UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA

ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

CIENCIAS DE LA VIDA
ANALISIS INSTRUMENTAL
PRACTICA N°4
Tema:

LISIS CUANTITATIVO DE CAFEINA EN MATERIAL VEGETAL SECO DE LA PLANTA

ILEX GUAYUS, MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA DIRECTA

Integrantes:

Ante Blanca

Lorena Bravo

Gualinga Víctor

Ortiz Natali

Sánchez María

Docente

MSc. Rubén Darío Ledesma

Fecha

01/12/2017

Puyo – Ecuador -2017

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CIENCIAS DE LA VIDA
ANALISIS INSTRUMENTAL

INTRODUCCION
La espectrofotometría UV-Vis es un método óptico de análisis basado en la absorción molecular. El
compuesto a analizar se irradia con luz de energía suficiente como para provocar transiciones
electrónicas, es decir, promover un electrón desde un orbital de baja energía a uno vacante de alta
energía. En el espectro UV-Vis se registra Absorbancia (A) vs. longitud de onda (λ) y permite
encontrar la longitud de onda de máxima absorción. La Ley de Bouguer-Lambert-Beer: A = ε c l,
expresa matemáticamente la relación directa y lineal entre la absorbancia y la absortividad molar, la
concentración y el camino óptico. Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la
concentración, se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre ambas, lo cual
permite la cuantificación de analitos. La espectrofotometría UV-Vis se ha empelado ampliamente en
el análisis de muestras biológicas o ambientales. La cafeína (1,3,7-Trimethylpurine-2,6-dione) es un
alcaloide del grupo de las xantinas, que actúa como una droga psicoactiva, levemente disociativa y
estimulante por su acción antagonista no selectiva de los receptores de adenosina. Su fórmula global
es: C8H10N4O2 y su masa molar: 194,19 g/mol.
Su solubilidad en agua se incrementa notablemente por la temperatura: 2,17 g/100 mL (25 °C); 18,0
g/100 mL (80 °C); 67,0 g/100 ml (100 °C); es por eso que es factible emplear la decocción con agua
caliente como método idóneo de extracción desde las muestras ambientales que la contienen. Para la
eliminación posterior de interferencias se emplea la extracción líquido - líquido con cloroformo,
manipulando la disociación de la cafeína (base débil) por medio de la adición de ácidos y bases.

OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Ejercitar la metodología analítica para la cuantificación de cafeína por espectrofotometría ultravioleta
directa
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Determinar la longitud de onda máxima absorción de la disolución patrón.
Calcular la concentración de cafeína presente en la muestra de guayusa.
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MARCO TEORICO:
Ilex guayusa:
Es un árbol nativo de la Amazonía occidental. Sus hojas contienen altas concentraciones de cafeína y
antioxidantes (flavonoides), saponinas.
Su cultivo es tradicional y se remonta a siglos atrás y pertenece a la tradición agro-silvícola del pueblo
Kichwa amazónico del Ecuador. Sobre todo se encuentra en la provincia de Napo, pero está presente
también en las provincias de Sucumbíos, Orellana, Pastaza, Morona Santiago y Zamora Chinchipe.
Se aprecia que la guayusa se cultiva y crece bien especialmente en el pie de monte Amazónico desde
el sur de Colombia hasta el norte de Perú. Pero una ventaja comparativa importante es que la guayusa
está presente y, al parecer, prende y crece mejor, en la alta Amazonía ecuatoriana, en especial en la
provincia de Napo. (Cuello, 2003)
Extractor Soxhlet:
Es un material de vidrio que se utiliza para la extracción de compuestos contenidos en un sólido, a
través de un solvente afín. Típicamente, para una extracción Soxhlet se requiere solamente donde el
compuesto deseado tiene solamente una solubilidad limitada en un solvente. El método es aplicable
en muestras de alimentos en general, ya que la técnica se basa en la extracción de grasas de una
muestra. El aparato de Soxhlet fue creado por el químico alemán Franz Von Soxhlet en 1879. (Zamora,
2013)
Balanza Técnica:
Es utilizado para realizar las mediciones donde se utilizan patrones de masa cuyo grado de exactitud
depende de la precisión del instrumento. Al igual que en una romana, pero a diferencia de una báscula
o un dinamómetro, los resultados de las mediciones no varían con la magnitud de la gravedad (Torres,
2016).
Espectrofotómetro UV-Visible
Es utilizada generalmente en la valoración cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición
y compuestos orgánicos, ambos absorben la luz. La Ley de Beer-Lambert estipula que la absorbancia
de una solución es directamente proporcional de la concentración de la solución, por lo que la
espectrofotometría UV-Visible puede usarse para determinar la concentración de la solución
(Universidad de Granada, 2004).
Pipetas:
Son recipientes tubulares de vidrio o de plástico. Están destinadas a medir líquidos, ya sea en
operaciones rutinarias (pipetas graduadas) o en aquellas que se necesite precisión científica (pipetas
volumétricas). Estas últimas poseen un bulbo y se usan para transferir un volumen definido de líquido
(L, 2011).
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Celda de vidrio para lectura:

