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Sous la direction de
milien PELLETIER
Peter G.C. CAMPBELL
Francine DENIZEAU
Catalogage avant publication de la Bibliothque nationale du Canada

Vedette principale au titre :


cotoxicologie molculaire : principes fondamentaux et perspectives de dveloppement
Comprend des rf. bibliogr.
ISBN 2-7605-1258-4
1. cotoxicologie. 2. Organismes aquatiques, Effets de la pollution de leau sur les.
3. Biologie molculaire. 4. Marqueurs biologiques. 5. Polluants de leau. 6. Xnobiotiques.
I. Pelletier, milien. II. Campbell, P.G.C. (Peter Gerald Cadogan), 1943- .
III. Denizeau, Francine.
QH90.8.T68 E26 2004 571.9'5'0916 C2004-940015-0

Nous reconnaissons laide financire du gouvernement du Canada


par lentremise du Programme daide au dveloppement
de lindustrie de ldition (PADI) pour nos activits ddition.

Mise en pages : INFO 1000 MOTS INC.


Couverture : RICHARD HODGSON

1 2 3 4 5 6 7 8 9 PUQ 2004 9 8 7 6 5 4 3 2 1
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2004 Presses de lUniversit du Qubec
Dpt lgal 2e trimestre 2004
Bibliothque nationale du Qubec / Bibliothque nationale du Canada
Imprim au Canada
Table des matires vii

la mmoire de notre collgue et trs chre amie,


Francine Denizeau,
dcde le 24 mars 2004
la suite dun long combat contre le cancer.
Nous garderons de Francine le souvenir
dune femme de sciences nergique
et profondment engage en recherche et en formation
de jeunes diplms capables de prendre la relve
en toxicologie de lenvironnement.
viii cotoxicologie molculaire
Table des matires ix
TABLE DES
M AT I R E S

Liste des figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi

Liste des tableaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxvii

Abrviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxi

Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
milien Pelletier, Peter G.C. Campbell et Francine Denizeau
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Chapitre 1
Prise en charge et dtoxication des mtaux
chez les organismes aquatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Peter G.C. Campbell et Yves Couillard
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1. Contamination environnementale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2. Identification de mtaux prioritaires . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3. Plan du chapitre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2. Toxicologie aquatique des mtaux notions . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1. Chimie environnementale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2. Prise en charge des mtaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.1. Considrations gnrales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
x cotoxicologie molculaire

2.2.2. Modle de lion libre (MIL)/Modle


du ligand biotique (BLM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.3. Applicabilit du Modle du ligand
biotique (BLM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.4. Rsum : prise en charge des mtaux . . . . . . . . . . 30
2.3. Toxicit et de dtoxication des mtaux . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.1. Mcanismes de toxicit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.2. Mcanismes de dtoxication . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.3.3. Spciation intracellulaire des mtaux
un outil pour dceler la toxicit ? . . . . . . . . . . . . . . 39
3. Mtallothionines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.2. Biochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.3. Synthse et dgradation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4. Fonctions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4.1. Rle dans la rgulation des mtaux essentiels . . . 47
3.4.2. Protection contre le stress oxydant . . . . . . . . . . . . 49
3.4.3. Dtoxication des mtaux traces . . . . . . . . . . . . . . . 49
4. Conclusions et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

Chapitre 2
La mtallothionine : un biomarqueur dexposition
au cadmium pour les invertbrs deau douce . . . . . . . . . . . 63
Bernadette Pinel-Alloul, Olivier Perceval, Anik Gigure,
Yves Couillard, Peter G.C. Campbell et Landis Hare
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
1.1. Contamination mtallique dans les cosystmes
aquatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
1.2. Concept de biomarqueur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
1.3. Dmarche cotoxicologique holistique
et hirarchique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2. La mtallothionine comme biomarqueur dexposition
et de toxicit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.1. Approche cotoxicologique intgre . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.2. Rappel du rle de la MT comme
biomarqueur dexposition au cadmium . . . . . . . . . . . . . . 74
2.3. tude de cas : caractrisation limnologique
ettoxicologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
Table des matires xi

2.4. valuation de la MT comme biomarqueur


des effets toxiques du cadmium au niveau
de la cellule et de lorganisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
2.5. Validation de la MT comme biomarqueur
des effets des mtaux au niveau des populations . . . . . . 82
2.5.1. Contexte cotoxicologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
2.5.2. Variables toxicologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
2.5.3. tat des populations et qualit
environnementale des habitats . . . . . . . . . . . . . . . . 85
2.5.4. Relations entre ltat des populations
et les variables toxicologiques . . . . . . . . . . . . . . . . 85
2.5.5. Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
2.6. Effets confondants des facteurs
environnementaux en milieu naturel . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3. Conclusions et perspectives de recherche . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Chapitre 3
La dpollution des POP : les nouveaux outils
de la biologie molculaire la rescousse
des biotechnologies environnementales . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Michel Sylvestre, Diane Barriault,
Marie-Michle Plante et Catherine Simard
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
2. Biodisposition des composs xnobiotiques
par les bactries de lenvironnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
2.1. Capacit des micro-organismes dgrader
les xnobiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
2.2. Capacit dadaptation des micro-organismes
dans un nouvel environnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
3. Les POP, une menace pour lenvironnement . . . . . . . . . . . . . . . 117
3.1. Persistance des POP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
3.2. Exemple des BPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
4. Voie catabolique des BPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
4.1. Purification et mcanismes ractionnels
de la dioxygnase du biphnyle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
4.2. Activit et spcificit de la dioxygnase
du biphnyle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
xii cotoxicologie molculaire

5. Ingnierie de la dioxygnase du biphnyle . . . . . . . . . . . . . . . . 129


5.1. volution molculaire in vitro
par recombinaison alatoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
5.2. Application de lvolution molculaire in vitro
par recombinaison alatoire lingnierie
de la dioxygnase du biphnyle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
5.3. volution molculaire de familles de gnes . . . . . . . . . . . 134
5.4. Mthode de criblage pour
une dioxygnase amliore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
5.5. Ingnierie de la dioxygnase du biphnyle de la souche
B-356 par recombinaison in vitro alatoire . . . . . . . . . . . . 136
5.6. Analyse dhybrides obtenus en remplaant
la partie C-terminale de la chane 
de la dioxygnase de LB400 par celle de B-356 . . . . . . . . 136
6. Autres enzymes de la voie catabolique
du biphnyle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
6.1. La 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle
2,3-dshydrognase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
6.2. La 2,3-dihydroxybiphnyle 1,2-dioxygnase . . . . . . . . . . 143
6.3. Hydrolase du HOPDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
7. Application des organismes modifis gntiquement
dans des procds de dcontamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
7.1. Expression et fonctionnalit des enzymes modifies . . . 146
7.2. Survie des organismes modifis gntiquement . . . . . . . 148
8. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

Chapitre 4
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes :
exposition de poissons et amphibiens aux mtaux
et aux pesticides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Alice Hontela et J. John Dorval
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
1.1. Problmatique des perturbateurs endocriniens . . . . . . . . 163
1.2. Cibles endocrines des polluants environnementaux
et axe hypothalamo-hypophyso-adrnal . . . . . . . . . . . . . 164
Table des matires xiii

2. Endocrinologie compare
du tissu adrnocortical et hormones corticostrodes . . . . . . . 166
2.1. Anatomie compare : poissons tlostens,
amphibiens et mammifres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
2.2. Cellule corticostrodognique
et voies de signalisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
2.3. Les hormones corticostrodes
et leurs effets physiologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
3. Travaux sur le terrain et effets
des expositions chroniques chez les poissons . . . . . . . . . . . . . . 170
3.1. La dfaillance cortisolique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
3.2. Effets des mtaux sur la capacit dosmorgulation . . . . 173
3.3. Effets des mtaux sur la croissance
et le mtabolisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
4. Expositions in vitro : mcanismes impliqus
dans la dfaillance cortisolique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
4.1. Les interactions des mtaux
avec le Ca2+ intracellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
4.2. Effets des mtaux et des pesticides
sur les enzymes strodogniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
5. Pesticides et stress oxydatif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
5.1. Dfinition du stress oxydatif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
5.2. Les systmes de dfense antioxydants . . . . . . . . . . . . . . . 182
5.3. Travaux en laboratoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
5.3.1. Exposition in vitro lendosulfan . . . . . . . . . . . . . . 184
5.3.2. Travaux sur le terrain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
6. Utilisation des biomarqueurs hormonaux . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
6.1. Recommandations et protocoles
pour lutilisation sur le terrain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
6.2. Avantages et limitations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
7. Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
8. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
xiv cotoxicologie molculaire

Chapitre 5
Rtinodes : biomarqueurs et base molculaire
deffets de substances toxiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Monique Boily, Marjolaine Bisson et Philip A. Spear
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
2. Biochimie, mtabolisme et action molculaire . . . . . . . . . . . . . 200
2.1. Absorption, mtabolisme,
stockage et transport des rtinodes majeurs . . . . . . . . . . 200
2.2. Mtabolisme de lacide rtinoque
et formes apparentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
2.3. Interactions au niveau des rcepteurs nuclaires . . . . . . 206
2.4. Aspects nutritionnels de la vitamine A et effets
dun excs en acide rtinoque sur lembryon . . . . . . . . . 208
3. Dsquilibres des rtinodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
3.1. Dsquilibre des formes de stockage . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
3.1.1. Stockage au niveau du foie et certains organes . . 215
3.1.2. Corrlations entre enzymes
et rtinodes hpatiques stocks . . . . . . . . . . . . . . . 220
3.1.3. Rserve au niveau des ufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
3.1.4. Effet des contaminants sur la HER,
la LRAT et lARAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
3.1.5. Conclusions propos du stockage
de rtinodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
3.2. Rtinol sanguin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226
3.3. Effets sur le mtabolisme de lacide rtinoque . . . . . . . . 229
4. Exemples des rtinodes comme biomarqueurs
dans le contexte dtudes cotoxicologiques . . . . . . . . . . . . . . . 230
4.1. Programmes de surveillance des colonies aviennes
sur les Grands Lacs et le fleuve Saint-Laurent . . . . . . . . . 230
4.2. tudes sur les populations desturgeon jaune . . . . . . . . . 237
5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
Table des matires xv

Chapitre 6
Les interactions multiples en cotoxicologie :
le cas du benzo(a)pyrne et du tributyltain
chez lomble chevalier (Salvelinus alpinus) . . . . . . . . . . . . . . . 257
Jaime Padrs, milien Pelletier et Ciro A. de Oliveira Ribeiro
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258
1. Introduction gnrale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
1.1. Lantagonisme slnium/mercure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260
1.2. Introduction au problme du TBT et du BaP . . . . . . . . . . 262
1.3. Hypothses de travail et objectifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
2. Matriel et mthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
2.1. Produits chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
2.2. Poissons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
2.3. Traitements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
2.4. Prlvement des tissus cibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
2.5. Prparation des essais enzymatiques
et dosages biochimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
2.6. Analyse des mtabolites du BaP dans la bile . . . . . . . . . . 270
2.7. Isolement des macromolcules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
2.8. Analyses chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
2.9. Analyses histopathologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
2.10. Analyses statistiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
3. Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
3.1. Effets interactifs du BaP et du TBT
sur lactivit du P4501A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
3.2. Effets du TBT sur le mtabolisme du BaP . . . . . . . . . . . . . 272
3.3. Effets du TBT sur la bioactivation du BaP . . . . . . . . . . . . 273
3.4. Effets interactifs du BaP et du TBT
sur les activits de la GST et de la GR hpatiques . . . . . . 274
3.5. Effets interactifs du BaP et du TBT sur le glutathion . . . 275
3.6. Effets du BaP sur le mtabolisme du TBT . . . . . . . . . . . . . 276
3.7. Effets interactifs du BaP et du TBT
sur lhistopathologie du tissu hpatique . . . . . . . . . . . . . . 277
4. Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279
4.1. Inhibition de la bioactivation du BaP par le TBT . . . . . . . 281
4.2. Potentiation du mtabolisme et/ou
de lexcrtion du TBT par le BaP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
xvi cotoxicologie molculaire

4.3. Effet modulateur du TBT sur lactivit du P4501A . . . . . 284


4.4. Diminution de lactivit de la GST et du glutathion
et effet protecteur du BaP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
4.5. Protection mutuelle entre le BaP et le TBT
au niveau tissulaire hpatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
5. Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
6. Perspectives sur les interactions multiples
encotoxicologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294

Chapitre 7
Interactions cellule-cellule : cible des xnobiotiques . . . . . . 301
Daniel G. Cyr, Stphane Pillet et Jean-Marc Nicolas
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302
1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
2. Intgrines et slectines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
2.1. Slectines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
2.2. Intgrines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
3. Jonctions lacunaires et communication intercellulaire . . . . . . . 315
3.1. Connexines et jonctions lacunaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315
3.2. Effets des xnobiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321
3.2.1. Hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321
3.2.2. Phnobarbital (PB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322
3.2.3. Organochlors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
3.2.4. Mtaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
4. Jonctions dadhsion cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
4.1. Cadhrines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
4.2. Voie de signalisation des cadhrines . . . . . . . . . . . . . . . . . 330
4.3. Rgulation de la jonction adhrente . . . . . . . . . . . . . . . . . 332
4.4. Effets du cadmium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335
5. Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336
Table des matires xvii

Chapitre 8
Stress physiologique et perturbation
endocrinienne chez les bivalves marins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349
Jocelyne Pellerin, Sophie Gauthier-Clerc,
Ahmed Siah et Olivier Assoi-Etchian
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351
1.1. Les biomarqueurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352
2. Signaux cellulaires et molculaires
de stress physiologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352
2.1. Les processus oxydants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352
2.1.1. Exemples de stress oxydant en milieu marin . . . . 354
2.1.2. Observations interspcifiques . . . . . . . . . . . . . . . . 355
2.2. La dstabilisation de la membrane lysosomale . . . . . . . . 356
2.2.1. Rponses de la membrane lysosomale
aux paramtres du milieu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358
2.2.2. Rponses de la membrane lysosomale
aux stress anthropiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
2.3. La croissance : un signal physiologique,
intgrateur des dysfonctionnements . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
2.3.1. Les paramtres du milieu : exemples
de leur influence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
2.3.2. Le potentiel de croissance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 360
3. Signalisation cellulaire de la reproduction et de ses
dysfonctionnements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
3.1. La gamtogense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362
3.1.1. Le dveloppement des ovocytes . . . . . . . . . . . . . . 362
3.2. Lenzyme aspartate transcarbamylase . . . . . . . . . . . . . . . . 362
3.2.1. Utilisation de lATCase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363
3.3. Rgulation de la gamtogense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363
3.4. La strodogense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364
3.4.1. Relations entre la disponibilit des rserves
nergtiques et la rgulation endocrinienne
de la maturation des gonades . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
3.4.2. Le rle physiologique des strodes
chez les mollusques bivalves . . . . . . . . . . . . . . . . . 366
3.5. Rle de la vitellognine et des protines associes . . . . . 366
3.5.1. La vitellogense chez les invertbrs . . . . . . . . . . . 366
xviii cotoxicologie molculaire

4. Les perturbateurs endocriniens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367


4.1. Problmatique gnrale des perturbateurs
endocriniens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367
4.2. Le cas des xno-strognes dans lenvironnement . . . . 369
4.2.1. Identification et mode daction . . . . . . . . . . . . . . . . 369
4.2.2. Prsence en milieu aquatique . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
4.3. Utilisation de la vitellognine comme
signal dexposition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370
4.4. Autres effets associs lexposition
aux xno-strognes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
4.5. Les anti-strognes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372
5. Signalisation cellulaire
en milieu marin : rsultats rcents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
5.1. Variation de la maturation sexuelle chez Mya arenaria
dans le fjord du Saguenay (Qubec) :
exposition des perturbateurs endocriniens ? . . . . . . . . . 373
5.1.1. Relations entre les rserves nergtiques
et la maturation des gamtes . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
5.2. Effets du tributyltain sur la reproduction
des mollusques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
6. Rle de la progestrone dans la maturation sexuelle :
rsultats rcents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378
7. Effets des perturbateurs endocriniens
sur lenzyme aspartate transcarbamylase . . . . . . . . . . . . . . . . . 383
7.1. Cas du tributyltain (TBT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383
7.1.1. Rsultats rcents sur lATCase
chez Mya arenaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
7.1.2. Les acquis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386
8. Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386
8.1. Lintgration de signaux molculaires et cellulaires . . . . 386
8.2. Utilisation de Mya arenaria comme organisme
sentinelle dans le cas dexposition
des xno-strognes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387
9. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 388
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390
Table des matires xix

Chapitre 9
Biomarqueurs immunologiques appliqus
lcotoxicologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
Michel Fournier, Alain Lalancette, Lucie Mnard,
Marie-Soleil Christin-Pich, Sylvain De Guise et Pauline Brousseau
Rsum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
1. Considrations gnrales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403
1.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403
1.2. Diversit des effets immunotoxiques . . . . . . . . . . . . . . . . 403
1.3. Procdures dvaluation toxicologique
et prvision dimmunotoxicit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
1.4. Principes dune exploration immunotoxicologique . . . . 405
1.5. valuation du risque en immunotoxicologie . . . . . . . . . . 406
2. Immunotoxicologie des invertbrs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407
2.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407
2.2. Rponses immunitaires non spcifiques . . . . . . . . . . . . . . 408
2.2.1. La phagocytose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408
2.2.2. Lactivit des cellules NK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409
2.3. Rponses immunitaires spcifiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410
2.3.1. Rponse mdiation cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . 410
2.3.2. Rponse mdiation humorale . . . . . . . . . . . . . . . 411
2.3.3. Les cytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
2.4. Les biomarqueurs immunologiques
chez les invertbrs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
2.4.1. Les marqueurs immunologiques
chez les annlides oligochtes . . . . . . . . . . . . . . . . 411
2.4.2. Biomarqueurs immunologiques
chez les mollusques bivalves . . . . . . . . . . . . . . . . . 415
2.5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
3. Immunotoxicologie des amphibiens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
3.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
3.2. La structure du systme immunitaire . . . . . . . . . . . . . . . . 422
3.2.1. Le thymus et les lymphocytes T . . . . . . . . . . . . . . . 422
3.2.2. La rate et les lymphocytes B . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422
3.2.3. Autres organes lymphodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
3.3. Limmunit inne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
3.4. Limmunit acquise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424
3.4.1. Le complexe majeur dhistocompatibilit . . . . . . . 424
3.4.2. Les immunoglobulines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424
3.4.3. La diversit des anticorps
dans la rponse humorale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425
xx cotoxicologie molculaire

3.5. La tolrance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425


3.6. Les changements dans le systme immunitaire
lors de la mtamorphose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426
3.7. Sensibilit des amphibiens diffrents pathognes
lors de la mtamorphose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426
3.8. Effets toxiques des produits chimiques
sur le systme immunitaire des amphibiens . . . . . . . . . . 427
3.9. Effets immunotoxiques dun mlange
de pesticides sur les grenouilles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
4. Discussion et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431
5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434

Glossaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451

Auteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 457
Table des matires xxi
LISTE DES
FIGURES

Figure 1.1 Schma gnral montrant la spciation


chimique des mtaux en solution . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Figure 1.2 Modle conceptuel des interactions


entre les mtaux et les organismes aquatiques . . . . . . 21

Figure 1.3 Prise en charge de mtaux par des organismes


aquatiques mcanismes gnraux . . . . . . . . . . . . . . . 23

Figure 1.4 Schma gnral des courbes dose-rponse


typiquement observes chez un organisme vivant
pour i) un macro-lment nutritif (p. ex., Ca) ;
ii) un micro-lment nutritif (p. ex., Cu) ;
et iii) un lment toxique non essentiel (p. ex., Pb) . . 35

Figure 1.5 Liens entre lexposition aux mtaux,


leur prise en charge, leur dtoxication,
et la manifestation deffets dltres . . . . . . . . . . . . . . . 38

Figure 1.6 Structure tridimensionnelle des deux domaines


de chlation mtallique de la mtallothionine 2a
du foie de lapin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Figure 1.7 Modle de synthse et de dgradation


de la mtallothionine lchelle cellulaire . . . . . . . . . 46
xxii cotoxicologie molculaire

Figure 1.8 Changements dans les concentrations dhmocyanine,


de cuivre et de zincthionine dans lhpatopancras
du crabe bleu Callinectes sapidus
au cours de son cycle de mue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Figure 2.1 Effet de lintroduction dun mtal toxique


dans lenvironnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

Figure 2.2 Approche cotoxicologique intgre . . . . . . . . . . . . . . 72

Figure 2.3 Modles de cytotoxicit (ou de dbordement)


cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Figure 2.4 Concentration de mtallothionine . . . . . . . . . . . . . . . . 81

Figure 2.5 Ractions des populations de bivalves


au niveau de contamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

Figure 2.6 Productivit des populations de bivalves


en fonction de la contamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Figure 3.1 Mtabolisme des organismes


prototrophiques arobies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Figure 3.2 Voie catabolique oxydative du biphnyle


et des chlorobiphnyles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

Figure 3.3 Structure probable du centre Rieske . . . . . . . . . . . . . . . 124

Figure 3.4 Mode dhydroxylation et proprits catalytiques des


dioxygnases du biphnyle des souches B-356, KF707
et LB400 envers les congnres chlorobiphnyles . . . 126

Figure 3.5 Comparaison des squences en acides amins


des portions C-terminales des chanes 
des dioxygnases du biphnyle des souches
LB400, B-356 et KF707 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

Figure 3.6 Modes dattaque du 2,2'-dichlorobiphnyle


par la dioxygnase du biphnyle de LB400 . . . . . . . . . 130

Figure 3.7 volution molculaire par recombinaison


in vitro alatoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

Planche 1 Colonies induites de E. coli exposes


aux vapeurs de biphnyle
Liste des figures xxiii

Figure 3.8 Constructions dhybrides entre la dioxygnase


de la souche LB400 et celle de la souche B-356
et leur activit envers le biphnyle . . . . . . . . . . . . . . . . 138

Figure 3.9 Potentiel catalytique et alignements des squences


de variants de la dioxygnase du biphnyle obtenus
par recombiaison in vitro alatoire . . . . . . . . . . . . . . . . 141

Figure 3.10 Mcanisme dinhibition de la 2,3-dihydroxybiphnyle


1,2-dioxygnase par le 3-chlorocatchol . . . . . . . . . . . . 145

Figure 4.1 Niveaux dorganisation anatomique


et fonctionnelle de laxe HHI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

Figure 4.2 Lorganisation cellulaire du tissu interrnal


chez le poisson tlosten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

Figure 4.3 Voies signaltiques de la synthse du cortisol


dans la cellule strodognique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

Figure 4.4 Sites chantillonns dans ltude cotoxicologique


de la perchaude Perca flavescens dans la rgion
minire de Rouyn-Noranda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Figure 4.5 Le bioessai utilis pour valuer in vivo


et in vitro la toxicit adrnale chez les poissons
et les amphibiens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

Figure 4.6 Enzymes impliques dans la dfense oxydative . . . . . 183

Figure 4.7 Effet dune exposition in vitro lendosulfan


sur la scrtion de cortisol par les cellules
corticostrodogniques de la truite arc-en-ciel. . . . . . 185

Figure 5.1 Structure gnrale des rtinodes . . . . . . . . . . . . . . . . . 200

Figure 5.2 Schma gnral des interactions


concernant les rtinodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

Figure 5.3 tude sur les colonies de grands hrons nichant


le long du fleuve Saint-Laurent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235

Figure 5.4 Chromatogrammes par HPLC des extraits de foie


desturgeons jaunes, Acipenser fulvescens,
provenant du fleuve Saint-Laurent
et de la rgion dAbitibi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
xxiv cotoxicologie molculaire

Figure 5.5 Proportions (A) et concentrations (B)


de rtinodes hpatiques pour lesturgeon jaune,
Acipenser fulvescens, du fleuve Saint-Laurent
et de la rgion dAbitibi (site de rfrence) . . . . . . . . . 243

Figure 6.1 Structures chimiques du benzo(a)pyrne (BaP)


et du chlorure de tributyltain (TBTCl) . . . . . . . . . . . . 263

Figure 6.2 Schma gnral du mtabolisme


des xnobiotiques chez le poisson . . . . . . . . . . . . . . . . 265

Figure 6.3 Processus de bioactivation du BaP en un mtabolite


cancrogne (+)-anti-BaPDE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267

Figure 6.4 Effets interactifs du BaP et du TBT sur lactivit


de lEROD hpatique (UF/min/mg de protine) . . . . 272

Figure 6.5 Effets interactifs du BaP et du TBT


sur lactivit de la GST hpatique
(nmol/min/mg de protine) dans le foie . . . . . . . . . . . 275

Figure 6.6 Effets interactifs du BaP et du TBT sur le contenu


en GSH (nmol/g de tissu) dans le foie . . . . . . . . . . . . . 276

Figure 6.7 Coupes microscopiques (5m) du foie de


Salvelinus alpinus expos 6doses successives,
soit de TBT, soit de BaP, ou encore de TBT + BaP,
colores lhmatoxyline et losine
(agrandissement 400). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278

Figure 6.8 Distribution des aires non colores du cytoplasme . . 280

Figure 7.1 Reprsentation schmatique des interactions


intercellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304

Figure 7.2 Principales molcules dadhrence intercellulaire


et leur implication dans le processus squentiel
de migration cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307

Figure 7.3 Reprsentation schmatique


dune plaque jonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316

Figure 7.4 Reprsentation schmatique de linsertion dune


connexine au sein de la membrane plasmatique . . . . 319
Liste des figures xxv

Figure 7.5 Reprsentation schmatique du complexe


cadhrine-catnine dans une cellule pithliale . . . . . 331

Figure 7.6 Reprsentation schmatique de la voie


de signalisation Wnt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333

Figure 8.1 Suivi des processus oxydants chez Mya arenaria


via lactivit catalasique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

Figure 8.2 Suivi des processus oxydants chez Mya arenaria


autant en milieu naturel que transplants
dans les msocosmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357

Figure 8.3 Exemple de rponses du potentiel de croissance


(Scope for growth) chez Mya arenaria
et Mytilus edulis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358

Figure 8.4 Exposition de Mya arenaria et de Mytilus edulis


du TBT via du phytoplancton contamin . . . . . . . . . 361

Figure 8.5 Profil des variations de la maturation sexuelle


de Mya arenaria dans le fjord du Saguenay . . . . . . . . . 374

Figure 8.6 Profil saisonnier des variations


des concentrations en glycogne de Mya arenaria
dans le fjord du Saguenay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375

Figure 8.7 Profil des variations des concentrations en protines


apparentes aux vitellines dans lhmolymphe
de Mya arenaria dans le fjord du Saguenay . . . . . . . . . 376

Figure 8.8 Frquence des diffrents stades de maturation


sexuelle chez Mya arenaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380

Figure 8.9 Profil de la progestrone chez Mya arenaria . . . . . . . . . 381

Figure 8.10 Influence du TBT sur lactivit de lATCase


gonadique de Mya arenaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385

Figure 9.1 Diagramme de points de la dispersion en taille (FSC)


et en complexit (SSC) dune population
dhmocytes de myes (Mya arenaria) . . . . . . . . . . . . . . 417
xxvi cotoxicologie molculaire
Table des matires xxvii
LISTE DES
TABLEAUX

Tableau 1.1 Comparaison cotoxicologique entre les mtaux


traces et les micro-polluants organiques . . . . . . . . . . . 12

Tableau 1.2 Classification des lments mtalliques


dans un contexte environnemental . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Tableau 1.3 Spciation chimique des mtaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Tableau 1.4 Spciation inorganique typique de quatre mtaux


traces (Cd, Cu, Pb, Zn) dans les eaux
douces oxyques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Tableau 1.5 Proprits chimiques des substances humiques


et processus biogochimiques reconnus
qui y sont associs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Tableau 1.6 Influence de la matire organique dissoute (MOD)


naturelle sur la biodisponibilit des mtaux . . . . . . . . 32

Tableau 1.7 Facteurs physiologiques et exprimentaux


entranant linduction de mtallothionine
chez les mammifres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Tableau 1.8 tudes montrant le rle des mtallothionines


dans lacquisition de tolrance accrue aux mtaux . . 50

Tableau 2.1 Relations entre la MT chez diffrentes espces


dinvertbrs et le niveau de cadmium
dans le milieu (Cd2+) et dans les organismes
(Cd dans le corps entier ou les branchies) . . . . . . . . . . 74
xxviii cotoxicologie molculaire

Tableau 2.2 Mthodes de mesure de la contamination


au cadmium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

Tableau 2.3 Concentrations de cadmium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

Tableau 2.4 Mthodes de mesure des variables


dmographiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

Tableau 2.5 Caractristiques dmographiques


dans les lacs slectionns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

Tableau 2.6 Caractristiques morphomtriques et limnologiques


des 9 lacs slectionns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Tableau 2.7 Effets de la contamination du milieu


sur les populations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

Tableau 3.1 Quantit de substrat consomm 5 min


aprs le dbut de la raction enzymatique . . . . . . . . . 128

Tableau 3.2 Activit de dioxygnases hybrides purifies


par chromatographie daffinit de protines
recombinantes portant une tiquette Histidine . . . . . 137

Tableau 4.1 Concentrations tissulaires en mtaux (g/g poids sec)


de la perchaude, Perca flavescens, prleve
dans la rgion minire de lAbitibi . . . . . . . . . . . . . . . . 172

Tableau 4.2 Sensibilit de cellules adrnocorticales de la truite


aux mtaux et pesticides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

Tableau 5.1 Effets des contaminants sur le stockage


de rtinodes majeurs au niveau du foie . . . . . . . . . . . 213

Tableau 5.2 Effets des organochlors sur lactivit


de lARAT, de la LRAT et de la HER . . . . . . . . . . . . . . . 224

Tableau 5.3 Rsum des rsultats chez la population de lesturgeon


jaune, Acipenser fulvescens, du fleuve Saint-Laurent
comparativement aux sites de rfrence . . . . . . . . . . . 239

Tableau 6.1 Effets du TBT sur la concentration biliaire


de mtabolites du BaP (g/mg de protine) . . . . . . . . 273

Tableau 6.2 Effets du TBT sur la formation in vivo des adduits


lalbumine (Alb), la globine (Gb) et lADN
(pg BaP ttrol I-1/mg de macromolcule) . . . . . . . . . . 274
Liste des tableaux xxix

Tableau 6.3 Effets du BaP sur la concentration biliaire


des composs butyltains (ng Sn/g de bile) . . . . . . . . 277

Tableau 6.4 Nature et incidence des effets morphologiques


observs dans le foie de Salvelinus alpinus expos
six doses de TBT, de BaP, ou de TBT + BaP . . . . . . . . 279

Tableau 7.1 Liste des connexines identifies ce jour


chez les mammifres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317

Tableau 7.2 Liste des connexines identifies ce jour


chez les vertbrs aquatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318

Tableau 8.1 Rcapitulatif des effets observs sur diffrentes


espces exposes aux perturbateurs endocriniens . . . 368

Tableau 9.1 Concentrations inhibant de 50 % la phagocytose


effectue par des hmocytes de myes (Mya arenaria)
et des clomocytes de vers (Lumbricus terrestris)
exposs divers mtaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414

Tableau 9.2 Concentrations inhibant de 50 % la phagocytose


effectue par des hmocytes de myes (Mya arenaria),
de moules bleues (Mytilus edulis) et de mactres
(Spisula polynima) exposs divers composs de
butyltain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418
xxx cotoxicologie molculaire
Table des matires xxxi

1
ABRVIATIONS
17b-HSD 17b-hydroxystrode dshydrognase-isomrase
2,4,5-T Acide 2,4,5-trichlorophnoxyactique
2,4-D Acide 2,4-dichlorophnoxyactique
3b-HSD 3b-hydroxystrode dshydrognase-isomrase
4-NP 4-nonylphnol
Actyl CoA Actyl coenzyme A
ACTH Hormone adrnocorticotropique
ADN Acide doxyribonuclique
ADN Acide dsoxyribonuclique
AgNO3 Chlorure dargent
AH + AF Acides humiques et acides fulviques
AHH Aryl-hydrocarbone-hydroxylase
Ahr Aryl hydrolase
Alb Albumine
ALP Phosphore labile en milieu alcalin
AMPc Adnosine monophosphate cyclique
APC Suppresseur de tumeurs de polypose rtro-colique familiale
(adenomatous polyposis coli tumor suppressor)
APs Alkylphnols
ARAT Acyl-coenzyme A rtinol-acyltransfrase
ARN Acide ribonuclique
ASE Anse Saint-tienne
ATCase Aspartate transcarbamylase
BaP Benzo(a)pyrne
BaPDE Benzo(a)pyrne-7,8-diol-9,10-poxyde
BE Baie ternit
BKME Effluents dusine de pte kraft blanchie
(bleached Kraft pulp mill effluents)
BLM Modle du ligand biotique (Biotic Ligand Model)
BPB Biphnyles polybroms
BPC Biphnyles polychlors
C Sest Carbone dans le seston < 80 m
CAT Catalase
CCF-1 Facteur cytolytique clomique de type 1
(coelomic cytolytic factor-1)
CdCl2 Chlorure de cadmium
Cd-FPM Cadmium li aux ligands de faible poids molculaire
Cd-HPM Cadmium li aux ligands de haut poids molculaire
xxxii cotoxicologie molculaire

Cd-MT Cadmium li aux protines sapparentant aux


mtallothionines
CE50 Concentration efficace 50 %
CH3HgCl Chlorure de mthyl mercure
Chl.a Chlorophylle a
CI10 Concentration requise pour obtenir 10 % dinhibition
CI50 Concentration requise pour obtenir 50 % dinhibition
CL50 Concentration ltale 50 %
CMH-I Complexes dhistocompatibilits majeurs de classe I
CMH-II Complexes dhistocompatibilits majeurs de classe II
CNRC Conseil national de recherches du Canada
COD Carbone organique dissous
CRABP Cellular Retinoic Acid-Binding Protein
CRBP Cellular Retinol-Binding Protein
CuCl2 Chlorure de cuivre
Cx Connexine
CYP Cytochrome P450
DbcAMP Dibutiryle AMP cyclique
DBT Dibutyltain (C4H9)2Sn(IV)
DDT 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophnyl)thane
DEN Dinotrosamine
DMF N,N-dimthylformamide
DMSO Dimthylsulfoxyde
DSh Protine dishevel
E-Cad Cadhrine pithliale
ECOD 7-thoxycoumarine-O-dthylase
EDTA thylnediamine-ttraactate
EE2 thynyloestradiol
EIT lments inhibiteurs de transcription
ELAM Molcule dadhsion des leucocytes lendothlium
(endothelial leukocyte-adhesion molecule)
ELISA Immuno-absorption enzymatique
(enzyme-linked immunosorbent assay)
ER Rcepteur strognique
ERE Composante ractive aux estrognes
ERO Espces ractives de loxygne
EROD 7-thoxyrsorufine-O-dthylase
ESEE tude de suivi des effets sur lenvironnement
FAD Flavine adnine dinuclotide
Abrviations xxxiii

