutritivo.
• Se recomienda realizar a la bebida un análisis nutricional completo que demuestre
los beneficios reales de este producto en humanos.

99
BIBLIOGRAFÍA

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INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y CERTIFICACIÓN. Control


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INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y CERTIFICACIÓN. Productos


lácteos, leche entera pasterizada. Bogotá: ICONTEC.,1993. p. 3, 4. NTC 506 (Segunda
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WEIMER, Richard. Estadística. México : CECSA, 1996. p. 517-520, 589-600, 792


ANEXO A

Resultados de los volúmenes para la curva de calibración


(destilación)

Sulfato de amonio (NH4)2SO4 (250 ml de solución)


Peso molecular: 132 g
Cada mol de sulfato de amonio contiene 28 g de nitrógeno
Cantidad teórica de nitrógeno presente en 0.9428 g de sulfato de amonio.
X = 0,9428 g (NH4)2SO4 x 28 g de N / 132 g (NH4)2SO4 = 0,2 g de nitrógeno
Cantidad teórica de nitrógeno presente en 1ml de la solución de sulfato de amonio.
X = 1 ml Sln. (NH4)2SO4 x 0,2 g N / 250 ml Sln. (NH4)2SO4 = 0,0008 g de nitrógeno

Cuadro 29. Promedio de los volúmenes de HCL 0,0996 N empleados en la titulación de


los diferentes volúmenes de solución de sulfato de amonio
Vol. solución
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Promedio
Sulfato de amonio
(ml HCL) (ml HCL) (ml HCL) (ml HCL)
(ml)
4 2,3 2,3 2,1 2,23
8 4,5 4,5 4,6 4,53
12 6,8 6,8 6,8 6,80
16 9,0 9,0 9,2 9,07
20 11,3 11,4 11,4 11,37

103
Anexos 104

ANEXO B

Resultados de los volúmenes para la curva de calibración


(destilación, digestión y titulación)

Urea (NH2)2CO
Peso molecular: 60 g
Cada mol de sulfato de amonio contiene 28 g de nitrógeno
Cantidad teórica de nitrógeno presente en 1,3928 g de urea.
X = 1,3928 g (NH2)2CO x 28 g de N / 60 g (NH2)2CO = 0,65 g de nitrógeno

Cuadro 29. Promedio de los volúmenes de HCL 0,9677 N empleados en la titulación de


los diferentes pesos medidos de urea.
Peso de urea Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Promedio
medido (g) (ml HCL) (ml HCL) (ml HCL) (ml HCL)
0,4286 14,5 14,5 14,5 14,50
0,5357 18,0 18,2 18,2 18,30
0,6428 21,8 21,5 22,0 21,77
0,7500 25,4 25,4 25,5 25,43
0,8571 29,1 29,1 29,0 29,07
0,9643 32,6 32,6 33,0 32,73
1,0714 36,4 36,4 36,4 36,40
1,1786 40,5 39,7 40,0 40,07
1,2857 43,8 43,6 43,8 43,73
1,3928 47,4 47,4 47,5 47,43
Anexos 105

ANEXO C

Composición de los medios de cultivo deshidratados para


siembras microbiológicas de laboratorios Merck

Composición (g/lt)

• Agar PCA (Agar-peptona de caseína-glucosa-extracto de levadura)


Peptona de caseína 5,0; extracto de levadura 2,5; D(+)-glucosa 1,0; Agar-agar 14,0
• Caldo BRILLA (Caldo-Verde brillante-bilis-lactosa)
Peptona 10,0; lactosa 10,0; bilis de buey, desecada 20,0; Verde brillante 0,0133
• Medio de cultivo SIM
Peptona de caseína 20,0; peptona de carne 6,6; citrato de amonio y hierro (III) 0,2;
tiosulfato sódico 0,2; Agar-agar 3,0
• Agar BP (Agar selectivo para Staphylococcus seg. BAIRD-PARKER)
Peptona de caseína 10,0; extracto de carne 5,0; extracto de levadura 1,0; piruvato
sódico 10,0; glicina 12,0; cloruro de lítio 5,0; Agar-agar 15,0
Aditivos: emulsión de yema de huevo telurito 50 ml; eventualmente, Sulfametacina
0,05 g
• Agar YGC (Agar-extracto de levadura-glucosa-Cloramfenicol) (FIL-IDF)
Extracto de levadura 5,0; D(+)-glucosa 20,0; Cloramfenicol 0,1; Agar-agar 14,9
• Agar MRS (Caldo para Lactobacillus seg. DE MAN, ROGOSA y SHARPE)
Peptona universal 10,0; extracto de carne 5,0; extracto de levadura 5,0; D(+)-glucosa
20,0; hidrogenofosfato dipotásico 2,0; Tween80 1,0; hidrogencitrato diamónico 2,0;
acetato sódico 5,0; sulfato de magnesio 0,1; sulfato de manganeso 0,05; Agar-agar
(ausente en Caldo MRS) 12,0
Anexos 106