Las Celdas o Cubetas para Espectrofotómetro son recipientes de plástico, vidrio o cuarzo que se utiliza
para realizar lecturas espectrofotométricas a líquidos. Para que una Celda o Cubeta para
Espectrofotómetro funcione adecuadamente requiere estar completamente limpia y sin ralladuras;
además, la elección del material de fabricación es importante dependiendo del método espectrométrico
que se utilice y la naturaleza de la muestra (Anonimo, 2008).
Matraz:
Frasco con Base redonda, la cual posee una estructura cónica en la zona del medio y en la zona superior
se aprecia una boca con cuello estrecho. Cuando se habla de Matraz Erlenmeyer, se está hablando de
un matraz graduado que contiene marcas que indican un determinado volumen. Se encuentran en
distintas capacidades. Es más seguro que un vaso de precipitado, ya que la estructura del matraz evita
perdidas de la sustancia o solución contenida (agitación o evaporación). Es ideal para agitar soluciones.
Se puede tapar fácilmente utilizando algodón o tapa (Anonimo, Laboratorio quimico, 2009).
Agua Destilada:
El agua destilada es un protóxido de hidrógeno, es decir H2O, en estado líquido y de vapor, y al ser
destilada mantiene su fórmula. La fórmula del agua destilada es H2O pura, es decir no contiene cloro
ni otras sales. Lo que tiene en especial es que se le ha quitado el calcio, magnesio, y otras sustancias
que están presentes en el agua corriente que sale del caño. Este tipo de agua se utiliza para disoluciones
y experimentos (Duran, 2014).
Hidróxido de Sodio:
También conocido como lejía, soda cáustica o sosa cáustica, es un compuesto químico de formula
NaOH. Formando una solución fuertemente alcalina cuando se disuelve en un disolvente tal como
agua, la soda cáustica es ampliamente utilizada en muchas industrias, sobre todo como base química
fuerte en la fabricación de pulpa y papel, textiles, agua potable, jabones y detergentes. (Dìaz, 2011)
Celdas o cubetas de cuarzo.
Las cubetas de flujo permiten que la disolucion circule continuamente a travez de
la cubeta.Son especialmente utiles para medir la absorvancia de una disolucion
que sale de una columna cromotografica. (Harris, 2007)
Espectofotometria de luz ultravioleta.
La espectrofotometria de absorcion ultravioleta-visible fue uno de los primeros
metodos fisicos que se aplico al analisis cuantitativo y a la determinacion de
estructuras.La espetrofotometria ultravileta-visible supera al resto de metodos
opticos de analisis en lo referente al analisis cuantitativo y es tambien una tecnica
auxiliar. (Olsen, 1990)
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MATERIALES:
EQUIPOS E MATERIALES MUESTRAS REACTIVOS Y
INSTRUMENTOS DISOLVENTES
-Balanzas -Pipetas graduadas -Hojas secas de Ilex -Ácido clorhídrico - HCl 0,01
-Planchas de calentamiento -Equipo de reflujo guayusa M
-Espectrofotómetro UV-Vis -Embudos de -Hidróxido de sodio - NaOH 1
-Soxhlet filtración M
- Matraz Erlenmeyer -Cloroformo - CHCl3
-Vaso de
precipitación
-Papel filtro
-Probetas graduadas

PROCEDIMIENTO:

Preparación de la disolución estándar (patrón) de cafeína y registro del espectro.