FGF Facteur de croissance fibroblastique (fibroblast growth factor)


Frz Rcepteur frizzle
Gb Globine
GC-MS Chromatographie en phase gazeuse couple
une spectromtrie de masse
GJIC Communication intercellulaire via les jonctions lacunaines
(gap junctional intercellular communication)
GPx Glutathion peroxydase
GR Glutathion rductase
GSH Glutathion
GSK Synthtase de glycogne
GST Glutathion S-transfrase
HAP Hydrocarbures aromatiques polycycliques
HCB Hexachlorobenzne
HER Hydrolase des esters du rtinol
HgCl2 Chlorure de mercure
HHA Hydrolase des hydrocarbures aromatiques
HOPDA Acide 2-hydroxy-6-oxo-6-phnylhexa-2,4-dinoque
ICAM Molcule dadhrence intercellulaire
(intercellular adhesion molecule)
Ig Immunoglobuline
IGF Facteur de croissance semblable linsuline
(insulin-like growth factor)
IL Interleukine
IPTG Isopropyl--D-thiogalactopyranoside
K Constante du taux de croissance instantane
K-Cad Cadhrine rnale
KOW Coefficient de partage octanol/eau
L Longueur asymptotique thorique
LC-MS Chromatographie en phase liquide couple la spectromtrie
de masse
LECAM Molcule dadhrence cellulaire des leucocytes lendothlium
(leukocyte-endothelial cell adhesion molecule)
L-FPM Ligands de faible poids molculaire
L-HPM Ligands de haut poids molculaire
LOEL Effet observ dose faible
LPS Lipopolysaccharide
LRAT Lcithine rtinol-acyltransfrase
LVn Lipovitellines
MBT Monobutyltain (C4H9)Sn(IV)
xxxiv cotoxicologie molculaire

MDA Malondialdhyde
MDCK Cellules rnales de chien Mardin-Darby (Mardin-Darby dog kidney)
MFO Oxygnas fonction mixte (mixed function oxygenase)
MIL Modle de lion libre
MoCl4 Chlorure de molybdne
MOD Matire organique dissoute
MT Mtallothionine
MTF-1 Facteur de transcription impliqu dans linduction
de la synthse de la mtallothionine
Mz+ Ion mtallique libre (incluant sa sphre dhydratation)
N Sest Azote dans le seston < 80 m
NAD Nicotinamide adnine dinuclotide
NADP Nicotinamide adnine dinuclotide phosphate
NADPH Dihydronicotinamide adnine dinuclotide phosphate
NiCl2 Chlorure de nickel
NK Celllule tueuse naturelle (natural killer)
NOAEL Dose sans effet nfaste observ
(no observable adverse effect level)
NOEL Pas deffet observ
NP Nonylphnol
NP1EC Acide nonylphnoxyactique
NP2EC Acide nonylphnoxythoxyactique
NPxEO Nonylphnolpolythoxylates
NTA Nitrilotriactate
o,pDDE o,p-dichlorodiphnyldichlorothylne
o,pDDT o,pdichlorodiphnoltrichlorthane
OFM Oxygnases fonction mixte
OP Octylphnol
P/B Ratio Production/Biomasse
P450 Cytochrome P-450
PbCl2 Chlorure de plomb
P-Cad Cadhrine placentaire
PCB Pentachlorobiphnyle
PCDD Dibenzopolychlors (polychlorinated dibenzodioxin)
PCDF Dibenzofuranes (polychlorinated dibenzofuran)
PCP Pentachlorophnol
PCR Raction de polymrisation en chane
PHMB Para-hydroxymercuribenzoate
PMN Cellules polymorphonucles
Abrviations xxxv

POP Polluants organiques persistants


Protine StAR Steroidogenic Acute Regulatory Protein
RAG Enzymes de recombinaison dactivation des gnes
(recombination activating genes enzyme)
RAG All-trans-rtinoylglucuronide
RAR Rcepteurs de lacide rtinoque
RBP Retinol-binding Protein
RNI Intermdiaires ractifs dazote (reactive nitrogen intermediates)
ROI Intermdiaires ractifs doxygne (reactive oxygen intermediates)
RXR Rcepteurs X des rtinodes
slectine-Ec Slectine-E circulante
SH Groupes thiol
SNC Systme nerveux central
SOD Super oxyde dismutase
TBT Tributyltain (C4H9)3Sn(IV)
TCB Ttrachlorobiphnyle
TCCD 2,3,7,8-dichlorodibenzo-dioxine
TCDD 2,3,7,8-ttrachlorodibenzo-p-dioxine
TCDD-EQ quivalences toxiques en TCDD
TdT Transfrase-terminale (terminal deoxynucleotidyl transferase)
TGF- Facteur de croissance de transformation bta
(transforming growth factor )
TNF Facteur de ncrose des tumeurs (tumor necrosis factor)
TNT Trinitrotolune
TTR Transthyrtine
UDP-GT Uridine diphosphoglucuronyltransfrase
UMP Uridine monophosphate
VCAM Molcule dadhrence vasculaire (vascular adhesion molecule)
VLA Gne dactivation tardive (very late antigen)
ZnCl2 Chlorure de zinc
ZO Zona occludens
-BHC Gamma benzene hexachlorure
xxxvi cotoxicologie molculaire

CHAPITRE

INTRODUCTION
lcotoxicologie molculaire

MILIEN PELLETIER
Universit du Qubec Rimouski,
Institut des sciences de la mer de Rimouski

PETER G.C. CAMPBELL


Universit du Qubec,
INRS Eau, Terre et Environnement

FRANCINE DENIZEAU
Universit du Qubec Montral,
Dpartement de chimie et biochimie
2 cotoxicologie molculaire

Lcotoxicologie se dfinit de faon concise comme tant la science qui traite


de limpact des composs chimiques sur les cosystmes. Cette science, qui
intgre la chimie, la toxicologie et lcologie, a fait ses premiers pas il y a
un peu plus de trente ans lorsque le professeur Ren Truhaut a dfini
cette nouvelle discipline comme une branche de la toxicologie concerne
par ltude des effets toxiques causs par les polluants sur les constituants
des cosystmes (voir Truhaut, 1977). Cest effectivement au cours des
annes 1970 et au dbut des annes 1980 que les concepts et les mthodes
propres lcotoxicologie se sont peu peu dvelopps, donnant lieu la
publication de plusieurs ouvrages qui cherchaient de plus en plus
intgrer les diffrents savoirs disciplinaires en une approche fonctionnelle
portant la fois sur leffet des contaminants sur les cosystmes et sur le
rle des cosystmes eux-mmes dans le devenir des contaminants (Butler,
1978 ; Moriarty, 1983 ; Nrnberg, 1984 ; Ramade, 1979). Louvrage de Levin
et ses collaborateurs, publi en 1989, nous parat particulirement impor-
tant parce quil fournit une excellente synthse de lavancement des
connaissances la fin des annes 1980 et surtout parce que les auteurs
abordent la question de lcotoxicologie prdictive par lintgration de
rsultats exprimentaux des modles cologiques comportant des bases
mathmatiques solides avec une bonne comprhension du comportement
physico-chimique des composs chimiques dans lenvironnement.
Lapproche de la fugacit dveloppe par le professeur Donald Mackay
lUniversit de Toronto en est un exemple exceptionnel montrant
comment des connaissances trs disciplinaires en physique et chimie
peuvent servir dcrire le comportement complexe des composs chi-
miques dans les diffrents compartiments de lenvironnement (Mackay,
1991).
Lide dutiliser des microcosmes (ou msocosmes selon leur taille)
pour obtenir des donnes exprimentales en cotoxicologie provient
dabord des cologistes marins qui ont cherch reproduire petite chelle
des phnomnes difficiles observer en pleine mer (Grice et Reeve, 1980).
Le Marine Ecosytem Research Laboratory (MERL) a t pendant les
annes1980 le haut lieu de la recherche sur le comportement des sub-
stances chimiques en prsence dorganismes marins plus ou moins orga-
niss en populations et communauts plagiques ou benthiques (Gearing
et Gearing, 1983). Des microcosmes deau douce ont aussi t dvelopps
pour comprendre les mcanismes de bioaccumulation et les effets de
contaminants chez les invertbrs et les poissons (Boudou et Ribeyre, 1989).
Plusieurs ouvrages publis depuis les annes 1990 ont mis laccent
sur lvaluation des impacts des contaminants sur les cosystmes et sur
les risques pour les humains et les organismes de vivre en contact avec
des environnements pollus (Landis et Yu, 1995 ; Wright et Welborn, 2002).
Ainsi, la seconde dition de limposant ouvrage de Gary Rand sur la
Introduction 3

toxicologie aquatique (Rand, 1995) consacre maintenant quinze chapitres


(350 pages) lvaluation des risques environnementaux alors que la pre-
mire dition (Rand et Petrocelli, 1985) nen comportait que quatre (62
pages), preuve tangible des progrs enregistrs en matire de lgislation
et de mthodes de caractrisation du risque associ la contamination
des cosystmes. Ces mthodes ont progress parce que notre compr-
hension des mcanismes fondamentaux qui rgissent les modes daction
des composs chimiques sur les processus vitaux a progress et que des
bioindicateurs qui permettent de poser un diagnostic environnemental
de qualit ont t dvelopps. Le dveloppement dune cotoxicologie
applique lvaluation des risques et au suivi de la sant des cosys-
tmes passe par la mise au point doutils de diagnostic la fois sensibles
et pertinents au plan cologique (Huggett etal., 1992). Ces outils sont le
plus souvent regroups sous le vocable de biomarqueurs et diviss en
sous-groupes en fonction de lutilisation quon veut en faire, soit pour
dterminer les niveaux dexposition (bioaccumulation de xnobiothiques
ou formation de mtabolites), soit pour caractriser les effets toxiques
partir du niveau cellulaire jusquau niveau dun cosystme entier. Il
nexiste pas de biomarqueur universel qui fournirait ltat de sant dun
cosystme donn ou mme dune population spcifique au sein dun co-
systme. La solution prconise en sant environnementale, tout comme
dailleurs en sant humaine, est lutilisation dune batterie de tests (ou
marqueurs biologiques) qui permette au clinicien environnemental de
dtecter la prsence dun ou plusieurs stresseurs et den dterminer les
effets sur des individus, des populations et des communauts.
Notre ouvrage sur lcotoxicologie molculaire se prsente comme une
suite logique aux travaux fondamentaux entrepris au cours des annes
1990 (Malins et Ostrander, 1993) sur les mcanismes biochimiques et cel-
lulaires faisant intervenir une ou plusieurs substances chimiques, parti-
culirement les mtaux et les petites molcules organiques ayant un
caractre persistant dans lenvironnement. Les chapitres de ce livre ont
t ordonns de faon montrer le passage progressif dune approche
mcanistique de nature chimique et biochimique une approche de nature
plus toxicologique aux niveaux cellulaire et tissulaire.
Les deux premiers chapitres proviennent de lquipe de chercheurs
dirige par les professeurs Peter G.C. Campbell, Bernadette Pinel-Alloul
et Ladis Hare qui uvre depuis dj plusieurs annes comprendre
laction toxicologie des mtaux chez les organismes aquatiques et relier
la prsence de certains mtaux traces, comme le cadmium dans des lacs
du nord du Qubec, des indicateurs dexposition et deffets toxiques
chez les bivalves indignes. On trouve dans le premier de ces deux textes
une analyse approfondie des mcanismes dinteraction chimique et
biochimique des mtaux avec la cellule vivante et sur les outils dont
4 cotoxicologie molculaire

dispose cette cellule pour contrler son environnement intracellulaire et


se dfendre contre lintrusion des ions mtalliques. Les rles de rgula-
tion et de dfense cellulaire dvolus de la mtallothionine y sont discuts
dans une perspective dutilisation de cette protine comme biomarqueur
dexposition aux mtaux. Le deuxime texte dcrit une application sur le
terrain de loutil mtallothionine chez un bivalve deau douce,
Pyganodon grandis, choisi comme espce sentinelle. La prsence dun gra-
dient de contamination en cadmium entre une dizaine de lacs de la rgion
de Rouyn-Noranda au nord du Qubec offre un cadre exprimental excep-
tionnel permettant de relier la prsence du cadmium ltat de sant
gnral des moules et la mise en place de leurs moyens de dfense
cellulaires.
Le troisime chapitre, prpar par le professeur Michel Sylvestre et
son quipe de recherche de lINRS-Institut Armand-Frappier, aborde le
sujet trs novateur de la biologie molculaire applique lcotoxicologie.
Les auteurs montrent les progrs trs rcents et prometteurs dune tech-
nique appele volution molculaire in vitro par recombinaison ala-
toire . Cette technique reproduit lchelle molculaire ce que lvolution
a ralis sur des millions dannes et ouvre la porte des modifications
gntiques qui permettront par exemple de transformer des bactries pour
les rendre capables de dgrader des contaminants encore rcalcitrants aux
attaques enzymatiques. La diffrence essentielle avec les mthodes clas-
siques de slection des souches actives est que lvolution des nouveaux
gnes se fait beaucoup plus rapidement que par slection naturelle. Cette
approche ainsi que dautres mthodes en ingnierie molculaire sont
dcrites en dtail et appliques au cas des biphnyles polychlors (BPC)
ainsi que dautres composs organiques persistants. Cette approche
mcanistique est fascinante, car elle montre les voies dapplication de la
gnomique et de la protomique aux problmatiques environnementales.
Les auteurs discutent aussi trs franchement des risques rels que
pourraient reprsenter les organismes gntiquement modifis.
Le quatrime chapitre est aussi un texte nettement orient sur les
mcanismes chimiques et biochimiques au niveau cellulaire qui sinscrit
dans une suite logique avec les chapitres prcdents. La question des per-
turbateurs endocriniens a t et reste au cur de lactualit environne-
mentale puisque de nombreux xnobiotiques sont capables daffecter le
systme endocrinien et par consquent dagir plusieurs niveaux dorga-
nisation tant anatomique que fonctionnelle, aussi bien chez le poisson que
chez les invertbrs. Le texte de la professeure Hontela et de son collabo-
rateur nous prsente une synthse des travaux les plus rcents sur la
dfaillance cortisolique induite entre autres par les mtaux, ainsi que sur
les stress oxydatifs provoqus par la prsence de nombreux contaminants
Introduction 5

organiques. Ces travaux ont men les chercheurs proposer lutilisation


de biomarqueurs hormonaux sur le terrain afin de dtecter la prsence et
laction des perturbateurs anthropiques. Les auteurs montrent les dif-
ficults que prsente linterprtation des rsultats fournis par ces
biomarqueurs dans un contexte environnemental o des dizaines de
substances peuvent agir simultanment et o les organismes peuvent et
doivent sadapter leur environnement.
Le chapitre 5, propos par le professeur Spear et ses collaborateurs,
nous plonge dans la chimie et la biochimie des rtnodes, petites mol-
cules essentielles plusieurs fonctions biologiques dont la diffrenciation
cellulaire et la vision. Or, le mtabolisme des rtnodes est sensible la
prsence des contaminants environnementaux et une carence en rtnodes
est considre comme dommageable pour la sant des organismes aqua-
tiques. Ce texte prsente une revue trs exhaustive sur le stockage des
rtnodes chez diverses espces animales et montre comment ce stoc-
kage peut tre utilis comme un biomarqueur dexposition sensible la
prsence de contaminants lipophiles persistants ou non chez les oiseaux
et les poissons. La deuxime partie du chapitre nous entrane vers
lcotoxicologie applique en dcrivant comment les rtnodes ont t
utiliss dans lapplication de grands programmes de surveillance
environnementale sur les Grands Lacs et le fleuve Saint-Laurent au cours
des annes 1980 et 1990.
Tout en restant fermement ancr au monde des indicateurs chimiques
et biochimiques, le chapitre 6, prpar par le professeur Pelletier et ses
collaborateurs, nous prsente un exemple dinteractions multiples en
cotoxicologie, un secteur de connaissances encore peu explor mais
combien important quand vient le temps dinterprter des rsultats de
biomarqueurs dexposition pouvant rpondre simultanment des
stresseurs ayant des actions synergiques ou antagonistes. Ce chapitre pr-
sente les rsultats rcents de deux expriences in vivo o des salmonids
ont t exposs simultanment au benzo(a)pyrne (BaP) et au tributyltain
(TBT) dont les actions individuelles sur le cytochrome P450 sont dj bien
documentes. Le texte montre comment une batterie de biomarqueurs,
allant de lactivit de lEROD jusquaux microlsions hpatiques en pas-
sant par les adduits lADN, peut tre utilise pour quantifier les effets
antagonistes ou synergiques du BaP et du TBT et surtout pour comprendre
les mcanismes biochimiques qui sous-tendent ces effets. Les auteurs pro-
posent une nouvelle approche pour ltude des interactions chimiques
qui passe par la prdiction dinteractions en se basant sur les voies mta-
boliques des polluants et sur leur capacit de moduler lactivit du P450,
le systme enzymatique cl impliqu la fois dans la bioactivation et la
dtoxication des polluants organiques.
6 cotoxicologie molculaire

Le texte suivant, rdig par le professeur Daniel Cyr et son quipe


de lINRS-Institut Armand-Frappier, nous amne examiner les effets des
contaminants environnementaux sur les interactions cellule-cellule, afin
de mieux comprendre les mcanismes de toxicit au niveau cellulaire. Cest
le monde des protines membranaires, comme les slectines et les
intgrines, qui rgissent les interactions entre les cellules du systme immu-
nitaire et des cellules endothliales. Quoiquil existe encore peu de travaux
dans ce domaine particulier, on comprend que toute modulation de la
synthse de ces protines peut entraner dimportantes consquences au
niveau du systme immunitaire. Ce chapitre prsente les dveloppements
les plus rcents en toxicologie cellulaire et cherche comprendre comment
certains xnobiotiques qui agissent sur les jonctions lacunaires peuvent
induire la prolifration cellulaire et le dveloppement de tumeurs. Dans
un deuxime temps, les auteurs dcrivent le rle jou par les cadhrines
dans les jonctions adhrentes entre cellules et montrent comment un mtal
comme le cadmium peut agir sur les cadhrines et ventuellement drgler
les interactions cellule-cellule. Ce chapitre marque une transition entre
les chapitres prcdents, plutt axs sur les mcanismes biochimiques
intra-cellulaires, et les deux chapitres suivants, qui utilisent la signalisa-
tion cellulaire et la rponse du systme immunitaire pour quantifier des
effets toxiques observs sur le terrain.
Le chapitre 8, produit par la professeure Pellerin et son quipe dtu-
diants, illustre fort bien lutilisation des biomarqueurs pour des fins dva-
luation de la sant environnementale de populations de bivalves marins.
La gamme des biomarqueurs utiliss stale de la mesure du stress oxy-
dant jusqu la dtermination histologique des stades de maturation
sexuelle en passant par la stabilit de la membrane lysosomale et les
mesures du potentiel de croissance et des rserves nergtiques permettant
aux organismes de survivre aux multiples stresseurs tant anthropiques
que naturels. Ces travaux montrent que lintgration des signaux mol-
culaires et cellulaires permet de formuler un diagnostic environnemental
pour plusieurs sites marins. Les rsultats obtenus sur le terrain montrent
limportance dune meilleure comprhension de la strodognse et de
la vitellognse chez les bivalves, notamment la mye Mya arenarias, qui
montre un excellent potentiel comme organisme sentinelle de lestuaire
du Saint-Laurent.
Enfin, on ne pouvait prsenter un ouvrage sur lcotoxicologie
molculaire sans y consacrer un chapitre aux effets immunotoxiques des
contaminants et aux mthodes de dtection des diffrentes rponses immu-
nitaires. Sachant que le systme immunitaire est une cible particulirement
importante pour nombre de contaminants environnementaux, il apparat
clairement que tous les niveaux de lorganisation biologique peuvent
Introduction 7

montrer une sensibilit leve la prsence de substances chimiques


capables de moduler lactivit immune et fragiliser le systme de dfense
contre les pathognes. Les auteurs du chapitre 9 ont particulirement port
attention aux biomarqueurs immunologiques chez les invertbrs (acti-
vit des lysosomes, phagocytose, drivs oxygns) et limmunotoxi-
cologie chez les amphibiens, dont le systme immunitaire marque une
transition entre les invertbrs aquatiques et les vertbrs terrestres.
La succession de ces neuf chapitres montre toute la vigueur et la
diversit de la recherche en cotoxicologie dans les universits au Qubec.
On voit une convergence remarquable de tous ces laboratoires et quipes
de recherches approcher lcotoxicologie dun point de vue molculaire
et cellulaire et de chercher comprendre les mcanismes qui rgissent les
interactions entre la matire inerte et le monde vivant, entre les molcules
chimiques et la cellule capable de ragir et se dfendre face son agres-
seur. Sil fallait fournir une dfinition de lcotoxicologie molculaire en
regard du contenu de cet ouvrage, on pourrait probablement avancer que
cette branche de lcotoxicologie traite tout particulirement des mcanismes
fondamentaux de la dfense cellulaire face aux stress du milieu et de lapplication
de la biochimie et de la biologie molculaire aux problmatiques environnementales
complexes auxquelles notre socit est quotidiennement confronte.
Ce livre sadresse aux tudiants des deuxime et troisime cycles et
aux chercheurs du domaine de la toxicologie environnementale et de
lcotoxicologie au sens large. Il se veut une premire tentative dintgra-
tion de travaux trs diversifis en cotoxicologie et montre le dfi qui soffre
aux futurs chercheurs du domaine qui consiste au fond trouver des
causes molculaires et cellulaires des effets qui sobservent lchelle
des populations et des communauts naturelles.
8 cotoxicologie molculaire

RFRENCES
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CHAPITRE

1
PRISE EN CHARGE ET
DTOXICATION DES MTAUX
chez les organismes aquatiques

PETER G.C. CAMPBELL


Universit du Qubec,
INRS Eau, Terre et Environnement

YVES COUILLARD
Environnement Canada,
Division de lvaluation des produits chimiques
10 cotoxicologie molculaire

RSUM
Les espces mtalliques les plus communes dans les eaux naturelles sont de nature hydro-
phile, alors que les barrires biologiques que doivent franchir les mtaux sont plutt de
caractre lipophile. quelques exceptions prs, les mtaux cationiques et leurs complexes
ne peuvent traverser des membranes biologiques par simple diffusion ; au contraire, la
prise en charge (uptake) des mtaux fait gnralement appel au transport facilit, impliquant
des transporteurs protiques intgrs dans la membrane. Trois mcanismes de prise en
charge ont t identifis : i) transport facilit du cation, impliquant soit un transporteur trans-
membranaire protique, soit un canal trans-membranaire ; ii) transport facilit dun com-
plexe mtallique anionique, impliquant un transporteur danions relativement peu slectif
(transport accidentel de lanion + le mtal qui y est associ) ; iii) transport passif, par
simple diffusion, dun complexe mtallique neutre et lipophile (p.ex., HgCl20). Norma-
lement cest la voie (i) qui prdomine ; dans de tels cas le modle du ligand biotique (BLM)
sapplique et la rponse de lorganisme varie en fonction de la concentration de lion
mtallique libre en solution, [Mz+], et de la concentration dautres ions pouvant concourir
avec Mz+ pour le ligand biotique (Ca2+, Mg2+ et H+).
Laction toxicologique dun mtal, une fois accumul, dcoule de son interaction
anormale avec une biomolcule essentielle. Cette liaison dun mtal inappropri des
molcules physiologiquement importantes peut induire des effets dltres de diffrentes
manires : en bloquant des groupements fonctionnels essentiels de la biomolcule (sou-
vent des groupements thiol) ; en dplaant des mtaux essentiels de leurs sites chez la
biomolcule ; en modifiant la conformation (et donc lactivit) de la biomolcule. Dans ce
cadre conceptuel, on peut envisager trois mcanismes de dtoxication : lorganisme
peut agir i) sur le flux dentre (contrle du transport trans-membranaire), ii) sur les ligands
intracellulaires disponibles (nature, concentration et compartimentalisation cellulaire), et
iii) sur les flux de sortie (vers des vacuoles ou vers lextrieur de la cellule). Si lorganisme
emploie le mcanisme (i) et/ou le mcanisme (iii), les teneurs intracellulaires du mtal
seront contrles lintrieur dune gamme troite (cas des organismes rgulateurs ) ;
si la cellule ragit plutt en synthtisant des ligands daffinit approprie (mcanisme
(ii)), qui permettent de squestrer le mtal dans le milieu intracellulaire et de le rendre
non-disponible (p. ex., la mtallothionine, ou MT ), les teneurs intracellulaires en mtal
seront gnralement leves et varieront en fonction de lexposition (cas des organismes
accumulateurs ).
Selon ce modle intgr de toxicit/dtoxication, la dtermination de la spciation
intracellulaire des mtaux pourrait en principe savrer utile pour diagnostiquer ltat
physiologique dun organisme (concept dun biomarqueur deffets). Il sagirait de pouvoir
diffrencier les mtaux lis des biomolcules sensibles de ceux qui ont t squestrs
lintrieur de la cellule sous forme inerte. On approfondit cette ide dans la dernire section
de ce chapitre, en mettant un accent particulier sur la mtallothionine, un peptide reconnu
comme ligand cl pour les mtaux dans le milieu subcellulaire. On passe en revue les
proprits biochimiques, la biosynthse et la dgradation de ce peptide cl, et on consi-
dre ensuite les diverses fonctions cellulaires qui lui ont t attribues, en insistant sur
son rle dans la rgulation des mtaux essentiels, sa protection contre le stress oxydant et
son implication possible dans la dtoxication des mtaux traces.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 11

1. INTRODUCTION
1.1. CONTAMINATION ENVIRONNEMENTALE
En abordant le sujet de la contamination environnementale, il convient
de considrer sparment les contaminants inorganiques (surtout mtaux)
et les (micro)polluants organiques. Ces derniers furent lorigine de la
prise de conscience environnementale des annes 1960 (p. ex., Carson,
1962) et ils sont abondamment tudis depuis ce premier rveil (voir
Sylvestre, chapitre 3). En contraste, la contamination des cosystmes aqua-
tiques par les mtaux a t quelque peu nglige pendant cette priode,
avec lexception vidente du mercure (dont le comportement environne-
mental sapparente celui des contaminants organiques, au moins dans
le cas de sa forme la plus nocive, le mthyl-mercure). On pourrait mme
dire que les micro-polluants organiques ont domin le calendrier
environnemental pendant cette priode. Lapproche rglementaire adopte
par les agences environnementales, avec son accent sur la persistance, la
bioaccumulation et la toxicit (P-B-T) dun produit comme critres
dvaluation du risque, reflte cette dominance.
Lide daborder sparment les contaminants organiques et inor-
ganiques nest pas le rsultat dune simple formule ditoriale. Au con-
traire, il y a de bonnes raisons scientifiques pour considrer sparment
les mtaux et les micro-polluants organiques (tableau 1.1). Il importe de
noter ds le dpart que les mtaux sont naturellement prsents dans la
crote terrestre et quils ne sont ni crs ni dtruits par les activits
humaines (diffrence importante par rapport aux substances xnobiotiques
et aux micro-polluants organiques synthtiques). Les mtaux ne sont donc
pas sujets la biodgradation, mais ils peuvent subir des transformations
rversibles dans lenvironnement naturel (p. ex., changements de sp-
ciation cf. section 2.1). Plusieurs mtaux et mtallodes sont essentiels
la vie biologique (p. ex., le cuivre (Cu), le cobalt (Co), le fer (Fe), le man-
ganse (Mn), le nickel (Ni) et le zinc (Zn)) et leur prsence dans le milieu
ambiant est essentielle ; on ne peut en dire autant des contaminants orga-
niques. La bioaccumulation des mtaux essentiels est donc un processus
naturel, exig par tous les organismes vivants afin de satisfaire leurs
besoins mtaboliques. Plusieurs organismes ont dvelopp des mca-
nismes efficaces pour contrler leurs concentrations internes de mtaux
essentiels et pour maintenir celles-ci dans des gammes relativement
restreintes (contrle homostatique). Comme nous le verrons dans ce
chapitre, ces mcanismes de contrle homostatique peuvent galement
jouer un rle dans la dtoxication de mtaux non essentiels (p.ex., le
cadmium (Cd), le plomb (Pb) ou le mercure (Hg)).
12 cotoxicologie molculaire

Tableau 1.1
Comparaison cotoxicologique entre les mtaux traces
et les micro-polluants organiques

Mtaux Micro-polluants organiques


Naturellement prsents dans la Naturellement absents de la crote
crote terrestre ; nombre limit par terrestre (composs synthtiques,
le Tableau priodique des lments xnobiotiques ) ; nombre presque
sans limite, et croissant
Pas sujets la (bio)dgradation, Sujets la (bio)dgradation, des
mais peuvent subir des transforma- degrs divers (composs labiles
tions de forme (changements de composs rfractaires) ; ces chan-
spciation) ; ces changements sont gements sont gnralement
rversibles irrversibles
Plusieurs mtaux et mtallodes Jamais essentiels la vie biologique
sont essentiels la vie biologique
(p. ex., Cu, Co, Fe, Mn, Ni, Zn)
Bioaccumulation implique gnrale- Bioaccumulation implique gnra-
ment la prise en charge de formes lement la prise en charge de formes
hydrophiles (transport lipophiles (transport membranaire
membranaire facilit) par simple diffusion)
Chez plusieurs organismes il existe Aucun processus quivalent
des mcanismes efficaces pour con-
trler les concentrations internes de
certains mtaux essentiels (contrle
homostatique)

1.2. IDENTIFICATION DE MTAUX PRIORITAIRES


Parmi les diffrences entre contaminants inorganiques et organiques, il y
en a une qui simplifiera notre traitement contrairement la situation: des
produits organiques synthtiques, dont le nombre ne cesse de crotre, dans
le cas des contaminants mtalliques on se trouve limit par la ralit du
Tableau priodique des lments (~80 mtaux et mtallodes). Comment
doit-on identifier les mtaux prioritaires parmi ceux-ci, dans un con-
texte cotoxicologique ? Wood (1976) a propos une classification des
mtaux et mtallodes en trois catgories : a) lments inoffensifs ;
b) lments trs toxiques et relativement accessibles ; et c) lments
toxiques mais insolubles ou trs rares (tableau 1.2). Campbell et al. (1985)
se sont inspirs de cette premire classification en choisissant la catgorie
b) et en y ajoutant une valuation du degr de perturbation du cycle
gochimique naturel du mtal par les activits humaines.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 13

Tableau 1.2
Classification des lments mtalliques dans un contexte environnemental
(adapt de Wood, 1976 ; voir aussi Campbell et al., 1985)

A. lments B. lments trs toxiques C. lments toxiques


inoffensifs et relativement mais insolubles
accessibles ou trs rares
Ca calcium Ag argent Ba baryum
Fe fer Al2,4 aluminium Ga gallium
K potassium As3,4 arsenic Hf hafnium
Li lithium Au or In indium
Mg magnsium Be bryllium La lanthane
Mn1 manganse Bi bismuth Nb niobium
Na sodium Cd4 cadmium Os osmium
Rb rubidium Co cobalt Re rhnium
Si silicium Cr4 chrome Rh rhodium
Sr strontium Cu4 cuivre Ru ruthnium
Hg4 mercure Ta tantale
Ni4 nickel Ti titane
Pb4 plomb W tungstne
Pd palladium
Pt platine
Sb antimoine
Se3 slnium
Sn4 tain
Te tellure
Tl thallium
Zn4 zinc

Notes :
1. Wood (1976) na pas classifi le manganse, puisque selon lui cet lment couvrait
plus dune catgorie , et il semble avoir oubli le chrome.
2. Wood (1976) a caractris laluminium d inoffensif , mais actuellement, la lumire
notamment des recherches ralises sur les prcipitations acides, il faudrait le placer
dans la catgorie B.
3. Larsenic et le slnium sont des mtallodes.
4. lment identifi par Environnement Canada comme substance dintrt prioritaire.
Cr = Cr(VI) ; Sn = composs organomtalliques ; Al = sels utiliss dans le traitement
des eaux ; Cu = rejets des fonderies de Cu ; Zn = rejets des fonderies de Zn. Pour de
plus amples renseignements sur ltablissement de listes de substances prioritaires
(LSP) dans le cadre de la Loi canadienne sur la protection de lenvironnement, voir Envi-
ronnement Canada (1997).
14 cotoxicologie molculaire

Dans un cycle gochimique naturel, non perturb, on peut identifier


plusieurs sources naturelles de mtaux : laltration naturelle des roches
prsentes la surface terrestre (weathering) ; les manations volcaniques ;
les fentes sous-marines hydrothermales (deep-sea vents). celles-ci
sajoutent des sources anthropiques possibles de mtaux : sources ponc-
tuelles, comme les effluents miniers ou les effluents dusines impliques
dans la transformation des mtaux, ainsi que des sources diffuses comme
les fonderies impliques dans le raffinage de minerais sulfureux. ces
sources videntes sen ajoute une dont limplication est plus subtile: les
pluies acides et lacidification des sols peuvent mobiliser ( mettre en cir-
culation ) des mtaux, constituant ainsi une source diffuse indirecte. Dans
ce contexte, une premire question cl se pose : Quelles sont les contri-
butions relatives des sources naturelles et des sources anthropiques aux
quantits de mtaux couramment prsentes dans la partie superficielle
de la terre ?
Sachant quil existe pour chaque lment un bruit du fond ou
background (qui nexiste videmment pas dans le cas des composs orga-
niques xnobiotiques), il sagit de dterminer si ce bruit du fond a t
perturb par les activits anthropiques. Pour y arriver, il convient de con-
sidrer le comportement des mtaux dans latmosphre ; les concentrations
de mtaux dans ce compartiment environnemental tant normalement trs
faibles, il est plus facile dy dtecter linfluence des activits humaines.
On peut
comparer pour chaque lment le taux dmission de sources natu-
relles celui de sources anthropiques = facteur de mobilisation ;
comparer pour chaque lment sa concentration dans les arosols
atmosphriques celle dans des matrices naturelles non perturbes
= facteur denrichissement ;
dterminer pour chaque lment les tendances temporelles de sa
concentration dans la dposition atmosphrique.
Lapplication de ces trois critres a permis didentifier neuf mtaux
et deux mtallodes dont les cycles gochimiques avaient incontesta-
blement t perturbs par les activits anthropiques, savoir : largent (Ag),
le cadmium (Cd), le cuivre (Cu), le plomb (Pb), le manganse (Mn), le
mercure (Hg), le nickel (Ni), le vanadium (V), le zinc (Zn) ; larsenic (As),
le slnium (Se) (Campbell et al., 1985).
Il faut raffiner ce premier rsultat de tri en y ajoutant des considra-
tions de la toxicit inhrente du mtal (Kaiser, 1980 ; Newman et
McCloskey, 1996 ; Tatara et al., 1997), permettant dtablir des seuils de
concentration partir desquels le mtal pourrait exercer des effets toxiques.
Ensuite il faut comparer ces seuils aux concentrations qui risquent de se
Prise en charge et dtoxication des mtaux 15

prsenter dans le milieu rcepteur. Cette approche relve du domaine de


lvaluation de risque cotoxicologique et nous encourageons le lecteur
consulter la documentation pertinente (CCME, 1996 ; Chapman, 1996 ;
Chapman et al., 1998 ; Chapman et Wang, 2000 ; Suter, 1993). Lapplica-
tion de ces critres mne lidentification du cadmium, du cuivre, du
plomb et du zinc comme mtaux lintrt prioritaire (tableau 1.2), et ce
sont ces mtaux et leurs complexes qui retiendront notre attention. ceux-
ci sajouteraient certainement le mercure (surtout le mthyl-mercure, pro-
duit de la mthylation in situ du mercure inorganique) et certains
organomtaux synthtiques comme le tributyl-tain (TBT), employ
comme agent pour empcher les salissures (fouling) sur la coque des
bateaux (voir Padrs et Pelletier, chapitre 6). Cependant, puisque le com-
portement cotoxicologique de ces composs organomtalliques diffre
considrablement de celui des mtaux cationiques (Cd, Cu, Pb, Zn), nous
ne les considrerons pas dans le contexte du prsent chapitre.

