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RECHERCHE D’HEMOLYSINE ALPHA ET BETA CHEZ LES DONNEURS DE SANG

AYANT SUBIT UNE TRANSFUSION SANGUINE

INDRODUCTION GENERALE

Le système de groupe sanguin ABO est caractérisé par les anticorps sériques naturels.
Il existe, en plus et en réponse à certains stimuli, des anticorps immuns encore appelés
hémolysines en raison de leur pouvoir hémolysant. Chez les donneurs de sang, ces
hémolysines peuvent induire des hémolyses parfois importantes lorsque le sang est transfusé
en compatible non iso-groupe. Nous avons voulu situer le taux des hémolysines dans notre
population afin de prédire de l’intérêt de la systématisation de leur recherche chez tous nos
donneurs de sang. Les anticorps sériques naturel sont constamment présent et correspondent
aux antigènes absent a la surface des hématies. Elles sont dites réguliers, de nature IgM dont
l’optimum thermique est de 4o C.
Cependant il existe des anticorps anti érythrocytaires anti A et anti B dite irréguliers, donc
immun qui proviennent soit de l’allo immunisation (cas de poly transfusion non iso groupe et
de grossesse ABO incompatible), ou encore hétéro immunisation.(cas des vaccination). Ces
anticorps immun sont responsables de la destruction complet du complément d’où l’action
hémolysant. On parlera donc ainsi d’hémolysine. Ces dernières sont caractérisées par
un maximum d’activité à 37°C et sont surtout de

1. PROBLEMATIQUE

1.1. Contexte et justification de la recherche

La distribution et la fréquence des antigènes érythrocytaires dépendent de la population. La


transmission des caractères génétiques des groupes sanguins suit les règles de génétique
mendélienne. Les individus polytransfusés du groupe O peuvent développer des anticorps
irréguliers de type IgG qui sont capable de lysés les hématies lors d’une incompatibilité.

Contrairement aux anticorps anti A et anti B naturels, les anticorps immuns sont fortement
hémolysants car ils sont capables de déclencher la cascade complète du complément. On parle ainsi
d’hémolysines. Ces dernières sont caractérisées par un maximum d’activité à 37°C et sont surtout de
nature IgG. C’est pourquoi, ces anticorps doivent être recherchés dans le cadre du diagnostic
d’inclusion ou d’exclusion devant une transfusion sanguine dans le système ABO incompatible.

1.2.Problème de l’étude
Les antigènes A et B ne sont pas présents uniquement à la surface des globules rouges, mais
aussi sur de nombreuses autres cellules. Le système ABO est considéré principalement comme un
groupe tissulaire.

Le développement d’anticorps immuns anti-A ou anti-B chez un individu peut etre produit :

- soit par allo-immunisation par voie transplacentaire lors d’une grossesse antérieure ou
après une transfusion ;
- soit par hétéro-immunisation après contact avec des agents de l’environnement portant
les substances A et B ou ayant une communauté antigénique avec ces substances. Ce
dernier processus d’hétéro-immunisation explique pourquoi la maladie hémolytique peut
aussi bien se développer chez une femme primipare que multipare. Il se pose donc le
problème des facteurs de risques associés à la présence et au titre élevé d’hémolysines.

1.3. Questions de recherche

- Quelles sont la fréquence et le titre des hémolysines anti-A et anti-B chez les
donneurs de sang camerounais à l’hôpital Saint Luc de Mbalmayo?
- Quels sont les facteurs de risque associés à la présence d’hémolysines et à un titre
élevé ?

1.4.Objectifs de la recherche

1.4.1. Objectif général

Déterminer la fréquence et le titre des hémolysines anti-A et anti-B chez les donneurs
camerounaises du groupe O à l’hopital Saint Luc de Mbalmayo.

1.4.2. Objectifs spécifiques

- déterminer la fréquence des antigènes érythrocytaires dans les systèmes de groupes


sanguins érythrocytaires ABO et Rhésus chez les donneurs.
- Déterminer la fréquence et titrer les hémolysines anti-A et anti-B chez les donneurs.
- Identifier les facteurs de risque associés à la présence des hémolysines et à un titre élevé.
- Diminuer les incidence hémolytique.
- Montre l’importance d’une recherche systematique des hemolysine avant une transfusion
sanguine.

