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REPUBLIC ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de

L'Enseignement supérieure et de la Recherche Scientifique

Les méthodes d’etudés de


coliformes

Mdm mehamdi
1. Introduction.
2. Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux.
3. Méthodes classiques de détection des coliformes.
3.1. Les méthodes de dénombrent.
3.2 . Méthode en milieu solide.
3.2.1. Méthode par filtration:
3.2.2. Méthode par incorporation:
3.2.3. Méthode par étalement
3.3. Technique de dénombrement en milieu liquide :
4. La nouvelle méthode pour l’étude des bactéries fécales
appliquées au bassin de la Seine .
4 .1. Développements méthodologique.
4.2. Objectif.
4.3. Méthode enzymatique pour le dénombrement d’ Escherichia coli.
4.3.1. Principe de la méthode enzymatique.
4.3.2. Interprétation.
5. Conclusion.
Les coliformes sont des micro-organismes que nous
retrouvons partout dans notre environnement, dans notre
corps, de même que dans celui de tous les êtres vivants.
L'ensemble de ces coliformes se nomme coliformes
totaux. Certains groupes de coliformes se retrouvent
dans les excréments des animaux à sang chaud; ce sont
les coliformes fécaux.
2.Recherche et dénombrement des
coliformes totaux et fécaux
Définitions:
Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non sporulé,
oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de
se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le
lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une
température de 35- 37°C.
Ils se répartissent en fait en deux catégories :

Les germes d’origine fécale stricte : Ces coliformes sont


capables de se développer à 44°C Escherichia coli, Citrobacter,
Klebsiella, serratia.

 Les germes provenant d’autre sources


environnementales (aquatique et tellurique) :
Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella
3.Méthodes classiques de détection des
bactéries coliformes :

les deux méthodes traditionnelles


d'énumération des coliformes sont la
détermination du Nombre le Plus Probable
(NPP) en milieu liquide, et le dénombrement des
Unités Formant Colonie (UFC) après incubation
sur milieu gélosé spécifique .
en milieu solide En milieu liquide

Méthode de
Méthode par incorporation détermination du
nombre le plus
Méthode par étalement
probable (NPP)
Méthode par filtration
3.2Méthodes en milieu solide

3.2.1Méthode par filtration:

Principe:
L’échantillon d’eau à analyser est filtré à
Travers une membrane qui retient les
micro organisme. La membrane est ensuite
placée sur un milieu Mac conkey ou
chapman TTC. Durant l’incubation, les
colonies se forment à la surface de la
Membrane.
Protocole expérimental:

100ml de chaque échantillon d’eau recueilli ont été


filtrés sur une membrane stérile d’acétate de
cellulose 0.22um millipore, cette dernière est ensuite
déposée sue une gélose de Mac conkey puis
incubée pendant 24 heures a 37C pour le
dénombrement des coliformes totaux et a 44C pour
le dénombrement des coliformes fécaux.
La méthode manuelle :
3.2.2Méthode par incorporation:

Principe:
L’échantillon d’eau à analyser est
mélanger au milieu de culture
solide(milieu VRBL ou DCL)
préalablement fondu et refroidi une à
T proche de la T de solidification.
Après incubation, les colonies qui se
développent à la surface et à
l’intérieur du milieu sont comptées.
Mode opératoire
3)faire un mouvement
de rotation

2) Incorporer le
milieu en
surfusion
(VRBLOU DCR)

1) volume d'eau à
ensemencer ( 1 ml)

Incuber

Faire le dénombrement
MÉTHODE PAR ÉTALEMENT:

Principe:
L’échantillon d’eau à analyser est étaler à
la Surface d’un milieu (VRBL ou DCL) sans
trace d’humidité: après incubation, les
colonies qui se développent à la surface
sont dénombrées.
Mode opératoire

Etaleur stérile (râteau)

Volume d'eau à ensemencer


1 ml

 Incuber
 Dénombrer les colonies développer à la surface
GÉLOSE VRBL
DOMAINE D’UTILISATION:

 La gélose lactosée biliée au


cristal violet et au rouge neutre
(VRBL) est un milieu sélectif
utilisé .

 pour les recherche et


dénombrement des coliformes
dans l’eau, le lait, les produits
laitiers et les autres produits
alimentaires.