ANEXO D

Cuestionario para la prueba de aceptación (escala hedónica)

Prueba de escala hedónica


Instrucciones: en la siguiente escala de puntuación anote el comentario que mejor
describe cuando le gusta o le desagrada la muestra que ha probado. Tenga presente
que usted es el juez y el único que puede decir lo que le gusta. Nadie sabe si este
alimento debe ser considerado bueno, malo o indiferente. La sincera expresión de su
sensación personal no ayudará a decidir.

___________ Gusta muchísimo......................... (9)


___________ Gusta mucho................................ (8)
___________ Gusta moderadamente................. (7)
_____________ Gusta ligeramente........................ (6)
___________ Ni gusta ni disgusta...................... (5)
___________ Desagrada ligeramente................ (4)
___________ Desagrada moderadamente......... (3)
___________ Desagrada mucho........................ (2)
___________ Desagrada muchísimo................. (1)
Anexos 107

ANEXO E
Anexos 108

ANEXO F
Anexos 109

ANEXO G
Anexos 110

ANEXO H
Anexos 111

ANEXO I
Anexos 112

ANEXO J
Anexos 113

ANEXO K
Anexos 114

ANEXO L

Resultados de la evaluación fisicoquímica

Cuadro 30. Resultados de la caracterización fisicoquímica del suero


Densidad Acidez Grasa Sólidos Sólidos
Muestra pH
(g/ml) (%ác. láctico) (%) Solubles (%) Totales (%)
1,032 6,73 0,184 0,60 8,79 9,39
1 1,031 6,74 0,187 0,65 8,33 8,98
1,032 6,75 0,189 0,60 8,42 9,02
1,032 6,79 0,164 0,80 8,88 9,68
2 1,032 6,80 0,162 0,80 8,78 9,58
1,032 6,80 0,167 0,70 8,98 9,68
1,033 6,98 0,169 0,50 8,95 9,45
3 1,033 6,97 0,169 0,55 9,04 9,59
1,033 6,97 0,171 0,60 9,04 9,64
1,031 7,00 0,182 0,80 8,56 9,36
4 1,031 7,00 0,180 0,75 8,72 9,47
1,031 6,90 0,182 0,65 8,13 8,78

Cuadro 31. Resultados de la caracterización fisicoquímica de la bebida terminada


Densidad Acidez Grasa Sólidos Sólidos
Muestra (g/ml)
pH
(%ác. láctico) (%) Solubles (%) Totales (%)
1,059 4,17 0,594 0,40 15,69 16,09
1 1,058 4,17 0,587 0,40 15,50 15,90
1,060 4,16 0,590 0,50 15,65 16,15
1,061 4,04 0,671 0,55 15,77 16,32
2 1,060 4,06 0,677 0,60 15,64 16,24
1,062 4,05 0,673 0,60 15,41 16,01
1,056 4,30 0,545 0,50 14,57 15,07
3 1,055 4,31 0,551 0,40 14,50 14,90
1,055 4,31 0,536 0,40 15,08 15,48
1,049 4,09 0,675 0,45 15,35 15,80
4 1,050 4,07 0,680 0,50 15,28 15,78
1,049 4,07 0,680 0,50 15,32 15,82
Anexos 115