1.5. GENERALITES

Aucune étude n’a encore été faite sur l’ampleur de l’allo-immunisation chez la femme en
période du post-partum dans cet hôpital. Les résultats obtenus permettront de connaitre la
fréquence de cette affection et les facteurs de risques associés à l’allo-immunisation dans le système
ABO d’une part, le risque potentiel d’apparition de la maladie hémolytique chez les enfants de ces
mères d’autre part.

Pour mieux comprendre le thème de cette recherche intitulé dépistage et titrage des
hémolysines anti-A et anti-B chez les donneurs.il nécessaire de définir et d’analyser les différents
cmot cles de cette recherche; il s’agit de :

- Titrage : Le titrage est une technique de dosage utilisée en chimie analytique afin de
déterminer la concentration d'une espèce chimique en solution (ou titre d'une solution).

- Hémolysines anti-A et anti-B : Ce sont des anticorps immuns anti-A et anti-B qui
apparaissent chez certains sujets à la suite d’une stimulation antigénique (grossesse ABO
incompatible, transfusion des produits dérivés du sang, infections bactériennes, etc.). Ce
sont des anticorps de classe IgG qui peuvent passer à travers la barrière foeto-placentaire
et provoquer la lyse des hématies fœtales.

- Période du post-partum : Le post-partum est la période qui va de l’accouchement


jusqu’au retour de couches, c’est-à dire aux premières règles normales ; il est marqué par
la disparition progressive des modifications de l’organisme liée à l’état gravidique. Cette
période englobe deux phases à risque différentes :
 le post-partum immédiat couvrant les 10 premiers jours suivant l'accouchement.
 le post-partum tardif est de délai variable, en fonction de l'allaitement ou d'une
évolution pathologique. La fin de cette période est marquée par le retour de couches
(retour des règles).

2. METHODOLOGIE

2.1. Cadre de l’étude

2.1.1. Type d’étude

Pour atteindre les objectifs de cette recherche une étude prospective et descriptive sera
menée chez les femmes en période du post-partum et chez leurs enfants (nouveaux-nés).

2.1.2. Période et durée de l’étude


Cette étude est prévue s’étendre sur une période de 4 mois, du 01 Septembre 2011 au 31
Décembre 2011.

2.1.3. Lieux de l’étude

L’étude se déroulera dans les services d’hématologie et transfusion sanguine et de


Gynécologie et Obstétrique du CHU de Yaoundé.

2.1.4. Echantillonnage

2.1.4.1. Taille de l’échantillon

En considérant l’hypothèse selon laquelle, la fréquence des hémolysines chez les mères en
période périnatale est supérieure à 20%, nous allons considérer P= 20%.

Z 2 .P.q
En prenant la formule de LORENTZ : N= avec :
I2
N : taille de l’échantillon,

P : prévalence des hémolysines anti-alpha et anti-bêta chez les mères en période périnatale,

q : 1-p, évènement contraire,

Zα : valeur de distribution normale qui correspond à un seuil de précision de 95% (Zα = 1.96),

I : erreur sur la précision : 5%,

En calculant, trouve : N= (1,96)2. 0.2 (1-0,2)/ (0,05)2= 245,8624

Ainsi, la taille de l’échantillon sera fixée à 246 femmes en période postpartum.

2.1.4.2. Population cible

Toute femme en postpartum.

2.1.4.3. Critères d’inclusion

- Toute femme ayant accouché il y a moins de 45 jours,


- Elle doit être de groupe sanguin O, A et B,
2.1.4.4. Critères d’exclusion

- Toute femme primipare,


- Toute personne non consentante,
- Femme de groupe sanguin AB.

2.2. Matériel et réactifs

2.2.1. Matériel de prélèvement

Le matériel nécessaire au prélèvement au cours de cette étude est :


- gants à usage unique,
- de l’alcool à 70°,
- des tubes EDTA pour le groupage ABO et Rhésus,
- des tubes secs pour la recherche des hémolysines,
- du coton,
- un garrot,
- des bandes adhésives,
- des portoir de tubes,
- un conteneur d’objets tranchants.

2.2.2. Matériel d’analyses

- 02 pipettes de 20 à 200 µl et de 100 à 1000 µl,


- des embouts de 200 µl et des embouts de 1000 µl,
- tubes à hémolyse pour suspension,
- des stylos à bille,
- du papier hygiénique,
- de l’eau physiologique.
- Incubateur 37°c ou bain-marie,
- Poupinel,
- Centrifugeuse
- Réfrigérateur
- Congélateur

2.2.3. Réactifs

- Les réactifs utilisés lors de l’étude sont :


- les suspensions globulaires d’hématies lavées,
- des coffrets de réactifs pour le groupage sanguin ABO et Rhésus,
- le sérum dépourvu d’anti-A et d’anti-B pour le complément.