•Les coliformes présentent des colonies
violacées de diamètre égal ou supérieur
à 0,5 mm après 24 heures d’incubation.
3.3 Technique de dénombrement en
milieu liquide

La numération des coliformes est


réaliséé par ensemencement de 1 ml de
l’echantillon et de ses dilution dans un
bouillon lactosé bilé au vert brillant
BLBVB les essais sont effectués en
double ou triple et les resultats analysés
Mac Grady. par méthode de
BOUILLON LACTOSÉ
BILIÉ AU VERT BRILLANT
(BLBVB) •DOMAINE D’UTILISATION :

BLBVB est utilisé pour les


recherche et dénombrement
des coliformes, des
coliformes thermotolérants et
d’Escherichia coli dans le lait,
les produits laitiers et les
autres produits alimentaires,
les eaux d’alimentation
résiduaires.
La présence simultanée de bile de bœuf
et de vert brillant provoque l’inhibition de
la presque totalité des microorganismes
à Gram+ et des bactéries à Gram- autres
que les
coliformes.

- Le développement des coliformes se


manifeste par l’apparition d’une turbidité,
associée à une
production de gaz dans la cloche de
Durham par suite de la fermentation du
lactose.
La méthode du NPP (Nombre le Plus Probable) utilise une
méthode statistique pour connaître le nombre (le plus
probable) de bactéries présentes dans 1 mL de dilution.

• Si le tube est + = il y a au moins une


bactérie / mL de la dilution considérée

• Si le tube est - = il y a moins de une


bactérie / mL de la dilution considérée

Cette technique utilise plusieurs tubes par dilution (2, 3, 4 ou


5) et on compare les résultats à une table statistique = la
table de Mac Grady
4.La Nouvelle méthode pour l’étude des bactéries fécales
appliquées au bassin de la Seine

(Groupe de Microbiologie des Milieux Aquatiques, Université


Libre de Bruxelles, Belgique)

Le bassin de la Seine est un des plus densément peuplé


d'Europe. Cette importante pression anthropique, implique des
rejets très importants des
eaux . bactéries fécales dans ses eaux, essentiellement par les
usées domestiques et les rejets agricoles

La détection des pollutions fécales dans les milieux naturels se


fait habituellement par la
recherche des germes indicateurs de contamination fécale, des
bactéries spécifiques de la flore intestinale .
4.1 Développements méthodologiques

Les méthodes classiques d'énumération des coliformes dans les


eaux naturelles sont basées sur la mise en culture des échantillons
dans ou sur des milieux nutritifs sélectifs. En raison de certaines
limitations des méthodes traditionnelles, de nombreuses autres
techniques de détection des coliformes ont été développées, Une
des méthodes basées sur les propriétés enzymatiques des
mise en culture des échantillons.coliformes ne nécessite pas de
4.2 Objectif

Dans se travail l’objectif était d’optimiser cette


méthode pour la détection quantitative des coliformes
dans les eaux douces naturelles et les eaux usées, afin
de l’utiliser comme alternative aux traditionnels
dénombrements sur milieu gélosé sélectif.
4.3 méthode enzymatique pour le dénombrement
d’Escherichia coli

4.3.1 Mise au point de la méthode enzymatique:

La méthode originale développée dans ce travail est basée sur la


mesure d’une activité Enzymatique spécifique du coliforme fécal le
plus abondant, Escherichia coli: l’activité b-Dglucuronidasique
4.3.2 Principe de la méthode
enzymatique :
4.3.3 la Méthode enzymatique:
4.3.2 Interprétation

L'apparition de fluorescence est proportionnelle à la


quantité d'enzyme présent dans l'échantillon, qui est elle-
même proportionnelle au nombre d’E.coli dans
l'échantillon si la quantité d'enzyme par bactérie est
constante .
les inconvénients L’avantage de la
des méthodes méthode
classique enzymatique

ne comporte
un long temps
aucune étape de
de réponse
mise en culture

ne permettent
pas de détecter permet un gain de
les pollutions temps d’incubation
fécales en milieu considérable par
naturel rapport aux
méthodes classiques
sur milieu gélosé
ne permettent pas (réponse en 20 à 30
d’y détecter les minutes)
bactéries ‘actives
mais non
cultivables
•L’intérêt de la détection des coliformes, à titre
d’organismes indicateurs, réside dans le fait que leur
survie dans l’environnement est généralement équivalente
à celle des bactéries pathogènes et que leur densité est
généralement proportionnelle au degré de pollution
produite par les matières fécales

• Les coliformes fécaux sont donc des indicateurs des taux


de contamination qui ont une résistance au traitement
élevée para port à celle des espéces pathogénes par
conséquence leurs absence nous assurons que notre
échantillons est bien traité

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