1.3. PLAN DU CHAPITRE


Ce chapitre comporte deux sections complmentaires, qui sont compltes
par ltude de cas prsente dans le chapitre suivant. Dans la premire
section, qui se veut une introduction gnrale la toxicologie des mtaux
chez la faune et la flore aquatiques, on traite dabord des mcanismes de
prise en charge (uptake) des mtaux chez ces organismes, pour ensuite
considrer comment ces mtaux peuvent exercer leurs effets toxiques, une
fois accumuls. Cette discussion mne naturellement un examen des
mcanismes de dtoxication, o on introduit la notion de rpartition sub-
cellulaire des mtaux, et on explore la possibilit que ce paramtre puisse
tre utilis pour diagnostiquer ltat de sant dun organisme expos aux
mtaux (concept dun biomarqueur deffets).
Ayant introduit lide de rpartition subcellulaire des mtaux, nous
mettons laccent sur un des acteurs principaux dans le milieu subcellu-
laire, la mtallothionine. Cette deuxime section du chapitre passe en
revue les proprits biochimiques, la biosynthse et la dgradation de ce
peptide cl. On considre ensuite les diverses fonctions cellulaires qui ont
t attribues ce peptide cl, en insistant sur son rle dans la rgulation
des mtaux essentiels, sa protection contre le stress oxydant et son impli-
cation possible dans la dtoxication des mtaux traces. Cette section se
termine par un examen critique du potentiel de la mtallothionine comme
biomarqueur pour les mtaux.
16 cotoxicologie molculaire

Signalons que ce modle cotoxicologique est confront la ra-


lit du terrain au chapitre 2, o on prsente une tude de cas portant sur
un mollusque deau douce, Pyganodon grandis, un organisme filtreur qui
vit naturellement dans des lacs du Bouclier canadien et qui offre beau-
coup de potentiel comme organisme sentinelle .

2. TOXICOLOGIE AQUATIQUE DES MTAUX NOTIONS


2.1. CHIMIE ENVIRONNEMENTALE
Avant daborder la toxicologie aquatique des mtaux qui retiennent notre
attention (Cd, Cu, Pb, Zn), il faut rappeler certains aspects de la spciation
des mtaux. Par spciation dun mtal on entend sa rpartition parmi
diffrentes formes physiques ou chimiques (Templeton et al., 2000). La
spciation physique dun mtal fait appel sa distribution entre des
formes particulaires (p. ex., >200 nm), collodales (10200 nm) ou dissoutes
(< 10 nm), alors que la spciation chimique dun lment renvoie surtout
son implication dans la formation de divers complexes de coordination.
Dans ce dernier cas, pour un mtal cationique, on peut considrer les for-
mes suivantes (figure 1.1 ; tableau 1.3) :

Tableau 1.3
Spciation chimique des mtaux*

Forme (A E dans la figure 1.1) Exemples


A. Ion mtallique libre Al3+(H2O)6
Cu2+(H2O)6
B. Hydroxo-complexes AlOH2+, Al(OH)2+, Al(OH)4
FeOH2+, Fe(OH)2+, Fe(OH)4
Cu(OH)20
C. Complexes simples inorganiques AlF2+, AlF2+
CdCl+, CdCl20, CdCl3
HgCl20, HgOHCl0
CuCO30
CdSO40
D. Complexes simples organiques
ii) synthtiques CuEDTA2
CdNTA
ii) naturels Cdalanine
Cdcitrate
Fesidrophore
E. Complexes polymres organiques Al, Fe, Cu, Pb ou Hg acide
fulvique ou humique

* Exemples de formes ou despces mtalliques qui sont potentiellement importantes sur


le plan toxicologique.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 17

lion mtallique libre (p. ex., Cd2+, Cu2+, Pb2+, Zn2+)


des complexes inorganiques, impliquant les anions inorganiques
couramment trouvs dans les eaux naturelles (p. ex., HO, F, Cl,
HCO3, CO32, SO42, S2O32)
des complexes organiques, impliquant des ligands monomres
simples (p. ex., acides amins, acides hydroxamiques, acides
polycarboxyliques)
des complexes organiques, impliquant des ligands polymres
complexes (p. ex., acides fulviques et humiques ; protines).

Figure 1.1
Schma gnral montrant la spciation chimique des mtaux en solution

(H2O)n-1 M -OH M -X
hydroxo-complexes complexes inorganiques
X = Cl , F , SO42,
HCO3, CO32
B C

M (H2O)Z+
aquo ion
A

M
E
D
substances humiques;
M -L acides fulviques et humiques
complexes organiques (htropolymres)
(ligands monomres)
L = acide amin
acide polycarboxylique

La rpartition du mtal M entre les formes A, B, C et D peut se calculer laide de la mod-


lisation des quilibres chimiques.
18 cotoxicologie molculaire

Tel quindiqu la figure 1.1, lion mtallique libre joue un rle central
dans la spciation des mtaux dissous. Il faut cependant noter que les
cations mtalliques ne sont jamais parfaitement libres en solution
aqueuse ils sont toujours associs des molcules deau dhydratation,
Mz+(H2O)n, o n vaut normalement 4 ou 6. Cependant, par convention on
crit souvent Mz+ sans indiquer la prsence de la sphre dhydratation.
Il importe de souligner le caractre dynamique de la distribution
reprsente la figure 1.1. Les formes A E sont toutes en quilibre, les
unes avec les autres ; le mtal schange rapidement entre les diffrents
complexes, la demi-vie dune espce donne tant gnralement trs courte
(< 1 min), mais si les conditions ambiantes demeurent constantes, la dis-
tribution globale du mtal entre les formes A E ne change pas. Cepen-
dant, la distribution est souvent sensible des variations de certains
paramtres, notamment le pH ; les ajustements de la distribution en
rponse de tels changements dans les conditions physico-chimiques se
produisent trs rapidement et de manire rversible. Ces deux caract-
ristiques de la spciation des mtaux, savoir la rapidit avec laquelle
les quilibres stablissent ainsi que la rversibilit des changements,
diffrencient nettement les mtaux des contaminants organiques.
La spciation chimique dun mtal dissous dpendra entre autres
de la composition de la solution (pH ; concentrations des divers ligands ;
temprature) et de son affinit pour les ligands disponibles. Si les cons-
tantes dquilibre sont connues pour ces diverses ractions, on peut sen
servir comme donnes dentre dans un modle dquilibres chimiques
pour calculer la spciation du mtal (p. ex., Turner, 1995). cause de la
variabilit invitable de la composition de la solution, la spciation chi-
mique dun mtal variera dun milieu un autre ; cependant, malgr cette
variabilit inhrente, les proprits intrinsques du cation mtallique
savrent encore plus importantes dans la dtermination de la spciation
dun mtal et les mmes tendances gnrales se manifestent dans divers
milieux. titre dexemple, le tableau 1.4 prsente la spciation chimique
des quatre mtaux dintrt, telle que calcule pour une eau douce typique
(en loccurrence, leau dun des Grands Lacs laurentiens, le lac ri, en ne
tenant compte que des ligands inorganiques). lexamen de ce tableau
on constate que la proportion du mtal prsente sous forme dions libres
savre plus importante dans les cas du Cd et du Zn que pour le Cu ou le
Pb ; les valeurs absolues changeront dun milieu un autre, mais cette
tendance persistera. Ce genre de calcul peut galement se faire avec des
ligands organiques naturels, mais avec moins de confiance (notamment
cause de lhtrognit de ces ligands et de leurs proprits comme
htropolymres et polylectrolytes Turner, 1995) ; de nouveau la pro-
portion du mtal prsente sous forme dions libres savre plus importante
dans les cas du Cd et du Zn que pour le Cu ou le Pb.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 19

Tableau 1.4
Spciation inorganique typique de quatre mtaux traces
(Cd, Cu, Pb, Zn) dans les eaux douces oxyques

Mtal Mz+ M(OH)n M(CO3) M(Cl)n M(SO4)


Cd 84 <1 2 CdHCO3+ ; 5 CdCl+ 4 CdSO4
6 CdCO3
Cu 3 1 CuOH+ ; 5 CuCO3 <1 <1
90 Cu(OH)2
Pb 14 10 PbOH+ 2 PbHCO3+ ; <1 1 PbSO4
73 PbCO3
Zn 86 2 ZnOH+ ; 2 ZnHCO3+ ; <1 3 ZnSO4
2 Zn(OH)2 5 ZnCO3

Note :
composante [ ] (mol/L) composante [ ] (mol/L)
2+ 3
Ca 1,00 x 10 Cl 0,80 x 103
Mg2+ 0,30 x 103 SO42 0,30 x 103
Na+ 0,60 x 103 PO43 1,00 x 107
K+ 0,04 x 103 F 2,50 x 106

HCO3 1,80 x 103
Conditions gnrales : pH 7,6 ; T = 20 oC

Avant de passer de la spciation des mtaux leur prise en charge


par les organismes aquatiques, il importe de contraster la nature hydro-
phile des espces mtalliques communes (tableau 1.4) au caractre
lipophile des barrires biologiques que devront franchir les mtaux.
quelques exceptions prs (p. ex., HgCl20), les mtaux cationiques et leur
complexes ne pourront traverser des membranes biologiques par simple
diffusion ; la prise en charge (uptake) des mtaux fera plutt appel au
transport facilit, impliquant des transporteurs protiques intgrs dans
la membrane.

2.2. PRISE EN CHARGE DES MTAUX

2.2.1. Considrations gnrales


Considrons dabord la nature de linterface abiotique/biotique. En
sapprochant dune surface biologique (branchies, tgument, paroi cellu-
laire, etc.), le mtal rencontrera souvent une couche protectrice compose
soit de polysaccharides (p. ex., parois cellulaires chez les microorganismes
ou les plantes suprieures), soit de glycoprotines (p. ex., mucus la sur-
face de cellules animales pithliales). Les macromolcules prsentes dans
20 cotoxicologie molculaire

cette couche renferment une varit de groupements fonctionnels, nor-


malement non chlatants et domins par loxygne comme atome don-
neur (groupements C(O)OH, P(O)OH ou C(OH)). Dans la gamme de
pH normalement rencontre dans les eaux naturelles, plusieurs de ces
groupements fonctionnels se dissocient, gnrant une matrice de sites
chargs ngativement que le mtal devra franchir avant datteindre la
barrire membranaire proprement dite. La composition (bio)chimique de
la membrane cellulaire varie dune espce une autre, et mme dun tissu
un autre (Simkiss et Taylor, 1995). Cependant, dans le contexte actuel,
ce sont plutt les similarits entre membranes qui nous intressent : leur
caractre hydrophobe ; lomniprsence de phospholipides et de protines
(dont certaines traversent la membrane) ; lexistence de divers transpor-
teurs protiques et/ou de canaux ioniques, impliqus dans le transport
dions dun ct lautre de la membrane.
Le mtal rencontrera donc une grande diversit de sites de liaison
potentiels, lesquels se divisent en deux classes distinctes : des sites phy-
siologiquement inertes, o le mtal peut se lier sans perturber les fonc-
tions cellulaires normales, et des sites physiologiquement actifs o, en se
liant, le mtal affecte le mtabolisme de la cellule. Dans ce dernier cas, la
liaison du mtal peut affecter le mtabolisme cellulaire directement si, par
exemple, le site de liaison correspond un enzyme cl intgr la mem-
brane cellulaire, ou indirectement si le site de liaison correspond plutt
un site de transport qui permet au mtal datteindre lintrieur de la cellule.
Une fois le cytosol atteint, le mtal peut ragir avec une grande diversit
de sites de complexation intracellulaires, avec des consquences mta-
boliques videntes.
Dans le cadre de ce modle gnral des interactions entre les mtaux
et les organismes vivants (figure 1.2), on peut donc identifier quatre tapes :
i) advection ou diffusion du mtal (et de ses complexes) de la solution
vers la surface biologique ; ii) diffusion du mtal au travers de la couche
protectrice externe ; iii) complexation du mtal des sites physiologi-
quement inertes dans la couche protectrice, ou des sites sur la face apicale
de la membrane cellulaire ; iv) prise en charge (uptake ou internalisation)
du mtal. La rponse biologique globale comprendra la bioaccumulation
du mtal (sorption ; internalisation), ainsi que les effets induits par le mtal
bioaccumul sur des processus tels que la photosynthse, la respiration,
la motilit, la croissance et la reproduction. Une valuation de la
biodisponibilit dun mtal doit tenir compte de lensemble de ces
lments de rponse. Le dfi, pour un mtal donn, est de pouvoir pr-
dire la rponse biologique en fonction de la spciation du mtal dans le
milieu dexposition.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 21

Figure 1.2
Modle conceptuel des interactions entre les mtaux
et les organismes aquatiques

Mz+ = ion mtallique libre ; ML = complexe mtallique en solution ; K1 = constante dqui-


libre pour la formation de lespce ML ; MXmembrane = complexe mtallique de surface ;
kf, kf = constantes de vitesse pour la formation du complexe de surface ; kd, kd = cons-
tantes de vitesse pour la dissociation du complexe de surface ; kint = constante de vitesse
pour linternalisation du mtal. Les charges sur les complexes ne sont pas indiques.
Source : Dessin modifi partir de Campbell (1995) figure 1.1, p. 47. Reproduit avec
lautorisation de lauteur.

2.2.2. Modle de lion libre (MIL)/Modle du ligand biotique (BLM)


Au cours des 30 dernires annes, plusieurs chercheurs ont explor les
liens entre la spciation des mtaux et leur biodisponibilit et il est devenu
vident que normalement la rponse biologique sollicite par un mtal
dissous varie en fonction de la concentration de lion mtallique libre,
Mz+(H2O)n, laquelle est dtermine par la concentration totale du mtal
dissous de mme que par la concentration et la nature des ligands pr-
sents en solution (voir la section 2.1). La premire formulation cohrente
de cette dpendance, sous la forme du Modle de lion libre ou MIL, a
22 cotoxicologie molculaire

t ralise par Morel (1983), qui invoquait limportance universelle de


lactivit de lion mtallique libre pour dterminer la prise en charge, la
nutrition et la toxicit des mtaux traces cationiques . Subsquemment
Campbell (1995) et Hudson (1998) ont quelque peu nuanc ce premier
nonc (voir la section 2.2.3), dans des examens critiques de la littrature,
mais il demeure nanmoins valable comme premire base de prdiction
de la biodisponibilit des mtaux.
Limportance de lactivit de lion mtallique libre comme prdicteur
de la rponse biologique dun organisme aquatique dcoule de la chimie
des quilibres qui stablissent linterface entre lorganisme et son milieu.
Linteraction du mtal avec la surface cellulaire, impliquant lion mtal-
lique libre (Mz+) ou le complexe (MLn) comme ractif, peut tre repr-
sente comme une raction de complexation de surface, menant la
formation de complexes du genre M X cellule, o X cellule = un ligand
cellulaire prsent la surface membranaire (figure 1.2 ; figure 1.3, voie i).
Dans le cas le plus simple, o cest lion mtallique libre qui ragit avec le
ligand cellulaire, on peut envisager les ractions suivantes (o, pour sim-
plifier, les charges sur le ligand et les complexes ne sont pas indiques) :

quilibre en solution
Kc
Mz+ + L ML (1)
Kc = [ML]/([Mz+][L]) (2)

Raction de Mz+ la surface cellulaire


Kad
Mz+ + Xcellule MXcellule (3)
{MXcellule} = Kad {Xcellule}[Mz+] (4)
o Kc et Kad sont des constantes dquilibre. Si la rponse biologique varie
en fonction de la concentration du complexe {MXcellule}, cest--dire
selon le degr de saturation des sites Xcellule, et si la concentration de
sites Xcellule libres demeure approximativement constante dans la
gamme dexposition, on peut dduire partir de lquation 4 que la
rponse biologique suivra la concentration de lion mtallique libre, [Mz+],
en solution. Une situation semblable prvaut mme si cest le complexe
MLn qui ragit avec le ligand cellulaire, condition que la raction se
produise par change de ligands (Campbell, 1995) :
MLn + Xcellule MXcellule + n L (5)
Prise en charge et dtoxication des mtaux 23

Figure 1.3
Prise en charge de mtaux par des organismes
aquatiques mcanismes gnraux

i) transport facilit de cations ; ii) transport accidentel de cations lis des anions ;
iii)diffusion passive de complexes mtalliques lipophiles.

tant donn limportance accorde au Modle de lion libre, aussi bien


par les scientifiques que par le rgulateurs (Renner, 1997 ; Environnement
Canada, 2001), il importe de bien identifier les prmisses de base qui le
sous-tendent (Campbell, 1995).

la surface biologique :
La membrane cellulaire constitue le site cl pour linteraction des
mtaux en solution avec les organismes aquatiques. Lion mtallique
libre, Mz+, et ses complexes hydrophiles, mL, ne peuvent traverser
la membrane plasmique par simple diffusion. Leur interaction avec
cette barrire prend plutt la forme dune raction de complexation
de surface (quations 3 ou 5). La rponse biologique est proportion-
nelle la concentration du complexe de surface {MXcellule} ainsi
form.
Les variations de {MXcellule} en fonction de la concentration de
lion libre en solution, [Mz+], suivent un isotherme de type Langmuir.
condition que la concentration de sites de liaison libres,
24 cotoxicologie molculaire

{Xcellule}, demeure peu prs constante lintrieur de la gamme


de concentrations mtalliques dintrt toxicologique, les variations
de la rponse biologique suivront celles de lion mtallique libre
(quation 4).
La barrire biologique ne change pas lors de lexposition au mtal
dintrt, cest--dire quil ny a pas dacclimatation au niveau de la
membrane cellulaire (corollaire : le MIL sappliquera davantage
des expositions de courte dure qu des expositions chroniques).

Cintique
Le transport du mtal travers la membrane plasmique est ltape
limitante. Cest--dire que la diffusion du mtal travers la couche
non mixe et sa complexation subsquente la surface biologique
se produisent rapidement, menant ltablissement dun quilibre
entre la surface biologique et la solution externe dexposition.
De lensemble de ces conditions, il sensuit que lidentit de lespce
mtallique qui ragit la surface biologique, pour former le complexe
{MXcellule}, na pas de signification biologique aucune espce pr-
sente en solution ne peut tre considre comme plus (ou moins)
biodisponible quune autre. Limportance de lion mtallique libre comme
prdicteur de la biodisponibilit nimplique pas quil soit lespce bio-
disponible , mais dcoule plutt de la chimie des quilibres ; connatre la
concentration ou lactivit de lion mtallique libre permet de prdire la
concentration de lespce cl, {MXcellule}.
Toutes ces prmisses de base ont t bien conserves dans le Modle
du ligand biotique (Biotic Ligand Model ou BLM), qui constitue la mani-
festation la plus rcente du MIL (Di Toro et al., 2001 ; Santore et al., 2001) ;
lespce {Xcellule} a t renomme {Ligand biotique}, mais autrement
les deux modles reposent sur les mmes bases. En effet, vu en rtrospec-
tive, lemploi de lexpression Modle de lion libre pour dcrire cette
approche dquilibres chimiques a peut-tre sem une certaine confusion
dans la littrature, dans le sens que le nom du modle mettait laccent
exclusivement sur lion mtallique libre lui-mme, lexclusion dautres
facteurs comme le pH et la duret de leau qui sont reconnus pour leur
influence sur la biodisponibilit des mtaux. Lintroduction de lexpres-
sion Modle du ligand biotique nous mne migrer de la solution
dexposition vers lorganisme cible, vers le ligand biotique o le mtal,
le proton et les cations majeurs (Ca2+, Mg2+) concourent pour sy lier. Pour
cette raison, nous emploierons lexpression Modle du ligand biotique
dans le texte qui suit. Signalons que les autorits gouvernementales au
Prise en charge et dtoxication des mtaux 25

Canada, aux tats-Unis ainsi quau sein de lUnion europenne semblent


avoir adopt lapproche du BLM pour dvelopper des objectifs
environnementaux de rejet pour les mtaux.
Plusieurs liens possibles entre la formation du complexe MXcellule
et linitiation dun effet biologique ont t suggrs dans la littrature
(Morel, 1983 ; Pagenkopf, 1983 ; Sunda, 1991). Si Xcellule correspond
un site physiologiquement actif prsent la surface cellulaire, sa raction
avec le mtal pourra induire une rponse biologique directe (p. ex.,
branchies de poisson Pagenkopf, 1983 ; Wood, 2001). Dautre part, si
Xcellule correspond plutt un site de transport qui permet au mtal

de traverser la membrane cellulaire et dentrer dans le cytosol, alors sa


raction avec le mtal ne constituera quune tape pralable au transport
membranaire (et la raction du mtal avec les sites mtaboliquement actifs
se produira dans le milieu intracellulaire, suite au transport Morel, 1983).
Dans une variante de ce scnario, Xcellule pourrait correspondre un
site de transport normalement emprunt par un oligo-lment nutritif
essentiel ; dans ce cas, sa raction avec le mtal M inhiberait le transport
du mtal essentiel et en induirait une dficience (p. ex., phytoplancton
Sunda et Huntsman, 1983 (Mn, Cu) ; Harrison et Morel, 1983 (Fe, Cd)).

2.2.3. Applicabilit du Modle du ligand biotique (BLM)


A priori, le Modle du ligand biotique devrait sappliquer aux organismes
aquatiques qui nassimilent pas de matire particulaire (p. ex., des algues
et des plantes aquatiques suprieures), ou encore ceux qui peuvent en
assimiler mais pour qui la phase dissoute demeure le vecteur principal de
prise en charge (p. ex., des poissons, du moins pour les conditions
dexposition de courte dure). Beaucoup de preuves exprimentales
lappui du BLM se sont effectivement accumules depuis 30 ans.

Organismes tudis
Le phytoplancton a t beaucoup tudi, les tudes avec les algues deau
douce et les algues marines tant de loin les plus nombreuses dans la lit-
trature scientifique. Cette distribution ingale reflte sans doute la sen-
sibilit des algues (unicellulaires) aux mtaux, mais elle dcoule aussi de
la facilit relative des manipulations exprimentales impliques (milieu
de culture inorganique dfini ; temps de gnration court ; rponse rapide).
Des essais avec les invertbrs sont aussi relativement nombreux, avec
un biais vident vers des espces marines. Par contre, chez les poissons la
majorit des tudes ont t ralises avec des espces dulcicoles.
26 cotoxicologie molculaire

Conditions exprimentales (mtaux/ligands)


Presque sans exception, les expriences conues pour tester le BLM ont
t ralises un pH constant, avec des mtaux bivalents (Cu, Cd, Ni, Pb,
Zn), dans des milieux artificiels (inorganiques) ou dans leau de mer filtre,
et en prsence de quantits connues de ligands synthtiques tels que
lthylnediamine-ttraactate (EDTA) ou le nitrilotriactate (NTA). Ces
ligands ont t employs comme tampons mtalliques en manipulant
[M]T et/ou [L]T, on peut faire varier la concentration de lion mtallique
libre, [Mz+], dans la gamme voulue. Signalons que ces ligands forment
des complexes hydrophiles avec les mtaux dintrt, envers lesquels les
membranes biologiques savrent impermables, ce qui a beaucoup
simplifi linterprtation des expriences. Le cuivre domine largement
parmi les mtaux tudis ; le nombre de citations diminue dans lordre
Cu > Cd > Zn >> les autres.
Lexamen critique de cette littrature (Campbell, 1995 ; Campbell et
al., 2002 ; Hudson, 1998) permet de dgager un aperu gnral de
lapplicabilit de lapproche BLM aux eaux naturelles. Il convient de con-
sidrer sparment les tudes ralises en absence/en prsence de la ma-
tire organique dissoute naturelle (MOD).

tudes ralises en labsence de la MOD


Diverses rponses ont t suivies dans ces expriences, allant dindices
trs spcifiques (p. ex., accumulation du mtal adsorption superficielle,
absorption ; distribution sub-cellulaire) jusqu des mesures plus
holistiques (p. ex., croissance, motilit, mortalit). Dans la trs grande
majorit des expriences ralises pH et duret constants, et en pr-
sence de ligands formant des complexes mtalliques hydrophiles, la
rponse biologique varie en fonction de la concentration de lion mtal-
lique libre (Mz+(H2O)n ou aquo ion), tel que prdit par le BLM (52 cas sur
59 voir Campbell, 1995).
Des exemples dexpriences o la biodisponibilit dun mtal ne suit
pas lactivit de lion mtallique libre sont plutt rares. Ces quelques
exceptions se classent en trois groupes : i) des expriences avec des ligands
formant des complexes mtalliques hydrophobes, MLn0, ou avec des com-
poss organomtalliques hydrophobes, R M X0 ; ii) des tudes impli-
quant des ligands formant des complexes mtalliques hydrophiles, mais
o on permettait au pH et/ou la duret de leau de varier ; et iii) quelques
cas avec des ligands formant des complexes hydrophiles (normalement
avec des mtabolites de poids molculaire faible).
Prise en charge et dtoxication des mtaux 27

Groupe (i) : Dans la littrature scientifique on retrouve quelques


exemples o la biodisponibilit dun mtal augmente aprs
complexation, cette disponibilit accrue tant attribuable la for-
mation de complexes neutres lipophiles (Block et Wicklund Glynn,
1992 ; Croot et al., 1999 ; Phinney et Bruland, 1997). On sattendrait
ce que de tels complexes puissent traverser les membranes biolo-
giques directement (figure 1.3, voie iii), sans devoir emprunter les
systmes (canaux, permases) impliqus dans le transport mem-
branaire des mtaux essentiels comme le Cu ou le Zn. Il importe de
mentionner, cependant, que les concentrations de ligand ncessaires
pour provoquer cette disponibilit accrue sont gnralement sup-
rieures celles susceptibles dtre trouves dans les eaux naturelles.
Pour que ces rsultats puissent tre considrs pertinents sur le
plan environnemental, il faudrait dmontrer que de tels complexes
lipophiles, de poids molculaire faible, existent rellement dans les
eaux naturelles. La question demeure ouverte : ces exceptions sont-
elles dintrt acadmique seulement ou constituent-elles des ana-
logues valables pour une certaine classe de complexes mtalliques
naturels ?
Groupe (ii) : Daprs des tudes ralises sur des organismes deau
douce, dans des conditions de pH ou de duret variables, il est vi-
dent que la simple connaissance de la concentration de lion mtal-
lique libre, Mz+, ne suffit pas pour prdire la rponse biologique au
mtal. En effet, on sattendrait ce que lion H+ et les cations majeurs
responsables de la duret (Ca2+, Mg2+) puissent concourir pour le
site de liaison, Xcellule. Dans le cas dun mtal toxique, ce genre
de comptition offrirait une certaine protection lorganisme. Le
BLM tient compte de cette comptition, en introduisant explicitement
les ractions du ligand biotique, Xcellule, avec le proton et les
cations majeurs.
KH
H+ + Xcellule HXcellule (6)
KCa
Ca2+ + Xcellule CaXcellule (7a)
KMg
Mg2+ + Xcellule MgXcellule (7b)

Lvidence qualitative de ce genre de comptition est reconnue


depuis longtemps dans la littrature toxicologique (proton : Campbell
et Stokes, 1985 ; duret : Howarth et Sprague, 1978), mais ce nest
que rcemment que lon a tent de la quantifier (Meyer et al., 1999 ;
Schamphelaere et Janssen, 2002). Dautre part, il serait imprudent
28 cotoxicologie molculaire

de conclure que cette comptition pour des sites de liaison suffise


elle seule expliquer leffet protecteur de lion H+ et des ions Ca2+ et
Mg2+. Le calcium et le proton ne se limiteront pas concourir avec le
mtal M pour le ligand biotique ; ils peuvent aussi affecter dautres
proprits de la membrane cellulaire comme sa fluidit et sa per-
mabilit globale. Par exemple, chez les organismes pluricellulaires,
le calcium joue un rle dans le maintien de lintgrit des jonctions
paracellulaires (Lacaz-Viera, 2000). De tels effets bnfiques vien-
draient sajouter leffet protecteur reprsent par lquation (7a).
De mme, le rle du proton ne se limitera pas la comptition pour
le ligand biotique reprsente par lquation (6). Par exemple, dans
leur tude de la prise en charge de 85Sr par la carpe commune
(Cyprinus carpio), Chowdhury et Blust (2001) ont fait varier le pH
entre 5 et 8,5 et ils ont russi dmontrer que lion H+ agissait comme
inhibiteur non comptitif de la prise en charge du strontium.
Groupe (iii) : Normalement, la complexation dun mtal par un
ligand de poids molculaire faible, donnant lieu la formation de
complexes hydrophiles, mne une diminution de la biodisponibilit
du mtal. Cependant, dans quelques cas, la biodisponibilit rsi-
duelle du mtal en prsence du ligand dpasse celle qui aurait t
prdite selon la concentration de lion mtallique libre prsente en
quilibre avec les complexes hydrophiles (Campbell, 1995 ; Errcalde
et Campbell, 2000 ; Errcalde et al., 1998 ; Fortin et Campbell, 2001).
Dans tous les cas recenss, ces exceptions apparentes au BLM impli-
quent des ligands assimilables de poids molculaire faible (p. ex.,
acides amins, acide citrique, thiosulfate), pour lesquels il existe des
transporteurs (permases) au niveau de la membrane cellulaire. De
cette observation dcoule lexplication la plus plausible de ce com-
portement anormal des mtaux, savoir le transport accidentel ;
on suppose que le transporteur responsable de lassimilation du
ligand Z est relativement peu slectif, et quil peut saccommoder
non seulement du ligand libre Z, mais galement du complexe
MZ. Le mtal ne fait quaccompagner le ligand, en mode piggy-back.
Ce transport accidentel offre donc au mtal une voie additionnelle
pour atteindre lintrieur de la cellule (figure 1.3, voie ii), qui existe
en parallle la voie normale de transport (figure1.3, voie i).
Ces exemples constituent un dfi thorique important pour le BLM,
mais, tout comme dans le cas du groupe (i) ci-dessus, leur pertinence
environnementale demeure discutable. En effet, dans la plupart des
cas on nobserve de biodisponibilit accrue que pour des concentra-
tions de ligand qui excdent celles trouves normalement dans les
eaux naturelles (p. ex., pour les mtabolites organiques on observe
des effets des concentrations de 10 100 M, alors que ces ligands
Prise en charge et dtoxication des mtaux 29

sont normalement prsents dans les eaux naturelles des concen-


trations < 1 M). Cependant, des concentrations leves pourraient
prvaloir dans des stations dpuration deaux uses, dans des
milieux rcepteurs influencs par le rejet de telles eaux rsiduaires,
ou encore dans le tractus intestinal de certains animaux aquatiques
(Chen et Mayer, 1998).

tudes ralises en prsence de la MOD


La matire organique dissoute quon trouve dans les eaux naturelles est
domine par les substances humiques (acides fulviques et humiques :
Thurman, 1985 ; Tipping, 2002). Parmi les proprits reconnues de ces
substances (tableau 1.5), celle qui nous intresse le plus est leur capacit
de complexer des mtaux cationiques.
KMOD
Mz+ + MOD MMOD (8)
En faisant lanalogie entre les quations (1) et (8), on sattendrait ce
que la MOD agisse en complexant le mtal et en faisant diminuer la con-
centration de lion mtallique libre. De fait, maintes fois dans la littra-
ture on a tudi les effets de la MOD sur la biodisponibilit dun mtal et
dans la trs grande majorit des cas on a effectivement observ une dimi-
nution de la biodisponibilit, tel que prdit par le BLM. Cependant, pres-
que sans exception ces tudes sont de nature qualitative (cest--dire que
la spciation du mtal est demeure indfinie) et on na pas pu dtermi-
ner si la diminution de la biodisponibilit suivait rigoureusement la baisse
de la concentration de lion libre. La situation avec les quelques tudes
quantitatives nest gure meilleure (tableau 1.6) ; lexamen des rsultats
ne rvle aucun consensus (contrairement ce que nous avons vu ant-
rieurement pour les expriences ralises en labsence de la MOD). En
effet, environ la moiti des expriences se conforment au BLM (tableau1.6A),
alors que les autres semblent tre en contradiction (tableaux 1.6B et 1.6C).
Ce manque dtudes quantitatives permettant de tester le BLM en
prsence de la matire organique dissoute naturelle limite actuellement
son application aux eaux naturelles. Le fait que lon observe presque
toujours une diminution de biodisponibilit en prsence de la MOD est
nanmoins rassurant ; il indique que globalement le BLM reprsente cor-
rectement le rle de la MOD. Les autres effets de la MOD, relis son
activit de surface et ses effets sur la permabilit membranaire
(Campbell et al., 1997 ; Vigneault et al., 2000), seraient dordre secondaire.
Cette situation ressemble celle dcrite antrieurement pour le Ca2+ et
lion H+, o leurs effets dominants sur la biodisponibilit des mtaux
30 cotoxicologie molculaire

seraient lis leur comptition pour le ligand biotique, Xcellule, alors


que leurs effets sur les proprits membranaires (permabilit/fluidit/
conformation des protines) demeureraient secondaires.

