Profesores: Dr.

Enrique Mamani Zapana 29 de Noviembre de 2017

Mg. Christian Florian Carrillo
Merino Loayza, Aarom Sebastian1 16100075
1
E. A. P. Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San
Marcos
PRACTICA N°15
ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCIÓN
Uno de los aspectos a los que se enfrenta a diario un profesional de la microbiología es el
de manejar cantidad de microorganismos ya que sin esta información muchos de los procesos de
investigación no podrían llevarse a cabo, es por lo que a lo largo del tiempo se empezaron a
desarrollar y a utilizar métodos que faciliten la cuantificación de microorganismos.
Estos métodos requieren de instrumentación diversa, sin embargo, todos se basan en el
aprovechamiento del tamaño de los individuos a cuantificar, como en el caso del conteo con la
camara de NeuBauer el cual utiliza las diferentes dimensiones de las levaduras, bacterias y
microalgas para luego realizar un conteo aproximado por cuadrantes. Otros métodos se guiaran
por la densidad del medio u otras características pero todas llegaran a una aproximación ya que el
enumerar organismos tan pequeños resulta ser una tarea difícil por lo que se debe llegar a un
número aproximado.
MARCO TEÓRICO

Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso de células microbianas

en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Se pueden mencionar el recuento
en placa, el recuento de células en cámara de Neubauer, el método de turbidimetría.
Método de conteo directo en placa:
La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes
en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio
de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada,
proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese
microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC.
Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo (Camacho,
Giles, Ortegón, & Serrano, 2009).
 Figura 1. Procedimiento realizado para el conteo de microorganismos por el método de
placas.
Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-
placa_6527.pdf

Método de conteo en cámara de Neubauer:

Tiene la ventaja de ser muy rápido y económico, aunque no se pueden distinguir las
células viables y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una
muestra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra que sean
necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de la observación y la cuantificación se
dificultan en células muy pequeñas (1-5µm) o en poblaciones de baja densidad debido al
pequeño volumen de muestra que se utiliza (01-0.2 mm3). (Aquiahuatl y Pérez, 2004)

Figura 2. Cámara de NeuBauer para conteo de microorganismos por cuadrantes.

Fuente: http://www.celeromics.com/es/resources/Technical%20Notes/neubauer-chamber-
cell-concentration/formula-camara-neubauer-concentracion.php
  Cuadrado 1:
Área: 1mm x 1mm = 1mm2
Volumen: 1mm2 x 0,1mm = 1x10-4ml
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥 10000
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠
 Cuadrado 2:
Área: 0.25mm x 0.25mm = 0.0625mm2
Volumen: 0625mm2 x 01mm = 6.25x10-6ml
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥 160000
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠

 Cuadrado 3:
Área: 0.2mm x 0.2mm = 0.04mm2
Volumen: 0.04mm2 x 0.1mm = 4x10-6ml

Turbidimetría:
Es la medición de la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es
relativamente rápida y se basa en la capacidad de las células microbianas de dispersar la
luz que incide sobre estas. Como el tamaño de células en una población es casi constante,
el grado de dispersión es proporcional a la concentración de células presentes, pero no se
puede diferenciar la turbidez dada por células viables y no viables (Molina, 2016).

Figura 3. Principio de acción del espectrofotómetro para la determinación de turbidez.

Fuente: https://es.slideshare.net/shirleychaya/microbiologia-17566510
Escala de Mac Farland:
El patrón o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos herméticamente
cerrados,previamente calibrados y con una densidad óptica diferente originada por la
aparición de unprecipitado de sulfato de bario (BaSO4) resultante de la reacción entre el
cloruro de bario (Cl2Ba) al1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36N).

Esta turbidez puede interpretarse ópticamente o por métodos espectrofotométricos y cada

una deellas se corresponde a una concentración conocida de bacterias/ml.Para cada cepa
bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y lamasa o la
concentración de bacterias (cél/ml) que genera una turbidez similar (Aquiahuatl & Perez,
2004).

Tabla 1. Tabla de valores aproximados de células por valor de turbidez. Escala de Mac
Farland
Fuente: http://monterde2.blogspot.pe/2016/06/sesion-8-recuentocoliformes-totales-por.html

PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES

 Muestras de Agua
 1 tubo con cultivo de E. coli
 1 tubo con cultivo de S. aureus
 1 tubo con cultivo de Saccharoyces cerevisiae
 3 tubos de 9ml de solución salina 16x150
 Cámara de NeuBauer
 Micropipeta
 Placas Petri con Agar nutricio
 2 pipetas de 10 y 5 ml
 Gradilla
 Espátula de Drigalsky
 1 placa Petri estéril vacía
 Mechero Bunsen
 Marcador indeleble de punta fina
PROCEDIMIENTO

Métodos Directos
a) Método de placas: Se realizaron 3 disoluciones de 1/10, 1/100 y 1/1000 a partir
de la muestra dada, previamente homogenizando bien los tubos. Tomar 1ml de
cada disolución y colocarla sobre la superficie del Agar Nutricio, para finalmente
diseminar con ayuda de la espátula de Drigalsky, esperando 15 min para invertir
y llevar a incubar a 37°C por 24 horas para su respectiva lectura de datos.
b) Conteo directo total: Se realizo una dilusion de 1/1000 de un cultivo de
levadura. Para luego extraer un microlitro de dicha disolución con ayuda de una
micropipeta y colocarla en la cámara de NeuBauer y llevar esta al microscopio
para hacer el conteo respectivo, siguiendo las instrucciones correspondientes.
Métodos Indirectos
a) Turbidimetría: Comparar los cultivos de E. coli y S. aureus con los tubos de
Mac Farland en el espectrofotómetro.

