CLASE INTRODUCTORIA DEL PROFESOR GALLARDO

INMUNOHEMATOLOGÍA

PREAMBULO: Nosotros nos vamos a concentrar en la membrana del GR, la cual está llena de una gran cantidad de componentes
como proteínas o glucoproteínas, y los mismos van a tener una propiedad de antígenos, es decir que pueden desencadenar una
reacción antígeno-anticuerpo, en pocas palabras una respuesta inmune.

Concepto de Inmunohematología: Aplica los conocimientos básicos inmunológicos para el estudio de los antígenos presentes en la
célula sanguínea y su comportamiento serológico. El antígeno que se encuentra presente en la membrana del GR es lo que define al
grupo sanguíneo, es la estructura más importante y esto es debido a que induce la respuesta inmune e incluso puede llegar a generar
la muerte del paciente. No se pueden cometer errores a la hora de la determinación del grupo sanguíneo ya que ese Ag no cambia a lo
largo de la vida, aunque bajo situaciones excepcionales pueden cambiar pero esto es muy extraño, por esto un error en la
determinación del grupo sanguíneo es totalmente d

 Un tema importante es la histocompatibilidad, que es el sistema del grupo de los leucocitos, si una persona es de un
determinado grupo de HLA y le introducen otro grupo al cual no es compatible, el organismo lo rechaza. El leucocito tiene un
HLA que se comporta como antígeno detectable y puede ser fatal en un paciente.

La inmunohematologia también estudia los desórdenes hematológicos relacionados con el estado inmune del paciente. Por ejemplo.
¿Qué pasa con un GR que tiene un Ag y el cuerpo genera un Ac que lo puede reconocer y lo ataca? Ese GR se Hemolizaría, lo que a su
vez generaría una anemia hemolítica de tipo inmune.

Lo puede Hemolizar (GR) por FAGOCITOSIS, en la que ocurre una opzonización (el anticuerpo que se origina de la respuesta inmune,
marca al antígeno). Por lo tanto una de las respuestas inmunes más importantes es la producción de anticuerpos, el principal
anticuerpo que opzoniza es IgG (IgM no opzoniza). En la respuesta inmune entonces se produce IgG, este opzoniza el antígeno y lo
destruye gracias a los macrófagos del bazo, que es el órgano donde se destruyen los GR y luego queda una respuesta inmune de
memoria. Y si vuelven a introducir GR con el mismo antígeno extraño, la respuesta es más fuerte y puede llevar a la muerte a una
persona, ya que puede haber una RI exacerbada y puede agravar más el cuadro del individuo.
Si una persona tiene anemia y tiene pocos GR, al adquirir GR con antígenos diferentes, hay un caos, por la destrucción de GR y puede
morir.

SISTEMA DE GRUPO SANGUINEO: conjunto de Ags estructuralmente similares ubicados en la membrana del GR. Existen dos
grandes sistemas de importancia clínica:
 Sistema ABO
 SISTEMA Rh
 Otros sistemas de grupos sanguíneos
Hasta ahora se sabe que un sistema de grupo sanguíneo tiene un antígeno, si otra persona no lo tiene, no hay problema, si no lo tiene
NO VA A TENER ANTICUERPOS CONTRA ESE ANTIGENO X, PORQUE NUNCA HA ESTADO EN CONTACTO CON EL, de esto trata la
mayoría de los grupos sanguíneos como el Rh.

 El sistema ABO es diferente, porque si no tiene ese antígeno, va a tener de manera natural un anticuerpo.
 O: no tiene antígeno ni A ni B. por lo tanto las personas que sean O van a tener de manera natural anticuerpos contra A y B y
si esa persona adquiere células que son B las va a destruir y la persona puede morir por una respuesta MUY FUERTE.
 El sistema Rh corresponde al resto, a un antígeno que es altamente inmunogénico (capaz de desarrollar una respuesta
inmune siempre y con mucha fuerza), dentro de ese sistema hay muchos antígenos y ellos tienen un orden de mayor a
menor, donde el mayor es el antígeno más inmunogénico de todos (aunque se le introduzca en pequeñas cantidades a una
persona, produce anticuerpos) y eso tiene implicaciones porque si una persona es Rh no debería de tener anticuerpos contra
Rh A MENOS QUE HAYA SIDO SENSIBILIZADO.

