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Université Alger 1 Faculté des Sciences Département SNV

Module TAE 3ème année (L3/S5) 2017-2018

TP2 : La centrifugation et la dialyse


Réalisé par Dr. BEYAZ
Objectifs du TP :

 Décrire les techniques couramment utilisées pour séparer les différents types de
cellules et organites (centrifugation et dialyse).
 Connaitre le principe et les types de chacune des deux techniques.

I. La centrifugation :

I.1. Introduction et définition :

La centrifugation est un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction de


leur différence de densité en les soumettant à une force centrifuge. Le mélange à séparer peut
être constitué soit de deux phases liquides, soit de particules solides en suspension dans
un fluide. L'appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse appelée centrifugeuse.

Le mot centrifugation est construit à partir du verbe « centrifuger »qui vient du


latin fugere qui signifie « fuir » et de « centre », auquel est ajouté le suffixe -ation indiquant
une action, un effet physique.

Elle est utilisée en laboratoire pour récupérer un précipité, pour séparer des éléments
figurés dans le sang par exemple (globules rouges, globules blancs, plaquettes en suspension
dans le plasma sanguin), séparation de composés cellulaires pour étude biochimique ou
moléculaire… etc.
I.2. Principe et calcul de la vitesse de sédimentation :

La séparation des composés d'un mélange est réalisable par décantation, sous l'action de la
seule gravitation mais elle nécessite parfois une longue durée pour acquérir de bons résultats
et est donc souvent inefficace.

Il est donc plus efficace d'utiliser la centrifugation. Au cours de cette opération de séparation,
les composés dans le fluide situés à une distance r de l'axe de rotation sont soumis à
différentes forces :

Schéma des différentes forces s’appliquant sur le composé à centrifuger


 Fp : la force de pesanteur descendante.
 Fa : la poussée d'Archimède ascendante.
 Fv : une force de friction.
 F'c : la force centripète.
 Fc : la force centrifuge.
La séparation s'opère par l'action de la force centrifuge Fc sur les composés. Cette force
centrifuge s’exprime en newtons.

Le rapport de la force centrifuge Fc sur le poids Fp est appelé intensité de la pesanteur


artificielle et s'exprime en « g3 ». Les valeurs utilisées en centrifugation sont d'environ 400
à 10 000 g ce qui correspond à des vitesses de rotation de l'ordre 2 000 à 10 000 tours/min
suivant le rayon des rotors.
La centrifugation fait appel à la force centrifuge exercée sur les particules incluses dans la
solution, afin de ségréguer certaines composantes. Cette séparation s’effectue selon la densité
des particules. La force exercée par l’accélération à haute vitesse de la solution à séparer est
régie par la loi de Stokes qui est de :

Cette loi permet de calculer la vitesse de sédimentation des particules qui est exprimée en
S (Sverdberg). Dans cette équation, la composante vs est la vitesse de sédimentation. Le r est
le rayon de la particule en solution. Le Δρ est la différence de densité entre la particule et le
milieu où la particule est contenue. Le « g » est l’accélération due à la force centrifuge dans la
centrifugeuse. Le η est la viscosité de la solution.
I.3. Technique :
Elle consiste à séparer les constituants d’une cellule ou d’un organite et comporte deux
étapes principales :
A. L’homogénéisation (ou broyage), qui implique la destruction de la membrane
plasmique et donne un homogénat (extrait acellulaire).
B. La séparation des organites par des centrifugations successives.

A. Homogénéisation
Elle a pour objectif de conduire à la destruction des cellules sans détérioration des
organites. Le milieu de broyage doit respecter des exigences ioniques, osmotiques et de pH,
de façon à ce que les organites (en général des vésicules) ne subissent pas de modification
chimique ou de volume. Les méthodes d’homogénéisation sont de type :
- Mécanique (pistons, mixers) ;
- Physique (hautes pressions, ultrasons) ;
- Chimique : destruction des membranes par des détergents et des parois (cas des cellules
végétales ou des bactéries) par des enzymes appropriées tels que cellulases et lysozymes.
En fait, chaque type cellulaire nécessite des conditions de broyage particulières, mais une
constante est que cette opération doit être effectuée à basse température (0-4 °C), et le plus
rapidement possible, pour minimiser les phénomènes de dégradations chimiques liés à la
libération d’enzymes à partir d’organites détériorés.

B. Séparation
Le principe de la centrifugation consiste à soumettre un mélange à une force centrifuge
importante, obtenue par rotation d’un rotor dans une enceinte. Dans ces conditions, en
fonction de leur taille et leur densité, les constituants sédimentent vers le fond du tube à une
certaine vitesse, proportionnelle à leur coefficient de sédimentation S (unité : le Svedberg).
Après cette opération, on obtient, au sein d’un tube à centrifuger, un culot (ou sédiment)
et un surnageant contenant ce qui n’a pas sédimenté.

NB : Certaines applications, comme la séparation des macromolécules biologiques


(protéines, acides nucléiques), nécessitent de passer par la méthode d'ultracentrifugation.
Les ultracentrifugeuses sont des machines très sophistiquées par rapport aux centrifugeuses
classiques qui utilisent des accélérations très élevées de l'ordre de 200 000 g, et qui
nécessitent de ce fait des vitesses de rotations de plusieurs dizaines de milliers de tours par
minute (jusqu’à 80 000 tours par minute).

I.4. Types de centrifugation :


1. La centrifugation différentielle
Technique appliquée à la séparation des organites ayant des constantes de sédimentation
notablement différentes et élevées.
C’est l’application de forces centrifuges d’intensités croissantes qui permet la séparation
d’organites de tailles et/ou de densité de plus en plus petites qui sédimentent au fond du tube
sous forme d’un culot, au cours de centrifugations successives.