- Tomar 1 mL de disolución madre de cafeína de 1000 mg/L, transferir a un matraz aforado de 25 mL,
añadir 1mL de HCl 0,01 M y enrasar con agua destilada.
- Realizar un espectro en el intervalo 250 – 300 nm realizando mediciones de absorbancia cada 5 nm
contra un blanco.
- Dibujar el espectro en una hoja de Excel y determinar la longitud de onda de máxima absorción.
Procesamiento y análisis de la muestra.
- Pesar 0,3 g de la muestra de hojas secas de guayusa.
- Reflujar con 100 mL de agua destilada por 15 minutos.
- Filtrar en caliente.
- Dejar enfriar y alcalinizar con NaOH 0,1 M (20 gotas).
- Extraer en embudo separador con dos porciones de cloroformo de 15 mL cada una y reunir los
extractos clorofórmicos.
- Evaporar el cloroformo hasta sequedad en baño de María y redisolver la cafeína añadiéndole 50 mL
de agua destilada caliente (60ºC – 90ºC).
- Dejar enfriar, transferir a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con agua destilada.
- De la disolución anterior, tomar 5 mL y colocar en un matraz aforado de 25 mL, añadir 1 mL de
HCl 0,01 M y enrasar con agua destilada.
- Leer la absorbancia de la muestra problema a la longitud de onda se máxima absorción determinada
a través de su espectro.
- Calcular la concentración de cafeína en la muestra por el método del patrón externo.
CALCULOS Y RESULTADOS
Datos Recolectados:
LONGITUD DE ABSORBANCIA ABSORVANCIA
ONDA (PATRON) (MUESTRA)

250 0.689
255 0.973
260 1.334
265 1.763
270 2.013
275 2.056 0.310
280 1.800
285 1.228
290 0.649
295 0.220
300 0.064

Longitud de Onda Máxima:

LONGITUD DE ABSORBANCIA ABSORBANCIA (PATRON)

ABSORBANCIA (PATRON)
ONDA (PATRON)
2500 2.5
250 0.689
255 0.973
2000 2 2.0132.056
260 1.334 2.013 2.056
1.763 1.800
265 1.763 1.763 1.8
1500 1.5
270 2.013 1.3341.334
275 2.056 1.228 1.228
1
1000 0.973
280 1.8
285 1.228 0.5 0.689 0.649
500
290 0.649 0.22 0.064
295 0.22 0

300 0.064 0 0 2500 255 260 265 270 275 280 285
0 0290 0295 300
250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300

En este gráfico podemos observar que la máxima longitud de onda es de 275 ya que en esta
longitud encontramos absorbancia del patrón de 2.056.

• Cálculos para encontrar la Concentración de la muestra (C2) (Ilex guayusa):

𝑪𝑴 𝑪𝑷 𝐶𝑃∗𝐴𝑀
= 𝑨𝑷 𝐶𝑀 =
𝑨𝑴 𝐴𝑃
𝑚𝑔
𝐶𝑃∗𝐴𝑀 40 𝐿 ∗0.310
𝐶𝑀 = = 𝐶𝑀 = = 𝑪𝑴 = 𝟔. 𝟎𝟑𝒎𝒈/𝑳
𝐴𝑃 2.056
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• Cálculos para encontrar la Concentración de cafeína en la muestra (Ilez guayusa) (C1)

por medio de la ley de VOLUMETRIA.

𝐶2∗𝑉2
C1*V1= C2*V2 𝐶1 =
𝑉1

𝑚𝑔
𝐶2∗𝑉2 6.03 𝐿 (25𝑚𝑙)
𝐶1 = = 𝐶1 = C1 = 30.15 mg/L
𝑉1 5𝑚𝑙

30.15mg ∗ 100ml
30.15mg 1000ml 𝑋= = X= 3.02mg
1000𝑚𝑙
X 100ml

3.02 𝑚𝑔∗1000 𝑔
100ml 3.02 mg 0.3 g 𝑋= = X = 10,066.67 mg
0.3 𝑔
10,066.67
X 1000 g 𝑋= = X = 10.07 g/Kg (Ppm)
1000