Tableau 1.5
Proprits chimiques des substances humiques
et processus biogochimiques reconnus qui y sont associs

Proprits chimiques Processus biogochimiques


Acides faibles (prsence de grou- Complexation des mtaux
pements carboxyliques et Complexation du phosphate (com-
phnoliques) plexes ternaires avec le Fe)
Polyfonctionnels Complexation et stabilisation
Polylectrolytes dexoenzymes
Contrle du pH de certaines eaux
desurface

Surfactants Contrle des charges superficielles


de particules inorganiques

Prsence de domaines hydrophobes Association avec des composs


(chanes aliphatiques et noyaux organiques hydrophobes
aromatiques)
Prsence de domaines hydrophiles
coexistant avec des domaines
hydrophobes au sein de la molcule

Prsence daccepteurs dlectrons (Photo)rduction de mtaux, Fe


(groupements quinones) et Mn

Prsence de chromophores (Photo)oxydation dautres molcules


(lectrons  excitables) organiques (photosensibilisation)
Attnuation de la lumire dans les
eaux de surface

2.2.4. Rsum : prise en charge des mtaux


Dans la section 2.2 nous avons considr les interactions possibles entre
un mtal dissous et la barrire biologique membranaire qui spare un orga-
nisme (aquatique) de son milieu. Trois mcanismes de prise en charge
ont t identifis :
transport facilit du cation, impliquant soit un transporteur trans-
membranaire protique, soit un canal trans-membranaire (figure 1.3,
voie i) ;
Prise en charge et dtoxication des mtaux 31

transport facilit dun complexe mtallique anionique, impliquant


un transporteur danions relativement peu slectif (figure 1.3, voie ii :
transport accidentel de lanion + le mtal qui y est associ) ;
transport passif, par simple diffusion, dun complexe mtallique
neutre et lipophile (figure 1.3, voie iii).
Normalement cest la voie i qui prdomine, aussi bien pour les
mtaux essentiels (pour lesquels il existe des systmes de transport facilit
conus pour assurer/contrler la prise en charge de ces oligo-lments
nutritifs essentiels) que pour les mtaux non essentiels comme le Cd ou le
Pb, qui russissent tromper les systmes de transport cationique pr-
sents linterface membranaire. Lorsque la voie i prdomine, le Modle
du ligand biotique (BLM) sapplique et la rponse de lorganisme varie
en fonction du degr de saturation du ligand biotique, cest--dire selon
la concentration de la forme {MXcellule} (quation 4). La concentration
de cette dernire forme est dtermine par la concentration de lion
mtallique libre en solution, [Mz+], de mme que par la concentration
dautres ions pouvant concourir avec Mz+ pour le ligand biotique (Ca2+,
Mg2+ et H+).
Dans cette section nous navons pas considr explicitement la prise
en charge de mtaux associs aux particules (mtaux particulaires). Pour
quun mtal particulaire puisse tre rellement assimil, il faut dabord
que la particule soit ingre et ensuite que le mtal soit solubilis. Norma-
lement cette tape de solubilisation se produit dans le tractus intestinal
de lorganisme consommateur, mais dans certains cas (p. ex., la phagocy-
tose) la particule est assimile par un processus dinvagination de la mem-
brane cellulaire, crant une vacuole. Dans les deux cas, la particule peut
se trouver dans des conditions fort diffrentes de celles qui rgnent dans
le milieu ambiant, notamment en ce qui concerne le pH et les conditions
doxydorduction ; souvent ces nouvelles conditions favoriseront la
solubilisation des mtaux initialement associs la particule. Cependant,
cette tape de solubilisation nest quune premire tape pour tre rel-
lement assimil , le mtal doit franchir la membrane digestive ou la
membrane vacuolaire. La nature de ces barrires membranaires sera peut-
tre diffrente de celle des membranes qui se trouvent exposes aux
mtaux dissous dans le milieu ambiant (p. ex., membranes pithliales
des branchies ou du tgument), mais en principe le transport trans-
membranaire impliquera les mmes trois processus que nous avons dj
identifis (figure1.3).
Tableau 1.6 32
Influence de la matire organique dissoute (MOD) naturelle sur la biodisponibilit des mtaux

Espce Mtal Milieu Dure Rponse Rfrence

A Cas se conformant au BLM, o le rle de la MOD se limite complexer le mtal dans la solution dexposition
1. Monochrysis lutheri Cu Eau de mer filtre + eau 5j Croissance (mmax vs pCu2+) Sunda et Lewis
(algue euryhaline) de rivire filtre + TRIS (1978)
2. Selenastrum Cd Milieu synthtique + acide 0,5 h Prise en charge du Cd Vigneault et
capricornutum humique ou fulvique (comparaison avec Cd2+ Campbell (2004)
(algue deau douce) ou NTA tamponn avec NTA)
3. Bactrie marine Cu Eau de mer filtre + eau 2,5 h Incorporation 14C-glucose Sunda et
(gram-ngative) de rivire filtre (cpm vs pCu2+) Gillespie (1979)
4. Daphnia magna Cu Milieu synthtique + 4j Mortalit (CL50(Cu2+) vs [MOD]) Meador (1991)
(cladocre deau douce) EDTA + MOD + tampon
5. Xenopus laevis Cu Milieu synthtique + acide 4 j Dveloppement des larves Buchwalter
(embryon, larve) humique ou fulvique (anormalits ou terata vs pCu2+) et al. (1996)
(amphibien deau douce)

cotoxicologie molculaire
Espce Mtal Milieu Dure Rponse Rfrence

B Cas ne se conformant pas au BLM, o le mtal savre plus toxique que prvu
1. Selenastrum capricorntum Cd Eau de lac filtre + 4h Prise en charge du 14CO2 Laegreid
(algue deau douce) lments nutritifs ajouts (% inhibition vs pCd2+) et al. (1983)
2. Simocephalus serrulatus Cu Eau souterraine + eau 2j Mortalit (CL50(Cu2+) mesure Giesy et al.
(cladocre deau douce) dtang filtre dans diffrents milieux) (1983)
6h Prise en charge du Cu
3. Daphnia magna Cu Milieu synthtique ou 2j Immobilisation (CE50(Cu2+) Borgmann et
(cladocre deau douce) eau de lac + TRIS mesure dans diffrents milieux) Charlton (1984)
4. Pimephales promelas Cu Eau de lac + acide humique 4 j Mortalit des larves (CL50(Cu2+) Erickson
(men tte-de-boule) mesure dans diffrents milieux) et al. (1996)

C Cas ne se conformant pas au BLM, o le mtal savre moins toxique que prvu
Prise en charge et dtoxication des mtaux

5. Chlorella pyrenoidosa Al Milieu synthtique + acide 4 j Inhibition de croissance Parent et al.


(algue deau douce) fulvique (rendement final), sans/avec (1996)
acide fulvique, pAl3+ constant
6. Paratya australiensis Cu Eau naturelle riche en MOD, 6 j Mortalit (CL50(Cu2+) mesure Daly et al.
(crevette deau douce) dilue avec eau de robinet dans diffrents milieux) (1990)
7. Salmo salar (juvnile) Al Milieu synthtique + acide 4 j Mortalit (CL50(Al3+) mesure Roy et Campbell
(saumon atlantique) fulvique sans/avec acide fulvique) (1997)
33
34 cotoxicologie molculaire

2.3. TOXICIT ET DE DTOXICATION DES MTAUX

2.3.1. Mcanismes de toxicit


En abordant la toxicit des mtaux, il convient de distinguer entre macro-
lments essentiels, lments traces essentiels et lments traces sans
fonction biologique connue. Les mtaux de classe A, de configuration lec-
tronique correspondant des gaz inertes (p. ex., Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Al3+),
se lient prfrentiellement des ligands offrant loxygne et lazote (O >
N > S) comme atomes donneurs, forment des liaisons coordonnes
caractre ionique et montrent des constantes de stabilit qui sont gnra-
lement relativement faibles (exception = Al3+). Les cations de classe B, de
configuration lectronique d8, d9 ou d10 (p. ex., Ag+, Cd2+, Hg2+, Pb2+) pos-
sdent plusieurs lectrons non liants, sont trs polarisables, se lient prf-
rentiellement des groupements sulfhydryles (S > N > O), forment des
liaisons caractre partiellement covalent, et montrent des constantes de
stabilit trs grandes. Les cations borderline (Cu2+, Mn2+, Ni2+, Zn2+), pour
leur part, montrent un comportement intermdiaire, comme leur nom
( limite ) lindique. Ce sont les cations A et borderline qui sont essentiels ;
ceux de la classe B ne sont que toxiques.
Pour un mtal donn, la forme de la courbe dose-rponse variera
selon la classe dans laquelle se trouve llment (figure 1.4). Dans cette
figure, inspire de lanalyse initiale de Bowen (1979), la concentration ou
la dose du mtal est indique le long de laxe des abscisses (units arbi-
traires) alors que la rponse de lorganisme est exprime selon laxe des
ordonnes, une rponse positive correspondant une stimulation de la
performance de lorganisme et une rponse ngative une inhibition
de celle-ci. Pour un macro-lment nutritif comme le Ca, la rponse ini-
tiale sera positive, jusqu latteinte dun plateau plutt large correspon-
dant la dose optimale (suffisance) ; des concentrations trs leves on
pourrait thoriquement commencer dceler de linhibition. Dans le cas
dun oligo-lment nutritif essentiel comme le Cu, la courbe montrera une
stimulation initiale, mais seulement sur une gamme relativement troite
de concentrations, suivie dun court plateau et ensuite dune inhibition
progressive au fur et mesure que la dose augmente. La situation avec
un lment non essentiel comme le Hg ou le Pb sera plus simple, montrant
un plateau initial plus ou moins court (tolrance) suivi dune inhibition
progressive.
Dans le contexte actuel, nous nous intressons surtout aux effets
dltres provoqus par les mtaux traces, cest--dire la partie droite
de la figure 1.4 (courbes ii et iii). Ces effets dltres couvrent toute la
gamme des effets sous-ltaux (p. ex., inhibition de croissance ; atteintes
au cycle de reproduction ; motilit rduite) jusqu la mortalit. Pour
Prise en charge et dtoxication des mtaux 35

Figure 1.4
Schma gnral des courbes dose-rponse typiquement observes
chez un organisme vivant pour i) un macro-lment nutritif
(p. ex., Ca) ; ii) un micro-lment nutritif (p. ex., Cu) ;
et iii) un lment toxique non essentiel (p. ex., Pb)

Source : Dessin modifi partir de Wright et Welbourn (2002), figure 6.2, p. 251. Repro-
duit avec permission.

comprendre ces effets dltres, il faut dabord considrer les rles mta-
boliques essentiels que peuvent jouer les mtaux. Mason et Jenkins (1995)
ont identifi trois catgories de rle : strique, catalytique et oxydatif/
rductif. Comme exemple dun rle strique, mentionnons limplication
du Zn dans les finger proteins qui sont appeles interagir avec lacide
dsoxyribonuclique (ADN) comme facteurs de transcription ; en se liant
au rsidus de cystine (SH) et dhistidine (N :) prsents chez ces
protines, le Zn stabilise leur topologie (conformation) et permet leur inter-
action avec la rgion promoteur du gne. Un tel rle strique se mani-
feste aussi chez plusieurs mtallo-enzymes, o le cofacteur mtallique est
responsable du maintien de la conformation active de la protine. La sug-
gestion dun rle catalytique pour les mtaux dcoule de lobservation de
leur capacit catalyser in vitro lhydrolyse de liaisons dester et damide ;
par exemple, le Zn tant un cofacteur essentiel pour le bon fonctionnement
de certains peptidases, on peut envisager quil joue un rle catalytique
dans lhydrolyse de la liaison peptide, en se liant au groupement carbo-
nyle et en le rendant plus susceptible une attaque nuclophile (Mason et
36 cotoxicologie molculaire

Jenkins, 1995). Finalement, certains mtaux dans la catgorie borderline


(p. ex., Fe, Mn, Cu et Mo) sont incorpors dans des mtalloprotines et
jouent un rle cl dans les ractions intracellulaires doxydation/rduction.
Aprs ce bref aperu des rles mtaboliques jous par les mtaux
essentiels, considrons maintenant comment les mtaux peuvent pro-
voquer des effets toxiques. Rappelons que les mtaux jouant ces rles
mtaboliques essentiels sont tous lis aux molcules organiques par des
ractions de complexation, cest--dire par des liaisons de coordination
dont les forces de liaison sont relativement faibles (pas covalentes). Les
ractions de complexation sont donc rversibles ; par consquent, un mtal
tranger qui entre dans une cellule peut dplacer un mtal/cation
essentiel. Ce genre de dplacement nest pas limit aux mtaux
trangers ; mme un mtal essentiel, sil est prsent des concentra-
tions intracellulaires anormalement leves, pourra provoquer un tel
dplacement par la loi daction des masses. Selon ce raisonnement, le
mcanisme gnral de toxicit des mtaux impliquera la liaison dun mtal
inappropri des molcules physiologiquement importantes (Mason
et Jenkins, 1995). La liaison du mtal inappropri pourrait induire des
effets dltres de diffrentes manires :
en bloquant des groupements fonctionnels essentiels de biomolcules
(souvent des groupements thiol) ;
en dplaant des mtaux essentiels de leurs sites chez les bio-
molcules ;
en modifiant la conformation (donc lactivit) de biomolcules.
Signalons quun mtal donn peut normalement ragir avec une
varit de ligands intracellulaires et ainsi provoquer une diversit deffets.
De mme, un ligand intracellulaire donn peut normalement accepter dif-
frents mtaux (i.e., slectivit imparfaite), donc un effet donn peut tre
induit par plus dun mtal. Par exemple, linhibition de lenzyme Na+/
K+ATPase a t rapporte pour plusieurs mtaux (Ag, Cd, Cu, Zn, Pb).
En dautres termes, aucune cible intracellulaire nest entirement spci-
fique un seul mtal, et aucun mtal ne savre entirement spcifique
une seule cible.
Outre ce mcanisme gnral de liaison de mtaux inappropris
des biomolcules importantes, certains mtaux susceptibles de subir des
changements cycliques de leur tat doxydation (p. ex., Fe, Cu) peuvent
gnrer la production despces ractives doxygne telles O2, HO et
O2 dans le milieu intracellulaire et induire ainsi un stress oxydatif. Les
radicaux libres doxygne, une fois forms, auront tendance attaquer
Prise en charge et dtoxication des mtaux 37

les lipides polyinsaturs des membranes biologiques en leur arrachant


un hydrogne, menant une peroxydation lipidique et une fragilisation
des membranes cellulaires (Bus et Gibson, 1979).

2.3.2. Mcanismes de dtoxication


partir de lide gnrale prsente dans la section prcdente, leffet
que laction toxicologique dun mtal dcoule de son interaction anormale
avec une biomolcule essentielle, Mason et Jenkins (1995) ont propos une
dfinition oprationnelle de la dtoxication : la dtoxication comprend tous
les processus, stratgies, ou mcanismes qui permettent de minimiser le
potentiel dun mtal interagir de manire nuisible avec des macromol-
cules essentielles. Comme corollaire, tout exemple dacclimatation, de
tolrance ou de rsistance des mtaux pourra tre interprt comme une
preuve de lexistence dun systme de dtoxication. La figure 1.5 repr-
sente ce modle intgr de toxicit et de dtoxication. Le mtal qui entre
dans la cellule, via un des mcanismes dcrits la section 2.2, ne demeurera
pas longtemps libre dans le cytosol. Au contraire, il aura tendance se
lier rapidement aux ligands intracellulaires. Dans leur analyse de la
dtoxication, Mason et Jenkins (1995) identifient trois classes de ligands
sur la base de leur action physiologique aprs stre lis un mtal. Les
ligands du groupe LE sont ceux qui exercent un effet bnfique une
fois le mtal li (p. ex., un apomtalloenzyme, LE, qui requiert un mtal
spcifique pour son fonctionnement normal, <MLE>). La situation inverse
sapplique aux ligands de type LT , pour lesquels la liaison du mtal
provoque un effet ngatif ; il sagit de molcules qui sont inactives
lorsquun mtal inappropri sy lie. La dtoxication correspondrait aux
efforts de lorganisme limiter la formation despces <MLT>. Fina-
lement, les ligands de type LI sont physiologiquement inertes, ne
manifestant ni stimulation ni inhibition lorsque le mtal sy lie ; les formes
<MLI> reprsenteraient plutt des rservoirs dentreposage ou de
stockage du mtal. La mtallothionine est probablement lexemple le
mieux connu dun ligand de ce type ; nous la considrons en dtail la
section 3 du prsent chapitre.
Le destin intracellulaire du mtal, cest--dire sa rpartition parmi
les formes <MLE>, <MLT> et <MLI>, sera fortement influenc par deux
facteurs cls, son affinit pour chaque ligand, KML, et la concentration libre
de chaque ligand, [LE,T ou I]. Dautres facteurs thermodynamiques (pH,
potentiel doxydorduction, prsence dautres mtaux comptitifs) et
cintiques (vitesse de raction du mtal <M> avec les diffrents ligands)
viendront moduler cette comptition. premire vue, la situation ici
ressemble celle que nous avons dcrite pour le milieu extracellulaire
(section 2.1), o la spciation dun mtal peut tre prdite avec confiance
38 cotoxicologie molculaire

partir des quilibres chimiques. Lintrieur dune cellule vivante nest


cependant pas lquilibre ! Il correspond davantage un tat station-
naire, o la cellule pourra activement influencer la distribution du mtal
en agissant sur le flux dentre (contrle du transport trans-membranaire),
sur les ligands intracellulaires disponibles (nature, concentration et
compartimentalisation cellulaire) ainsi que sur les flux de sortie (vers des
vacuoles ou vers lextrieur de la cellule).

Figure 1.5
Liens entre lexposition aux mtaux, leur prise en charge,
leur dtoxication et la manifestation deffets dltres

Pour un mtal essentiel, la cellule visera maintenir une concentra-


tion optimale des formes <MLE>. Si la concentration extracellulaire de
ce mtal augmente, la cellule aura trois choix : agir sur le systme de
prise en charge et rduire le flux dentre ; agir sur le systme defflux et
augmenter ainsi le flux sortant ; ou laisser augmenter le flux dentre du
mtal et entreposer lexcdent de mtal sous forme de complexes <MLI>.
Cette dernire option aurait pour effet de constituer une rserve intra-
cellulaire facilement mobilise et de minimiser les chances que le mtal se
lie aux ligands de type LT et provoque des effets dltres. Lensemble de
ces processus assurera lhomostasie du mtal essentiel.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 39

Des considrations semblables sappliquent aux mtaux non essen-


tiels, quoique dans ce cas la cellule vise une concentration non pas opti-
male mais plutt minimale des complexes de type <MLT>. De nouveau,
la cellule pourra adopter deux stratgies de dtoxication : i) rguler la con-
centration intracellulaire totale du mtal, en empchant son entre dans
la cellule ou en acclrant sa sortie (cas des organismes rgulateurs ,
qui contrleront la teneur intracellulaire du mtal lintrieur dune
gamme troite) ; ii) synthtiser des ligands daffinit approprie, ce qui
permettra de squestrer le mtal dans le milieu intracellulaire et de le
rendre non disponible pour former des complexes de type <MLT> (cas
des organismes accumulateurs , dont la teneur intracellulaire en mtal
est gnralement leve et varie en fonction de lexposition).
Selon une perspective chimique, la dtoxication peut paratre relati-
vement lmentaire, le but ultime tant simplement de limiter/empcher
la formation de complexes de type <MLT>, mais dun point de vue biolo-
gique elle est beaucoup plus complexe (Mason et Jenkins, 1995). Dans cer-
tains cas les mcanismes molculaires/cellulaires impliqus dans la
dtoxication peuvent oprer de manire constitutive (cas des phytoch-
latines chez les cellules vgtales), alors que dans dautres situations ils
doivent tre induits (cas de la mtallothionine). Lorsque la stratgie de
dtoxication est active et devient oprationnelle durant le cycle de vie de
lorganisme expos, on peut parler dacclimatation physiologique. Si par
contre la stratgie dcoule dun processus de slection naturelle chez des
populations dorganismes exposs au mtal, et si la rsistance au mtal
peut tre transfre la progniture, on parlera plutt ladaptation gn-
tique. Sur le plan biologique, ces deux processus sont radicalement diff-
rents, mais leurs consquences sont semblables : dans le deux cas la toxicit
du mtal est rduite et lorganisme acquiert de la tolrance/rsistance.
Signalons que ces deux derniers termes sont relis lun lautre, mais quils
ne sont pas strictement synonymes. Selon Mason et Jenkins (1995), la
rsistance implique la capacit de sopposer aux effets ngatifs du mtal
et de ramener/maintenir les processus physiologiques aux mmes taux
que chez les organismes non exposs. La tolrance suppose elle aussi
une capacit de combattre les effets dltres du mtal, mais de manire
moins efficace, de sorte que les processus mtaboliques continuent de se
drouler, mais des taux anormaux.

2.3.3. Spciation intracellulaire des mtaux un outil pour dceler la toxicit ?


Selon le modle intgr de toxicit/dtoxication prsent dans les sec-
tions prcdentes, la dtermination de la spciation intracellulaire des
mtaux pourrait nous renseigner indirectement sur ltat physiologique
dun organisme. Considrons, par exemple, le cas dun organisme accu-
mulateur (p. ex., un mollusque) qui vit dans un environnement propre
40 cotoxicologie molculaire

mais qui doit soudainement faire face des concentrations leves dun
mtal non essentiel comme le Cd (scnario dune exposition pisodique).
Dans les conditions initiales, lorganisme devrait tre en mesure de pro-
tger les ligands de type LT et dviter que le Cd forme des complexes de
type CdLT ; une dtermination de la spciation intracellulaire du Cd
montrerait des concentrations en <CdLT> trs faibles. Si maintenant on
changeait le rgime dexposition, en augmentant [Cd2+], la prise en charge
du mtal augmenterait et sa concentration intracellulaire suivrait. Si
lorganisme tait en mesure de dtoxiquer le mtal, la concentration en
<CdLI> augmenterait progressivement avec le temps, mais celle en <Cd
LT> resterait faible et relativement constante. Si, par contre, le flux dentre
du Cd dpassait les capacits de lorganisme dtoxiquer le mtal, on
sattendrait voir une augmentation de la concentration des formes <Cd
LT>, et cette augmentation correspondrait au dclenchement des effets
dltres chez lorganisme expos.
Pour tester ce modle de dbordement cellulaire , il faut pouvoir
distinguer exprimentalement entre les formes <MLI> et <MLT>. Si on
se limite au cytosol, cest dire aux ligands intracellulaires dissous (acides
amins, peptides, mtallothionine, enzymes, etc.), on pourra homog-
niser la cellule, isoler le cytosol par ultracentrifugation, puis sparer les
complexes MLcytosol par chromatographie dexclusion (Micallef et al.,
1992). Dans ce genre dapproche on associe les ligands de poids molcu-
laire lev des enzymes, une fraction qui normalement ne devrait pas
contenir des mtaux non essentiels ; en suivant de prs leur contenu en
mtaux, on peut en principe dceler linitiation du dbordement cellu-
laire . Pour considrer la fois le cytosol, les organelles ainsi que les gra-
nules/lysosomes, on peut faire appel des techniques de centrifugation
diffrentielle (Wallace et Lopez, 1997) et les coupler une tape finale de
chromatographie dexclusion, applique au cytosol.
Le modle de dbordement cellulaire a t test quelques
reprises (Jenkins et Mason, 1988 ; Couillard et al., 1995a,b ; Baudrimont et
al., 1999), mais toujours selon un protocole impliquant un changement
dans le rgime dexposition o les organismes tests ont d subir une aug-
mentation brusque de la concentration du mtal dans leur milieu. Nous
sommes en droit de nous demander si le modle sapplique aussi chez les
organismes qui sont exposs de manire chronique des concentrations
leves de mtaux, comme chez les organismes indignes sdentaires
vivant dans des lacs contamins. Cest la question qui fait lobjet du cas
dtude prsent au chapitre 2. Cependant, avant dy arriver, nous devons
considrer en dtail les mtallothionines, des molcules polyfonction-
nelles auxquelles on attribue souvent un rle de dtoxication. Cest ce que
nous ferons la section 3 de ce chapitre.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 41

3. MTALLOTHIONINES
3.1. INTRODUCTION
Les recherches scientifiques sur les mtallothionines (MT) dbutent il y
a plus de 40 ans avec lisolation dans les annes 1950 dune protine com-
plexant le cadmium dans le rein du cheval (Margoshes et Vallee, 1957).
Depuis ce temps les tudes sur ces protines ont port sur dautres groupes
animaux ; leurs fonctions sont mal cernes et restent lobjet dintenses dis-
cussions. Le dveloppement de ce domaine de recherche a bnfici de
contributions en biochimie, en mdecine humaine et vtrinaire, en nutri-
tion, en pathologie, en cancrologie, en toxicologie et en cotoxicologie. Il
peut tre constat que lintrt suscit par les mtallothionines reste lev,
eu gard au nombre darticles publis danne en anne (> 1000 : Nordberg,
1998) et les confrences internationales sur le sujet depuis 20 ans (Kgi et
Kojima, 1987 ; Kgi et Nordberg ; 1979, Suzuki et al., 1993). La prsente
revue documentaire sappuie sur ce savoir ainsi que sur nos recherches
sur des organismes aquatiques deau douce. Le lecteur peut galement
consulter des publications et articles de revue rcents portant sur la puri-
fication, la caractrisation et la quantification des mtallothionines
(Stillman et al., 1992 ; Stillman, 1995), et les synthses qui furent faites sur
les poissons et invertbrs aquatiques (Amiard et Cosson, 1997 ; Cosson
et Amiard, 2000 ; George et Olsson, 1994 ; Roesijadi, 1992).

3.2. BIOCHIMIE
Appartenant au groupe des mtalloprotines, les mtallothionines pr-
sentent des caractristiques uniques (Roesijadi, 1992 ; Stillman, 1995) :
une forte teneur en cystine, atteignant 33 % sur les 61 acides amins
que comportent les formes mammaliennes ;
une absence totale dacides amins aromatiques ;
un contenu lev et une forte affinit pour les mtaux ;
un poids molculaire de 67 kD, ou de 10 kD lorsque celui-ci est
estim partir de la chromatographie liquide dexclusion ;
un spectre dabsorption dans lultraviolet comportant une absence
dabsorbance 280 nm, en raison de labsence dacides amins
aromatiques, et un pic dabsorbance des longueurs dondes qui
varient selon le mtal qui est associ aux groupements thiols (Cd :
250 nm) ;
labsence de ponts disulfure ;
une grande thermostabilit et la capacit de rsister aux attaques
acides.

Licence enqc-11-620680-583909-950 accorde le 18 mars 2011


Algeria Educ
42 cotoxicologie molculaire

La structure tridimensionnelle de ces protines a t rvle grce


la rsonance magntique nuclaire et aux techniques de diffraction aux
rayons X. Typiquement, on peut distinguer deux domaines globulaires (
et ) lis entre eux par deux lysines (figure 1.6). Le domaine  comporte
11 cystines alors que le domaine  en comporte 9. Les ions mtalliques
qui leur sont associs sont isols de lextrieur par la chane peptidique.
Ces deux domaines paraissent indpendants lun de lautre et semblent
arborer des affinits respectives diffrentes pour les mtaux. Lensemble
forme une structure dynamique dans laquelle les changes intramol-
culaires et intermolculaires de mtaux avec dautres ligands cellulaires
ont pu tre mis en vidence. Ces changes sont permis par la prsence de
deux crevasses donnant accs aux liaisons cystiniques des sites de fixation
dans chacun des domaines (Brouwer et al., 1993 ; Stillman, 1995). On a
entre autres dcouvert lexistence de complexes CuMTGSH lintrieur
de cellules de vertbrs et dinvertbrs (Brouwer et al., 1993).
En contraste avec cette relative aisance dans les transferts inter-
molculaires de mtaux, les mtallothionines retiennent fortement les
ions mtalliques qui leur sont associs. Des constantes dassociation de
2 1012 (pH 7) et 2  1019 (pH 8) sont rapportes respectivement pour le
Zn et le Cd (MT mammalienne : Roesijadi, 1992 ; Vallee et Maret, 1993). In
vitro, laffinit des mtaux pour les MT dcrot gnralement dans lordre
Hg(II) > Ag(I) Cu(I) > Cd(II) > Zn(II) (Stillman, 1995). Les rapports
stchiomtriques dduits partir de techniques de spectroscopie optique
indiquent gnralement que dans le rgne animal, une molcule de MT
peut lier sept ions pour le Hg(II), le Cd(II) et le Zn(II), 12 pour le Cu(I) et
12, 17 ou 18 pour lAg(I). Des rapports particuliers sont observs chez
certains organismes en fonction notamment de labondance des grou-
pements thiols (Stillman, 1995).
Les mtallothionines se prsentent naturellement sous une mul-
tiplicit de formes. Une mme molcule peut voir ses deux domaines
occups par diffrents ions mtalliques. De plus, on a pu observer plusieurs
isoformes dans un mme organisme et dans diffrents phylums. Ces pro-
tines semblent ubiquistes on en a rapport chez lhumain (quatre
isoformes), les mammifres terrestres et aquatiques, les amphibiens et rep-
tiles, les oiseaux, les poissons, les protistes unicellulaires, les champignons
microscopiques et les vgtaux (Bebianno et al., 1992 ; Bell et Lopez, 1985 ;
Chattai et al., 1997 ; Couillard, 1997 ; Hamer, 1986 ; High et al., 1997 ;
Laflamme et al., 2000 ; Mackay et al., 1993 ; Overnell et al., 1981 ; Rauser,
1993 ; Roesijadi, 1992 ; Santovino et al., 2000 ; Schlenck et al., 1995 ; Shears
et Fletcher, 1984 ; Sulaiman et al., 1991 ; Stillman, 1995 ; Suzuki etal., 1993 ;
Unger et al., 1991).
Prise en charge et dtoxication des mtaux 43

Figure 1.6
Structure tridimensionnelle des deux domaines de chlation
mtallique de la mtallothionine 2a du foie de lapin

Le chiffrage des structures renvoie la localisation des cystines le long de la chane


peptidique de la protine.
Source : Adapt de Stillman (1995).

Les structures primaires ne sont pas connues pour toutes les


mtallothionines isoles ce jour. Cependant, il est possible de dfinir
trois classes de MT sur la base de composition en acides amins et de leur
mode de formation. Le principal critre retenu dans cet exercice est lali-
gnement des squences cyscys, cysaaXcys, et cysaaXaaYcys o aaX
et aaY reprsentent un acide amin autre que la cystine (Fowler et al.,
1987) :
la classe I regroupe les polypeptides montrant un alignement en
cystine trs similaire celui de la MT du rein de cheval ;
la classe II comprend les polypeptides avec un alignement en cystine
non homologue la MT quine ; les formes isoles notamment dans
les levures et certains vgtaux terrestres appartiennent cette classe ;
la classe III incluent les polypeptides non directement produits par
un gne, tels la cadystine et les phytochlatines, ces dernires tant
un assemblage GluCys(n)Gly o n varie de 2 11. Ces composs
ont t isols dans les champignons, plantes et algues.
44 cotoxicologie molculaire

3.3. SYNTHSE ET DGRADATION


Les mtallothionines, lexception de celles de la classe III, sont synth-
tises par un processus dinduction. Au sens biologique, linduction
dsigne lactivation dun phnomne se produisant avec un certain retard
relativement lagent dclencheur de celui-ci. La complexit du mca-
nisme cellulaire de biosynthse est responsable de ce dlai dans la pro-
duction des MT. Le tableau 1.7 fait tat des facteurs physiologiques et
exprimentaux induisant la synthse des mtallothionines chez les
mammifres (Cousins, 1985 ; Onasaka et al., 1987 ; Palmiter, 1998).

Tableau 1.7
Facteurs physiologiques et exprimentaux entranant
linduction de mtallothionine chez les mammifres

Facteurs physiologiques Facteurs exprimentaux


Dveloppement Ag Adjuvant contre larthrite Isopropanol
Zinc dans la dite Cd Agents alkylants Acide rtinoque
Infection (citokines) Cu Endotoxine Trbenthine
Jene Hg Epinphrine Chloroforme
Stress (capture) Zn Glucocorticodes Malate de dithyle
Diabte Ni Glucagon Paraquat
Co Interleukine 1 CCl4
Bi H 2O 2

Les stimuli physiologiques et hormonaux promeuvent habituel-


lement la production de Zn ou de Cuthionine (Stillman, 1995).
Cependant, il est gnralement admis que les mtaux sont les plus forts
inducteurs de MT (Hamilton et Mehrle, 1986 ; Klaassen, 1981). Des exp-
riences avec des cultures cellulaires dont on a modifi le matriel gntique
ont dmontr que lintensit de lexpression de ces mtalloprotines est
fortement dpendante du mtal inducteur. En prsence de zinc dans le
milieu de culture, les potentiels dinduction des mtaux sont dans lordre
Cd > Cu ~ Zn >Ag > Bi >Hg > Ni ~ Co (Palmiter, 1994). En environne-
ment naturel, les variations en MT sont frquemment associes la pr-
sence de mtaux traces dans le milieu ambiant (Amiard et Cosson, 1997 ;
Couillard, 1997).
Des modles cellulaires de synthse et de dgradation des mtal-
lothionines ont t rcemment proposs (Davis et Cousins, 2000 ;
Hogstrand, 1991 ; Palmiter, 1994 ; Roesijadi, 1996 ; figure 1.7). Leurs carac-
tristiques individuelles ne sont pas toutes fondes sur des certitudes et
Prise en charge et dtoxication des mtaux 45

plusieurs de celles-ci restent valider en milieu naturel. Linduction des


MT par des mtaux et agents oxydants dbuterait par un accroissement
initial du zinc cellulaire labile. Les mtaux faisant intrusion dplaceraient
le zinc des ligands avec lesquels il serait initialement complex. Les agents
oxydants (p. ex., HO, NO, GSSG) feraient de mme en librant le Zn
du rservoir initial de Znthionine (Davis et Cousins, 2000). Ce zinc rendu
disponible serait habilit se lier des lments inhibiteurs de trans-
cription (EIT), ces derniers faisant office de verrou des facteurs de trans-
cription (MTF-1). Le dcodage dun gne spcifique la MT sinitierait
par la complexation de la molcule MTF-1 avec llment rgulateur (ERM)
correspondant en amont du gne. Les complexes mtal-ligand initiale-
ment forms reprsenteraient des interactions toxiques (p. ex., turbot,
George et al., 1996), qui seraient rpars par change mtallique avec la
ZnMT nouvellement synthtise. Llimination des mtaux en excs pro-
cderait par exocytose de lysosomes renfermant des formes polymrises
de complexes mtalMT. Ce mcanisme parat plus efficace liminer le
Cu et le Zn cellulaire excdentaire que le Cd (Hogstrand, 1991 : mammi-
fres et poissons ; George, 1983 : mollusques). Ces observations sont en
accord avec les demi-vies estimes trs longues du Cd chez de nombreux
vertbrs (Hogstrand, 1991, humain inclus) et invertbrs (George, 1983).
Comme indiqu plus haut, ce cycle dinduction se montrerait galement
efficace rduire la quantit doxydants cellulaires avec comme acteur
central la ZnMT nouvellement produite, faisant office dantioxydant
ultime (Powell, 2000).
Plusieurs autres lments rgulateurs de la transcription des gnes
MT ont t mis en vidence (figure 1.6), dont un rceptif aux gluco-
corticodes (ERG : Davis et Cousins, 2000) et lun rpondant aux lectro-
phyles (ERA, rcemment isol : Andrews, 2000). Le facteur de transcription
MTF-1 a t isol dans de nombreux groupes animaux il sagit une pro-
tine du type Cys2His2 caractrise par la prsence de structures en
digitation. Le zinc parat ncessaire au maintien de ces structures et
linteraction du facteur MTF-1 avec lADN cellulaire (Andrews, 2000 ; voir
galement Vallee et Maret, 1993).