2.3. Procédures
2.3.1. Recrutement des participants

Le recrutement des participants se fera au chevet du lit des patientes dans le service de
Gynécologie et d’Obstétrique, ainsi que dans la salle de vaccination pour les mères qui reviennent
quelques jours après l’accouchement vacciner leurs enfants. Cela se fera à l’aide d’une fiche
technique comportant un questionnaire. Ce questionnaire devra contenir entre autres le nom et
prénom du patient, l’âge, le sexe, l’ethnie, le nombre de grossesses, le nombre d’accouchements, le
groupe sanguin des parents et des enfants, l’âge de l’enfant pour l’essentiel.

2.3.2. Le prélèvement

Toute femme remplissant les critères d’inclusion sera prélevée ainsi que son enfant. Les
échantillons de sang seront prélevés dans deux tubes pour chaque mère : un tube EDTA pour le
groupage sanguin et rhésus et un tube sec pour la recherche d’hémolysines.

2.3.3. Réalisation des tests

Les prélèvements seront centrifugés à 3000 trs/min pendant 3 minutes. Le surnageant des
tubes secs sera décanté et aliquoté dans les cryotubes et congelé à – 20°C pour la recherche
d’hémolysines.

2.3.3.1. Groupages sanguins et Rhésus

 Principe

La détermination des groupes sanguins est basée sur la présence ou l’absence des hématies A
et/ou B à la surface des érythrocytes et à la présence régulière d’anticorps naturels anti-A et anti-B
correspondant aux antigènes absents des hématies. La détermination du groupe ABO correspond à
l’analyse simultanée par deux épreuves:
 L’épreuve globulaire(ou de Beth-Vincent) qui permet de rechercher les antigènes
érythrocytaires par une technique d’agglutination à l’aide des sérums tests monoclonaux
anti-A, anti-B et anti-AB ;

 L’épreuve plasmatique(ou de Simonin Michon) qui permet de rechercher des anticorps


naturels plasmatiques également par des techniques d’agglutination, à l’aide d’hématies
tests A et B.

On doit chaque fois s’assurer de la concordance des deux épreuves globulaire et sérique.

L’analyse de l’antigène D suivra les mêmes principes en se limitant à l’étude de la réactivité


des hématies par des anticorps anti-D.

 Mode opératoire de la méthode sur plaque

 Epreuve globulaire de Beth-Vincent

- Sur une plaque d’opaline, déposer successivement côte à côte des goutes de sérums tests
anti-A, anti-B et anti-AB,
- A l’aide d’une pipette déposer à côté de ces sérums tests, une goutte d’hématies
échantillons à tester en suspension à 10 p. 100 dans l’eau physiologique,
- Mélanger soigneusement à l’aide d’une baguette de verre ou du fond d’un tube, les
globules rouges et les plasmas ou sérums pour obtenir un fond de 2 cm de diamètre
environ. L’agitateur doit être changé ou nettoyé soigneusement après chaque mélange.
- Constater immédiatement l’agglutination des globules rouges.

 Recherche de l’antigène D

En pratique, elle se fait simultanément avec l’épreuve globulaire de Beth-Vincent et suit


le même protocole d’analyse :
- Sur une plaque d’opaline, déposer une goutte de sérum test anti-D polyclonal,
- A l’aide d’une pipette déposer à côté une goutte de sérum test anti-D polyclonal, une
goutte d’hématies échantillons à tester en suspension à 10 p. 100 dans l’eau
physiologique,
- Mélanger à l’aide d’une baguette ou d’un tube les deux gouttes pour former un cercle de 2
cm environ,
- Constater immédiatement l’agglutination des globules rouges.