Supongamos que nuestro cuerpo tiene un Ag y a su vez tiene un Ac que reconoce dicho Ag, pasaría que habría una respuesta inmune
y por ende se destruiría dicho Ag, por lo que en general no se espera que existan estos Acs, aunque en ciertas ocasiones excepcionales
existen unos Acs, suponiendo que yo soy X y Z(Ags), no debería tener Acs ni contra X ni contra Z, la única forma que yo pueda tener
Acs contra Z es que yo me exponga al Ag Z, estos son los llamados Acs inmunes o irregulares. Entonces si yo soy una persona X pero
no tengo Ags contra el Z, ¿es esperado que yo tenga Acs contra Z? No, Entonces esto es una situación rara o irregular, por esto ese
tipo de Acs se han generado porque se desarrolla una respuesta inmune. Existen también algunos casos donde yo soy X y no tengo Z,
pero voy a tener de manera natural Acs contra Z, ya que ese Ag Z se parece a algo con lo que habitualmente puedo tener contacto,
generándose asi dichos Ac contra Z, es en estos casos donde se generan los llamados Anticuerpos naturales o esperados, ojo estos
solo se dan en unos casos muy particulares. ¿Es natural que yo tenga un Ac contra un Ag que nunca he visto? NO, pero en algunos
casos eso es algo natural o esperado, y no se produjo por una respuesta inmune sino por otro mecanismo. Ojo lo importante de
este trabalenguas loco del profesor es saber que existen unos Acs inmunes o irregulares que surgen por exposición de
dicho Ag con el Ac. Y también existen los Acs naturales o esperados que se dan por otro tipo de condiciones distinta a
la exposición del Ag-Ac. Hay anticuerpos NATURALES o ESPERADOS. Cuyo ejemplo es el sistema ABO y en el resto lo
que se va a encontrar son anticuerpos INMUNES o IRREGULARES (como ejemplo una persona Rh- que tiene
anticuerpos contra Rh, es producto de una reacción antígeno-anticuerpo).
Nosotros vamos a tener lo que es la DETECCÍON, y nos basaremos en lo que son las pruebas de aglutinación, las cuales se basan a su
vez en una reacción Ag-Ac. Entonces hizo este ejemplo: Si yo tengo un GR , este va a tener un Ag y yo puedo demostrar la presencia
de dicho Ag con el uso de un reactivo que contenga el Ac dirigido a este Ag. Ahora bien ¿yo puedo hacer lo inverso? Por supuesto que
si, sabiendo que tengo un GR con un Ag, se hace reaccionar con una determinada muestra y si me produce aglutinación entonces se
demuestra la presencia del Ac.

Cuando hablamos de los medios de reacción que son aquellos que facilitan la formación de los complejos Ag-Ac, uds recuerdan que
tomabamos un tubo en donde le agregaríamos una suspensión de 75% de GR y allí se coloca el Ac para detectar determinado Ag,
esos GR generalmente están en solución salina, y a eso es lo que se le denomina MEDIO DE REACCÍON, y existe gran cantidad de
medios de reacción. Nosotros nos vamos a quedar con dos medios prácticamente; 1 que es el de la solución salina fisiológica al 5%,
generalmente es el que se toma para los GR, GB Y PLQ. 2) Reactivo de Antiglobulina humana.

Las reacciones Ag-Ac varían dependiendo de ciertos factores. Entonces hay unos que son dependientes del Ag y otros Dependientes
del Ac(Titulo, concentración).
En el caso de los dependientes del Ag, que son dependientes de dosis influye mucho lo que es el fenómeno de prozona
(Debido al exceso de Ac no se forma la red que permite la aglutinación. Puede también deberse a la presencia de Ac
“no aglutinantes”).

