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Université d’Alger 01 Faculté des Sciences Département de SNV

Module de TAE (TP) 3ème année (L3/S5) Année universitaire 2017/2018

TP n°4
Chromatographie de la chlorophylle sur gel de silice
Réalisé par Mme Ayari- Guentri. S et Mme Nacer. A

Objectifs du TP :
• Comprendre le principe de la chromatographie
• Réaliser une séparation des différents constituants de la chlorophylle

I. Généralités sur la chromatographie


Les méthodes chromatographiques sont des méthodes de séparation mettant en jeu différents
processus physicochimiques. La chromatographie doit son apparition au botaniste russe
Mikhaïl Tswett suite à ses travaux en 1906 réalisés pour la séparation de pigments végétaux
de la chlorophylle sur une colonne remplie de carbonate de calcium avec de l’éther de pétrole.

La première chromatographie
La séparation d’un mélange en ses différents constituants est le but de la chromatographie.
Les composés se répartissent dans deux phases une dite mobile et l’autre dite stationnaire
insolubles entre elles jusqu’à l’établissement d’un équilibre. Cet équilibre dépend des
propriétés de chaque composé vis-à-vis des phases considérées. Ces composés migrent avec
une vitesse différente.
1- Classifications des méthodes chromatographiques

a- Classification selon la nature physique des phases

On désigne couramment les différents types de chromatographie en fonction de la nature de la


phase mobile qui est par définition un fluide (liquide ou gaz) :
• Chromatographie liquide
• Chromatographie gazeuse
La phase stationnaire peut être un solide finement pulvérisé ou un liquide immobilisé sur une
phase fixe.
b- Classification selon le phénomène chromatographique
Bien que la séparation soit le résultat de plusieurs phénomènes ; l’habitude a été prise de
classer les différentes méthodes selon celui qui est considéré comme dominant.
• Chromatographie d’adsorption
• Chromatographie de partage

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• Chromatographie par échange d’ions
• Chromatographie d’exclusion moléculaire
• Chromatographie d’affinité
• Chromatographie par échange de ligand
c- Classification d’après le procédé utilisé
Selon la présentation de la phase stationnaire, on distingue :
• Chromatographie sur colonne
• Chromatographie planaire ou de surface
• Chromatographie sur papier
• Chromatographie sur couche mince
• Chromatographie d’élution
II. La Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
La CCM fut décrite dès 1938 mais ce n’est qu’à partir de 1956 que les travaux de STAHL la
firent connaitre. Elle permet la séparation de substances différentes : ions minéraux,
complexes organo-minéraux et composés organiques.
1-Matériel utilisé
a-Couche mince. Elle est constituée par le dépôt de la phase stationnaire sur une surface de
dimension variable. L’adhérence de la phase stationnaire sur la surface du support est obtenue
par incorporation d’un liant (amidon, sulfate de calcium) au moment de la préparation. La
phase stationnaire est mélangée avec le liant et des solvants volatiles ne contenant presque pas
d’eau jusqu’à obtention d’un mélange semi-liquide qui est par la suite étalé sur les plaque à
l’aide d’un étaleur réglant l’épaisseur de la couche. Les plaques sont séchées et conservées à
l’abri de l’humidité.
Des réactifs peuvent être ajoutés au moment de la préparation de la plaque, il s’agit de :
Réactifs de visualisation (le plus souvent des composés fluorescents pour la visualisation sous
UV), réactifs modifiant le pH et des réactifs complexant.
b-Enceintes et cuves de migrations. Les cuves sont en verre et doivent être d’une étanchéité
parfaite.
c-Solvants de migration.Ce sont des solvants organiques plus ou moins hydratés dont la
nature dépend des substances à séparer.
2-Mode opératoire
a-Dépôt des échantillons. Des volumes de 10 à 50 µL sont déposés sur une ligne horizontale
à 1 ou 2 cm du bord inférieur de la plaque et sont séchés immédiatement par un courant d’air
chaud pour éviter leur diffusion.
b-Migration.La plaque est alors introduite dans la cuve au fond de laquelle se trouve le
solvant de migration. La migration est arrêtée lorsque le front du solvant a parcouru 10 à
15cm. La durée de la migration dépend de la nature des solvants, elle peut aller de 30 min à 3
heures. La plaque est retirée de la cuve et séchée à l’air libre.
c-Révélation. Les substances colorées peuvent être séparées directement. Les substances
incolores sont révélées par plusieurs procédés : examen de la plaque sous lampe UV,
exposition aux vapeurs d’iode, localisation radioactive.
Après localisation des tâches sur les plaques, celles-ci sont grattées séparément et les poudres
collectées peuvent être mises dans des solvants appropriés pour les récupérer.