ANEXO M

Recuento de bacterias acidolácticas para la realización de la


curva de crecimiento del cultivo comercial

Cuadro 32. Promedio del recuento de bacterias lácticas, intervalo de confianza del 95%
y pH en el seguimiento de la fermentación
Tiempo Promedio log. (límite. superior) log. (límite. inferior)
pH
(horas) UFC/ml (UFC/ml) (UFC/ml)
0 0 2,047 1,948 6,76
1,0 7 2,122 2,032 6,60
1,5 5 1,900 1,782 6,61
2,0 3 1,985 1,878 6,57
2,5 15 2,241 2,163 6,50
3,0 10 2,214 2,134 6,48
4,0 9,0 x 102 2,532 2,477 6,25
5,0 2,3x 103 2,768 2,727 5,82
6,0 4,6 x 103 3,093 3,065 5,45
7,0 4,0 x 103 3,159 3,133 4,91
8,0 5,6 x 103 3,237 3,213 4,65
9,0 4,5 x 103 3,247 3,224 4,35
10,0 4,5 x 103 3,227 3,203 4,24
11,0 3,0 x 103 3,232 3,208 4,20
12,0 4,2 x 103 3,203 3,178 4,18
14,0 4,0 x 103 3,242 3,218 4,10
16,0 3,0 x 103 3,227 3,203 4,09
18,0 9,5 x 102 2,993 2,961 4,08
20,0 8,1 x 102 2,925 2,891 4,07
24,0 5,0 x 102 2,825 2,786 4,07
28,0 6,2 x 102 2,838 2,800 4,07
32,0 4,2 x 102 2,647 2,599 4,06
36,0 2,8 x 102 2,476 2,417 4,06
40,0 1,2 x 102 2,122 2,032 4,06
44,0 6,0 x 101 1,837 1,710 4,06
48,0 2,0 x 101 1,399 1,174 4,06
52,0 1,0 x 101 1,133 0,808 4,05
56,0 - 2,047 1,948 4,05
ELABORACIÓN DE UNA BEBIDA LÁCTEA
FERMANTADA Y SABORIZADA A PARTIR DEL
SUERO OBTENIDO COMO SUBPRODUCTO DE LA
FABRICACIÓN DE MANTEQUILLA

MARÍA CRISTINA CHARRIS OEDING


ROBERTO OSCAR ROIS ROMERO
GENERAL
Elaborar una bebida láctea fermentada y saborizada a partir del suero de la
mantequilla.

ESPECÍFICOS

! Realizar pruebas preliminares que conlleven a conocer el comportamiento que sigue


el cultivo comercial.
! Caracterizar fisicoquímica y microbiológicamente el suero de la mantequilla.
! Realizar el seguimiento de la fermentación y obtener la curva de crecimiento de las
bacterias del cultivo comercial.
! Saborizar el suero fermentado con tres formulaciones diferentes.
! Realizar pruebas sensoriales a consumidores desprevenidos para eligir la mejor
formulación.
! Caracterizar fisicoquímica y microbiológicamente la bebida terminada con la
formulación escogida.
! Evaluar nutricionalmente la bebida terminada.
! Estimar los costos de producción de la bebida en la empresa Coolechera
(Barranquilla).
" Leche
" Mantequilla
" Suero de mantequilla
" Bacterias lácticas
• fermentación
" Leches fermentadas
" Diseño experimental
" Resultados
• pruebas preliminares
• caracterización de la materia prima (suero)
• seguimiento de la fermentación acidoláctica
• elaboración de la bebida
• análisis sensorial
• caracterización de la bebida fermentada
" Costos de producción
La leche es el líquido segregado por las hembras de los mamíferos a
través de las glándulas mamarias, cuya finalidad básica es alimentar
a su cría durante un determinado tiempo.
Composición de la leche
Componente Porcentaje
Agua 85,0 - 89,0
Grasa 3,40 - 5,20
Proteína 3,10 - 3,70
Lactosa 4,40 - 4,80
Cenizas 0,71 - 0,75
Fuente: Badui, Salvador. Química de los Alimentos. México : Alhambra Mexicana, 1996.

Requisitos microbiológicos para leche pasterizada


Requisitos n m M c
Coliformes totales NMP/ml (30ºC) 3 11 39 1
Coliformes fecales NMP/ml (45ºC) 3 <3 - 0
Recuento total de microorganismos mesófilos UFC/ml 3 5 x 104 1 x 105 1
Fuente: NTC 506 : 1993, Productos lácteos, leche entera pasterizada.