Existen 5 tipos de Acs, donde los más importantes clínicamente son IgG e IgM, donde la IgG indica un proceso infeccioso pasado (de
Memoria) y la IgM un proceso activo.
Tenemos que: la IgG es un Pentámero.
Las IgG son poderosas opsoninas que necesitan la temperatura del cuerpo 37grados para poder reaccionar (lo que se denomina
anticuerpos calientes PARENTESIS “Es decir que requieren la temperatura corporal (37°) para producir la reacción” ,mientras que
los Acs frios reaccionan a temperatura ambiente), hay muy poca aglutinación en medio salino, y la igG que opsonina si atraviesa la
placenta. Se encuentra en plasma y otros fluidos.
En cambio la IgM:
 no atraviesa placenta por su tamaño
 si reacciona a temperatura ambiente
 no es opsonina, ACTIVA EL COMPLEMENTO, produce hemolisis intravascular
 es un pentámero que generalmente esta en baja proporción pero por su tamaño si produce aglutinación en medio salino
 solo se encuentra en plasma

Los GR en solución salina se encuentran separados gracias a la presencia del ácido sialico en su superficie lo que le otorga carga
negativa y permite esa separación la cual es de aprox 180 Amstrong, es decir que se necesita de una molecula superior a esa distancia
para que se pueda dar la aglutinación en una solución salina fisiológica, La IgM al medir 300 Amstrong puede producir aglutinación en
medio salino ya que la distancia de dicha molecula supera la de la separación del GR, pero la IgG mide apenas 140 Amstrong. Es decir
que el espacio que tiene este Ac para reconocer esos antígenos es muy corto para que se pueda producir aglutinación en solución
salina fisiológica.

Se va a llegar a una reacción antígeno-anticuerpo, se genera una respuesta inmune.

 Si se produce igG se induce la fagocitosis en el bazo y se produce hemólisis extravascular.
 Pero si se produce igM, se activa el complemento y generalmente se da la hemolisis intravascular(dentro de los vasos
sanguineos) y se destruyen los GR.

Al producirse hemolisis, hay una disminución de GR y Hb y si el cuerpo no es capaz de compensar se produce una anemia y se genera
una anemia hemolítica inmune. Estas anemias van a tener una marca que va a indicar que hubo una reacción Ag-Ac (la célula queda
marcada por la igG cuando se opzoniza y también queda marcada por uno de los componentes del complemento cuando se activa por
el IgM). Todo esto va a ser de orientación para descubrir la patología.

Las anemias que se van a estudiar son:

 autoinmune (por el estímulo) calientes (Por IgG) y frías .
 inducidas por drogas (aplica para monocitos y plaquetas).
 A. Hemolíticas aloinmunes.
 Enfermedad hemolítica del recién nacido.
 Clase Anti-Globulina Humana Prof. Thais Delgado Historia
 La primera vez que se habló del principio de esta prueba, fue en 1908, por Moreshi
 En 1945 Coombs, Mourant y Race, introducen a la clínica este principio para la determinación de anti globulinas en el
laboratorio.
 Desde ese momento la prueba queda bautizada como prueba de Coombs, pero realmente como él no fue quien descubrió el
principio de la misma quedo al final llamada como prueba de anti globulina humana.
 En 1957 Dacie y colaboradores observaron componentes del complemento fijados a os glóbulos rojos podían ser detectados
por esta prueba.

¿Por qué es importante la anti globulina humana o la prueba como tal?

¿En condiciones normales, tenemos la capacidad de observar sobre la superficie del glóbulo rojo alguna
molécula o anticuerpo, a través del microscopio? No.
En las anemias hemolíticas y durante procesos hemolíticos, se producen porque los glóbulos rojos quedan sensibilizados,
entonces el personal clínico o medico necesita saber o evidenciar de alguna manera si hay algo que no es normal en la superficie del
GR. ¿Cómo se va a evidenciar? Haciendo pruebas de aglutinación.
Es importante saber que en condiciones normales en SSF la distancia entre un GR y otro es de 180Å. Para la IgG la distancia
mayor a abarcar es de 120Å, por lo tanto es incapaz de producir la aglutinación de los GR, a diferencia de lo que sucede con la IgM, la
cual es capaz de cubrir esta distancia.