3.4. FONCTIONS
Il a t voqu en introduction que les fonctions biologiques relles des
mtallothionines sont encore sujettes controverse. Ce dbat continue
dtre aliment par des observations rcentes selon lesquelles des souris
transgniques dont on a inactiv les gnes codant pour les MT peuvent
quand mme survivre et ne pas prsenter de symptmes de dficience en
zinc dans la mesure o elles sont nourries avec une dite quilibre. Le
46

Figure 1.7
Modle de synthse et de dgradation
de la mtallothionine lchelle cellulaire

ERM : lment rgulateur rceptif aux mtaux, ERG : lment rgulateur rceptif aux glucocorticodes ; ERA : lment rgulateur rceptif aux oxydants.
On suppose le mtal extracellulaire associ un ligand pour son transport lintrieur de la cellule. La synthse de la MT est induite par des
hormones, des agents oxydants et des mtaux traces ; linduction par ces derniers implique le dplacement du zinc de ligands intracellulai-
res. Ce zinc rendu labile active un facteur de transcription (MTF-1) autorisant le dcodage du gne MT. La mtallothionine nouvellement pro-
duite possderait une affinit pour les mtaux inducteurs suprieure aux autres ligands intracellulaires. La Cu et la Znthionine excdentaires

cotoxicologie molculaire

saccumuleraient dans les lysosomes sous une forme polymrise pour ensuite tre ventuellement excrtes par exocytose.
Source : Adapt de Davis et Cousins (2000), Hogstrand (1991), Roesijadi (1992) et Palmiter (1994).
Prise en charge et dtoxication des mtaux 47

tout suggre que dautres mcanismes homostatiques jouent un rle pr-


pondrant dans la stabilisation des rservoirs de zinc et llimination
dapports excdentaires de ce mtal (Dalton et al., 1996 ; Kelly et al., 1996).
Si de tels mcanismes (non bass sur la MT) apparaissent efficaces
rguler les mtaux essentiels, il semble en aller tout autrement pour les
mtaux non essentiels. Par exemple, lexception des bactries, les orga-
nismes vivants ne semblent pas avoir dvelopp de mcanismes dexcr-
tion efficace pour le cadmium (Palmiter, 1998 ; Simkiss et Taylor, 1995).
Sa dtoxication se ferait alors par un systme charg de sa squestration
lintrieur de lorganisme la MT se veut un des candidats logiques ce
poste (Palmiter, 1998). De nouvelles tudes contribuent la diversit dj
riche en formes et en fonctions potentielles attribues cette classe de
mtalloprotines. Quelques-unes des plus importantes sont rsumes dans
les sections suivantes.

3.4.1. Rle dans la rgulation des mtaux essentiels


La propension des mtallothionines changer des mtaux sest rvle
partir des connaissances de leur structure et des aspects dynamiques
lis leur fonctionnement (section 3.2). Des changes intermolculaires
de Cu et de Zn avec les MT comme molcules donneuses ont par ailleurs
t mis en vidence dans des expriences in vitro (Vallee et Maret, 1993).
Cependant, dautres recherches illustrent que les MT peuvent remplir des
fonctions trs diverses selon lorgane ou lespce animale considre.
Une srie de travaux intressants effectus par Engel et Brouwer ont
montr que les MT peuvent jouer un rle actif dans le mtabolisme et la
mobilisation des mtaux essentiels au cours du cycle de mue des crus-
tacs dcapodes (figure 1.8). Ainsi, les MT peuvent squestrer le Cu pro-
venant du catabolisme de lhmocyanine (pigment respiratoire contenant
du Cu) en pr-mue ; et elles peuvent devenir donneuses de Cu pour la
synthse dhmocyanine au cours de la reconstitution des tissus (Engel et
Brouwer, 1987). La glutathione serait une intermdiaire dans ce dernier
processus (ligand pour le Cu(I) : Engel et Brouwer, 1993). Il est tabli que
ce mcanisme de mue est sous le contrle dhormones ecdystrodes. Dans
ce contexte, Torreblanca et al. (1996) injectrent lhormone 20-hydroxyec-
dysone des spcimens mles de lcrevisse Procambarus claarki se trouvant
en inter-mue. Lhormone dclencha la perte de protines, Cu et Zn dans
lhpatopancras. En contrepartie les niveaux de MT augmentrent et le
rapport molaire Zn/Cu bascula en faveur du zinc dans lorgane. Ces chan-
gements correspondent assez bien ceux dcrits par Engel et Brouwer
(1987) durant la transition de linter-mue la pr-mue chez le crabe bleu.
48 cotoxicologie molculaire

Figure 1.8
Changements dans les concentrations dhmocyanine, de cuivre
et de zincthionine dans lhpatopancras du crabe bleu
Callinectes sapidus au cours de son cycle de mue

Zn-MT

HMOCYANINE

Cu-MT

La rgion ombre indique une priode de transition dune CuMT vers une ZnMT.
Les stades de mue reprsents sont :
A : carapace molle ; B : carapace en voie de durcissement ;
C : inter-mue ; D : pr-mue.
La flche dsigne lecdyse.
Source : Adapt dEngel et Brouwer (1993).

Chez les petits mammifres, les mtallothionines semblent repr-


senter un rservoir de zinc qui peut tre mobilis lors dpisodes de carence
en ce mtal. Les MT protgeraient galement les tissus de charges toxiques
en Zn (Dalton et al., 1996 ; Kelly et al., 1996 ; Palmiter, 1998). Dautre part,
une mtallothionine dun nouveau type (nomme MT-III) a rcemment
t isole dans le cerveau humain. Son expression nest pas rgule par
Prise en charge et dtoxication des mtaux 49

les mtaux ou les glucocorticodes et elle remplit le rle inusit dinhibi-


teur de croissance. On a associ son malfonctionnement la maladie
dAlzheimer (Vallee et Maret, 1993).

3.4.2. Protection contre le stress oxydant


La dcouverte rcente dlments rgulateurs de transcription rpondant
des agents oxydants (figure 1.7) dsigne sans ambigut un rle pour la
mtallothionine dans la dfense cellulaire contre le stress oxydant (p. ex.,
Wright et al., 2000, poissons). La mtalloprotine est vue comme un anti-
oxydant direct parce que ses groupements thiols ont la capacit de cap-
turer les radicaux hydroxyle HO et superoxyde O2 (Viarengo, 1989). De
plus, le zinc libr par loxydation de la MT est un antioxydant puissant
et permettrait de stabiliser les membranes endommages (Powell, 2000).
La comparaison des capacits antioxydantes du dithiothritol, de lapo-
thionine et de la Zn-thionine amena Thomas et al. (1986) conclure que
la libration dions Zn de la MT tait bien plus importante que loxyda-
tion des groupes thiols de la protine pour diminuer les dommages causs
aux membranes par les oxydants. Ce type de stress est gnralement
rpandu dans le rgne animal et peut tre dclench par des mtaux, des
xnobiotiques et dautres substances naturelles favorisant les phnomnes
de peroxydation lipidique. La privation deau et de nourriture sont
dautres agents dclencheurs (Bremner et Beattie, 1990).

3.4.3. Dtoxication des mtaux traces


La dcouverte en 1957 dune mtallothionine complexant le Cd dans le
foie de cheval amena initialement Vallee et ses collaborateurs dduire
lexistence dun systme biologique de dtoxication pour ce mtal (Vallee
et Maret, 1993). Cette fonction a depuis t mise en doute entre autres en
raison de lanciennet de la protine dans le monde vivant et du caractre
rcent ( lchelle gologique) de la pollution de la biosphre par les mtaux
traces. cet gard, il reste possible que la dtoxication interne des mtaux
soit une proprit des MT plutt quun rle affirm (Cosson et al., 1991 ;
Palmiter, 1998). Nanmoins, certaines populations animales semblent avoir
mis profit cette proprit leur confrant la possibilit de vivre et de se
reproduire en un environnement enrichi en mtaux (discut ci-aprs).
Deux catgories dexpriences appuient fermement la thse dun rle
(ou effet) protecteur des mtallothionines en regard de la toxicit de mtaux
essentiels ou non (tableau 1.8). Primo, le prconditionnement en labora-
toire dorganismes des concentrations de Cd, Cu ou Zn suffisantes pour
induire la synthse de MT leur a donn une tolrance accrue des exposi-
tions mtalliques subsquentes (Hogstrand, 1991 ; Klaverkamp et Duncan,
50 cotoxicologie molculaire

1987 ; Roesijadi et Fellingham, 1987 ; CNRC, 1985). Par ailleurs, des obser-
vations sur des populations naturelles dphmres indiquent que des larves
despces sensibles au Cd ne synthtisent pas de MT en rponse une
agression par ce mtal. Ces espces sont introuvables dans les milieux
contamins, en conformit avec leur sensibilit au Cd (Aoki etal., 1989).

Tableau 1.8
tudes montrant le rle des mtallothionines
dans lacquisition dune tolrance accrue aux mtaux

Organisme Type dexprience Rfrence


Meunier noir Tests de toxicit in situ Klaverkamp
Catostomus commersoni en enclos et al., 1991
Saumon Coho juvnile tude en laboratoire McCarter et
Oncorhynchus kisutch Roch, 1983
Carpe Cyprinus carpio tude en laboratoire Kito et al., 1982
Truite arc-en-ciel juvnile tude en laboratoire Dixon et
Oncorhynchus mykiss Sprague, 1981a,b
Moule bleue tude en laboratoire Roesijadi et
Mytilus edulis Fellingham, 1987
Populations naturelles tude en laboratoire Maroni et al., 1987
de mouches fruit
Drosophila melanogaster
Souris transgniques Utilisation dune souche avec Habeebu et al.,
une mutation MT-null 2000
inactivant le gne MT
Utilisation dune souche Liu et al., 1999
sauvage produisant de la MT

La seconde classe dexpriences comporte une manipulation gn-


tique de lignes cellulaires, ou dorganismes entiers, de faon les rendre
incapables de produire de la MT ou en faire des sur-producteurs (sou-
vent par duplication de gne, voir le tableau 1.8). Des expriences en
laboratoire ont montr la grande sensibilit des premiers et la rsistance
accrue des seconds lexposition aux mtaux traces (Roesijadi, 1992 :
exemple avec Cu et levure, Hogstrand, 1991).
Prise en charge et dtoxication des mtaux 51

4. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Au dbut de ce chapitre, nous avons insist sur les proprits qui diff-
rencient les contaminants inorganiques (mtaux et mtallodes) des
(micro)polluants organiques. Rappelons, titre dexemple, la prsence
naturelle des mtaux dans la crote terrestre, leur persistance infinie (pas
sujets la biodgradation) et leur implication comme lments essentiels
requis pour le mtabolisme des organismes vivants. Dans un contexte
cotoxicologique, il importe donc de considrer sparment ces deux
classes de contaminants. Par ailleurs, le nombre de contaminants mtal-
liques est limit par la ralit du Tableau priodique des lments (~80
mtaux et mtallodes). Lidentification parmi ceux-ci des mtaux prio-
ritaires , dans un contexte cotoxicologique, fait appel des critres
biogochimiques (quantification de linfluence des activits humaines sur
les cycles dlments) et toxicologiques (toxicit inhrente des diffrents
mtaux). La considration de tels critres mne lidentification dun
nombre plus restreint de mtaux dintrt prioritaire (p. ex., Cd, Cu, Hg,
Pb, Zn).
Dans un deuxime temps, nous avons examin linteraction des
mtaux avec les organismes aquatiques, en considrant la squence sui-
vante : la spciation des mtaux en solution leurs interactions avec les
membranes cellulaires leur transport transmembranaire leurs rac-
tions intracellulaires leur dtoxication. De cette analyse nous pouvons
dgager quelques conclusions gnrales :
La spciation dun mtal dissous dpend de la composition de la
solution aqueuse dans laquelle il se trouve (pH ; potentiel doxydo-
rduction ; concentration des divers ligands) et de son affinit pour
les ligands disponibles. cause de la variabilit invitable de la com-
position des eaux naturelles, la spciation chimique dun mtal varie
dun milieu un autre ; cependant, malgr cette variabilit inhrente,
les proprits intrinsques du cation mtallique savrent encore plus
importantes dans la dtermination de la spciation dun mtal et les
mmes tendances gnrales se manifestent dans divers milieux
(p.ex., proportion du mtal prsente sous forme dions libres plus
importante dans les cas du Cd et du Zn que pour le Cu ou le Pb).
quelques exceptions prs, les mtaux cationiques et leur complexes
ne peuvent traverser des membranes biologiques par simple diffu-
sion ; la prise en charge (uptake) des mtaux fait plutt appel au
transport facilit, impliquant des transporteurs protiques intgrs
la membrane.
52 cotoxicologie molculaire

Les transporteurs impliqus dans le transfert transmembranaire des


cations rpondent la concentration de lion mtallique libre dans
la solution externe, [Mz+]. Le modle du ligand biotique (BLM), qui
tient compte de cette dpendance, a dmontr une utilit indniable
dans la prdiction de la bioaccumulation de plusieurs mtaux
cationiques et de leurs effets associs (surtout pour les organismes
aquatiques qui obtiennent leurs mtaux principalement par la voie
aqueuse). Il faut cependant noter que la grande majorit des exp-
riences qui appuient le BLM ont t ralises en laboratoire, dans
des milieux sans matire organique naturelle ; lapplicabilit du
modle gagnerait tre value en milieu naturel et pour diverses
combinaisons mtal-organisme.
Pour saisir comment les mtaux exercent leur toxicit, il faut com-
prendre leurs rles mtaboliques essentiels (rle strique, rle cata-
lytique et rle oxydatif/rductif). Les mtaux jouant ces rles
mtaboliques essentiels sont tous lis des molcules organiques
par des ractions de complexation. Ces ractions de complexation
sont rversibles ; par consquent, un mtal tranger qui entre dans
une cellule peut dplacer un mtal/cation essentiel. Ce genre de
dplacement ne se limite pas aux mtaux trangers ; mme un
mtal essentiel, sil est prsent des concentrations intracellulaires
anormalement leves, pourra provoquer un tel dplacement par la
loi daction des masses. En dautres termes, laction toxicologique
dun mtal dcoule de son interaction anormale avec une biomolcule
essentielle.
Une fois accumul, un mtal donn peut normalement ragir avec
une varit de ligands intracellulaires et provoquer une diversit
deffets. De mme, un ligand intracellulaire donn peut normalement
accepter diffrents mtaux (slectivit imparfaite), donc un effet
donn peut tre induit par plus dun mtal. Il sensuit quaucune
cible intracellulaire ne serait entirement spcifique un seul mtal
et quaucun mtal ne savrerait entirement spcifique une seule
cible.
Plusieurs organismes ont dvelopp des mcanismes efficaces pour
contrler leurs concentrations internes de mtaux essentiels et pour
maintenir celles-ci dans des gammes relativement restreintes (con-
trle homostatique). Ces mcanismes de contrle homostatique
peuvent galement jouer un rle dans la dtoxication de mtaux non
essentiels (p. ex., le cadmium (Cd), le plomb (Pb) ou le mercure (Hg)).
Dans certains cas, lorganisme contrle la concentration intracel-
lulaire totale du mtal, en empchant son entre dans la cellule ou
en acclrant sa sortie (cas des organismes rgulateurs , qui
Prise en charge et dtoxication des mtaux 53

contrlent leur teneur intracellulaire du mtal lintrieur dune


gamme troite) ; dans dautres cas, lorganisme synthtise des ligands
daffinit approprie, qui permettent de squestrer le mtal dans le
milieu intracellulaire et de le rendre non disponible (cas des orga-
nismes accumulateurs , dont les teneurs intracellulaires en mtal
sont gnralement leves et varient en fonction de lexposition).
Plusieurs organismes accroissent leur concentration interne de
mtallothionine pour se protger des mtaux en excs dans leur
milieu environnant. Ce faisant, ils deviennent plus tolrants des
expositions mtalliques subsquentes.
La mtallothionine est actuellement utilise comme outil dans divers
programmes de suivi environnemental des pollutions mtalliques
en milieu aquatique. Elle indique si lorganisme sentinelle a t
expos une concentration biodisponible de mtal dans son milieu
ambiant. Cependant, la vritable utilit de cet outil rsiderait dans
son potentiel prdire ou indiquer si des effets dltres se sont
produits sur lorganisme sentinelle en question en raison de la pres-
sion de contamination. Un tel potentiel na pas encore t dmontr,
mais les donnes disponibles demeurent encourageantes cet gard.
Considrons maintenant les perspectives de recherche dans ce
domaine. Selon le modle intgr de toxicit/dtoxication que nous avons
dvelopp dans ce chapitre, la dtermination de la spciation intracellu-
laire des mtaux pourrait en principe savrer utile pour diagnostiquer
ltat physiologique dun organisme (concept dun biomarqueur deffets).
Il sagirait de pouvoir diffrencier les mtaux lis des biomolcules sen-
sibles de ceux qui ont t squestrs lintrieur de la cellule sous forme
inerte. En se limitant au cytosol, cest--dire aux ligands intracellulaires
dissous (acides amins, peptides, mtallothionine, enzymes, etc.), on peut
envisager lhomognisation du tissu, la sparation du cytosol par ultra-
centrifugation, puis la sparation des complexes MLcytosol par chromato-
graphie. Dans ce genre dapproche on associe les ligands de poids
molculaire lev des enzymes, une fraction qui normalement ne devrait
pas contenir des mtaux non essentiels ; en suivant de prs leur contenu
en mtaux, on peut en principe dceler linitiation du dbordement cel-
lulaire . Pour considrer la fois le cytosol, les organelles ainsi que les
granules/lysosomes, on peut faire appel des techniques de centrifuga-
tion diffrentielle et les coupler une tape finale de chromatographie,
applique au cytosol. Lapplication de telles approches intgres nous
semble prometteuse, mais il faudra sassurer que les techniques utilises
pour sparer les diverses fractions intracellulaires ne perturbent pas la
rpartition subcellulaire originale des mtaux (p. ex., les complexes
MLcytosol sont-ils suffisamment stables pour demeurer intacts pendant
les tapes de sparation chromatographique ?).
54 cotoxicologie molculaire

Rappelons aussi que toutes les expriences qui appuient le modle


de dbordement cellulaire , sans exception, ont t ralises selon un
protocole impliquant un changement dans le rgime dexposition, cest-
-dire que les organismes tests ont subi une augmentation brusque de la
concentration du mtal dans leur milieu (scnario dune exposition pi-
sodique, potentiellement aigu). Il est lgitime de se demander si le modle
sapplique aussi chez les organismes qui sont exposs de manire chro-
nique des concentrations leves de mtaux, comme chez les organismes
indignes sdentaires vivant dans des lacs modrment contamins. Cest
une question pertinente : avec la dpollution de nos lacs et cours deau,
les cas de contamination aigu deviennent de plus en plus rares, mais les
cas de contamination chronique demeurent abondants.
Prise en charge et dtoxication des mtaux 55

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62 cotoxicologie molculaire
CHAPITRE

2
LA MTALLOTHIONINE
Un biomarqueur dexposition au cadmium
pour les invertbrs deau douce

BERNADETTE PINEL-ALLOUL
GRIL, Dpartement des sciences biologiques,
Universit de Montral

OLIVIER PERCEVAL
GRIL, Dpartement des sciences biologiques,
Universit de Montral

ANIK GIGURE
Universit du Qubec,
INRS Eau, Terre et Environnement

YVES COUILLARD
Environnement Canada,
Division de lvaluation des produits chimiques

PETER G.C. CAMPBELL


Universit du Qubec,
INRS Eau, Terre et Environnement

LANDIS HARE
Universit du Qubec,
INRS Eau, Terre et Environnement
64 cotoxicologie molculaire

RSUM
Cette tude a t conue pour valuer les effets du cadmium sur le bivalve deau douce
Pyganodon grandis, choisi comme espce sentinelle. On cherchait tablir des relations de
type exposition bioaccumulation effets chez des bivalves exposs au Cd dans leur
milieu naturel. Des spcimens du bivalve furent rcolts dans une dizaine de lacs de la
rgion de Rouyn-Noranda, au Qubec. Ces lacs ont t choisis de faon maximiser le
gradient de contamination en Cd, tout en minimisant la variation des facteurs cologiques
pouvant avoir un effet confondant sur les rponses des bivalves indignes au gradient de
contamination. La concentration en Cd2+ libre, calcule partir des quilibres sdiments-
eaux, a t utilise pour valuer lexposition au Cd ([Cd2+ ] : 0,005-0,96 nM). La mtallo-
thionine a t mesure dans les branchies des bivalves ([MT] : 18-340 nmolsitesg1 p.
sec), et la rpartition subcellulaire du Cd entre diffrentes fractions cytosoliques a t
value par chromatographie dexclusion sur gel (HPM = ligands cytosoliques de poids
molculaire lev, > 18 kDa ; FPM = ligands cytosoliques de poids molculaire faible,
<1,8kDa ; MT = mtallothionine). Divers autres biomarqueurs ont t mesurs au niveau
cellulaire : la concentration en malondialdhyde (MDA) dans les branchies et dans la glande
digestive ; lactivit des enzymes glutathion-peroxydase et glutathion-rductase dans la
glande digestive ; contenu en lipides des gonades. Dautre part, ltat de sant des popu-
lations de P. grandis a t diagnostiqu sur la base des variables de dynamique des
populations, soit la densit et la biomasse dans la zone littorale des lacs, les paramtres de
croissance (K : taux de croissance instantane ; : longueur asymptotique thorique), la
production annuelle, le ratio de la production la biomasse (ratio P/B), le temps de
renouvellement de la population (inverse du ratio P/B) et la fcondit cumule.
Les concentrations en Cd et en MT dans le cytosol des branchies augmentaient en
fonction du gradient de contamination en Cd2+. Malgr cette augmentation, la distribu-
tion du Cd entre les diffrents complexes cytosoliques demeurait relativement constante :
80 % dans la fraction Cd-MT, 7 % dans la fraction Cd-FPM et 13 % dans la fraction Cd-
HPM. Pour ces organismes exposs au Cd de manire chronique, il ny avait donc pas de
seuil dexposition partir duquel la distribution du Cd commenait tre perturbe.
Cependant, la prsence du Cd dans les fractions Cd-FPM et Cd-HPM suggre que sa dtoxi-
cation tait imparfaite, cest--dire que P. grandis a t soumis un stress caus par le Cd
mme des concentrations externes en Cd relativement modestes.
Dautre part, notre tude a permis de relier laccumulation de Cd dans le cytosol
des branchies des bivalves un stress oxydant au niveau des membranes cellulaires,
manifest par la production de malondialdhyde, un indicateur de peroxydation lipidique
des membranes cellulaires, sans toutefois dmontrer un lien direct avec la production de
MT ou des formes de Cd lies aux ligands intracellulaires. Elle montre aussi un lien
apparent entre le mauvais tat de sant des populations de bivalves dans les lacs les plus
contamins et la contamination en Cd2+ dans le milieu, et laugmentation de Cd li aux
ligands de haut poids molculaire (Cd-HPM). Ceci pourrait indiquer que la rpartition
du Cd entre les ligands intracellulaires offre un potentiel de diagnostic des effets nfastes
au niveau des populations. Il semble cependant difficile dans le cadre de cette tude de
cas dassigner la MT ou dautres biomarqueurs potentiels (Cd-HPM, Cd-FPM), un rle
prdictif deffets cotoxicologiques sur ltat des populations de bivalves, cause des effets
confondants des facteurs cologiques sur les rponses des populations. Nanmoins, cette
tude de cas fournit un cadre cotoxicologique intgr pour lapplication de biomarqueurs
et/ou dapproches diagnostiques la problmatique de contamination par les mtaux
traces en rgion minire.
La mtallothionine 65

1. INTRODUCTION
1.1. CONTAMINATION MTALLIQUE DANS LES COSYSTMES AQUATIQUES
Les apports et les flux de plusieurs mtaux traces dans les cosystmes
aquatiques ont fortement augment notamment cause de lexpansion
des activits minires et mtallurgiques (Pacyna et Pacyna, 2001). Parmi
les quatre mtaux traces dintrt prioritaire (Cd, Cu, Pb, Zn) autres que
les organomtaux (p. ex., mthyl-Hg), le cadmium est un mtal non
essentiel qui prsente un grand intrt pour lapplication de biomarqueurs
cause de limportance de ses sources anthropiques et de sa toxicit pour
les humains et les organismes terrestres et aquatiques (Campbell et al., 1985 ;
Yeats et Bewers, 1987 ; Environnement Canada et Sant Canada, 1994 ;
Malley, 1996 ; Campbell et Couillard, 2004, chapitre 1 du prsent volume).
Au niveau mondial, les missions anthropiques de cadmium dans
latmosphre excdent de 3 10 fois les missions naturelles (Yeats et
Bewers, 1987 ; Nriagu et Pacyna, 1988). Ainsi, les apports industriels de
Cd en provenance de la mtallurgie des mtaux non ferreux et de lusage
des combustibles fossiles varient de 3 100 12 000 tan1 tandis que les
apports naturels dus aux feux de fort et au volcanisme sont estims
1 300 tan1 (Nriagu et Pacyna, 1988 ; Garrett, 2000). Au Canada, les sources
anthropiques de Cd se chiffrent 160 tan1 et proviennent de la fonte et
du raffinage des mtaux, de lutilisation des combustibles fossiles pour
lnergie et de lincinration des dchets solides (Environnement Canada
et Sant Canada, 1994). Sajoutent ces contributions des apports diffus
de cadmium lis aux retombes atmosphriques et aux prcipitations
acides, qui entranent sa mise en circulation partir du milieu terrestre
(Tessier et al., 1994). La contamination en Cd des eaux en Ontario et au
Qubec rsulte de la mobilisation accrue du Cd par ces activits indus-
trielles ; les concentrations en surface varient de < 20 pM (< 2 ngL1) dans
les milieux non pollus jusqu des maximums de 5 40 nM (600
4 800ngL1) dans des secteurs trs pollus comme la rgion minire de
Sudbury (Stephenson et Mackie, 1988 ; Malley, 1996). Le devenir du cad-
mium dans les cosystmes aquatiques dpend de nombreux processus
physiques, chimiques et biologiques complexes (Tessier, 1992 ; Tessier et
Turner, 1995 ; Chapman et al., 1998), mais finalement, le cadmium intro-
duit dans lenvironnement aquatique se retrouve en grande partie associ
aux sdiments de fond (p. ex., 93 % des ajouts exprimentaux faits dans
un lac du Bouclier canadien se retrouvent dans les sdiments voir
Lawrence et al., 1996) o il devient une menace potentielle pour les
invertbrs benthiques.
Aux termes de la Loi canadienne sur la protection de lenvironnement
(1999) (LCPE 1999), le cadmium (Cd) est inscrit la Liste des substances
dintrt prioritaire. Sa toxicit pour lhomme et les animaux de laboratoire
66 cotoxicologie molculaire

est bien connue (Environnement Canada et Sant Canada, 1994). En eau


douce, on a de bonnes estimations des concentrations de Cd dans leau,
les sdiments et certains invertbrs tels que les bivalves et les larves
dinsectes (Malley et al., 1993 ; Couillard et al., 1993 ; Hare, 1992 ; Hare et
Tessier, 1996, 1998 ; Andrs et al., 1999 ; Croteau et al., 2002). Cependant,
on connat encore trs mal sa toxicit chronique in situ, la majorit des
tudes toxicologiques ayant t ralises en laboratoire. Traditionnel-
lement, la toxicit des mtaux traces pour les organismes aquatiques a t
value par des tests de toxicit en laboratoire et, dans une moindre
mesure, par des observations in situ des populations indignes exposes.
La capacit des tests de toxicit prdire, seuls, les effets des mtaux
toxiques sur des populations en milieu naturel a souvent t remise en
cause (Kimball et Levin, 1985 ; Cairns et McCormick, 1992 ; Luoma, 1995),
le contexte exprimental en laboratoire tant souvent trs loign des con-
ditions relles dexposition des populations en milieu naturel. Dun autre
ct, les tudes sur la bioaccumulation et la toxicit des mtaux en milieu
naturel sont difficiles interprter cause des effets confondants de nom-
breuses variables gochimiques, physiologiques et cologiques qui influen-
cent la biodisponibilit des mtaux et leurs effets toxiques potentiels sur
les invertbrs aquatiques (Langston et Spence, 1995). Une approche alter-
native et complmentaire impliquant lutilisation des indicateurs biochi-
miques ou biomarqueurs , tels que la mtallothionine, pour valuer
lexposition et la toxicit des mtaux, a t dveloppe pour les organismes
dulcicoles et marins (Klaverkamp et al., 1991 ; Lagadic et al., 1994, 1997a,
1997b ; Ringwood et al., 1999 ; Cajaraville et al., 2000 ; Cosson et Amiard,
2000). Au Canada, le programme dvaluation des techniques de mesures
dimpacts en milieu aquatique (AETE) prconise aussi lutilisation de
biomarqueurs (la mtallothionine conjointement avec dautres outils)
dans le cadre spcifique de la surveillance des effets des effluents miniers
(Couillard, 1997). Par ailleurs, le nouveau rglement canadien sur les
effluents des mines de mtaux rend obligatoire une tude de suivi des
effets sur lenvironnement (ESEE) pour les exploitations actives. Le
document-guide de lESEE mentionne la mtallothionine comme un des
outils ou biomarqueurs pouvant tre utiliss divers tapes du suivi
environnemental tout en indiquant que lemploi des biomarqueurs pour
prdire des effets toxiques na pas encore franchi ltape de validation
exprimentale sur le terrain (Environnement Canada, 2002).

1.2. CONCEPT DE BIOMARQUEUR


Le concept de biomarqueur se dfinit comme une rponse au niveau mol-
culaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou comportementale dun
organisme suite lexposition prsente ou passe un polluant (Lagadic
et al., 1997a). Au niveau de lorganisme, la rponse molculaire,
La mtallothionine 67

biochimique ou physiologique peut se mesurer dans lindividu lui-mme


au niveau de ses cellules, organes (foie, rein, branchies, etc.) ou phanres
(griffes, poils, plumes, etc.) (Huggett et al., 1992 ; van Gestel et van
Brummelen, 1996). Toutefois, un biomarqueur mesur au niveau indi-
viduel ne trouve sa signification cotoxicologique que sil permet aussi
dexpliquer et de prdire les effets toxiques des polluants dautres
niveaux de lorganisation biologique, depuis lindividu jusquaux
populations et communauts (Lagadic et al., 1997a).
Dans le contexte dune pollution mtallique, les effets biologiques
des mtaux toxiques prsents dans lenvironnement sont provoqus par
linteraction du mtal avec un rcepteur biologique la surface ou lint-
rieur de lorganisme vivant (voir Campbell et Couillard, 2004, chapitre 1).
On suppose que les concentrations de mtaux requises pour dclencher
ces rponses sont bien infrieures celles qui provoquent une crise dans
lorganisme cible ou une dgradation visible de lcosystme. Ainsi, ida-
lement, la dtection et la quantification des rponses molculaires, bio-
chimiques ou physiologiques lintrieur de lorganisme vis--vis une
exposition chronique des mtaux pourraient servir dindicateur prcoce,
sensible et spcifique dun stress environnemental (CNRC, 1985). Quils
interviennent dans le maintien de lhomostasie ou quils traduisent des
perturbations fonctionnelles, la possibilit dutiliser les biomarqueurs
comme marqueurs prcoces de dysfonctionnement ultrieur au niveau
des populations et des communauts apparat comme une approche par-
ticulirement attrayante (van Gestel et van Brummelen, 1996 ; Lagadic etal.,
1997a ; Schlenk, 1999). Cependant, dans ltat actuel des connaissances,
les biomarqueurs ne sont gnralement considrs que comme des indi-
cateurs de la prsence (actuelle ou passe) de polluants dans le milieu et
dans les organismes, leur validation pour la prdiction deffets toxiques
sur les organismes et les populations ntant jusqu maintenant pas encore
clairement tablie (Lagadic et al., 1994 ; Depledge et Fossi, 1994 ; Couillard,
1997 ; Adams et al., 2001).