RESULTADOS

Métodos Directos
a) Método de placas: Realizadas las distintas disoluciones con E. coli. En la
primera placa con disolución 10-1 se obtuvieron 204UFC, en la segunda con
disolución 19UFC y en la última con disolución se encontraron 2UFC. Con lo que
quedaría los siguientes resultados:

(1) Disolución 10-1:

UFC⁄ = 204UFCx 1 x 1 = 2,04x104 UFC/ml
ml 10−1 0.1ml
-2
(2) Disolución 10 :
UFC⁄ = 19UFCx 1 x 1 = 1,9x104 UFC/ml
ml 10−2 0.1ml
-3
(3) Disolución 10 :
UFC⁄ = 2UFCx 1 x 1 = 2x104 UFC/ml
ml 10−3 0.1ml
(4) UFC/ml promedio:
UFC⁄ = 1.98x104 UFC/ml
ml prom

b) Conteo directo total: Se utilizaron dos disoluciones de 10-1 y 10-2 las cuales se
utilizaron 1microlitro por cada una en la camara de neuBauer, tal como se
observa en la Figura 4. Donde se lograron contar para la primera disolución 284
levaduras y en la segunda solo se contraron 24, todas en los 16 cuadrantes tipo
2 en la primera y 1 cuadrado de tipo 1 en la segunda. Con lo que se obtuvieron
los siguientes resultados:
(1) Disolución 10-1:
cell 284x160000
= = 2,84x106 cell/ml
ml 16
(2) Disolución 10-2:
cell 24x10000
= = 2,4x105 cell/ml
ml 1
 Figura 4. Cuantificacion de levaduras de Saccharomises cerevisae en una
disolución de 10-2
Fuente: Autoría propia
Métodos Indirectos
b) Turbidimetría: Los resultados obtenidos mostraron que para el tubo de E. coli
este poseía una turbidez de 4.0 en la escala de Mc Farland.

a) b)
Figura 5. Comparación de turbidez: a) Muestra de E. coli a la derecha con
solución salina a la izquierda. b) Comparación de las distintas soluciones salinas.
Fuente: Autoría propia
DISCUSIÓN

Métodos Directos
a) Método de placas: Este método es solo eficaz cuando las disoluciones se hacen
de manera correcta y con la asepsia debida, ya que las disoluciones por
estimación deberían mostrar una decima parte del numero de colonias de la
disolución anterior. Cosa que se cumplió en los resultados obtenidos ya que
después de contar los UFC’s se saco un promedio lo cual aproxima al valor exacto
que se encuentra en el tubo original. Este método a distintos errores ya sea por el
que lo realiza o por los equipos, ante esto se recomienda que se haga un minio de
dos placas por disolución con lo que se evitaría los problemas ya mencionados.
b) Conteo directo total: Para los resultados mostrados por este método tomamos
en consideración que la principal deficiencia de este método es el de no poder
 diferenciar células vivas o muestras lo cual incrementa el margen de error para la
estimación del numero de microorganismos. Otro punto que discutir es la limitación
de este método para realizar el conteo, ya que muchos microorganismos impiden
su correcto conteo por visualización en el microscopio ya sea el caso de muchas
bacterias. Ante ello los microorganismos mas usados por este método son las
levaduras y microalgas las cuales tienen un tamaño lo suficientemente grande
como para ser contabilizadas hasta en los cuadrados de tipo 2.
Métodos Indirectos
c) Turbidimetría: Los resultados obtenidos no pudieron contrastarse bien a causa
de que las soluciones salinas estaban vencidas ya que estas eran del año 2013 lo
cual afecto en las lecturas del espectrofotómetro el cual determino densidades no
correspondientes a las etiquetas con lo que, se requiere de material actual para
tener una aproximación real de lo que se quiere, ya que el resultado dado para la
muestra de E. coli es meramente intuitivo.
CUESTIONARIO

I. ¿Qué otros métodos no mencionados existen para el recuento de microorganismos?

Recuento electronico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de

bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y
microorganismos filamentosos o miceliares.
Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados a
través de un pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que
miden la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy
pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada compartimiento
es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se
explica a continuación. Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzado a
pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy
breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento,
la resistencia de éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es
menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o
voltaje y contados.

Rida Count: Es una prueba de lámina con medio listas para usar, diseñadas para la
detección cuantitativa de microorganismos en alimentos y ambientes que consisten
en una película deshidratada de medios generales o selectivos en las cuales se
deposita 1ml de muestra, la cual rehidrata el medio, posee una cubierta transparente
para evitar la contaminación indeseada. Está diseñado para el recuento de mesófilos
aerobios, coliformes totales, enterobacterias, Staphylococcus aureus, E. coli,
Salmonella y hongos y levaduras. (Corporación Chisso, 2003)

II. ¿Por qué se usa 30-300 como rango para el conteo en placa?
Por razones estadísticas. Para obtener resultados estadísticamente significativos.
Para que ello sea posible, en el momento de la siembra debe tenerse una idea
aproximada del número de bacterias presentes en la muestra a fin de realizar las
diluciones adecuadas que dependen de las características que presente la muestra,
 turbidez, olor, etc. Y porque en este rango de crecimiento significa que los
microrganismos presentes tuvieron las mismas posibilidades de desarrollarse.
BIBLIOGRAFIA

 Aquiahuatl, M. d., & Perez, M. (2004). Cuantificacion de microorganismos en laboratorio.

Iztapalapa: Universidad Autonoma Metropolitana.
 Bastidas, O. (2015). Formula de la cámara de Neubauer. Bogota: Celeromics.
 Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., & Serrano, B. (2009). Cuenta en placa de
bacterias. Mexico D.F.: Ediciones UNAM.
 Molina, S. (2016). Escala de Mac Farland. Colombia: Ed. YBL.