¿Quién sensibiliza un GR?

La IgG y complemento, entonces lo que necesitaríamos presenciar es la IgG o aquellas proteínas del complemento. Eso no lo vamos a
poder evidenciar en SSF, tal cual.

¿Qué necesitaríamos?
Que nosotros tuviéramos algo que se uniera a esas inmunoglobulinas IgG que están sensibilizando o que se uniera a ese complemento
que está sensibilizando, para establecer un puente entre esos glóbulos rojos sensibilizados, para lograr al final una aglutinación.

¿Cuál es el principio?
Evidenciar que los glóbulos rojos están sensibilizados, mediante un reactivo que tiene anticuerpos anti-IgG y anti-C3d.

¿De qué está constituido el suero de anti globulina humana?

Es un suero de conejo que contiene anti IgG policlonal y C3d monoclonal, que permite pues crear ese puente entre los GR
sensibilizados para que los mismos aglutinen y pueda ser evidenciable.

¿Cuáles son los tipos de anti globulina que hay?

Monoespecifiico y poliespecificos

¿Cuál es el que usa de rutina en el laboratorio?

El poliespecifico, pues simplemente lo que necesitamos saber es que esta sensibilizado o no.

¿Cuándo se usaría el monoespecifico?

Posteriormente a saber que esta sensibilizado, se debe saber si es por IgG o por C3d.

¿Por qué tenemos que saberlo?

Es necesario saber qué es lo que está sucediendo, si hay una activación solamente de IgG o también está el complemento actuando
allí. Si la persona lo que está produciendo son anticuerpos tipo IgG, y están aglutinando esos glóbulos rojos es recomendable una
esplenectomía para evitar que ocurra esa hemolisis.

Modalidades de la prueba de AGH

 Directa: se investiga sensibilización in vivo, es decir, la reacción ag-ac ocurre dentro del organismo. Es un paciente
que tiene una sensibilización previa por la cual pudiera estar sufriendo una hemolisis, lo cual nos estaría llevando a
una anemia. Es la que manda a hacer el médico y se llama anti globulina directa y es la que se reporta.

 Indirecta: en la que de manera indirecta yo hago la sensibilización en el laboratorio, y la hago para investigar algo
que me interesa, y esta no se reporta.

Antiglobulina directa
Entonces en la sensibilización in vivo la persona tiene sus GR previamente sensibilizados, por ende al extraer esos GR ya están
sensibilizados.
¿Para qué se utiliza esa antiglobulina directa?
Para todo aquello que esté relacionado con una sensibilización in vivo de los GR, como la EHRN, anemia hemolítica
autoinmune, inducida por drogas, entre otros. En todos estos casos hay una sensibilización de los GR in vivo que necesita ser
investigado.
 ¿Cómo se hace?
1. Tomamos la muestra del paciente, de la cual se va a tomar una gota de la sangre al 5% (según protocolo) pero para
nosotros van a ser 2 gotas porque como no estamos acostumbrados y perdemos GR cuando hacemos los lavados.
2. Lavamos 4 veces seguidas, en SSF , centrifugamos a 3000 rp2´ con cada lavado.
3. Una vez hecho esto aseguramos que no queden remanentes de SSF
4. Se le agrega dos gotas de reactivo de antiglobulina humana
5. Se vuelve a centrifugar para poder posteriormente leer (3000x15 segundos o 1000 rp1m)
6. Lectura. Posibles resultados
Resultado positivo: se reporta en cruces
Resultado negativo, se debe confirmar porque bien puede ser un verdadero negativo o un falso negativo puede
deberse a un lavado insuficiente, lo que va a ocasionar que haya inmunoglobulinas libres que van a neutralizar el
reactivo, puesto que las anti inmuniglobulinas del reactivo van a reaccionar con lo que tienen más fácil que son las
inmunoglobulinas libres y no las que están sensibilizando el GR; también puede ocurrir cuando el reactivo está dañado.
Entonces como hago para saber si era un verdadero negativo o un falso negativo?
Con un control, que serían GR pre-sensibilizados, el cual se va a agregar al tubo donde está la muestra del paciente con
el reactivo, donde si ocurre una aglutinación efectivamente el reactivo está en óptimas condiciones y es un verdadero
negativo y procedo a reportar. ¿Cómo reporto? Anti globulina directa negativa.