1.3. DMARCHE COTOXICOLOGIQUE HOLISTIQUE ET HIRARCHIQUE


Seule une approche multiparamtrique et hirarchique , comprenant
des mesures des mtaux toxiques dans le milieu et les organismes, lutilisa-
tion dun ou plusieurs biomarqueurs et la dtection deffets toxiques
diffrents niveaux de lorganisation biologique (cellule, individu,
population, communaut), devrait permettre de fournir une image suffi-
samment raliste des effets toxiques des mtaux sur ltat de sant des
organismes, des populations et des cosystmes (Clements et Kiffney,
1994 ; van Gestel et van Brummelen, 1996 ; Lagadic et al., 1997b ; Adams et
al., 2001). Dans cette perspective, de nombreux auteurs insistent sur la
68 cotoxicologie molculaire

ncessit de relier les rponses biochimiques ou physiologiques lint-


rieur des organismes la fois des mesures relles dexposition aux
polluants et des mesures de leur toxicit des niveaux levs de lorga-
nisation biologique (population, communaut : Depledge et Fossi, 1994 ;
Engel et Vaughan, 1996 ; McCarty et Munkittrick, 1996 ; den Besten, 1998).
Dans le cadre dune contamination par des mtaux toxiques, le con-
cept de biomarqueur sintgre une approche holistique et hirarchique
selon laquelle la toxicit dun mtal peut se traduire par un continuum
complexe de rponses biochimiques et physiologiques chez les organismes
entranant des rponses cotoxicologiques chez les populations et les com-
munauts (Luoma, 1995 ; Munkittrick et McCarty, 1995). La figure 2.1 sch-
matise ce continuum de rponses aux diffrents niveaux dorganisation
biologique, depuis la cellule jusquaux populations et communauts des
cosystmes. On suppose quun individu sain soumis des concentra-
tions croissantes de mtaux toxiques verra son tat de sant se dtriorer
progressivement. Ainsi, pour des doses de mtaux toxiques peu leves
et/ou des temps dexposition assez courts, leffet primaire initial du mtal
sur les fonctions cellulaires induira des mcanismes de dtoxication au
niveau subcellulaire, considrs comme des effets secondaires (produc-
tion de mtallothionines, granules/lysosomes). Ces mcanismes per-
mettront de compenser laction des mtaux, notamment en limitant leur
toxicit. Quand les doses internes et/ou les temps dexposition aug-
mentent, ces mcanismes de dtoxication deviennent insuffisants pour
limiter laction des mtaux toxiques. Il y a alors un phnomne de dbor-
dement cellulaire et les mtaux accumuls dans le cytosol, sous forme dis-
soute non lie la mtallothionine et non stocke dans les granules, auront
des effets tertiaires potentiellement toxiques (pour le modle de dbor-
dement cellulaire, voir section 2.3.3. dans Campbell et Couillard, 2004 (cha-
pitre 1); Couillard et al., 1995b ; Baudrimont et al., 1999). Ltat de sant
des individus exposs volue alors vers une dgradation irrversible des
fonctions physiologiques de lorganisme, ce qui pourrait se traduire par
des effets dltres au niveau des individus, puis des populations et des
communauts. Chaque niveau de lorganisation biologique comprend une
tape de dtoxication/compensation de nature comportementale et/ou
physiologique chez les organismes, de nature gntique ou cologique
chez les populations et communauts. Les effets dltres se produiraient
si les mcanismes de compensation sont dbords ou que les processus
de dtoxication/compensation entranent des cots bionergtiques secon-
daires trop levs, limitant la croissance et la reproduction des organismes.
Ces rponses toxicologiques des niveaux levs de lorganisation biolo-
gique peuvent avoir des consquences importantes sur la survie des
populations au sein des communauts.
La mtallothionine 69

Figure 2.1
Effet de lintroduction dun mtal toxique dans lenvironnement*

* Approche hirarchique et illustration des relations entre lintroduction dun mtal toxique
dans un cosystme et la dtection et la quantification des effets diffrents niveaux
hirarchiques de lorganisation des populations dorganismes aquatiques. chaque
niveau dorganisation, le mtal gnre une rponse en trois stades : primaire, secondaire
ou dtoxication/compensation, et tertiaire (adapt de Luoma 1995 et de CNRC 1985).
70 cotoxicologie molculaire

La mesure des effets toxicologiques au niveau des populations et


des communauts revt donc une grande pertinence cologique pour pr-
dire long terme limpact des mtaux toxiques sur ltat de sant des co-
systmes (Engel et Vaughan, 1996 ; Lagadic et al., 1997a ; Ringwood et al.,
1999). Toutefois, une rponse un niveau dans lorganisation biologique
nest pas forcment suivie dune rponse au niveau suprieur, si les
mcanismes de compensation ne sont pas dbords ou si le niveau dexpo-
sition aux mtaux toxiques est limit par certains facteurs environne-
mentaux. Ainsi, au fur et mesure que lon progresse au sein de
lorganisation biologique, il devient de plus en plus difficile de mettre en
vidence des relations de cause effet entre la prsence des mtaux et les
rponses des populations (Luoma, 1995 ; Engel et Vaughan, 1996 ;
Ringwood et al., 1999). En effet, la rponse des organismes et des popu-
lations aux mtaux toxiques est influence par dautres facteurs colo-
giques tels que la chimie des eaux, le rgime thermique, le niveau
doxygnation et labondance des ressources et des prdateurs. Ces fac-
teurs peuvent confondre linterprtation des rponses toxicologiques des
organismes et des populations en prsence de mtaux toxiques.
Lide de comparer les effets toxiques des polluants en interaction
avec les autres facteurs cologiques est encore trs rarement aborde en
cotoxicologie (Munkittrick et McCarty, 1995). Il sagit pourtant dune
avenue de recherche cruciale et incontournable dans loptique de caract-
riser et de valider des biomarqueurs utiles pour lvaluation des effets
des polluants en milieu naturel au niveau des populations et des commu-
nauts. Rcemment, Chapman (2002) recommandait une meilleure int-
gration des tudes cologiques et toxicologiques afin de mieux dfinir les
risques cotoxicologiques de la prsence des contaminants dans les milieux
naturels.

2. LA MTALLOTHIONINE COMME BIOMARQUEUR


DEXPOSITION ET DE TOXICIT
2.1. APPROCHE COTOXICOLOGIQUE INTGRE
Des tudes cotoxicologiques rcentes sinscrivant dans une dmarche
multiparamtrique et hirarchique , telle que dfinie prcdemment,
ont permis dvaluer lutilisation de la mtallothionine (MT) comme
biomarqueur dexposition au cadmium (Cd) et deffets toxiques, chez des
invertbrs aquatiques de lacs dune rgion minire du Qubec (Abitibi)
(Couillard et al., 1993, 1995a, 1995b, 2003 ; Tessier et al., 1993 ; Wang et al.,
1999 ; Croteau et al., 2002 ; Perceval et al., 2002, 2003 ; Gigure et al., 2003).
Tel que recommand par Adams et al. (2001) et Chapman (2002), les effets
La mtallothionine 71

confondants des facteurs cologiques sur les rponses toxicologiques des


organismes ont t minimiss et pris en considration dans ces tudes
(Perceval et al., 2002 ; Couillard et al., 2003).
Les bivalves sont considrs comme de bons bioindicateurs de la
contamination mtallique en eau douce (Malley et al., 1993 ; Metcalfe-
Smith, 1994). Le bivalve deau douce Pyganodon grandis (Say, 1829), choisi
comme espce sentinelle dans le cadre de notre tude en rgion minire,
est largement rpandu en Amrique du Nord, travers tout le bassin
intrieur canadien et les tats-Unis (Clarke, 1981). Ce bivalve est commun
dans la zone littorale des lacs et parfois plus rare en rivire ; il tolre des
eaux relativement peu productives et faiblement alcalines (Huebner et al.,
1990). Chez P. grandis, les sexes sont gnralement spars (avec certains
cas dhermaphrodisme) et la maturit sexuelle est atteinte vers lge de
45 ans (Hanson et al., 1989). La fertilisation et le dveloppement des
larves ont lieu assez tt au cours de lt (Huebner, 1980). Au nord de
laire de distribution (Nord du Qubec), les larves sont conserves dans
les marsupiums branchiaux maternels durant tout lhiver et relches au
printemps suivant (Lewis, 1985). Le cycle de dveloppement larvaire passe
par un stade parasitaire obligatoire sur les branchies des poissons. P.
grandis est considr comme un parasite gnraliste, ayant plus dune ving-
taine despces diffrentes de poissons comme htes potentiels (Watters,
1994). Les prdateurs connus sont le rat musqu (Ondatra zebithicus), la
loutre (Lutra canadensis), le vison (Mustela vison) et certains poissons (Tyrrell
et Hornbach, 1998).
Lapproche cotoxicologique intgre applique pour lespce sen-
tinelle Pyganodon grandis (Bivalvia, Unionacea), est schmatise dans la
figure 2.2. Elle comprend les tapes suivantes :
lvaluation de la biodisponibilit du cadmium in situ dans la colonne
deau immdiatement au dessus des sdiments partir des quili-
bres de sorption sdiments-eau (Tessier et al., 1993) et selon le Mo-
dle du ligand biotique (Campbell, 1995 ; Di Toro et al., 2001), en
tenant compte de lexposition lion mtallique [Cd2+] et de
linfluence de facteurs limnologiques tels que le pH, le calcium
dissous [Ca2+], le carbone organique dissous [COD] et les acides
humiques et fulviques [AH+AF] sur la biodisponibilit du cadmium ;
la mesure de la contamination des bivalves base sur la concentra-
tion de cadmium dans les branchies et la production de mtallo-
thionine [MT] au niveau subcellulaire (cytosol des branchies) ;
la mesure de la spciation intracellulaire du cadmium et de sa rpar-
tition entre les diffrents ligands cytosoliques (Cd-MT : Cd li aux
protines sapparentant aux mtallothionines, Cd-FPM : Cd li aux
72 cotoxicologie molculaire

ligands de faible poids molculaire, Cd-HPM : Cd li aux ligands de


haut poids molculaire) afin de tester le modle de dbordement
cellulaire ou de cytotoxicit ;

Figure 2.2
Approche cotoxicologique intgre*

* Schma de la dmarche cotoxicologique suivie dans le cadre des tudes de cas sur la
validation de la MT comme biomarqueur dexposition et de toxicit du cadmium chez la
moule Pyganodon grandis.

la dtermination des relations dose-rponse entre le niveau dexpo-


sition au cadmium [Cd2+] dans le milieu, laccumulation de [Cd] et
la biosynthse (nette) de la [MT] dans lorganisme, afin de valider la
MT comme biomarqueur dexposition au cadmium ;
la mesure des effets toxiques du cadmium diffrents niveaux de
lorganisation biologique depuis les rponses biochimiques au niveau
intracellulaire (malondialdhyde, molcules impliques dans la
rponse un stress oxydant : glutathion-rductase et glutathion-
peroxydase) jusquaux rponses des populations (densit, biomasse,
paramtres de croissance, production annuelle, ratio P/B, fcondit
cumule) ;
La mtallothionine 73

la dtermination des relations dose-rponse entre les rponses


toxiques intracellulaires (malondialdhyde, glutathion-rductase et
glutathion-peroxydase) et les concentrations de [Cd] et [MT] dans le
cytosol des branchies des bivalves, afin de tester la MT comme
biomarqueur deffets toxiques prcoces au niveau cellulaire ;
la dtermination des relations entre les rponses des populations et
les concentrations de Cd et MT dans les branchies, en tenant compte
de la spciation intracellulaire du Cd, afin de tester le modle de
cytotoxicit cellulaire ( dbordement cellulaire , voir la section 2.3.3
de Campbell et Couillard, 2004, chapitre 1) et dvaluer lutilisation
de la MT comme biomarqueur deffets toxiques du cadmium un
niveau lev de lorganisation biologique (population) ;
la dtermination deffets potentiellement confondants des facteurs
limnologiques et cologiques sur les rponses des organismes et des
populations.
Cette dmarche prend en compte les derniers dveloppements des
mthodes dvaluation du risque cotoxicologique (Chapman, 2002). Elle
vise dterminer in situ des niveaux rels dexposition a) les relations
entre la contamination du milieu et de lorganisme et linduction du
biomarqueur (MT), et b) les relations entre les concentrations de cadmium
et du biomarqueur MT au niveau subcellulaire et les rponses toxico-
logiques chez les organismes ainsi quau niveau des populations, tout en
tenant compte des effets des facteurs confondants dans lenvironnement
naturel. Une telle dmarche est essentielle pour :
dterminer le seuil critique de contamination en cadmium dans le
milieu au-dessous duquel il ny aura pas deffets dltres sur les
individus et les populations dans les milieux rcepteurs ;
valuer lutilisation de la MT comme biomarqueur dexposition et
deffets toxiques des mtaux chez les invertbrs benthiques ;
tablir de nouveaux outils et de nouvelles normes mieux adapts
la ralit cotoxicologique du milieu rcepteur et des organismes
exposs aux rejets miniers.
Ltude de cas qui est dcrite dans ce chapitre vise dvelopper un
modle cotoxicologique et des perspectives dapplication pour le suivi
des impacts des activits minires en milieu naturel. Elle se base en parti-
culier sur les rponses toxicologiques au niveau des individus et des popu-
lations du bivalve deau douce Pyganodon grandis. Les rsultats obtenus
avec dautres espces sentinelles (larves dinsectes aquatiques et poissons)
dans la mme rgion dtude ou ailleurs ne seront rapports qu titre
comparatif.
74 cotoxicologie molculaire

2.2. RAPPEL DU RLE DE LA MT COMME


BIOMARQUEUR DEXPOSITION AU CADMIUM
Plusieurs tudes sur la bioaccumulation du cadmium et linduction de la
MT chez les invertbrs aquatiques ont mis en vidence le rle de la
mtallothionine (MT) comme biomarqueur de lexposition au cadmium
en milieu naturel. Nos tudes dans la rgion minire de Rouyn-Noranda
(Qubec) (tableau 2.1) dmontrent :
lexistence de relations dose-rponse (r = 0,50-0,94) entre les concen-
trations de MT dans le bivalve Pyganodon grandis ou dans les larves
du diptre Chaoborus spp., et le niveau de contamination du milieu
en cadmium (Cd2+), tel questim partir dun modle gochimique
bas sur les quilibres de sorption sdiments-eau (Tessier, 1992 ;
Tessier et al., 1993) ;
lexistence de relations dose-rponse (r = 0,68-0,96) entre les concen-
trations de MT dans le bivalve Pyganodon grandis ou les larves du
diptre Chaoborus spp. et de lphmre Hexagenia limbata, et la
quantit de Cd bioaccumule dans lorganisme ;
une faible variation des concentrations de MT dans les branchies de
Pyganodon grandis durant la saison estivale, ainsi quen fonction de
la taille, de lge et de lindice de condition des organismes, relative-
ment celles enregistres le long du gradient environnemental en
Cd (Couillard et al., 1995a ; Kalhok et Cyr, 1997 ; Wang et al., 1999).
Le premier et le deuxime points dmontrent que la MT est un
biomarqueur dexposition qui rpond de faon dose-dpendante aux
variations des concentrations de cadmium dans le milieu environnant et
dans les organismes. Par ailleurs, ces tudes montrent que la MT ne rpond
pas aux gradients de contamination en mtaux essentiels (Cu et Zn),
puisque ces mtaux sont lobjet dune rgulation plus troite par les orga-
nismes (voir chapitre 1). Le troisime point suggre que les facteurs
endognes et saisonniers sont des sources de variation moins importantes
que la biodisponibilit du mtal en ce qui concerne la biosynthse de MT,
renforant ainsi son rle de biomarqueur dexposition aux mtaux non
essentiels comme le cadmium.
Le rle de la MT comme biomarqueur dexposition au Cd a aussi t
clairement dmontr lors dtudes de transplantation (dun site non pol-
lu un site pollu) pour les bivalves deau douce Pyganodon grandis dans
les lacs de la mme rgion (Couillard et al., 1995a, 1995b) et Corbicula
fluminea dans la rivire Lot (France) (Baudrimont et al., 1999), et gale-
ment pour les bivalves marins (Crassostrea giga, Macoma balthica) (Amiart-
Triquet et al., 1998 ; Mouneyrac et al., 2000). Des tudes en laboratoire avec
des bivalves (Mytilus galloprovincialis, Ruditapes decussatus) et des gastro-
podes (Littorina littorea) marins le montrent galement (Bebianno et
Tableau 2.1
Relations entre la MT chez diffrentes espces dinvertbrs et le niveau de cadmium dans le milieu (Cd2+)
et dans les organismes (Cd dans le corps entier ou les branchies)*

Organismes Relations r Concentrations Rfrences


Moules 2+ [Cd2+] : 0,8-2,8 (nM)
MT branchies - Cd 0,79 Couillard
Pyganodon grandis MT org. Cd2+ 0,75 [Cd] branchies : 260-2400 (nmol/g. ps.) et al., 1993
La mtallothionine

11 lacs MT org. Cd branchies 0,77 [Cd] org. : 170-1150 (nmol/g. ps.)


1989 MT org. Cd org. 0,83 [MT] branchies : 100-408 (nmol sites de liaison
du Hg/g. ps.)
[MT] org. : 163-414 (nmol sites de liaison du Hg/g. ps.)
Pyganodon grandis MT org. Cd org. 0,82 [Cd2+] : 0,28-2,2 (nM) Couillard
2 lacs, exprience [Cd] org. : 178-1560 (nmol/g. ms) et al., 1995a
de transplantation [MT] org. : 154-596 (nmol sites de liaison du Hg/g. ps.)
Pyganodon grandis MT branchies Cd2+ 0,94 [Cd2+] : 0,17-2,2 (nM) Wang
10 lacs MT branchies Cd 0,96 [Cd] cytosol : 34-189 (nmol/g. ms) et al., 1999
1994 cytosol [MT]branchies : 92-271 (nmol sites de liaison du Hg/g. ps.)
Pyganodon grandis MT branchies Cd2+ 0,52 [Cd2+] : 0,005-0,97 (nM) Couillard
24 lacs (37 stations) MT branchies Cd 0,83 [Cd] branchies : 19-2370 (nmol/g. ms) et al., 2003
1997 branchies [MT]branchies : 18-344 (nmol sites de liaison du Hg/g. ps.)
Pyganodon grandis MT branchies Cd2+ 0,50 [Cd2+] : 0,003-0,927 (nM) Gigure
10 lacs (18 stations) MT branchies Cd 0,78 [Cd] cytosol : 18-168 (nmol/g. ms) et al., 2003
1998 cytosol [MT]branchies : 39-254 (nmol sites de liaison du Hg/g. ps.)
Larves dphmres MT org. Cd org. 0,86 [Cd2+] : 0,12-2,23 (nM) Couillard
Hexagenia limbata [Cd] org. : 41-504 (nmol/g. ms) et al., 2003
1989-1994 [MT] org. : 18-106 (nmol sites de liaison du Hg/g. ps.)
Larves de diptres MT org. Cd 2+ 0,89 [Cd2+] : 0,03-8,7 (nM) Croteau
Chaoborus spp. MT org. Cd org. 0,68 [Cd]org. : 4,3-141 (nmol/g) et al., 2002
1999 [MT]org. : 100-270 (nmol sites de liaison du Hg/g. ps.)
75

* Dmonstration de lutilisation de la mtallothionine (MT) comme biomarqueur dexposition au cadmium (Cd) chez les invertbrs deau douce
(r de Pearson, P * 0.01).
76 cotoxicologie molculaire

Langston, 1995 ; Bebianno et Serafim, 1998). Linduction de la MT est


spcifique chaque organe (branchies, reins, glande digestive), mais la
rponse de la MT au gradient de contamination en Cd est plus nette dans
les branchies. Cet organe semble donc le plus appropri pour le dosage
de la MT chez les bivalves deau douce ou marins (Langston et al., 1998 ;
Gagn et al., 2002).
Les tudes ralises en milieu naturel avec des poissons comme
espce sentinelle soutiennent aussi lutilisation de la MT comme
biomarqueur dexposition aux mtaux traces. Ainsi les concentrations de
MT dans le foie et le tissu internal des perchaudes de la rgion minire
de Rouyn-Noranda sont relies au gradient de contamination polymtal-
lique en Zn, Cu et Cd (Laflamme et al., 2000). Olsvik et al. (2001) ont gale-
ment valid lutilisation de la MT dans le foie et les reins de la truite brune
(Salmo trutta) comme biomarqueur dexposition aux mtaux dans des
rivires contamines par le Cd, le Zn et le Cu.

2.3. TUDE DE CAS : CARACTRISATION LIMNOLOGIQUE


ET TOXICOLOGIQUE
Ltude de cas prsente dans le cadre de ce chapitre a t ralise de
1996 1999 dans la rgion minire de Rouyn-Noranda (Abitibi, Qubec :
4815'N, 7900'W), situe 600 km au nord-ouest de Montral. Lexistence
dans la rgion de Rouyn-Noranda dun gradient spatial de contamina-
tion atmosphrique par les mtaux traces (Cd, Cu, Zn, Pb) selon la direc-
tion des vents dominants, ainsi que la prsence, le long de ce gradient, de
populations du bivalve Pyganodon grandis ont conditionn ce choix
(Couillard et al., 1993). Dans cette rgion, la contamination des lacs par les
mtaux est lie lactivit minire, en particulier la prsence dune impor-
tante fonderie de cuivre Rouyn-Noranda et lexistence de parcs rsidus
miniers, ainsi quaux missions atmosphriques des industries de trans-
formation du minerai.
En 1997, une tude exhaustive des variables limnologiques et
toxicologiques dans 20 lacs (37 stations) de la rgion (Perceval et al., 2002)
a permis de caractriser :
le gradient de contamination en cadmium dans les sdiments
lacustres ([Cd2+ ] : 0,005-0,96 nM) et dans les branchies des bivalves
([Cd] : 19-2 400 nmolg1p. sec) ;
la concentration de mtallothionine ltat stationnaire dans les
branchies des bivalves ([MT] : 18-340 nmolsites de liaison du
Hgg1p. sec) selon le gradient de contamination en Cd dans le milieu
et chez les organismes ;
La mtallothionine 77

la variabilit inter-lac des facteurs limnologiques tels que la trans-


parence de leau (Secchi), la temprature, loxygnation (O2), la
chimie de leau (pH, conductivit, calcium, phosphore total, carbone
organique dissous, acides humiques et fulviques), et labondance et
la qualit de la nourriture en suspension (chlorophylle a, pho-
pigments, carbone et azote dans le seston) linterface eau-sdiments
au niveau des sites de rcolte des bivalves.
De faon minimiser les effets confondants de ces facteurs limno-
logiques sur la biodisponibilit du cadmium et les rponses toxicologiques
des bivalves, une procdure de slection de lacs a t dveloppe en 1998
pour identifier, parmi les 20 lacs initiaux, 10 lacs ayant les caractristiques
limnologiques les plus semblables possibles mais offrant le mme gradient
initial de contamination en cadmium. La mthode de slection des lacs
est dcrite en dtail par Perceval et al. (2002). La slection des lacs a permis
de rduire le coefficient de variation moyen des facteurs limnologiques
de 42 % 26 % tout en maintenant le mme niveau (84 %) de variation des
facteurs toxicologiques.
En 1998, une tude intensive sur les 10 lacs slectionns (18 stations)
a permis de dterminer les relations entre la contamination en Cd du milieu
et 1) la bioaccumulation de Cd dans les branchies des bivalves Pyganodon
grandis, 2) la concentration cytosolique du biomarqueur MT, 3) la spciation
intracellulaire du Cd entre les ligands cytosoliques et 4) les rponses des
populations de bivalves, en ayant minimis, a priori, par la procdure de
slection des lacs les effets confondants des facteurs limnologiques. Les
rsultats de cette tude, qui a permis dvaluer lutilisation de la MT
comme biomarqueur deffets toxiques du cadmium au niveau cellulaire
chez lindividu (Gigure et al., 2003) et au niveau des populations (Perceval
et al., 2003), sont rsums dans les sections 2.4 et 2.5.

2.4. VALUATION DE LA MT COMME BIOMARQUEUR


DES EFFETS TOXIQUES DU CADMIUM AU NIVEAU
DE LA CELLULE ET DE LORGANISME
La premire rponse observe au niveau intracellulaire lors dune expo-
sition un mtal non essentiel (le cadmium) est la mobilisation de mca-
nismes de dtoxication permettant de lier le mtal des ligands
intracellulaires de faon en rduire la toxicit (voir la section 2.3.3 du
chapitre 1). Sous forme dissoute, les ligands intracellulaires dans le cytosol
peuvent tre oprationnellement rpartis en trois classes : 1) les protines
sapparentant aux mtallothionines (MT), 2) les ligands de haut poids
molculaire (L-HPM) et 3) les ligands de faible poids molculaire (L-FPM).
Dans le cytosol, le cadmium peut se lier ces trois ligands pour former
78 cotoxicologie molculaire

des complexes : Cd-MT, Cd-HPM, Cd-FPM (figure 2.3). En milieu naturel,


les expriences de transplantation (Couillard et al., 1995a,b ; Wang et al.,
1999 ; Baudrimont et al., 1999) ont montr quen cas dexposition de faibles
concentrations de cadmium, le mcanisme de dtoxication induit une aug-
mentation des trois complexes avec une dominance du complexe Cd-MT
trs stable et non toxique, sans saturation des capacits de lorganisme de
synthtiser de la MT (figure 2.3A). Toutefois, si le niveau dexposition
augmente brusquement et que lentre de Cd dans la cellule dpasse les
capacits de lorganisme dtoxiquer le mtal en le liant la MT, la
spciation intracellulaire du Cd sorientera vers la formation de complexes
Cd-HPM et Cd-FPM (figure 2.3B). Ces complexes tant moins stables et
plus facilement biodisponibles, ils pourraient alors dclencher des effets
toxiques dltres au niveau des cellules chez lorganisme expos.

Figure 2.3
Modles de cytotoxicit (ou de dbordement) cellulaire*

* Exposition en milieu naturel de faibles (A) ou de fortes (B) concentrations de cadmium


(Cd2+) associe la rpartition du cadmium entre les ligands intracellulaires (MT : ligands
apparents aux mtallothionines HPM : ligands de haut poids molculaire ; FPM : ligands
de faible poids molculaire).

Ltude intensive dans les 10 lacs de la rgion minire (incluant


18stations) a permis de tester ce modle de toxicit cellulaire en relation
avec la manifestation dun stress toxique dans les cellules branchiales du
bivalve Pyganodon grandis exposes un gradient de Cd2+ (0,003 0,93nM)
(Gigure et al., 2003). Pour tester ce modle et valuer la MT comme
biomarqueur deffet toxique au niveau intracellulaire, on a mesur
La mtallothionine 79

plusieurs variables toxicologiques et biochimiques selon les mthodes


dcrites succinctement au tableau 2.2 et prsentes en dtail dans Gigure
et al. (2003). Pour cette tude au niveau infrieur de lorganisation biolo-
gique (cellule et organisme), on a pris en considration :
le niveau dexposition au cadmium dans le milieu exprim par la
concentration de lion libre Cd2+ estime linterface sdiment-eau ;
la bioaccumulation de Cd dans le cytosol des branchies et sa rparti-
tion entre les diffrents ligands intracellulaires (Cd-MT, Cd-FPM,
Cd-HPM) ;
la concentration totale de MT dans le cytosol des branchies ;
les rponses au niveau cellulaire, values selon la synthse dans la
glande digestive de molcules impliques dans la rponse un stress
antioxydant (glutathion-peroxydase, glutathion-rductase) ou
daprs un indice de lipoperoxydation des membranes cellulaires
suite un stress oxydant (malondialdhyde) ;
les rponses nergtiques chez lorganisme, soit la concentration de
lipides dans les gonades.
En premier lieu, le rle de la MT comme biomarqueur dexposition
au cadmium chez les bivalves Pyganodon grandis est confirm. En effet, les
concentrations de MT dans le cytosol des branchies refltent bien le niveau
de contamination du milieu par lion mtallique Cd2+ (r = 0,50 ; P 0,001)
et les concentrations de Cd total dans le cytosol des branchies des bivalves
(r = 0,78 ; P 0,001) (figures 2.4A, 2.4B), tel que rapport dans les tudes
antrieures (tableau 2.1).
Deuximement, le modle de dbordement cellulaire par saturation
du mcanisme de dtoxication de la MT nest pas corrobor par notre
tude, o le gradient de contamination en Cd2+ dans le milieu est inf-
rieur 1nM (0,003-0,93 nM). En effet, on observe une augmentation con-
tinue des trois complexes le long du gradient de contamination en Cd
cytosolique (figure 2.4C) et une augmentation linaire du complexe Cd-
MT en fonction de linduction de MT (figure 2.4D). Malgr cette augmen-
tation, la distribution du Cd entre les diffrents complexes cytosoliques
est demeure relativement constante : 80 % dans la fraction Cd-MT, 7 %
dans la fraction Cd-FPM et 13 % dans la fraction Cd-HPM. Pour ces orga-
nismes, exposs au Cd de manire chronique, il ny avait donc pas de
seuil dexposition partir duquel la distribution du Cd commenait
tre perturbe. Cependant, la prsence du Cd dans les fractions Cd-FPM
et Cd-HPM suggre que sa dtoxication tait imparfaite, cest--dire que
P.grandis a t soumis un stress caus par le Cd mme des concen-
trations externes en Cd relativement modestes. Par ailleurs, une tude
mene dans la mme rgion en 1994 (Wang et al., 1999), sur un gradient
plus large de contamination en cadmium (0,005-2,4 nM), indique des
80 cotoxicologie molculaire

Tableau 2.2
Mthodes de mesure de la contamination au cadmium

Variables Mthodologies
a
Contamination Couche superficielle oxique des sdiments (0,5cm),
du milieu, Cd 2+ 3carottes de sdiments par station
Couillard et al., 1993 Extraction squentielle du Cd
Tessier et al., 1993 Estimation de la concentration de lion libre Cd2+
Tessier, 1992 selon un modle gochimique bas sur lquilibre de
sorption de Cd2+ entre leau et les sdiments
Contamination de 12 moules par station (75-85 mm)
lorganisme dans Dissection des branchies (triplicats de 4 branchies)
les branchies Conservation sous atmosphre dazote 80 C
Cd dans le cytosol Homognisation des branchies 4 C dans un
MT dans le cytosol tampon Tris
Couillard et al., 1993 Sparation du cytosol par centrifugation
Dutton et al., 1993 Analyse du Cd par ICP-MS
Gigure et al., 2003 Analyse de la MT par mthode de saturation
au 203Hg
Rpartition Fractionnement du Cd cytosolique par HPLC
intracellulaire du Cd Elution sur colonne dexclusion strique
dans le cytosol Trois fractions rcupres :
des branchies L-HPM : 245-18 kDa
Cd-MT Cd-FPM MT : 18-1,8kDa
Cd-HPM L-FPM : < 1,8 kDa
Wang et al., 1999 Analyse du Cd dans chaque fraction par GFAAS
Gigure et al., 2003
Rponses Dissection glande digestive
toxicologiquesb Conservation 80 C
Glande digestive Homognisation dans du tampon Tris et mesure de
Malondialdhyde (MDA) la MDA au moyen de lacide thiobarbiturique par
Gigure et al., 2003 colorimtrie
Sunderman et al., 1985
Glutathion-peroxydase Homognisation dans du tampon phosphate et
Glutathion-rductase mesure par suivi de la cintique enzymatique au
Lawrence et Burk, 1976 moyen de la spectrophotomtrie
Carlberg et Mannervick,
1985
Gonades Homognisation dans du tampon phosphate
Lipides Analyse des lipides totaux
Frings et al., 1972
a) la contamination du milieu et de lorganisme Pyganodon grandis par le cadmium dans
10lacs de la rgion minire de lAbitibi, et b) les rponses toxicologiques biochimique et
nergtique au niveau cellulaire chez lorganisme Pyganodon grandis. Pour les dtails, voir
Gigure et al., 2003.
La mtallothionine 81

Figure 2.4
Concentration de mtallothionine*
[MT] (nmol sites de liaison
du Hg.g1 poids sec)

[Cd-MT] (nmol.g1 poids sec)


[Cd] (nmol.g1 poids sec)

* Relations entre la concentration de mtallothio-


nine (MT) dans le cytosol des branchies du
bivalve Pyganodon grandis et (A) le niveau de
(nmol.g1 poids sec)
[Malondialdhyde]

contamination des lacs de la rgion de Rouyn-


Noranda en 1998 (Cd2+ < 1 nM) ; (B) la concen-
tration de Cd dans le cytosol des branchies du
bivalve. (C) Rpartition du cadmium entre les
ligands intracellulaires (Cd-MT ; Cd-HPM, Cd-
FPM) en fonction de la concentration de Cd dans
le cytosol des branchies. (D) Relation entre le
cadmium li aux ligands sapparentant aux
mtallothionines (Cd-MT) et la concentration de
MT dans le cytosol des branchies du bivalve.
(E)Relation entre un indicateur de peroxydation
lipidique des membranes cellulaires (Malondial-
dhyde) et la concentration de Cd dans le cytosol
des branchies du bivalve.
82 cotoxicologie molculaire

perturbations dans la spciation intracellulaire du cadmium dans le cytosol


des branchies de Pyganodon grandis exposs des concentrations de
Cd2+ > 1 nM. La concentration de Cd sous forme de complexes Cd-FPM
augmente de faon marque dans les branchies des bivalves des deux lacs
les plus pollus ayant des concentrations de Cd2+ > 1 nM. Dans ces lacs,
les branchies des bivalves prsentent des signes de ncrose, indiquant un
effet toxique potentiel chez les organismes.
Le long du gradient de contamination observ en 1998 ([Cd2+]
< 1 nM), le stress toxique au niveau cellulaire sest traduit par une aug-
mentation de la malondialdhyde (MDA), produit de la peroxydation
lipidique des membranes, en fonction de laccumulation de Cd dans le
cytosol des branchies (figure 2.4E). Une hausse des concentrations de MDA
aprs une exposition au Cd en laboratoire ou lors dexpriences de trans-
plantation a dj t rapporte par Couillard et al. (1995b) et Cossu et al.
(2000) chez les bivalves Unionids, et par Viarengo et al. (1990) chez les
moules bleues. En 1990, chez le bivalve Pyganodon grandis transplant pen-
dant 400 jours dun lac peu pollu ([Cd2+] : 0,28 nM) un lac 10 fois plus
pollu ([Cd2+] : 2,2 nM), laugmentation de la MDA concidait avec laug-
mentation de Cd-FPM dans le cytosol des branchies, suggrant ainsi un
lien entre le dbordement des mcanismes de compensation lis la MT,
laugmentation des formes de Cd lis des ligands plus faibles (Cd-FPM)
et lapparition de stress oxydant au niveau cellulaire (Couillard et al.,
1995b).
Notre tude de cas ralise en 1998 sur le bivalve P. grandis suggre
que la MT pourrait tre utilise comme biomarqueur deffets de peroxy-
dation lipidique au niveau cellulaire (avec production de malondial-
dhyde) des niveaux de contamination en cadmium < 1 nM en milieu
naturel. Cependant, les autres indicateurs biochimiques de stress oxydant
au niveau cellulaire (glutathion-peroxydase, glutathion-rductase dans la
glande digestive) et les indicateurs nergtiques (lipides totaux dans les
gonades) chez le bivalve Pyganodon grandis nont pas rpondu au gradient
de contamination ambiante en Cd2+ < 1 nM et de biosynthse de MT
(Gigure et al., 2003).

2.5. VALIDATION DE LA MT COMME BIOMARQUEUR


DES EFFETS DES MTAUX AU NIVEAU DES POPULATIONS

2.5.1. Contexte cotoxicologique


Prcdemment, nous avons dmontr partir dtudes rcentes en milieu
minier le rle de la mtallothionine (MT) comme biomarqueur dexposi-
tion et de bioaccumulation du cadmium chez les invertbrs deau douce
La mtallothionine 83

(section 2.2). Le dfi actuel est dvaluer la MT comme biomarqueur


deffets toxiques au niveau suprieur de lorganisation biologique
(Chapman, 2002 ; McCarty et al., 2002 ; Beyer et Audet, 2002). Il y a encore
peu dvidence de lexistence de relations dose-rponse entre la produc-
tion de MT et les rponses toxicologiques au niveau intracellulaire en
milieu naturel (voir section 2.4). Il est encore plus difficile de relier les
rponses des populations et des communauts la contamination
ambiante par les mtaux traces, compte tenu des effets confondants des
autres facteurs environnementaux qui peuvent modifier non seulement
la biodisponibilit et la prise en charge des mtaux, mais aussi la physio-
logie des organismes, la dynamique des populations et la structure des
communauts. notre connaissance, une seule tude, portant sur les
rponses des populations de crapet soleil (Lepomis auritus) et de la com-
munaut entire de poissons en amont et aval dun effluent contamin en
mercure et BPC, aurait permis de mettre en vidence, dans les stations
contamines relativement au site de rfrence, une suite de rponses bio-
chimiques (MFO, cratinine, triglycrides), physiologiques (hormones de
reproduction, lipides totaux), dmographiques (taux de croissance, taille
moyenne des femelles) et cologiques (diversit, indice dintgrit biolo-
gique) aux diffrents niveaux de lorganisation biologique (Adams et al.,
2000). Notre tude de cas est la premire tentative de relier les rponses
du bivalve deau douce Pyganodon grandis, diffrents niveaux de lorga-
nisation biologique, la contamination en cadmium du milieu naturel.
Aprs avoir prsent les rponses au niveau cellulaire (section 2.4), nous
valuons ici les effets de la contamination en cadmium au niveau des
populations (Perceval et al., 2003).