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3-Applications
a-Application qualitative
L’identification d’une substance inconnue peut être présumée en comparant son rapport
frontal « Rf » avec celui des composés connus déposés sur le même chromatogramme.
distance parcourue par le centre de la tache depuis la ligne de départ
𝑅𝑓 =
distance parcourue par le front du solvant depuis la ligne de départ

D- Distance de
migration du
solvant Front du solvant
d - Distance de
migration du
composé D

Ligne de départ

Figure 1. Chromatogramme de la CCM

b-Application quantitative
Considérant que la surface de la tâche est proportionnelle au logarithme de la masse du
composé élué, il est possible à condition de déposer des volumes exactement connus de la
solution à analyser et des solutions étalons, d’avoir une idée approximative de la
concentration.
On peut également procéder à la mise en solution de cette tâche après isolement de la zone où
elle est localisée et procéder sur la solution ainsi obtenue des dosages par des méthodes telles
que la spectrophotométrie, spectrofluorométrie...
III. Partie pratique
1-Matériel
- Feuilles d’épinard séchées réduites en poudre.
- Solvant pour l’extraction de la chlorophylle (10 mL d’acétone).
- Solvants pour la préparation de l’éluant (phase mobile) : éther diéthylique (60%) et
éther de pétrole (40%).
- Mortier.
- Balance.
- Sable.
- Erlenmeyer, bécher et éprouvette graduée de 100mL.
- Plaque en aluminium couverte du gel de silice (prête à l’emploi).
- Cuve en verre de migration.
- Un tube capillaire.
- Minuteur.
- Règle et crayon.
- Unepaire de ciseaux.

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- Coton cardé.

2-Protocole d’extraction de la chlorophylle.


1- Peser 10g de feuilles d’épinard dans bécher et les hacher grossièrement, en éliminant la
nervure centrale, à l’aide d’une paire de ciseaux.
2- Placer les feuilles hachées dans un mortier, en ajoutant du sable,
3- Ecraser avec le pilon en ajoutant, petit à petit 10 mL d’acétone (ou d’éthanol) jusqu’à
obtenir une solution concentrée.
4- Filtrer le broyat dans un Erlenmeyer à l’aide d’un coton cardé et récupérer le filtrat.
3-Protocole de la CCM.
• Découper une bande de plaque de silice d’environ 15 cm de long et 2 cm de large,
• Tracer une croix à 1 cm du fond de la bande, ceci est le repère pour placer la tâche de
chlorophylle,
• Déposer une goutte de chlorophylle extraite sur la croix et attendre que ça se sèche,
répéter cette opération 6 fois afin que la tâche verte soit bien visible,
• Préparer 10 mLd’éluant avec 40% de solvant apolaire (éther de pétrole) et 60% de
solvant polaire (éther -diéthylique), verser l’éluant préparé dans une cuve de
migration,
• Mettre la bande de la plaque de silice et la faire tremper dans l’éluant sans toucher la
tâche,
• Couvrir la cuve de migration et faire migrer pendant 1 heure.

Figure 2 : Déroulement d’une CCM

III-Interprétation des résultats et conclusion


1-Sortez la plaque de la cuve, laissez sécher à l’air libre ou sèche-cheveux et repérez au
crayon le front.
2- Prenez une photographie de votre chromatogramme.
3- Calculez, pour les différentes tâches, les rapports frontaux « Rf » sachant que Rf = d/D
avec: * d= distance séparant les différentes composantes de la ligne de base.
* D= distance entre la ligne de base et le front de migration de l’éluant.
4- Recherchez dans la documentation la nature des différentes tâches observées ainsi que le
rôle de la chlorophylle.
5- Terminez votre travail en présentant une synthèse de vos observations, calculs et nature des
composés identifiés.