Antiglobulina indirecta

-Ahora bien, si el resultado es positivo es necesario hacer otra serie de estudios para ver exactamente que anticuerpos
están sensibilizando los GR del paciente y es mediante la ANTIGLOBULINA INDIRECTA
-También es útil para investigar anticuerpos atípicos, por ejemplo un paciente que tiene una anemia hemolítica
-Adicionalmente también se puede utilizar para investigar antígenos y para la realización de las pruebas cruzadas.

¿Cómo se realiza?
Se comienza con la prueba de determinación de Rh negativa. En la rutina se usa para la investigación de antígenos,
siendo específicamente el D débil el que va a ser investigado. Entonces vamos a tener un tubo donde supuestamente hay
un D-, pero bien sabemos que puede ser falso negativo, puesto que el mismo esta débilmente expresado, o pues también
puede ser que efectivamente se trata de un verdadero negativo.
¿Cómo lo comprobamos?
Debemos sensibilizar los GR con IgG anti D, pero en la rutina no se hace eso, se va a tomar el mismo tubo de donde se
hizo la determinación de Rh y ese tubo se va a llevar a 37°C para que la IgG anti D que está en el reactivo que proviene
de la determinación del Rh sensibilice al GR (asi como también tiene la IgM) ¿Y tiene las dos por qué? Para efectos de
poder hacer esto, si da negativo con la IgM estando a temperatura ambiente, yo para investigar ahora la IgG incubo a
37°C, que es la temperatura óptima de ese anticuerpo, y lo incubo el tiempo suficiente (20´) de tal manera que ocurra la
reacción antígeno anticuerpo y centrifugo. Se hacen los lavados, tal cual como en el caso anterior con la AGD y se agrega
el reactivo de antiglobulina humana., se vuelve a centrifugar y se leen los resultados.

Nota: ¿Qué es lo que espero yo? Que el ag. D exista débilmente expresado, por lo tanto la IgM se unió en algunos
puntos, donde está ese ag. D pero no logro hacer que los GR aglutinaran pero si hubo reacción. Ahora por qué tengo que
centrifugar por que no trabajo con esas IgM pegadas al GR? porque el reactivo de antiglobulina humana tiene es anti IgG
policlonal y si la IgM está atravesada allí no va a pasar nada, no le va a dar paso a la anti inmunoglobulina
correspondiente.

Posibles resultados:

 Negativo: no hay D débil (verdadero negativo) o pudiera haber un falso negativo, entonces debo corroborar
que no sea un falso negativo, y se corrobora con células pre sensibilizadas, entonces si hay aglutinación con las
células presensibilizadas, efectivamente el reactivo si está funcionando y reporto mi Rh negativo.
 Positivo: presencia del ag. D débil o que ya estaba sensibilizada (hemolisis compensada). Ahora debo confirmar
que esa persona no tenía una sensibilización previa con Coombs directo.

Ahora bien, si la antiglobulina indirecta esta positiva y la directa esta positiva el resultado es inválido, porque no puedo
saber cuál es la causa de la sensibilización.
Si la indirecta es positiva y la directa es negativa decimos entonces que el resultado es válido y se procede a reportar.

¿Cómo se reporta?
Si da negativo, Rh negativo, si da positivo (presencia de Ddebil) Rh positivo

-Causas de error (LEER LINARES)

No son pruebas muy sensibles, sin embargo son muy usadas

- SE NECESITAN 100-500 MOLECULAS SENSIBILIZANDO POR CADA GR PARA QUE LA AGD DE POSITIVA Y 120 PARA QUE EL D
DEBIL DE POSITIVO