 Epreuve plasmatique de Simonin Michon

- Sur une plaque d’opaline, déposer successivement côte à côte des goutes d’hématies
tests en suspension dans de l’eau physiologique de 5 à 10 p. 100: hématies A, hématies B
et hématies O (contrôle),
- Déposer également une goutte d’hématies du patient en suspension à 10 p. 100 dans l’eau
physiologique pour l’autotest,
- Ajouter à l’aide d’une pipette pasteur une goutte de plasma ou du sérum de l’échantillon à
côté de ces globules rouges,
- Mélanger soigneusement à l’aide d’une baguette de verre ou du fond d’un tube, les
globules rouges et les plasmas ou sérums pour obtenir un fond de 2 cm de diamètre
environ. L’agitateur doit être changé ou nettoyé soigneusement après chaque mélange.
- Constater immédiatement l’agglutination des globules rouges.

Remarque :

Lorsqu’il y a absence d’agglutination, il faut rechercher le D faible ; un D faible possède


très peu de sites antigéniques sur ses hématies. Pour déterminer ce D faible, la procédure
suivante est suivie :
- Mettre en contact les hématies lavées avec l’anti-D et incuber à 37°C pendant 30
minutes, laver pour éliminer les anticorps non fixés,
- Ajouter l’antiglobuline humaine polyvalente qui va permettre de former les réseaux si
les premiers sont fixés,
- S’il y a agglutination, le sujet est dit D faible. Dans le cas contraire, il est dit D
négatif.

 Lecture interprétative des groupes sanguins

- S’il y a agglutination, la réaction est positive et est notée par un « signe + »,


- S’il y a absence d’agglutination, la réaction est négative et est notée par un «signe-»

Les résultats observés lors des épreuves globulaires et sériques pour les principaux phénotypes ABO
et Rhésus sont présentés dans les tableaux suivants :

Tableau1 : Résultats de l’épreuve de Beth-Vincent

Epreuve globulaire Détermination de Groupe sanguin


l’antigène D
Sérums-tests

Anti-A Anti-B Anti-A+B Serum anti-D

Ajouter une goutte de suspension de globule rouge à grouper

+ - + + A Rh+

+ - + - A Rh-

- + + + B Rh+

- + + - B Rh -

+ + + + AB Rh+

+ + + - AB Rh-

- - - + O Rh+

- - - - O Rh-
Tableau 2 : Résultats de l’épreuve de Simonin Michon

Epreuve sérique Autotest Résultat

Hématies-tests

A1 B O patient

Ajouter une goutte du plasma ou sérum du sujet à grouper

- + - - A

+ - - - B

- - - - AB

+ + - - O

 contrôle de qualité :

- un échantillon groupe sanguin et rhésus connus est inséré dans les échantillons à
tester dans chaque série d’analyse ;
- un contrôle de groupage sanguin en tube est fait : il est réalisé sur un échantillon
de sang pris au hasard sur chaque série d’échantillons testés sur plaque.

2.3.3.2. Recherche et titrage des hémolysines anti-A et anti-B

 Recherche des hémolysines anti-A et anti-B

Les anticorps naturels et les anticorps immuns ont des propriétés sérologiques différentes
qui peuvent permettre de les séparer et de les identifier. La méthode manuelle de recherche du
pouvoir hémolysant en présence du complément sera utilisée.

 Principe
La réaction consiste à détecter l’hémolyse éventuelle de globules rouges A ou B connus par
le sérum à examiner. Toute réaction hémolytique nécessite la présence du complément. En théorie,
il convient de détruire dans un premier temps le complément présent dans le sérum à examiner et
de le remplacer par une quantité connue de complément.

Comme source de complément, un mélange de plasma de groupe AB (dépourvu d’anticorps d’anti-A


et anti-B) sera utilisé.

 Technique

La recherche d’hémolysines anti-A et anti-B sera effectuée simultanément. La procédure à


suivre sera la suivante :

- Laver les hématies A et B trois fois et les suspendre dans de l’eau physiologique à 10
p.100,
- Décomplémenter le sérum à examiner par chauffage au bain-marie à 56°C pendant 30
minutes,
- Disposer sur un portoir 6 tubes à hémolyses :
Tube 1 : recherche des hémolysines anti-A
Tube 2 : recherche des hémolysines anti-B
Tube 3 : témoin sérum, T(S)
Tube 4 : témoin complément, T(C)
Tube 5 : témoin globules rouges A, T(GRA1) 
Tube 6 : témoin globules rouges B, T(GRB) 
- Disposer les quantités (exprimés e gouttes) figurant dans le tableau suivant :

Tableau 3 : protocole recherche des hémolysines anti-A et anti-B

Anti-A Anti-B T(S) T(C) T(GRA) T(GRB)

Tubes 1 2 3 4 5 6

Sérum à examiner 4 gouttes 4 4 - - -


Sérum AB (complément) 4 4 - 4 - -

Eau physiologique - - 4 4 8 8

Globules rouges A 2 - 2 2 2 -

Globules rouges B - 2 - - - 2

- Mettre le portoir à l’étuve (ou au bain-marie à 37°C) pendant 30 minutes.