Acidez máxima permisible = 0,18% ác. láctico


Microbiología
Fosfatasa negativa
Fisicoquímica
4 - 8ºC

90 - 95ºC

63ºC

19 - 23ºC

6ºC

8 - 10ºC
Derivado lácteo obtenido por el batido de la crema a partir de leche fresca.
La mantequilla es densa y homogenea.
Tipos de mantequilla:
• Mantequilla de crema dulce
• Mantequilla de crema ácida

Propiedades de la mantequilla
Proteínas...........................0,7%
Grasa.................................80%
Lactosa..............................0,4%
Minerales...........................0,15%
Vitamina A.........................2.500 UI / 100g
Vitamina D3.......................55 UI / 100g
Fuente: TETRA PAK. Manual de industrias lácteas. Madrid : Iberia, 1996.

Nutricional
Leche
1000 kg (100%)
grasa (3,4%)

Crema
83,6 kg (8,36%) Crema
grasa (40%)

Leche descremada
916,4 kg (91,64%)
grasa (0,1%) Mantequilla
Suero 40,6 kg (48,6%)
grasa (82%)
43kg (51,4%)
grasa (0,44%)
El suero de mantequilla es un producto líquido, de apariencia lechosa, de poca
viscosidad que resulta como subproducto en el batido de la crema pasterizada,
luego de la aglomeración de cubos de grasa en la elaboración de la mantequilla.

Contiene 0,12% de lecitina, fosfolípido presente en las membranas de los


glóbulos grasos.

Clases de suero: Suero puro, Suero (10% agua), Suero dulce, Suero ácido
Composición del suero de mantequilla
Propiedades Porcentaje
Agua 90,5 - 91,1
Extracto seco 8,90 - 9,50
Grasa 0,50 - 0,70
Proteínas 3,20 - 3,50
Minerales 0,70 - 0,75
Lactosa 4,00 - 5,00
Fuente: Milcherzeugnisse. En : Ausbildung im molkereifach. Berlin. Vol. 15, (abril de 1994).
SPREER, Edgar. Lactología Industrial. Zaragoza : Acribia, 1991
Fisicoquímica
BACTERIAS Lactobacillaceae (bacilos) Lactococcus
LÁCTICAS Streptocpoccus
Streptococcaceae (cocos) Enterococcus
Pediococcus
Leuconostoc

Características Lactococcus
• pH = 9,3 – 4,2
• anaerobios aerotolerantes
• mesófilos (temperatura óptima 30ºC)
• homofermentativos
• resisten 63ºC por 30 seg.

Lactococcus lactis degrada glucosa, lactosa, galactosa y sacarosa


Reacción de oxidación de compuestos orgánicos en que estos actúan como
dadores y aceptores terminales de electrones.

Fermentación acidoláctica

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6


lactosa glucosa galactosa

C6H12O6
glucosa

2 C3H6O3 2 C3H6O3
ác. láctico ác. láctico
Glucólisis: es la vía metabólica que transforma la glucosa a piruvato
mediante reacciones bioquímicas en las que el ATP funciona como
portador de energía y el NAD como acarreador de electrones.

Etapa I. Acomodación preparatoria de glucosa GAL3


Etapa II. Oxidación del GAL3 piruvato
Etapa III. Reducción del piruvato productos de fermentación
Producto lácteo higienizado obtenido por fermentación de la leche por la
acción de cultivos lácteos específicos, con o sin adición de derivados lácteos.
Buttermilk: bebida láctea fermentada con bacterias productoras de ácido láctico
a base de suero de mantequilla.

Requisitos fisicoquímicos para leches fermentadas


Requisitos
Materia grasa (%p/p) 0,5% máximo (yogur, kumis, leche cultivada)
yogur, kumis, leche cultivada 2,6% mínimo
Proteína láctea (%p/p)
leches fermentadas 2,8% mínimo
Acidez titulable (ác. láctico %p/p) 0,6% mínimo
Fosfatasa negativa
Fuente: NTC 777 : 1994, Derivados lácteos, leches

Requisitos microbiológicos para leches fermentadas


Requisitos n m M c
Coliformes NMP/ml (30ºC) 3 10 100 1
Coliformes fecales NMP/ml (45ºC) 3 0 - 0
Recuento de mohos y levaduras UFC/ml 3 200 500 1
Fuente: NTC 777 : 1994, Derivados lácteos, leches fermentadas