Los resultados obtenidos nos quieren dar entender que la concentración de cafeína en material
vegetal seco de la planta Ilex guayusa es de 10.07g/kg(Ppm)
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CONCLUSIONES:
✓ Determinamos por el método de patrón externo un 10,07mg/L de concentración de cafeína
en una muestra de 0,3g de Ilex Guayusa como material vegetal seco. (Victor Felipe Gualinga
Santi).
✓ El valor de la absorbancia de la muestra se obtiene con la mayor longitud de onda obtenida
en la medición de espectrofotometría del patrón. (Natali Ortiz).
✓ Al realizar las mediciones con las distintas longitudes de onda entre 250-300nm, nos dio
un pico de absorbancia de 2,056. (Blanca Ante)
✓ Al medir las absorbancias entre 250-300nm con intervalos de 5nm se obtuvo un pico de
mayor absorbancia con la longitud de onda 275nm. (Lorena Bravo Rengel).
✓ Al leer la absorbancia de la muestra problema con una longitud de onda de 275nm nos dio
un absorbancia de 0,310. (María Jasmine Sánchez).

OBSERVACIONES:
✓ Para obtener el valor de la absorbancia de la muestra por medio de espectrofotometría
ultravioleta directa se debe trabajar con el pico de longitud de onda obtenido en la
absorbancia del patrón. (Natali Ortiz)
✓ Al añadir el cloroformo al extracto de guayusa y agitar el embudo separador suavemente
se dio la formación de aire acumulado y tuvimos que abrir la llave del embudo para
liberarlos.(Blanca Ante)
✓ En el espectrofotómetro de ultravioleta directa utilizamos celdas de cuarzo ya que son
transparentes y no absorben radiaciones innecesarias, por lo tanto estas son más efectiva en
la medición de absorbancia. ( Lorena Bravo)
✓ Después de obtener las absorbancias con distintas longitudes de onda solicitadas se observó
que a los 300nm se obtuvo la menor absorbancia con un valor de 0,064.( María Sánchez)
✓ Después de colocar y agitar el extracto de guayusa y el cloroformo se logró extraer la
cafeína presente en la Ilex guayusa.( Víctor Gualinga)
RECOMENDACIONES
✓ Es importante profundizar el conocimiento de los métodos de cuantificación ya que nos
permiten ser más presos en los resultados de las próximas prácticas de laboratorio (Víctor
Gualinga).
✓ Se recomienda tener cuidado con el manejo de los reactivos como el cloroformo, ácido
clorhídrico y el hidróxido de sodio ya que son corrosivos (Blanca Ante).
✓ Los equipos de trabajo deberían ser equitativos en integrantes para que, al momento de
realizar la práctica, todos aprendamos de una manera efectiva (Natali Ortiz).
✓ Se debe ser cuidadoso con la cristalería ya que es muy frágil y se puede quebrar (María
Sánchez).
✓ Se tiene que seguir correctamente el procedimiento para obtener unos datos y resultados
verídicos (Lorena Bravo).
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BIBLIOGRAFÍA

Cuello, P. C. (2003). Obtenido de

http://repiica.iica.int/docs/B3414e/B3414e.pdf
Harris, D. c. (2007). Analisis quimico cuantitativo. España: revertè S.A.
Olsen, E. D. (1990). Metodos opticos de analisis . mexico: revertè S.A.

Anónimo. (2008). INSTRUMENTACIÓN PARA ESPECTROSCOPIA. Obtenido de

file:///C:/Users/NOEMI/Downloads/lectura3%20(1).pdf
Universidad de Granada. (2004). Química Orgánica. Obtenido de
http://www.ugr.es/~quiored/espec/uv.htm
Dìaz, R. (2011). Lifeder.com. Obtenido de https://www.lifeder.com/hidroxido-
de-sodio/
Zamora, G. L. (05 de 2013). Equipo Soxhlet. Obtenido de
http://rosagerlam.blogspot.com/
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Anexos

pesando la muestra de hojas colocando 0,3g de guayusa reflujar por extractor soxhlet
secas de guayusa en el balón volumétrico

Filtrando en caliente después de reflujar

Cristalería: probetas, pipetas, embudo, matraces aforados, Embudo separador

vaso precipitado.
Espátula, pinzas de laboratorio.
Reactivos: NaOH, HCl
Disolución patrón.
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Colocando 20 gotas de NaOH Midiendo cloroformo Agregando cloroformo al extractor Extrayendo el cloroformo
de guayusa en el embudo separador

Evaporándose el cloroformo Se toma 5mL de la disolución que se Ingresando la longitud de onda en el

Con baño María prepara para redisolver la cafeína
espectrofotómetro de ultravioleta al agregar agua caliente (50mL)