 Résultats

i) Si les tubes témoins (3, 4, 5 et 6) ne présentent aucune hémolyse : la réaction est


interprétable.
 Une hémolyse dans le tube 1 indique la présence d’hémolysine anti-A.
 Une hémolyse dans le tube 2 indique la présence d’hémolysine anti-B.
 L’absence d’hémolyse dans les tubes 1 et 2 indique l’absence d’hémolysine.
ii) si un des tubes témoins présente l’hémolyse, la réaction est ininterprétable et doit être
refaite.

 Titrage des hémolysines anti-A et anti-B

Le titre est déterminé en faisant une série de dilutions successives du sérum à examiner et
en pratiquant sur celle-ci la technique précédente.

 Principe

La quantité approximative d’anticorps contenue dans un sérum ou « titre d’hémolysine»


mesure en déterminant la dilution la plus élevée encore capable d’hémolyser les hématies porteuses
de l’antigène.

 Technique
 Préparer une série de dilutions successives du sérum à tester
Préparer une série de 10 dilutions de raison 2 du sérum à examiner, en soluté isotonique de
manière à obtenir les dilutions suivantes : ½, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/62, 1/128, 1/256, 1/ 512, et
1/1024.

 Réalisation : dans une série de 10 tubes à hémolyse répartir à l’aide de la pipette


pasteur 6 gouttes d’eau physiologique dans chaque tube. Dans le premier tube, ajouter
6 gouttes de sérum à tester, mélanger par trois aspirations et refoulement de la pipette.
Transporter 6 gouttes du mélange dans le deuxième tube, mélanger comme
précédemment et transporter également 6 gouttes dans le troisième tube, et ainsi de
suite jusqu’au dixième tube.

 Réaction

Procéder comme précédemment pour obtenir le titre dans le tube de dilution plus élevée qui
présente encore une hémolyse.

2.4.Analyses statistiques

Les données seront saisies dans le logiciel WORD 2007 et analysées grâce aux logiciels EPI INFO et
EXCEL2007.

2.5. Considération éthique

Dans le souci du respect de l’éthique de la recherche médicale, nous avons entrepris une
démarche administrative qui nous a permis d’abord d’obtenir une mise en stage de collecte de
données auprès de notre université (UCAC), ensuite une autorisation du Directeur Général du CHUY
et enfin une Clairance éthique du Comité National d’éthique.

Un formulaire de consentement a été rédigé dans lequel nous avons assuré aux participants
la garantie du respect du principe de la dignité humaine, du respect du principe de consentement
éclairé et de l’assentiment des parents, du respect de principe de liberté et du respect de la
confidentialité.
Le recrutement des participants respectera le critère de justice : toutes les femmes
remplissant les critères seront recrutés sans considération de leur âge, de leur sexe ou de leur
origine.

Le bénéfice pour les participants sera l’obtention gratuite des résultats du groupage sanguin
et dépistage et titrage des hémolysines. Ces résultats de laboratoire leur sera remis
personnellement et confidentiellement.

Les données recueillies seront utilisées dans un cadre purement académique et ne mettrons
en rien les droits des participantes en danger.

2.6. Budget

Pour la réalisation de notre étude, nous aurons besoin des éléments suivants dans le tableau ci-
après :

Désignation coût

1 Réactifs 250.000

2 Matériel de prélèvement 100. 000

3 Autres matériels de manipulation 150.000

4 Saisies, impression, photocopie 150 .000

5 Internet 100.000
6 Commande de documents 100.000

7 Imprévus 100.000

8 Déplacement 50.000

Total 1 000 000 FCFA

2.7. Chronogramme des activités de recherche

PERIODE
ACTIVITES Septembre Octobre Novembre Décembre
S S S S S S S S S S S S S S S S
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Rédaction et dépôt
d’une demande
d’autorisation au lieu
de la recherche.
Pré-test
Prélèvements et
groupage sanguin et
rhésus
Recherche et titrage
des hémolysines
Dépouillement et
traitement des données
Rédaction du document
final
Publication des
résultats

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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