Características fisicoquímicas y nutricionales

pH......................3,7 – 4,7 Calcio...........0,12%


Microbiología
Sólidos totales...14,0% Fósforo.........0,095%
Fisicoquímica
Lactosa..............3,0 – 4,5% Hierro............5 x 10-5%
Nutricional
Toma de muestra

Pruebas preliminares (pH, sólidos solubles y mesófilos) de la fermentación

Caracterización microbiológica del Caracterización fisicoquímica del suero:


suero: recuento de mesófilos fosfatasa, densidad, pH, acidez, grasa,
aerobios, Staphylococcus aureus, sólidos solubles y sólidos totales, por
hongos y coliformes, por triplicado triplicado; proteínas y lactosa

Seguimiento de la fermentación acidoláctica con el cultivo comercial.


Realización de la curva de crecimiento (pH y recuento de bacterias acidolácticas)

Realización de la bebida: mezcla de los ingredientes,


homogenización y pasterización a 60ºC por 15 segundos

Análisis sensorial de las tres formulaciones


definitivas por medio de pruebas hedónicas

Caracterización microbiológica de Caracterización fisicoquímica de la


la bebida: recuento de mesófilos, bebida: fosfatasa, densidad, pH, acidez,
Staphylococcus aureus, hongos y grasa, sólidos solubles y sólidos totales,
coliformes, por triplicado por triplicado; proteínas y lactosa

Pruebas nutricionales: cenizas, minerales (Ca, P y Fe), vitaminas (A y D3) y


fibra dietaria (soluble e insoluble)
PRUEBAS PRELIMINARES

Tiempo Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3


(h) pH UFC/ml %S.S pH UFC/ml %S.S pH UFC/ml %S.S
0 6,78 1,0 x 102 9,0 6,80 3,5 x 102 8,8 6,79 2,4 x 102 8,8
2
1 6,59 1,2 x 10 8,8 6,58 3,7 x 102 8,8 6,57 2,2 x 102 8,8
2
2 6,57 1,1 x 10 8,8 6,57 3,8 x 102 8,8 6,55 6,5 x 102 8,5
2
3 6,47 3,6 x 10 8,5 6,46 6,0 x 102 8,5 6,48 7,0 x 102 8,5
2
4 6,22 7,8 x 10 8,5 6,25 6,2 x 102 8,5 6,23 9,8 x 102 8,5
2
5 5,82 9,0 x 10 8,2 5,81 9,8 x 102 8,5 5,84 1,0 x 103 8,5
3
6 5,44 1,1 x 10 8,2 5,39 1,5 x 103 8,2 5,41 1,2 x 103 8,2
3
7 4,90 1,2 x 10 8,2 4,91 1,6 x 103 8,2 4,93 1,3 x 103 8,2
3
8 4,70 1,2 x 10 7,0 4,63 3,4 x 103 7,5 4,68 2,1 x 103 7,5
S.S: sólidos solubles
UFC: unidades formadoras de colonias
CARACTERIZACIÓN DE LA MATERIA PRIMA (SUERO)

PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS

Resultados de la pruebas microbiológicas iniciales de la materia prima


Recuento de mesófilos NMP de Coliformes Hongos
Muestra
aerobios (UFC/ml) totales/ml (UFC/ml)
1 3,61 x 104 a 3,65 x 104 23 a 75 1,40 x 103 a 1,50 x 103
2 2,07 x 104 a 2,48 x 104 28 a 93 4,80 x 103 a 5,00 x 103

Resultados de la caracterización microbiológica de la materia prima


Recuento de mesófilos NMP de Coliformes
Muestra
aerobios (UFC/ml) totales/ ml
1 7,3 x 102 a 6,7 x 102 <3
2 3,6 x 102 a 3,2 x 102 9 a 43
3 7,6 x 102 a 4,5 x 102 4 a 9
4 1,9 x 102 a 2,3 x 102 <3