2. La centrifugation sur gradient de densité

Cette technique permet la séparation des organites cellulaires et même de petites molécules
présentant de très faibles différences dans leurs caractéristiques, et ce en fonction de leurs
densité. Les particules de l’échantillon, déposé au sommet du tube contenant un gradient
d’une substance dense non ionique (comme le saccharose ou du glycerol), sont séparées en
bandes selon leur vitesse de sédimentation. Il existe 2 types de gradient : le gradient
isopycnique et gradient isocinétique.

a/ Séparation isopycnique (sédimentation à équilibre)


Les molécules soumises à la centrifugation sur le gradient de chlorure de césium (CsCl) se
sépareront selon leur densité. La préparation à analyser est déposée sur le sommet du gradient,
puis on centrifuge à équilibre. Chaque type de particule sédimentera jusqu'à ce qu'elle atteigne
la concentration correspondant à sa densité. Elle s'immobilisera alors à ce niveau.

b/ Gradient isocinétique (de zone)


La centrifugation peut aussi être utilisée pour des fins analytiques, pour séparer des particules
ou des molécules, selon leur taille. Dans ce type d'applications, comme les particules sont
homogènes, elles ont toutes la même densité, elles ne diffèrent que par leur taille. Le gradient
(saccharose ou CsCL) sert donc à faire en sorte que les particules lourdes sédimentent plus
vite que les plus légères, tout en n'atteignant jamais le fond du tube à centrifuger. On ne
centrifuge donc pas à équilibre. Le gradient, dont la concentration maximale est moins dense
que les particules, ne sert qu'à ralentir la sédimentation. On arrête donc la sédimentation
quand les plus lourdes sont rendues vers le bas du tube à centrifuger et que le niveau désiré de
séparation est obtenu.

Centrifugation sur gradient


de densité Centrifugation différentielle
II. La dialyse
II.1. Introduction et définition :

Le terme dialyse désigne la diffusion d'un soluté à travers une membrane qui lui est
perméable.
C’est un procédé de séparation des molécules ou des ions en solution, en utilisant comme
agent séparant une membrane synthétique qui est une couche mince de matière. Elle permet
l’arrêt ou le passage sélectif de certaines substances dissoutes ou non dans un mélange, entre
les deux milieux qu’elle sépare. Les petits solutés passent donc d'une solution plus concentrée
vers une solution moins concentrée à travers une membrane semi-perméable jusqu'à ce que
l'équilibre soit établi.
Dans l'appareil utilisé à l'origine, la solution à dialyser est séparée du liquide « accepteur »
appelé dialysat par une membrane semi-perméable (poreuse). Les petites molécules et les ions
traversent la membrane en fonction de leur taille. En effet, la solution à dialyser est
généralement appelée rétentat, pour bien indiquer qu'il y a des molécules qui ne traversent pas
la membrane et qui sont retenues. Le côté opposé, dénommé dialysat, porte aussi le nom de
diffusat. Cette technique est utilisée par les biochimistes et les microbiologistes pour purifier
les solutions protéiques et les débarrasser des ions minéraux du tampon ou des réactifs de
relargage.
Cette technique met une évidence une force qui est utilisée pour que les espèces chimiques
ou les ions puissent traverser la membrane semi-perméable, c'est-à-dire la barrière
relativement mince séparant deux milieux liquides, cette force est basée sur le gradient de
concentration.

Notions de rétentat et de dialysat

Les conditions de dialyse peuvent être contrôlées ou modifiées afin d'obtenir les résultats
souhaités quelque soit le domaine d'application de la dialyse. Pour chaque utilisation, le seuil
de rétention moléculaire choisi, (MWCO) doit permettre le meilleur rendement possible.

II.2. Choix du bon seuil de rétention Moléculaire :


Puisque la membrane de dialyse est constituée d'une matrice spongieuse de polymères
synthétiques, le diamètre du pore choisi comme seuil de rétention, est indirectement lié à la
capacité de rétention. Plus précisément, le seuil de rétention de la membrane est choisi de
manière à ce que 90% du soluté d'intérêt soit retenu. Cependant, puisque la capacité de
diffusion d'un soluté dépend également de sa forme moléculaire, de son degré d'hydratation,
de sa charge ionique et de sa polarité, il est recommandé de choisir un seuil de rétention
correspondant à la moitié du poids moléculaire des éléments à conserver et/ou deux fois le
poids moléculaire des éléments destinés à y passer.
II.3. Les Membranes :
Elles sont cylindres, allongées et fermées à leurs extrémités
Contiennent les substances à étudier, collodion ou cellophane, porosité : 2,4nm
Variation possible de la porosité par étirement ou traitement chimique.

Début de dialyse (forte concentration) Fin de dialyse (équilibrée)

II.4. Les étapes de la technique de dialyse :


1. Mettre la membrane semi-perméable dans un tube à dialyseur et l’humidifier avec de
l’eau (2à -3 ml d’H2O) pendant 5 minutes.

2. Retirer l’eau du tube.


3. Remplir la membrane qui se trouve dans le tube par la solution à dialyser.
4. Placer le tube dans un bécher contenant le volume d’échantillon tampon désiré en
mettant en place la barre d’agitation.
La durée de la dialyse doit être déterminée au préalable par le manipulateur, elle varie
en fonction du volume, de la nature et de la viscosité de la solution à dialyser,
exemple : un minimum de 30 minutes par 0.1 ml de solution, solution visqueuse > 3
heures.

5. Collection du dialysat : pipeter soigneusement le dialysat et le mettre dans un tube


propre pour les utilisations en aval.