Leche
PRUEBAS FISICOQUÍMICAS
Resultados del análisis estadístico para la caracterización fisicoquímica de la materia prima
Densidad Acidez Grasa Sólidos Sólidos
pH
(g/ml) (%ác. láctico) (%) Solubles (%) Totales (%)
Media 1,0319 6,87 0,176 0,67 8,718 9,384
-7 -5
Varianza 6,3 x 10 0,012 9,1 x 10 0,011 0,089 0,090
-4 -3
Desviación 7,9 x 10 0,110 9,5 x 10 0,103 0,298 0,301
Límites de confianza del 95%
Inferior 1,0314 6,799 0,169 0,601 8,529 9,193
Superior 1,0324 6,939 0,182 0,732 8,907 9,575

Contenido de proteínas = 3,26%


Volumen de HCL 1N empleado en la
Muestra Muestra Cont. NT Proteínas
titulación (ml)
(ml) (g) (g) (%)
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Prom.
7,8 8,0496 2,9 3,0 2,9 2,93 0,0410 3,25
9,7 10,0104 3,7 3,7 3,7 3,70 0,0518 3,30
11,7 12,0744 4,3 4,4 4,4 4,37 0,0612 3,23
Prom.
1g Urea (control) 33,0 33,0 33,5 33,17 0,4644
3,26%
Contenido de lactosa = 4,75%
Prueba de fosfatasa negativa
Leche
SEGUIMIENTO DE LA FERMENTACIÓN ACIDOLÁCTICA

Tasa de crecimiento = 1,4 multiplicaciones por hora


Tiempo de generación = 42 minutos
Tasa de muerte = 0,2 muertes por hora
ANÁLISIS SENSORIAL DE LA BEBIDA

Formulaciones planteadas para la bebida


Ingredientes Formulación 1 (%) Formulación 2 (%) Formulación 3 (%)
Suero 79,0 75,0 76,6
Agua potable 10,0 15,0 15,4
Pulpa 4,5 4,5 3,5
Azúcar 6,5 5,5 4,5
Resultados de la prueba de escala de hedónica
Consumidor Formulación 1 Formulación 2 Formulación 3
1 A 6 9 8
2 A 5 8 7
3 A 4 7 6
4 N 5 8 5
5 A 4 8 6
6 N 6 9 6
7 N 4 7 6
8 A 5 8 7
9 A 6 9 7
10 A 5 7 5
11 N 3 6 5
12 A 5 9 7
Promedio niños 4,5 7,5 5,5
Promedio adultos 5,0 8,1 6,6
Promedio total 4,8 7,9 6,2
CARACTERIZACIÓN DE LA BEBIDA

PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS

Resultados de la pruebas microbiológicas de la bebida terminada sin pasterizar


Recuento de mesófilos NMP de Coliformes
Muestra Hongos (UFC/ml)
(UFC/ml) totales/ml
1 5,7 x 103 a 6,3 x 103 2,4 x 102 a 4,6 x 102 1,0 x 103 a 1,2 x 103
2 9,3 x 103 a 10,0 x 103 2,4 x 102 a 1,1 x 103 1,1 x 103 a 1,2 x 103

Resultados de la caracterización microbiológica de la bebida terminada pasterizada


Recuento de mesófilos NMP de Coliformes
Muestra
(UFC/ml) totales/ ml
2 2
1 2,6 x 10 a 3,0 x 10 <3
2 2
2 3,6 x 10 a 3,9 x 10 3 a 15
2 2
3 3,8 x 10 a 4,9 x 10 3 a 9
2 2
4 4,5 x 10 a 5,9 x 10 3 a 93

Fermentadas
PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Resultados del análisis estadístico para la caracterización


fisicoquímica de la bebida terminada
Densidad Acidez Grasa Sólidos Sólidos
pH
(g/ml) (%ác. láctico) (%) Solubles (%) Totales (%)
Media 1,056 4,15 0,621 0,483 15,31 15,80
Varianza 2,2 x 10-5 0,011 0,004 5,6 x 10-3
0,171 0,197
Desviación 4,7 x 10-3 0,105 0,060 0,075 0,414 0,444
Límites de confianza del 95%
Inferior 1,053 4,083 0,584 0,436 15,050 15,514
Superior 1,059 4,217 0,659 0,531 15,576 16,080

Contenido de proteínas = 2,74%


Volumen de HCL 1N empleado en la
Muestra Muestra Cont. NT Proteínas
titulación (ml)
(ml) (g) (g) (%)
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Prom.
7,6 8,0256 2,5 2,5 2,4 2,47 0,0345 2,75
9,5 10,0320 3,0 3,2 3,1 3,10 0,0434 2,76
11,4 12,0384 3,7 3,6 3,7 3,67 0,0513 2,72
Prom.
1g Urea (control) 33,5 33,0 32,5 33,0 0,4620
2,74%

Fermentadas
Contenido de lactosa = 4,18%

Diferencia en el contenido de lactosa:


4,75% - 4,18% = 0,57% de lactosa = 0,60 % de ác. láctico

Con respecto a la acidez, la cantidad de ácido láctico producido es:


0,62% - 0,18% = 0,44 % de ác. láctico

PRUEBAS NUTRICIONALES
Parámetro nutricional Cantidad
Vitamina A 99,7 UI/100g
Vitamina D 15,1 UI/100g
Cenizas 0,601%
Calcio 0,06%
Fósforo 0,06%
Hierro 2,4 x 10-5%
Fibra dietaria insoluble 2,0%
Fibra dietaria soluble 0,1%

Fermentadas

Mantequilla

Guía
Costo por consumo de energía para el procesamiento de 4.200 lt de suero
Consumo de energía (kW) Precio energía $130/kWh
Equipo
Potencia (kW) Rend. % Consumo (kW) Tiempo (h) Valor total ($)
Homogenizador 46 70 32,20 0,42 1.758
Tanque fermentador 5 65 3,25 7,00 2.957
Pasterizador 17 75 12,75 0,42 696
Compresor 154 75 115,50 0,42 6.306
Empacadora 32 65 20,80 5,00 13.520

Costo de ingredientes y empaque para 250 ml de la bebida fermentada


Precio Cantidad Costo total Costo de empaque
Ingredientes
($/kg) requerida (g) ($/250 ml) ($/unidad)
Pulpa 2.750 11,88 32,67 vaso 59,52
Azúcar 1.390 14,52 20,18 foil 17,81
Agua 2,32 39,60 0,092 total 77,33

Costo total por consumo de energía = $25.237/4.200 lt, es decir $1,502/250 ml


Costo total por mano de obra = 7 h x $2.800 = $19.600/4.200lt, es decir, $1,17/250 ml
Costo total por ingredientes = $52,94/250 ml
Costo total por empaque = $77,33/unidad de 250 ml
Costo del cultivo necesario para la fermentación = $4.000/50lt, es decir $20/250 ml
Costo total de producción de la bebida = $152,94/250 ml ≈ $153/250 ml
Pasterizador
Homogenizador

Compresor Tanques fermentadores

Empacadora Distribución

Suero Agua fría


Bebida Agua caliente
! Las características fisicoquímicas y micrbiológicas del suero de mantequilla se
encuentran dentro de los rangos teóricos estipulados en bibliografía y definidos por
la norma 506 del ICONTEC para leche pasterizada.

! El cultivo 992 (Lactococcus lactis ss. lactis y Lactococcus lactis ss. cremoris) sigue
el mismo comportamiento estipulado en la ficha técnica para la fermentación de la
leche.

! La degradación del suero por las bacterias lácticas produce ácido láctico,
aumentando la acidez del medio y provocando la muerte de las mismas que no se
reproducen en un pH menor de 4,2.

! La diferencia entre las varianzas de las tres formulaciones planteadas fue


significativa; por contener los ingredientes en una proporción adecuada que se
ajusta al gusto de los consumidores, la formulación dos fue escogida como la mejor.

! Las propiedades fisicoquímicas y microbiológicas de la bebida terminada se ajustan


a los parámetros establecidos en la norma 777 del ICONTEC para productos
fermentados.

! La disminución en el contenido de lactosa hace de la bebida un producto más


digerible para personas intolerantes a la bebida; la cantidad de proteína contenida en
el producto satisface en un 37,6% y 32,3% la necesidades proteicas de un adulto y un
niño respectivamente, si se ingieren dos vasos (250 ml) al día.

! El costo de producción de la bebida si se realizara en la empresa Coolechera sería de


$153, un 36% menor que los incurridos en la elaboración de un yogur en la misma
empresa ($240).