2.5.2. Variables toxicologiques


Dans le cadre de ltude intensive ralise en 1998 dans la rgion minire
de Rouyn-Noranda, on a valu les changements des variables dmogra-
phiques des populations de Pyganodon grandis dans un sous-ensemble de
9 lacs en fonction 1) du gradient de contamination dans le milieu, 2) de la
bioaccumulation du Cd et de sa spciation intracellulaire et 3) de linduc-
tion de MT dans le cytosol des branchies. Un petit lac atypique (Renaud)
de trs faible profondeur (< 1,5 m) et envahi par les plantes aquatiques
na pas t retenu parmi les 10 lacs slectionns pour ltude au niveau
cellulaire. Le tableau 2.3 indique le niveau de contamination du milieu et
des organismes, la concentration en MT ltat stationnaire et la rpar-
tition du Cd cytosolique entre les trois ligands intracellulaires dans les
branchies des bivalves de chacun des lacs (pour les mthodes, voir le
tableau 2.2).
Tableau 2.3 84
Concentrations de cadmium*

Lac (code) [Cd2+] [Cd] [MT] [Cd-HPM] [Cd-MT] [Cd-FPM]


(nb. stations) (nM) cytosol (nM sites liaison
(nMg1 p. sec) du Hgg1 p. sec) (nMg1 p. sec) (nMg1 p. sec) (nMg1 p. sec)
Bousquet (BO) (3) 0,605 90,55 182 16,71 73,19 5,88
Caron (CA) (1) 0,295 46,80 132 10,32 34,61 1,87
Dufay (DU) (3) 0,283 76,32 149 5,55 65,05 5,65
vain (V) (2) 0,052 55,91 105 3,08 45,85 6,83
Hva (H) (1) 0,812 168,33 253 13,60 151,54 14,54
Joanns (JO) (3) 0,234 104,36 201 9,10 88,94 5,21
Ollier (OL) (2) 0,049 18,45 39 3,76 12,79 1,13
Opasatica (OP) (4) 0,039 29,87 93 2,12 30,83 1,21
Vaudray (VA) (1) 0,659 103,81 141 11,46 77,76 8,12

* Mesures des valeurs moyennes des concentrations de Cd dans le milieu [Cd2+] et dans le cytosol des branchies de Pyganodon grandis ([Cd]
cytosol), de la production de MT et de la spciation du Cd dans les ligands intracellulaires (Cd-HPM : fraction du cadmium li aux ligands de
haut poids molculaire ; Cd-MT : fraction du cadmium li des ligands sapparentant la mtallothionine ; Cd-FPM : fraction du cadmium li
aux ligands de faible poids molculaire) dans les 9 lacs slectionns pour ltude des effets toxiques au niveau des populations.

cotoxicologie molculaire
La mtallothionine 85

2.5.3. tat des populations et qualit environnementale des habitats


Ltat de sant des populations de Pyganodon grandis a t diagnostiqu
sur la base des variables de dynamique des populations, soit la densit et
la biomasse dans la zone littorale des lacs, les paramtres de croissance
(K : taux de croissance instantane ; L : longueur asymptotique thorique),
la production annuelle, le ratio de la production la biomasse (ratio
P/B), le temps de renouvellement de la population (inverse du ratio
P/B) et la fcondit cumule. Les mthodes utilises pour estimer les
variables dmographiques des populations de moules sont rsumes dans
le tableau 2.4 et prsentes en dtail dans Perceval et al. (2003). Le
tableau2.5 prsente les valeurs des variables de population des bivalves
dans chacun des lacs. Les variables de densit, de biomasse, de produc-
tion et de fcondit sont troitement corrles (r = 0,71-0,96), tandis que le
ratio P/B et les paramtres de croissance (L, K) fournissent une rponse
indpendante des autres variables.
Tel que suggr par Chapman (2002), une tude cotoxicologique
au niveau des populations doit prendre en considration les facteurs
environnementaux des habitats naturels. Dans le cadre de cette tude, nous
avons tenu compte des effets confondants de la chimie de leau (pH, Ca,
COD) sur la biodisponibilit du cadmium et de certains facteurs colo-
giques, en particulier labondance et la qualit de la matire en suspen-
sion filtre par les moules (Chl.a, C Sest, N Sest), la quantit de chaleur
accumule durant lt (degrs-jours) linterface eau-sdiments au niveau
des sites de rcolte des bivalves, qui peut influencer leur croissance, et
labondance des poissons htes dans le milieu, qui conditionne le
dveloppement et la dispersion des larves (ou glochidies). Le tableau 2.6
prsente les caractristiques morphomtriques et limnologiques des lacs
(voir Perceval et al., 2002 et le tableau 2.4 pour les mthodes).

2.5.4. Relations entre ltat des populations et les variables toxicologiques


Pour valuer lutilisation de la MT comme biomarqueur deffets toxiques
au niveau des populations et tester le modle de cytotoxicit cellulaire
(figure 2.3), les relations entre les variables des populations (tableau 2.5)
et les variables toxicologiques (tableau 2.3) ont t values par des corr-
lations (r de Pearson) sur les donnes transformes (log-log ou racine car-
re), en appliquant la correction de Bonferroni pour tests multiples
(Perceval et al., 2003). La signification statistique des coefficients de corr-
lation a t teste par permutation (Legendre et Legendre, 1998).
Labondance des populations de Pyganodon grandis, en densit et en
biomasse, ainsi que leur production et leur fcondit cumule diminuent
en fonction du gradient de contamination en Cd2+ dans les lacs ltude
(figures 2.5 a-d). Les plus faibles valeurs ont t observes dans les lacs
86 cotoxicologie molculaire

Tableau 2.4
Mthodes de mesure des variables dmographiques*

Variables Mthodologies
Densit littorale Rcolte de moules par aspiration des sdiments en
(nb. individusm-2) plonge dans des quadrats de 1  1 m (juillet-aot 1998)
Perceval et al., 2002 et par recherche visuelle dans des segments de 10  2 m
Downing et (septembre 1999) le long de transects au niveau de la
Downing, 1992 zone littorale des lacs selon un plan dchantillonnage
Hanson et al., 1988 alatoire stratifi (3 strates : 0-2 m, 2-4 m, 4-6 m ; 13 33
Huebner et al., 1990 transects par lac).
Perceval et al., 2003 Une profondeur maximale de 6 m a t choisie comme
Cochran, 1977 limite infrieure de la distribution des moules.
17-675 moules rcoltes selon cette mthode dans
chaque lac.
chantillon de 120 moules de diffrentes tailles prlev
dans chaque lac pour la dtermination des relations
longueur-ge et longueur-poids ainsi que de la fcon-
dit cumule.
La prcision sur les densits moyennes est de 30 %.
Biomasse littorale Estimation des relations longueurs-poids sur un sous-
(poids vivant) (gm-2) chantillon de 50 individus de diffrentes tailles.
(poids sec somatique) Poids vivant = poids frais avec coquille.
(gm-2) Poids sec somatique = poids sec des viscres aprs
Hanson et al., 1988 schage 60 C pendant 36 h.
Perceval et al., 2003 Calcul de la biomasse totale par lac partir de la fr-
quence relative des diffrentes classes dge au sein des
populations, de la longueur moyenne de la coquille
pour les diffrentes classes dge et des relations
longueur-poids appropries.
Taux de croissance Mesure des longueurs totales chaque annulus de
instantan (an-1) croissance sur un sous-chantillon de 100 moules de
Longueur asympto- diffrentes tailles.
tique thorique (mm) Estimation des paramtres des rgressions de Walford
McCuaig et Green, pour chacun des lacs et calcul des paramtres L
1983 (longueur asymptotique thorique) et K (taux de crois-
Hinch et al., 1986 sance instantan de Brody) de lquation de croissance
Morris et Corkum, de von Bertalanffy.
1999
Perceval et al., 2003
Production Estimation de la biomasse moyenne de chaque classe
(poids vivant) dge et mesure de laccroissement de la biomasse
(gm-2an-1) annuelle entre chaque classe dge.
(poids sec somatique) Estimation de la production annuelle en biomasse par
(gm-2an-1) sommation des accroissements de biomasse des classes
Hanson et al., 1988 dge sans tenir compte de la mortalit.
Perceval et al., 2003
La mtallothionine 87

Tableau 2.4 (suite)


Mthodes de mesure des variables dmographiques*

Variables Mthodologies
Taux de renouvelle- Rapport entre la production et la biomasse annuelle
ment (ratio P/B)
Perceval et al., 2003
Fcondit Dtermination du sexe ratio : femelles gravides avec
individuelle (nb. larves glochidies, femelles non gravides, mles.
larvesfemelle gravide-1)
Comptage au microscope du nombre de glochidies par
Fcondit cumule femelle gravide.
(nb. larvesm2) Estimation de la fcondit individuelle en fonction de la
Aldridge, 1999 taille.
Estimation de fcondit cumule par sommation du
nombre total de glochidies produites par m2 par les
diffrentes classes dge.
Chaleur accumule Enregistrement de la temprature toutes les 2 heures
Degrs-jours entre juin et septembre laide de sondes thermom-
Young et Young, 1998 triques miniatures (Onset Computer Corp.) places
Perceval et al., 2003 dans un contenant tanche 10 cm au dessus des sdi-
ments superficiels de chaque station de rcolte des
moules. Une temprature de 10 C a t utilise comme
seuil infrieur pour le calcul du nombre de degrs-
jours. Cette temprature concide avec lmergence des
moules des sdiments aprs la priode dhibernation.
Calcul des degrs-jours selon la mthode rectangulaire.
Poissons htes chantillonnage des poissons littoraux avec des seines
Perceval et al., 2003 (50  33 m ; 9 mm de taille de mailles).
10 coups de seine par lac correspondant chacun des
surfaces chantillonnes de 400-600 m2 et des profon-
deurs de 0,5 3 m.
Lefficacit des captures dans les seines a t vrifie
par un plongeur.
numration des poissons et estimation des abondances
en captures par unit deffort (CPUE) :
1 unit deffort = 1 coup de seine.

* Mesures des variables dmographiques des populations de Pyganodon grandis, calcul de


la chaleur accumule au cours de lt et chantillonnage des communauts de poissons
dans la zone littorale de 9 lacs de la rgion minire de Rouyn-Noranda. Pour les dtails,
voir Perceval et al., 2002 et 2003.
Tableau 2.5 88
Caractristiques dmographiques dans les lacs slectionns*

Lac Densit Biomasse Production P/B L K Biomasse Production P/B Fcondit


(nb. (nb. (p. vivant) (p. vivant) (mm) (an-1) (p. secs (p. secs cumule
stations) ind.m2) (gm2) (gm2an1) somatiques) somatiques) (nb.
(gm2) (gm2an1) larvesm2)
Bousquet (3) 0,27 9,17 1,80 0,20 126,61 0,10 0,24 0,05 0,19 1 926
Caron (1) 0,04 1,95 0,46 0,23 116,63 0,22 0,04 0,01 0,23 1 297
Dufay (3) 0,54 14,98 3,21 0,21 88,92 0,24 0,31 0,06 0,20 6 456
vain (2) 1,56 52,29 14,41 0,28 111,92 0,23 1,13 0,32 0,28 14 549
Hva (1) 0,17 5,27 1,47 0,28 102,37 0,25 0,11 0,03 0,27 1 744
Joanns (3) 0,77 36,79 5,18 0,14 110,97 0,15 0,74 0,09 0,12 14 225
Ollier (2) 0,63 14,38 4,52 0,31 133,61 0,11 0,28 0,09 0,31 4 719
Opasatica (4) 1,12 34,75 11,48 0,33 110,27 0,22 0,59 0,19 0,32 7 155
Vaudray (1) 0,18 3,27 0,73 0,22 92,64 0,16 0,05 0,01 0,22 869

* Densit et biomasse (moyennes des campagnes dchantillonnage de 1998 et 1999), production et taux de renouvellement (P/B) (en terme de
poids total vivant et de poids secs somatiques), paramtres des courbes de croissance (L : longueur asymptotique thorique, K : taux de crois-
sance instantan) et fcondit cumule des populations de Pyganodon grandis dans la zone littorale des 9 lacs slectionns. Les mthodes dana-
lyse des variables dmographiques sont rsumes au tableau 2.4.

cotoxicologie molculaire
La mtallothionine 89

Hva (H), Bousquet (BO) et Vaudray (VA), les plus contamins en cad-
mium ([Cd2+ ] > 0,6 nM), tandis que les plus fortes valeurs ont t notes
dans les lacs Opasatica (OP), Ollier (OL) et vain (V), 10 fois moins con-
tamins ([Cd2+] < 0,05 nM) (tableau 2.3). Le lac Caron (CA), avec un niveau
de contamination intermdiaire ([Cd2+] = 0,3 nM), similaire celui des
lacs Joanns (JO) et Dufay (DU), abrite la population la moins abondante,
la moins productive et la moins fconde, en terme de fcondit cumule.
Cette rponse atypique pourrait tre due la morphomtrie du lac Caron,
caractrise par une trs grande surface (12 km2) et par une zone littorale
rduite (15 % de la surface du lac) avec une pente moyenne de la zone
littorale abrupte (34 %), une configuration dhabitat peu propice lins-
tallation de peuplements de bivalves (tableau 2.6). Les autres lacs sont en
gnral de plus petite taille (sauf les lacs Opasatica et Vaudray) avec une
zone littorale tendue sur plus de 50 % de la surface totale et en pente
douce infrieure 11 %.
Les paramtres de croissance des populations indiquent que le taux
de croissance instantane (K) est plus faible dans les lacs Vaudray,
Bousquet, Joanns et Ollier (K < 0,200 an1) et plus fort dans les lacs
Opasatica, Hva, vain, Dufay et Caron (K > 0,200 an1) (tableau 2.5). La
longueur asymptotique thorique des populations (L) est la plus faible
dans les populations des lacs Vaudray et Dufay (L < 100 mm) et la plus
forte dans les lacs Ollier et Bousquet (L > 125 mm) (tableau 2.5). Toute-
fois, les variations de ces paramtres de croissance ne semblent pas relies
au gradient de contamination des lacs ou des organismes (Perceval et al.,
2003). La longueur asymptotique thorique reoit plutt linfluence posi-
tive du niveau de minralisation des lacs (i.e., concentration de calcium
dissous dans la colonne deau) et de la quantit et la qualit de la nourri-
ture disponible (C Sest et N Sest) (r = 0,78 et 0,76, P < 0,016) (Perceval
etal., 2003).
La mtallothionine noffre pas un bon potentiel comme biomarqueur
deffets toxiques du Cd au niveau des populations puisque la plupart des
variables ne sont pas corrles avec la concentration de MT dans les
branchies des bivalves, bien que les corrlations suggrent une dtrio-
ration de ltat des populations avec la production de MT (tendances
ngatives non significatives). Seule, la productivit des populations (ratio
P/B) diminue en fonction des concentrations de Cd et de MT dans le
cytosol des branchies (figures 2.6 a-b). Le ratio P/B varie de 0,14 0,33, ce
qui signifie que les populations renouvellent leur biomasse, au pire, seu-
lement tous les 7 ans (lac Joanns) ou, au mieux, tous les 3 ans (lac
Opasatica). Les populations des lacs les moins contamins (Opasatica,
Ollier, vain) affichent les meilleures productivits (P/B : 0,28-0,32, soit,
les temps de renouvellement les plus courts), mais on observe de faibles
90 cotoxicologie molculaire

Figure 2.5
Ractions des populations de bivalves au niveau de contamination*
(nb. individusm2))0,5
(Densit littorale
Log10(Biomasse littorale
(g p. vivantm2))
(g p. vivantm2an1))
Log10(Production
Log10(Fcondit cumule
(nb. larvesm2))

* Relations entre les rponses des populations du bivalve Pyganodon grandis (densit, bio-
masse, production, fcondit cumule) dans la zone littorale de 9 lacs de la rgion de
Rouyn-Noranda en 1998, en fonction du niveau de contamination du milieu (Cd2+ : a-d)
estim selon un modle gochimique dquilibre de sorption linterface eau-sdiment
(Tessier, 1992), et la concentration de cadmium li aux ligands de haut poids molcu-
laire (Cd-HPM : e-h) dans le cytosol des branchies du bivalve. Les symboles gomtriques
(cercle, carr, triangle) indiquent les lacs peu contamins en blanc (OP, V, OL), moyen-
nement contamins en gris (JO, DU, CA) et trs contamins (BO, VA, H) en noir (voir
tableau2.3 pour les abrviations des noms des lacs).
Tableau 2.6
Caractristiques morphomtriques et limnologiques des 9 lacs slectionns*

Lac Aire Aire Pente pHa Ca COD Chl a C Sest N Sest Degrs-
(nb. lac zone zone (mgL1) (mgL1) (gL1) (mg CL1) (mg NL1) jours
stations) (km2) littorale littorale
La mtallothionine

(km2) (%)
Bousquet (3) 2,32 1,15 11,1 6,50 4,26 0,35 16,2 3,6 1,44 0,54 0,64 0,37 0,150 0,175 715
Caron (1) 12,25 1,87 34,2 6,97 11,60 1,66 10,4 2,2 1,26 0,38 0,32 0,21 0,081 0,106 669
Dufay (3) 4,36 2,94 5,8 6,81 2,99 0,19 9,6 0,3 2,11 0,64 0,55 0,17 0,061 0,032 752
vain (2) 2,05 1,17 4,9 7,48 6,83 0,28 7,7 0,7 2,12 1,31 0,37 0,22 0,050 0,047 847
Hva (1) 2,37 2,19 1,6 6,15 2,10 0,15 9,9 0,6 2,21 0,79 0,74 0,23 0,092 0,045 755
Joanns (3) 4,45 2,00 4,6 7,24 6,90 0,21 11,2 1,3 1,94 0,77 0,43 0,10 0,044 0,025 758
Ollier (2) 0,79 0,65 2,8 7,52 12,37 0,63 7,8 0,9 1,71 0,34 0,50 0,22 0,057 0,044 817
Opasatica (4) 9,75 5,98 2,5 7,60 8,42 0,29 7,9 2,3 1,40 0,36 0,38 0,10 0,053 0,027 771
Vaudray (1) 7,37 3,17 5,7 6,65 3,28 0,32 9,0 0,4 1,11 0,57 0,34 0,09 0,033 0,003 706

* Les mthodes destimation des variables morphomtriques et limnologiques sont dcrites par Perceval et al. (2002) et dans le tableau 2.4.
Note : La pente de la zone littorale a t dtermine laide de cartes bathymtriques ; elle correspond la moyenne des pentes individuelles (n =
41-671, selon laire du lac) calcule en fonction de la diffrence en lvation entre la bordure du lac et lisobathe de 6 m divise par la plus
courte distance entre les deux. Pour le calcul de lion libre [Cd2+], on a rcolt par plonge la couche superficielle oxygne des sdiments
dans chaque station 2 priodes (juin 1997 et juin 1998) et des chantillons deau au dessus des sdiments 6 priodes (juin, juillet, aot et
septembre 1997 ; juin et septembre 1998). Les valeurs des variables limnologiques ( lexception des degrs-jours) sont la moyenne ( cart-
type) de 6 chantillons rcolts en 1997 et 1998. Les donnes de temprature de 3 stations de la zone littorale (au lieu de 1) ont servi
calculer le nombre de degrs-jours pour P. grandis aux lacs Caron et Vaudray. a-log10(moyenne [H+]).
91
92 cotoxicologie molculaire

productivits (P/B : 0,12-0,2, soit des temps de renouvellement plus longs)


autant dans les populations de lacs trs (Vaudray et Bousquet) ou mod-
rment (Joanns) contamins. Par ailleurs, la population du lac Hva, le
plus fortement contamin, a une bonne productivit (P/B = 0,27), compa-
rable celle dvain (P/B = 0,28), un lac peu contamin (tableaux 2.3 et 2.5).
Le meilleur biomarqueur des effets dltres du Cd sur ltat de sant
des populations de bivalves est la concentration de Cd lie aux ligands de
haut poids molculaire (Cd-HPM). Ainsi, lexception des paramtres
des courbes de croissance de von Bertalanffy (L et K) qui ne sont pas
relis aux variables toxicologiques, la baisse de labondance et la biomasse,
de la production, du ratio P/B et de la fcondit cumule des populations
est associe une augmentation du complexe Cd-HPM dans le cytosol
des branchies des organismes (figures 2.5e-h ; figure 2.6c). Ceci indique-
rait un lien entre le mauvais tat de sant des populations de bivalves et
laugmentation du Cd cytosolique li aux ligands HPM dans le cytosol
des branchies, phnomne pouvant suggrer un manque defficacit des
mcanismes de dtoxication lis la MT chez les populations les plus
exposes au cadmium. En effet, les plus fortes concentrations de Cd-HPM
ont t notes dans les lacs les plus contamins (Vaudray, Bousquet et
Hva : [Cd2+] > 0,6 nM ; Cd-HPM > 11,6 nmolg1 p. sec) o les rponses
des populations sont gnralement les moins bonnes (figures 2.5 et 2.6).
Dans le lac Joanns, o le niveau de contamination est intermdiaire
([Cd2+] = 0,23 nM), et o les populations sont en bon tat (figure 2.5), la
concentration de Cd li la MT (89 nmolg1 p. sec) est similaire au niveau
rencontr dans les lacs les plus contamins (73-151 nmolg1 p. sec), mais
celle de Cd li aux ligands de haut poids molculaire (Cd-HPM) est plus
faible (9 nmolg1 p. sec) que dans les lacs contamins (11-17 nmolg1 p.sec)
(tableau 2.3).
Notre tude des populations dmontre limportance de dterminer
la spciation du Cd entre les ligands intracellulaires afin de mettre en vi-
dence la forme la plus approprie du biomarqueur. Le complexe Cd-HPM
semble un meilleur biomarqueur deffets dltres au niveau des popula-
tions que la MT elle-mme, mme si ces deux fractions subcellulaires ont
une certaine corrlation (section 2.4). Les rponses des populations dans
les milieux les plus contamins sont relies un changement dans la
spciation intracellulaire du Cd correspondant laugmentation du Cd
li aux ligands HPM (figures2.5e-h ; figure 2.6c).
La mtallothionine 93

Figure 2.6
Productivit des populations de bivalves en fonction de la contamination*

Log10(P/B (an1))

* Relations entre la productivit (ratio P/B) des populations du bivalve Pyganodon grandis
dans la zone littorale de 9 lacs de la rgion de Rouyn-Noranda en 1998, en fonction de la
concentration de Cd (a), de MT (b) et de Cd li aux ligands de haut poids molculaire
(Cd-HPM : c) dans le cytosol des branchies du bivalve. Les symboles gomtriques (cer-
cle, carr, triangle) indiquent les lacs peu contamins en blanc (OP, V, OL), moyenne-
ment contamins en gris (JO, DU, CA) et trs contamins (BO, VA, H) en noir (voir
tableau 2.3 pour les abrviations des noms des lacs).
94 cotoxicologie molculaire

2.5.5. Discussion
Les tudes visant valuer in situ les effets toxiques du cadmium au niveau
des populations dinvertbrs aquatiques sont encore trs rares, la plupart
des tudes ayant t ralises en laboratoire ou dans le cadre dexpriences
de transplantation. Ainsi Jensen et al. (2001) ont tudi en laboratoire les
effets du cadmium sur les traits de vie (taux de croissance, temps et taille
la premire reproduction, fcondit, taille la naissance) de 4 clones
dun petit gastropode Potamogyrus antipodarum des niveaux dexpo-
sition variant de 3,6 13 nM Cd dans leau et de 32 130 nM Cdg1 p. sec
dans les sdiments. Lexposition au cadmium durant 60 jours des con-
centrations suprieures 65 nM Cdg1 p. sec dans les sdiments a eu des
effets ngatifs sur certains traits de vie, en particulier le taux de crois-
sance, mais la tolrance au Cd et les rponses dmographiques taient
trs variables dun clone lautre. Lors dexpriences de transplantation
du bivalve Corbicula fluminea pendant 150 j dans des sites faiblement ou
fortement pollus de la rivire Lot (France), Andrs et al. (1999) ont observ
une inhibition de la croissance dans les sites les plus pollus. Dans notre
rgion dtude en 1990, les bivalves Pyganodon grandis ont aussi manifest
une inhibition de croissance et une baisse de leur indice de condition (poids
du corps/poids de la coquille) aprs leur transplantation du lac Opasatica
([Cd2+] : 0,28 nM) au lac Vaudray ([Cd2+] : 2,2 nM) (Couillard et al., 1995b).
Chez les invertbrs marins, des tudes en laboratoire ont montr un effet
dltre du Cd sur la croissance et la reproduction du polychte Neanthes
arenaceodentata des concentrations de [Cd2+] > 10 nM lorsque les formes
complexes de Cd-MT et Cd-FPM ou Cd-HPM augmentaient (Jenkins et
Sanders, 1986 ; Jenkins et Mason, 1988). McGreer (1982) a aussi tudi les
impacts des mtaux traces sur les populations naturelles du bivalve
Macoma balthica. Cependant, aucune de ces tudes na valu en parallle
les relations entre la production de MT, la spciation intracellulaire du
Cd et les changements dans les populations des niveaux dexposition
chronique en milieu naturel.
Notre tude de cas semble indiquer pour la premire fois lexistence
de relations statistiques entre des effets dltres au niveau des popula-
tions du bivalve Pyganodon grandis et le niveau dexposition au cadmium
en milieu naturel (Cd2+), ainsi que loccurrence de Cd li de faon non
spcifique des ligands de haut poids molculaire (Cd-HPM) dans le
cytosol des organismes. Cependant, compte tenu des effets multiples et
interactifs des autres facteurs environnementaux en milieu naturel, il est
essentiel de tester si les relations observes ne sont pas causes par des
interactions indirectes avec dautres facteurs environnementaux pouvant
avoir un effet confondant. Mme si nous avons appliqu une procdure
de slection de lacs visant minimiser la variabilit des facteurs
limnologiques, il reste encore une variabilit naturelle rsiduelle au niveau
La mtallothionine 95

des facteurs limnologiques et cologiques qui peut confondre les rponses


des organismes et des populations. Cest ce que nous allons examiner dans
la section suivante.

2.6. EFFETS CONFONDANTS DES FACTEURS


ENVIRONNEMENTAUX EN MILIEU NATUREL
En eau douce, plusieurs facteurs environnementaux extrinsques (dans
le milieu) ou intrinsques (chez les organismes) peuvent moduler la
biodisponibilit du cadmium et la biosynthse de mtallothionine (voir
Campbell et Couillard, 2004, chapitre 1) et affecter ensuite directement ou
indirectement les rponses biologiques des organismes aux mtaux traces.
Selon le Modle du ligand biotique, le transport membranaire du
cadmium et son accumulation dans le cytosol des invertbrs en eau douce
devraient tre influencs par les concentrations de protons (H+) et de
cations majeurs (Ca2+, Mg2+) qui comptionnent avec lion mtallique Cd2+
pour les sites de liaison membranaires, et par la prsence de matire
organique dissoute (COD, AH + AF) (voir Campbell et Couillard, 2004,
chapitre 1). Linfluence de ces comptiteurs est lie aux variations de la
qualit chimique de leau qui peuvent modifier la prise en charge du cad-
mium et sa toxicit potentielle (Amyot et al., 1994 ; Bervoets et Blust, 1999 ;
Croteau et al., 2002). En milieu naturel, on a montr que le calcium est un
comptiteur du Cd aux sites dabsorption membranaire chez plusieurs
espces de bivalves (Elliptio complanata, Pyganodon grandis) (Wang et Evans,
1993 ; Perceval et al., 2002 ; Couillard et al., 2003), damphipodes (Hyalella
azteca, Gammarus fasciatus) (Stephenson et Mackie, 1988 ; Amyot et al., 1994),
et des larves de Diptres (Chaoborus sp., Chironomus staegeri) (Hare et
Tessier, 1996 ; Craig et al., 1999). La prsence de matire organique dissoute
et la salinit en milieu marin peuvent aussi diminuer la biodisponibilit
du cadmium (Evans et Lasenby, 1993 ; Croteau et al., 1998 ; Mouneyrac et
al., 1998 ; Oste et al., 2001). Finalement, Stewart (1999) a montr dans le
cadre dexpriences en msocosmes que la prsence dune contamination
polymtallique (Cu, Zn, Pb, Ni) peut diminuer la prise en charge et la
bioaccumulation du Cd chez le bivalve Pyganodon grandis. Les variations
de ces facteurs dans les sites dtudes en milieu naturel doivent donc tre
limites et prises en considration si lon veut mieux dcrire les rponses
des organismes au gradient de contamination en cadmium.
Parmi les facteurs intrinsques aux organismes, la taille et lge, le
sexe, le cycle de reproduction et le type de nutrition sont aussi suscep-
tibles de moduler la bioaccumulation du cadmium et la biosynthse de
MT (Groulx et Lasenby, 1992 ; Amyot et al., 1994 ; Metcalfe-Smith et al.,
1995 ; Mouneyrac et al., 1998 ; Amiard-Triquet et al., 1998). Toutefois, chez
96 cotoxicologie molculaire

le bivalve Pyganodon grandis, les variations saisonnires de la MT sont beau-


coup plus faibles que celles observes le long dun gradient de conta-
mination polymtallique en rgion minire (Couillard et al., 1995a ; Wang
et al., 1999). En outre, les rsultats obtenus par Kalhok et Cyr (1997) dans
une tude conduite sur les populations naturelles de P. grandis dans la
rgion de Rouyn-Noranda dmontrent que, au sein dun mme lac, les
concentrations de MT dans les tissus mous des bivalves ne varient pas de
faon significative avec la taille, lge ou lindice de condition des
individus.
Les effets relatifs de lexposition au cadmium et des facteurs naturels,
et de leurs interactions, sur la bioaccumulation de cadmium et la syn-
thse de mtallothionine chez les invertbrs benthiques ont rarement
t valus en milieu naturel. Rcemment, Couillard et al. (2003) ont ana-
lys les effets des interactions comptitives impliquant les cations majeurs
(Ca2+, Mg2+), les mtaux (Cu2+, Zn2+, Pb2+) et lion hydrogne (H+) sur la
prise en charge du cadmium (Cd2+) et la concentration de mtallothionine
(MT) chez deux organismes sentinelles (le bivalve Pyganodon grandis et la
larve dphmre Hexagenia limbata) dans la rgion minire de Rouyn-
Noranda. Pour le bivalve, le calcium (Ca2+) apparat le principal compti-
teur du Cd au niveau des sites dabsorption, tandis que lion hydrogne
(H+) est le seul comptiteur chez la larve dphmre. Lorsque lon tenait
compte de ces facteurs confondants, les modles reliant les concentrations
de MT chez les organismes au niveau de la contamination du milieu (Cd2+)
taient significativement amliors. Les mmes effets confondants ont t
mis en vidence par Perceval et al. (2002) dans les 20 lacs tudis en 1997
dans la rgion minire de Rouyn-Noranda. La slection des 10 lacs pour
ltude intensive en 1998, ayant minimis les variations inter-lac dans la
chimie de leau (i.e., pH et Ca), a permis dobtenir une trs bonne prdic-
tion des concentrations de Cd (R2 = 0,74 ; P < 0,0001) et de MT (R2 = 0,62 ;
P < 0,0001) dans les branchies du bivalve P. grandis partir des concentra-
tions de lion libre (Cd2+), en tenant compte des effets de ces facteurs con-
fondants (pH et Ca) (Perceval et al., 2002). Ces tudes suggrent galement
quil nest pas possible dextrapoler les rponses dun invertbr quon a
choisi comme organisme sentinelle aux autres espces dinvertbrs de la
communaut puisqu un niveau similaire de contamination en cadmium,
la prise en charge du Cd et la production de MT sont diffrentes dune
espce lautre et dun habitat lautre.
Lorsque lon traite des rponses des populations dinvertbrs aqua-
tiques, les interactions avec les facteurs environnementaux deviennent
encore plus complexes, car la dynamique des populations est influence
non seulement par certaines caractristiques chimiques de leau (p. ex., le
calcium pour les mollusques et crustacs) mais aussi par de nombreux
La mtallothionine 97

autres facteurs cologiques (p. ex., disponibilit et qualit de la nourriture,


prsence de poissons-hte et de prdateurs). Dans le cadre de notre tude
de cas, les effets confondants des facteurs environnementaux ont t
valus, comparativement aux relations observes avec les variables
toxicologiques (Perceval et al., 2003). Ltude montre quil existe, tel que
montr auparavant (section 2.5), des corrlations ngatives (r = 0,58
0,81 ; P < 0,05) entre les variables des populations (densit et biomasse,
production et fcondit, ratio P/B) et le niveau de contamination du milieu
(Cd2+) et/ou le Cd li aux ligands de haut poids molculaire (Cd-HPM)
dans le cytosol des branchies de P. grandis (tableau 2.7). Toutefois, ces
mmes variables (sauf le ratio P/B) prsentent par ailleurs des corrla-
tions positives plus leves (r = 0,75-0,87 ; P < 0,05) avec la chaleur accu-
mule dans la zone littorale des lacs, une variable qui navait pas t
mesure tous les sites lors de ltude extensive de 1997 et qui ne fut
finalement pas prise en compte pour la slection des lacs pour ltude
intensive de 1998. Les lacs les moins pollus (Opasatica, Ollier, vain)
sont ceux qui ont accumul le plus de chaleur en 1998 dans la zone litto-
rale, tandis que les lacs Vaudray et Bousquet, les plus pollus, et le lac
Caron, avec une zone littorale pente abrupte, ont accumul moins de
chaleur dans la zone littorale. Il existe donc une relation inverse entre la
chaleur accumule dans la zone littorale et le niveau de contamination
des lacs en cadmium (Cd2+) (r= 0,71 ; P < 0,05), qui confond nos rsul-
tats. Lorsque lon contrle les effets de la chaleur accumule dans la zone
littorale des lacs entre les lacs sur les diffrentes variables des popula-
tions, laide de corrlations partielles (Legendre et Legendre, 1998), il
ny a plus de relations significatives entre les variables des populations
et le niveau de contamination (Cd2+) ou le biomarqueur (Cd-HPM)
(r = 0,36 et 0,40 ; P > 0,05) (Perceval et al., 2003). Les effets confondants
dus au rgime thermique des lacs dans la zone littorale doivent cepen-
dant tre considrs avec rserve, car il y a une diffrence maximum de
21 % entre la plus haute et la plus petite valeur de chaleur accumule en
zone littorale (en degrs-jours) dans les lacs, ce qui laisse suggrer que les
tempratures moyennes estivales de nos lacs doivent diffrer de peu (1
ou 2 C). Eu gard linfluence considrable que la variable degr-jour a
au point de vue statistique, il y aurait lieu de sassurer que cette influence
correspond bien une influence relle au point de vue biologique. Par
ailleurs, le nombre ou labondance des espces de poissons htes na pas
dinfluence sur les rponses des populations (tableau 2.7).
En ce qui concerne les autres facteurs environnementaux (pH, Ca,
Chl. a, C Sest et N Sest) dont on avait minimis la variabilit par la proc-
dure de slection des lacs, trs peu dentre eux (sauf le pH, et la chloro-
phylle pour la fcondit cumule) prsentent de relation statistique
significative avec les rponses des populations (tableau 2.7). Leffet du
Tableau 2.7 98
Effets de la contamination du milieu sur les populations*

Densit Biomasse Production Ratio Fcondit


(nb. ind.m2) (p. vivant) (p. vivant) P/B cumule
(gm2) (gm2an1) (nb. larvesm2)
(A) Variables toxicologiques
[Cd2+] (nM) 0,79 0,68 0,78 0,52 0,68
[Cd-HPM] (nMg1 p. sec) 0,81 0,68 0,79 0,58 0,67
(B) Facteurs du milieu contrls
pH 0,74 0,65 0,69 0,27 0,69
Ca (mgL1) 0,27 0,21 0,25 0,20 0,31
Chl a (gL1) 0,44 0,54 0,52 0,03 0,63
C Sest. (mg CL1) 0,15 0,01 0,00 0,02 0,06
N Sest. (mg NL1) 0,40 0,27 0,26 0,01 0,30
(C) Facteurs du milieu non contrls
Chaleur accumule (degrs-jours) 0,86 0,80 0,87 0,40 0,75
Nombre despces de poissons htes 0,26 0,28 0,35 0,36 0,38
Abondance des poissons htes 0,28 0,14 0,25 0,50 0,02

* Relations (r de Pearson sur les donnes transformes : log-log ou racine carre) entre les variables des populations (densit et biomasse, produc-
tion et ratio P/B, fcondit cumule) et (A) le niveau de contamination du milieu (Cd2+) et la concentration du biomarqueur potentiel (Cd-HTM
dans le cytosol des branchies) chez le bivalve Pyganodon grandis, et (B) les facteurs du milieu dont les effets confondants ont t minimiss en
1998 par la procdure de slection des lacs (pH, Ca, Chl. a, C Sest, N Sest), et ceux qui nont pas pu tre contrls (chaleur accumule dans la
zone littorale, abondance et nombre despces de poissons htes).

cotoxicologie molculaire
La mtallothionine 99

pH (positif) est difficile dissocier de leffet du gradient de contamina-


tion en cadmium puisque le pH est utilis pour estimer les concentrations
de lion libre Cd2+ (Tessier et al., 1993) et qu faible pH, la concentration
ambiante en Cd2+ augmente. La quantit dalgues en suspension a par
contre un effet positif sur la fcondit cumule des populations dans
certains lacs (Dufay, vain, Joanns) o les concentrations de Chl. a sont
suprieures ou gales 2 gL1. Cependant, la fcondit est faible au lac
Hva, qui a des niveaux de Chl. a similaire (tableaux 2.5 et 2.6).
Cette tude indique quen dpit de la slection des lacs visant
diminuer les effets des facteurs confondants, il est encore trs difficile de
dmontrer lexistence de relation dose-rponse entre ltat des popula-
tions et des biomarqueurs potentiels de la contamination des organismes
(MT et Cd-HPM). En milieu naturel, les facteurs cologiques sont trs
complexes et difficiles contrler a priori et ils ont souvent une influence
primordiale sur ltat des populations, ce qui masque et confond les
relations avec les mtaux traces.

3. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES DE RECHERCHE


partir de cette tude de cas en rgion minire ralise de 1996 1999, il
apparat que la mtallothionine (MT) est effectivement un excellent
biomarqueur dexposition et de contamination chez les invertbrs deau
douce (moules et larves dinsectes), comme cela a t montr pour les inver-
tbrs marins (Langston et al., 1998). Notre tude souligne limportance
de tenir compte des effets confondants lis aux caractristiques chimiques
de leau, en particulier de la concentration de calcium dissous en milieu
alcalin pour les bivalves et des ions hydrognes en milieu acide pour les
larves dinsectes, pour bien dfinir les rponses cellulaires (Cd et MT dans
le cytosol) des organismes en fonction du gradient de contamination en
Cd2+ (Perceval et al., 2002 ; Couillard et al., 2003).
Notre tude de cas, ralise dans des lacs o les concentrations
ambiantes de Cd2+ taient infrieures 1 nM, ne dmontre pas de pertur-
bation dans la rpartition subcellulaire du Cd, alors que de telles pertur-
bations taient videntes antrieurement (1994) dans les lacs les plus
contamins, avec des concentrations ambiantes en Cd2+ de 2 nM (Wang et
al., 1999). Ltude actuelle montre plutt un accroissement proportionnel
des diffrentes formes de Cd lis la MT ou aux ligands HPM et FPM le
long du gradient de contamination en Cd (< 1 nM), et ce mme dans les
lacs faiblement contamins. Notre tude fait ressortir limportance de
dterminer la rpartition intracellulaire du Cd entre les ligands cytoso-
liques pour mieux dfinir les effets toxiques au niveau des organismes et
des populations.
100 cotoxicologie molculaire

Les rsultats obtenus au niveau de la toxicit cellulaire dans le cadre


de notre tude de cas, ainsi que les travaux prcdents de Wang et al.
(1999) et de Couillard et al. (1995a,b), fournissent une certaine somme dl-
ments appuyant le potentiel de la MT et de la rpartition subcellulaire du
Cd entre les ligands intracellulaires comme biomarqueurs prdictifs du
risque toxicologique au niveau cellulaire et de ltat de sant des indi-
vidus. Notre tude de cas a permis de lier laccumulation de Cd dans le
cytosol des branchies des bivalves un stress oxydant au niveau des
membranes cellulaires, sans toutefois dmontrer de lien direct avec la pro-
duction de MT ou des formes de Cd lies aux ligands intracellulaires. La
rponse toxicologique au niveau cellulaire apparaissait plus importante
au dbut des annes 1990, lorsque le niveau de contamination des lacs
tait plus lev (Wang et al., 1999). On observait alors une diminution de
la masse sche des branchies associe une ncrose et laccroissement du
Cd li au ligands de faible poids molculaire (Cd-FPM) chez les bivalves
des lacs les plus contamins (Cd2+ > 1 nM). Lassociation entre un tel dom-
mage et la pression de contamination dun mtal trace exerce au niveau
individuel peut quelquefois tre une des donnes dterminantes dune
valuation de risque cotoxicologique au niveau dun site (Beyer et Audet,
2002).
Il semble cependant difficile dans le cadre de cette tude de cas
dassigner la MT ou dautres biomarqueurs potentiels, comme le Cd
associ aux ligands de haut poids molculaire (Cd-HPM) ou de faible poids
molculaire (Cd-FPM), un rle prdictif deffets cotoxicologiques sur ltat
des populations de bivalves. Notre tude de cas montre un lien apparent
entre le mauvais tat de sant des populations de bivalves dans les lacs
les plus contamins et la contamination en Cd2+ dans le milieu, et laug-
mentation de Cd li aux ligands de haut poids molculaire (Cd-HPM).
Ceci pourrait indiquer que la rpartition du Cd entre les ligands intracel-
lulaires offre un potentiel de diagnostic des effets nfastes au niveau des
populations. Toutefois, bien que nous ayons minimis a priori la varia-
bilit des facteurs cologiques dans le cadre de notre tude, les relations
ngatives observes entre certaines variables de population (abondance,
production, ratio P/B et fcondit cumule) et soit le niveau dexposition
(Cd2+), soit un biomarqueur potentiel (Cd-HPM), semblent indirectement
relies une relation inverse entre la chaleur accumule dans la zone
littorale des lacs et le niveau de contamination des lacs. Il na donc pas t
possible de mettre en vidence un lien direct entre le biomarqueur MT et
les rponses des populations.
Les rponses attnues observes en 1998 par rapport au dbut de la
dcennie 1990 peuvent sexpliquer par le contexte environnemental chan-
geant de la rgion de Rouyn-Noranda au cours des 10-15 dernires annes.
La mtallothionine 101

La dtection au dbut de la dcennie 1990 dun fort gradient environ-


nemental en mtaux traces dans les lacs de la rgion minire de Rouyn-
Noranda, ainsi que la prsence de populations de bivalves dans la majorit
de ces lacs, fournissait un cadre trs appropri pour tester le biomarqueur
MT en milieu naturel. Avec les efforts de mitigation consentis par les entre-
prises minires de la rgion, ce gradient environnemental de contamina-
tion sest beaucoup attnu au cours de la dcennie et na probablement
pas fourni les conditions optimales pour raliser la prsente valuation.
Dans les prsentes conditions, on peut sattendre ce que la pression de
contamination exerce par le Cd dcroisse en influence et que les facteurs
cologiques gagnent en importance comme lments structurants des
populations de bivalves des lacs de la rgion. Ds lors, les biomarqueurs
MT et subcellulaires ne sauraient reflter adquatement les rponses
numriques des populations de bivalves au changement de leur milieu
ambiant.
Notre tude de cas soutient le constat fait par Lagadic et al. (1997c)
sur la signification cotoxicologique des biomarqueurs. Mme si les bases
conceptuelles et scientifiques de lutilisation de biomarqueurs tels que la
MT sont bien tablies pour lvaluation diagnostique et prdictive des ef-
fets du cadmium au niveau cellulaire chez les invertbrs marins et deau
douce, le manque de connaissances sur les effets confondants des facteurs
cologiques en milieu naturel limite beaucoup la signification cotoxico-
logique de la MT comme biomarqueur deffets toxiques au niveau des
populations et des communauts. Dans un mme souffle, les prsents tra-
vaux fournissent des indications prcieuses du cadre cotoxicologique
intgr dans lequel fonctionneront le mieux les biomarqueurs et/ou
approches diagnostiques gnrales (Environnement Canada, 2002) en
regard dune problmatique de contamination par les mtaux traces en
rgion minire.
102 cotoxicologie molculaire

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CHAPITRE

3
LA DPOLLUTION DES POP
Les nouveaux outils de la biologie molculaire
la rescousse des biotechnologies
environnementales

MICHEL SYLVESTRE
INRSInstitut Armand-Frappier

DIANE BARRIAULT
INRSInstitut Armand-Frappier

MARIE-MICHLE PLANTE
INRSInstitut Armand-Frappier

CATHERINE SIMARD
INRSInstitut Armand-Frappier
110 cotoxicologie molculaire

RSUM
Les composs organiques dorigine naturelle ne saccumulent pas dans la biosphre, car
les micro-organismes peuvent les dgrader efficacement. Cependant, laccumulation de
composs toxiques comme les BPC, les HAP, les dioxines, etc. dans les tissus dorganismes
vivants indiquent que certains polluants ne sont pas minraliss efficacement dans lenvi-
ronnement. Cette persistance diffuse est due labsence de voies cataboliques microbiennes
efficaces pour dgrader ces polluants. Du fait que ces composs apparus avec lre indus-
trielle soient rcents, les micro-organismes nont pas encore appris les dgrader. Ces com-
poss organiques persistants (POP) reprsentent un problme majeur pour lenvironnement.
Lutilisation de procds de dgradation microbienne des POP ncessitera une inter-
vention humaine dabord pour acclrer le processus volutif conduisant au dvelop-
pement de voies cataboliques efficaces. Les stratgies de dveloppement de ces voies de
dgradation ncessitent une bonne comprhension des mcanismes biochimiques et gn-
tiques rgissant ces dgradations. Nous dcrirons lexemple des travaux visant lucider
la voie catabolique des biphnyles polychlors (BPC) et augmenter leur potentiel
catabolique envers ces composs.
Les bactries dgradent les BPC par la voie mtabolique du biphnyle. Cette voie
comprend quatre tapes enzymatiques qui les transforment en chlorobenzoates corres-
pondants. Les chlorobenzoates sont ensuite minraliss par une autre voie mtabolique.
Dans lordre, les BPC sont dabord hydroxyls sur deux atomes de carbone ortho-meta
adjacents, par la dioxygnase du biphnyle ; le 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle produit
est ensuite raromatis par une dshydrognase ; le catchol qui en rsulte est scind par
une dioxygnase en acide 2-hydroxy-6-oxo-6-phnylhexa-2,4-dinoque qui est hydrolys
pour former lacide benzoque. Les enzymes de cette voie catabolique ont t isoles et
caractrises afin didentifier leurs limites cataboliques. La biologie molculaire a fourni
des outils indispensables pour acclrer notre comprhension des mcanismes molcu-
laires impliqus dans la dgradation des BPC. Le spectre de congnres BPC dgrads
par les diffrentes bactries est en grande partie dtermin par la spcificit de la pre-
mire enzyme de la voie, mais les autres enzymes imposent aussi des restrictions au spectre
de BPC qui peuvent tre dgrads. Dans ce document, nous rsumerons nos connaissances
actuelles des paramtres biochimiques des quatre enzymes du tronon catabolique requis
pour la conversion de BPC en chlorobenzoates. Une emphase particulire sera donne
aux paramtres qui influencent leurs interactions avec les congnres BPC ainsi quaux
moyens notre disposition pour augmenter leur potentiel catabolique. Dans ce contexte,
nous dcrirons nos travaux qui visaient mieux connatre les paramtres cintiques de la
dioxygnase du biphnyle ainsi qu dvelopper des variants plus performants de cette
enzyme par ingnierie gntique. Un outil important qui a t dvelopp rcemment est
lvolution molculaire in vitro. Nous avons fait appel cet outil pour dvelopper des
dioxygnases du biphnyle et les rsultats rapports indiquent que cette approche est trs
prometteuse. Enfin, nous discuterons des problmes associs lutilisation des organis-
mes modifis gntiquement dans les procds de dcontamination et des solutions que
nous offre la biologie molculaire pour rendre ces procds plus scuritaires.
La dpollution des POP 111

1. INTRODUCTION
Plusieurs procds de dpollution bass sur la participation active des
micro-organismes ont t mis au point au cours des dix dernires annes.
Ces procds sont efficaces pour rhabiliter les sites contamins par des
polluants labiles. Cependant, certains polluants comme les hydrocarbu-
res aromatiques polycycliques (HAP) ou les biphnyles polychlors (BPC)
rsistent la dgradation microbienne, rendant difficile lapplication de
ces biotechnologies environnementales. Ces polluants organiques persis-
tants (POP) saccumulent dans la chane alimentaire et prsentent un
danger pour les cosystmes. La dgradation des POP est un processus
complexe qui ncessite lapport denzymes microbiennes spcialises, dont
la dioxygnase du biphnyle. Lincapacit de ces enzymes dgrader effi-
cacement certains polluants est en grande partie responsable de la persis-
tance de ces polluants. Le chapitre sera consacr dcrire comment les
plus rcents dveloppements de la biologie molculaire peuvent servir
mieux comprendre lcologie microbienne des procds de dpollution
et faciliter le dveloppement de nouvelles approches dintervention
biotechnologique pour dpolluer les POP. Nous verrons entre autres com-
ment ces outils molculaires ont facilit les investigations visant mieux
comprendre les mcanismes ractionnels responsables de la transforma-
tion biologique des polluants et visant laborer des stratgies faisant
appel des approches rationnelles et alatoires, pour dvelopper des
procds biotechnologiques efficaces de destruction de ces polluants.

2. BIODISPOSITION DES COMPOSS XNOBIOTIQUES


PAR LES BACTRIES DE LENVIRONNEMENT
Les micro-organismes du sol et des environnements aquatiques sont les
principaux agents responsables de la minralisation de la matire orga-
nique. Ce processus sert rgnrer les lments essentiels la recons-
titution de la biosphre. En ralit, la biosphre compte un nombre
incommensurable de composs organiques dont la majorit reste iden-
tifier. Par exemple, on estime que 1 g de sol contiendrait au moins 100 000
composs divers dont on ignore encore la structure. De nouveaux com-
poss apparaissent alors que dautres disparaissent de la biosphre, suivant
la dynamique de lvolution des espces. De faon gnrale, les composs
dorigine naturelle ne saccumulent pas dans la biosphre cause de la
capacit des micro-organismes dvelopper des voies biochimiques effi-
caces pour leur dgradation (McClure et al., 1991 ; Liu et Suflita, 1993).

Licence enqc-11-620680-583909-950 accorde le 18 mars 2011


Algeria Educ
112 cotoxicologie molculaire

Dj au dbut du XXe sicle, les microbiologistes reconnaissaient que


les bactries ont le potentiel de dgrader la majorit des composs orga-
niques rejets dans lenvironnement. Cependant, plusieurs facteurs
environnementaux affectent la capacit des micro-organismes dgrader
les xnobiotiques, entranant leur persistance. Ainsi plusieurs activits
humaines conduisent laccumulation de composs organiques dorigine
synthtique ou naturelle dans les cosystmes qui nous entourent, causant
des foyers de pollution.

2.1. CAPACIT DES MICRO-ORGANISMES


DGRADER LES XNOBIOTIQUES
Rappelons que le mtabolisme des micro-organismes prototrophiques
requiert la prsence dun compos organique servant de donneur dlec-
trons et de source de carbone pour fabriquer les constituants cellulaires.
Les lectrons librs au cours du processus doxydation de substrat orga-
nique sont ensuite transfrs le long dune chane de transporteurs dlec-
trons jusqu un accepteur final qui, pour les organismes arobies, est
loxygne (figure 3.1 ; voir aussi planche 1). En conditions anoxiques,
laccepteur dlectrons peut tre le fer, le cuivre, le nitrate, le sulfate, le
dioxyde de carbone, etc. ou un autre compos organique. Outre le car-
bone, la synthse des constituants cellulaires ncessite plusieurs autres
composs, dont lazote, le phosphore, le fer, le magnsium, le calcium, le
sodium, le soufre et plusieurs autres lments essentiels la croissance.
Lorsquune source de carbone est introduite dans un cosystme micro-
bien, sa dgradation dpend de la prsence de ces autres ingrdients en
quantit adquate. Par exemple, lorsquune source de carbone facilement
assimilable comme un sucre est introduite dans un cosystme, la dgra-
dation sera rapide initialement, mais elle cessera aussitt quun des ingr-
dients requis pour la croissance sera puis. Lazote, le phosphore et
loxygne sont souvent les ingrdients le plus rapidement puiss. Lpui-
sement des ingrdients essentiels la croissance microbienne est une raison
importante expliquant la persistance de composs organiques comme les
drivs du ptrole dans les cosystmes (Liu et Suflita, 1993).
Le processus doxydation des substrats organiques peut aussi gnrer
des mtabolites toxiques ou inhibiteurs qui vont restreindre les capacits
cataboliques des micro-organismes impliqus dans la dgradation du
polluant. Ce phnomne a surtout t observ dans le cas de composs
organiques synthtiques comme les chlorobenzoates (Reineke et
Knackmuss, 1988) et les BPC faible teneur en chlore (Sondossi et al., 1992).
La dpollution des POP 113

Figure 3.1
Mtabolisme des organismes prototrophiques arobies

La biodisponibilit est un autre paramtre important qui peut con-


tribuer la persistance dun compos organique dans lenvironnement.
Plusieurs phnomnes peuvent influencer la biodisponibilit dun com-
pos organique. Entre autres, les composs lipophiles ne peuvent pas
atteindre facilement les enzymes microbiennes impliques dans leur dgra-
dation, les enzymes cataboliques tant gnralement intracellulaires ou
priplasmiques. Plusieurs tudes montrant linfluence positive des agents
tensioactifs synthtiques ou biologiques ont clairement dmontr que la
solubilit dans leau constitue un facteur important influenant la biod-
gradation des composs organiques (Providenti et al., 1993). Un autre ph-
nomne qui influence la biodisponibilit des composs organiques est la
sorption qui rsulte de linteraction du compos organique avec la matrice
du sol. Le phnomne de sorption varie considrablement selon la nature
du polluant et la composition du sol. Ce phnomne saccentue avec le
temps conduisant une presque inaccessibilit du polluant aprs quelques
annes de persistance dans le sol (Alexander, 2000). Laugmentation de la
sorption du polluant en fonction du temps serait due en principe, la
migration graduelle des molcules du polluant lintrieur des nanopores
des particules de sol. Bien que ce phnomne contribue la persistance
des polluants facilement dgradables comme les hydrocarbures, ce ph-
nomne a un effet bnfique en tant responsable de la rduction de la
charge toxique du sol. En effet, bien que le polluant persiste dans le sol, il
nest pas disponible pour les organismes qui ingrent les particules de sol
(Alexander, 2000).
114 cotoxicologie molculaire

Un autre facteur important qui contribue la persistance des


polluants dans les sols et sdiments est reli au transport des micro-
organismes dans le sol. En effet, pour quil y ait dgradation dun pol-
luant, il est ncessaire que la bactrie entre en contact physique avec le
polluant. Les enzymes diffuses dans les sols et les sdiments peuvent par-
ticiper la dgradation des polluants (Bollag, 1992). Cependant, on estime
que ce rle est limit du fait que les enzymes sont instables lextrieur
des cellules et que la plupart des enzymes cataboliques sont intracellu-
laires et ne sont pas excrtes par les cellules. La diffusion des enzymes
rsulte de la mort et la lyse des cellules.
Plusieurs facteurs environnementaux et gntiques influencent le
dplacement des micro-organismes dans les sols (Murphy et Tate, 1996).
Les facteurs affectant le mouvement des micro-organismes dans les sols
comprennent, entre autres, la nature et la composition du sol, la teneur en
eau, le mouvement de leau, la force ionique, la quantit et le compor-
tement de la zooflore du sol (Murphy et Tate, 1996). De plus, des tudes
rcentes montrent limportance de la flore vgtale et de son systme
radiculaire sur la croissance et la migration des micro-organismes autant
que sur la migration des polluants dans les sols (Salt et al., 1998 ; Liste et
Alexander, 2000). Enfin dautres tudes ont dmontr que la chimiotaxie
peut influencer le dplacement des bactries vers les polluants (Parales et
al., 2000a).
Parmi les autres facteurs environnementaux susceptibles dinfluencer
la dgradation des composs organiques polluants, on compte la prsence
dautres polluants toxiques comme les mtaux lourds ou les phnols sur
le site contamin. En effet la plupart des sites contamins contiennent un
mlange de contaminants ; souvent, on y trouve des mtaux lourds qui
sont toxiques pour les bactries (Providenti, Lee et Trevors, 1993). Enfin,
la concentration du polluant lui-mme peut tre un facteur limitant sa
dgradation. Certains contaminants comme les polychlorophnols sont
trs toxiques et leur dgradation est impossible lorsque leur concentra-
tion est au-dessus du seuil de toxicit. Par contre, certains autres polluants
sont prsents en concentration trop faible pour soutenir la croissance des
bactries prsentes. Les polluants faiblement solubles dans leau sont pr-
sents en trs faible concentration dans la phase aqueuse du sol, rsultant
en une trop faible concentration disponible pour la croissance des micro-
organismes (Alexander, 2000). Cependant, dautres exemples de composs
trs solubles dans leau peuvent persister dans les sols sils sont prsents
en concentration trop faible (Alexander, 1973).
Outre les facteurs environnementaux, plusieurs facteurs de nature
physiologique peuvent influencer la dgradation microbienne des pol-
luants. Entre autres, la prsence dinducteurs appropris peut grandement
La dpollution des POP 115

influencer la dgradation des polluants. En effet, les voies cataboliques


sont inductibles, cest--dire que les enzymes catalysant la dgradation
des polluants sont exprimes en prsence dun inducteur qui est gnra-
lement le substrat dgrader ou lun de ses mtabolites. Ainsi la voie
catabolique du biphnyle qui sert dgrader les BPC faible teneur en
chlore (voir plus bas) ne sexprime quen prsence de biphnyle (Barriault
et Sylvestre, 1993). Les chlorobiphnyles qui sont incapables dinduire cette
voie ne peuvent tre dgrads quen prsence de biphnyle dans le milieu.
Un autre phnomne important qui influence la dgradation des polluants
est le co-mtabolisme. Comme nous lavons indiqu plus haut, la crois-
sance microbienne ncessite lapport dun substrat organique qui sert de
source de carbone et dnergie. Il arrive que les voies cataboliques micro-
biennes puissent transformer certains analogues de leur substrat naturel
sans toutefois que cette transformation soit assez efficace pour fournir les
lectrons ncessaires pour suppler leur besoin nergtique. Le phno-
mne qui consiste dgrader un substrat sans en retirer dnergie est
appel co-mtabolisme. Il va sans dire que pour que les bactries puissent
convertir un substrat organique par co-mtabolisme, elles doivent avoir
accs une autre source de carbone (donneur dlectrons) qui fournit
lnergie ncessaire leur croissance. Plusieurs polluants organiques, dont
les BPC faible teneur en chlore et les HAP, plusieurs herbicides et
pesticides sont dgrads par co-mtabolisme.

2.2. CAPACIT DADAPTATION DES MICRO-ORGANISMES


DANS UN NOUVEL ENVIRONNEMENT
La versatilit nutritionnelle des bactries, cest-dire leur capacit de
dgrader une varit considrable de composs organiques et leur capa-
cit apprendre rapidement dgrader de nouveaux composs organiques
est contrle par un ensemble de facteurs gntiques, biochimiques et co-
logiques. Les gnes rgissant la dgradation des composs organiques
prsents dans la nature sont souvent localiss sur des plasmides qui sont
des lments extrachromosomiques facilement mobilisables (transfrables)
entre les bactries (Wallace et Sayler, 1992). Par consquent, lorsquun gne
nouveau, mutant, permettant la dgradation dun nouveau compos
apparat, celui-ci peut tre transmis rapidement plusieurs autres bactries
appartenant des groupes taxonomiques diffrents.
Un autre phnomne important dans le dveloppement de bactries
capables de dgrader de nouveaux composs chimiques est la capacit de
ces organismes travailler en consortium pour effectuer la dgradation
(Liu et Suflita, 1993). Ainsi, des bactries diffrentes peuvent travailler
ensemble dgrader un compos efficacement. Par exemple, la dgra-
dation des BPC requiert deux voies cataboliques (voir plus loin). Une
116 cotoxicologie molculaire

premire voie transforme le BPC en chlorobenzoates correspondants


(Furukawa, 1982 ; Unterman, 1996 ; Sylvestre, 1995). Une seconde voie
minralise les chlorobenzoates. Les bactries arobies dgradent un
nombre restreint de congnres BPC ; elles dgradent surtout les cong-
nres faible teneur en chlore. Entre autres, certaines bactries sont
capables de transformer les monochlorobiphnyles en monochloroben-
zoates, mais, elles ne possdent pas la voie catabolique des chloroben-
zoates. Laccumulation des chlorobenzoates dans le milieu de croissance
conduit la formation de mtabolites toxiques qui inhibent la dgrada-
tion des chlorobiphnyles (Hernandez et al., 1991 ; Sondossi et al., 1992).
Cependant, il est possible de dvelopper des consortiums bactriens qui
ensemble dgradent efficacement les congnres faible teneur en chlore
autant en milieu liquide que dans les sols (Furukawa et Chakrabarty, 1982 ;
Sylvestre et Fauteux, 1982 ; Barriault et Sylvestre, 1993 ; Hickey et al., 1993).
Dans la nature, les bactries travaillent en consortium non seulement
lintrieur dune mme niche cologique, mais elles peuvent travailler
ensemble entre niches cologiques trs diffrentes. Ainsi, dans le cas des
BPC, il est reconnu que les bactries anarobies des sdiments aquatiques
peuvent effectuer une raction de dshalognation rductrice qui conduit
au remplacement des atomes de chlore par des atomes dhydrogne. Cette
raction a pour effet dallger la teneur en chlore des congnres BPC et
de les rendre plus disponibles la dgradation par les bactries arobies
en surface des sdiments. Ce systme a servi de modle pour concevoir
des bioracteurs deux phases arobie/anarobie qui viseraient la dgra-
dation des mlanges de BPC haute teneur en chlore. Malheureusement,
toutefois, la dshalognation rductrice est un processus trs lent dont les
mcanismes molculaires sont encore inconnus (pour un examen de la
question, voir Sylvestre, 1995 ; Abramowicz, 1994 ; Suflita et Townsend,
1995 ; Abramowicz et Olson, 1995). De plus, ce processus conduit lac-
cumulation de congnres non dsirables comme les 3,3',4,4'- et 2,2',6,6'-
ttrachlorobiphnyles ainsi que le 2,6-dichlorobiphnyle, qui rsistent
la dshalognation rductrice (Maltseva et al., 1999) ainsi qu la dgra-
dation par les bactries arobies. Il faudra encore beaucoup defforts de
recherche pour optimiser ce procd. Cependant, comme on le verra plus
loin, il est possible de dvelopper par gnie gntique des oxygnases qui
peuvent dgrader ces congnres persistants. Cependant, comme on le
verra plus loin, la biologie molculaire et le gnie gntique nous offrent
des outils permettant de dvelopper des enzymes plus efficaces, capables
de dgrader ces congnres persistants.
La dpollution des POP 117

3. LES POP, UNE MENACE POUR LENVIRONNEMENT


La persistance dun grand nombre de polluants est cause par lun ou
lautre ou par un ensemble des facteurs numrs dans les paragraphes
prcdents. Dans ces cas, la persistance est limite un cosystme et il
est souvent possible dy remdier en appliquant les conditions environ-
nementales appropries. Par exemple, on exploite les micro-organismes
depuis plus de 80 ans pour traiter efficacement les eaux uses domestiques
(Watanabe et Baker, 2000 ; Eckenfelder et Musterman, 1995). Au cours des
deux dernires dcennies, plusieurs procds efficaces ont t mis au point
pour la rhabilitation de sites contamins par des drivs du ptrole (sols
et eaux souterraines) (Rosenberg, 1993).
Cependant, la dtection de composs toxiques comme les BPC, les
HAP, les dioxines, etc. dans la biosphre et leur accumulation dans les
tissus dorganismes vivants indiquent que certains polluants ne sont pas
minraliss efficacement dans lenvironnement. Cette persistance qui se
traduit par une pollution diffuse est due labsence de voies cataboliques
microbiennes efficaces pour dgrader ces polluants. Du fait que ces com-
poss apparus avec lre industrielle soient rcents, les micro-organismes
nont pas encore appris les dgrader (Shannon et Unterman, 1993 ;
Edgington, 1994). Ces composs organiques persistants abrgs sous le
terme de POP reprsentent un problme majeur pour notre socit. Le
problme est dautant srieux que le Conseil administratif du Programme
des Nations Unies sur lenvironnement (PNUE), lors de sa 19e session en
fvrier 1997 (dcision 19/3(C)) a conclu quune action internationale,
incluant la conception dun instrument global ayant force excutoire,
simposait dans le but de rduire les risques sur la sant humaine et sur
lenvironnement provoqus lors des missions de douze POP cibls. Ces
douze POP sont les BPC, les dioxines et furanes, la dieldrine, le DDT,
lendrine, le clordane, lhexachlorobenzne, le mirex, le toxaphne et
lheptachlore.
Ces substances chimiques sont extrmement stables et sont recon-
nues pour leur facult saccumuler dans les tissus biologiques. De ce
fait, elles sont transportes sur de longues distances, vers des rgions qui
nont jamais connu ni leur usage, ni leur production, et ainsi elles menacent
lenvironnement lchelle globale (Molina et al., 1999 ; Brunstrom et
Halldin, 2000).
118 cotoxicologie molculaire

3.1. PERSISTANCE DES POP


Malgr les outils molculaires et cologiques que possdent les bactries
pour apprendre rapidement dgrader de nouveaux composs, les POP
sont encore parmi nous pour longtemps. Pourquoi en est-il ainsi ? Pour
rpondre cette question, il faut comprendre les mcanismes biochimiques
par lesquels les bactries dgradent ces composs nouveaux. Nous utili-
serons ici le modle de la dgradation microbienne des BPC, qui a fait
lobjet de plusieurs tudes au cours des dernires dcennies.
Une observation importante est que les enzymes bactriennes impli-
ques dans la dgradation des composs organiques du sol sont des
enzymes qui, en gnral, ont un large spectre de substrat, cest--dire que
ces enzymes peuvent catalyser des ractions biochimiques en utilisant des
substrats autres que leur substrat naturel. titre dexemple, chez les bac-
tries, les chlorobiphnyles sont dgrads par les enzymes de la voie res-
ponsable de la dgradation du biphnyle, qui est une substance dorigine
naturelle, prsente dans la nature depuis trs longtemps (Sylvestre, 1995).
La premire tape tant franchie, il reste au processus lent de la slection
naturelle dinfluencer la direction des mutations pour dvelopper des
enzymes plus efficaces pour dgrader les BPC. Ce processus est cependant
trs long lchelle humaine : il ncessite des milliers, voire des millions
dannes.
Un grand nombre de microorganismes capables de dgrader des
polluants quon considrait non dgradables ont t dcrits au cours des
dix dernires annes. Les exemples sont multiples (TNT, 2,4-D, 2,4,5-T,
PCP, etc.) (Yadav et Reddy, 1993 ; Daubaras et al., 1996 ; Eilers et al., 1999 ;
Hawari et al., 1999 ; Siciliano et Greer, 2000). Ces observations indiquent
que dans lenvironnement, la pression de slection favorise le dvelop-
pement de bactries capables de dgrader des composs xnobiotiques
persistants. Nanmoins, la persistance dans lenvironnement de certains
autres composs comme les BPC et les HAP montre lincapacit des voies
cataboliques microbiennes actuelles de dgrader ces polluants efficace-
ment. De fait, trois facteurs majeurs interviennent dans la dgradation
dun polluant : la biodisponibilit, la prsence denzymes efficaces pour
transformer le polluant, la prsence de tous les enzymes ncessaires pour
minraliser le polluant afin de prvenir laccumulation de mtabolites ind-
sirables. La biodisponibilit est un facteur non ngligeable considrer
dans les processus de biorestauration des POP, car ce sont souvent des
composs hydrophobes qui ont tendance se fixer sur la matrice envi-
ronnementale (sol, sdiments, particules en suspension dans leau). Lad-
dition dagents tensioactifs peut faciliter la dgradation des BPC (Barriault
et Sylvestre, 1993 ; Billingsley et al., 1999) autant que des HAP (Boonchan
et al., 1998). Cependant, laddition de ces composs nest pas suffisante
La dpollution des POP 119

pour permettre la dgradation des congnres les plus persistants des BPC
et HAP (Barriault et Sylvestre, 1993). La raison en est que les enzymes
utilises par les bactries arobies pour dgrader ces polluants sont inca-
pables doxyder les congnres les plus persistants (Haddock et al., 1995 ;
Hurtubise et al., 1995).

3.2. EXEMPLE DES BPC


Lutilisation de procds de dgradation microbienne des POP ncessitera
une intervention humaine pour dabord acclrer le processus volutif
conduisant au dveloppement de voies cataboliques efficaces. Les stra-
tgies de dveloppement de ces voies de dgradation ncessitent une
bonne comprhension des mcanismes biochimiques et gntiques
rgissant ces dgradations. Pour cette raison, plusieurs tudes ont vis
lucider les voies mtaboliques impliques dans la transformation micro-
bienne des POP dans la nature. Une liste exhaustive de ces tudes dpasse
le cadre du prsent examen ; nous nous limiterons dcrire lexemple de
la voie catabolique des BPC.

4. VOIE CATABOLIQUE DES BPC


Dans la nature, les bactries dgradent les BPC par la voie mtabolique
du biphnyle. Cette voie comprend quatre tapes enzymatiques pour
transformer les BPC en chlorobenzoates correspondants. Les chloroben-
zoates sont ensuite minraliss par une autre voie mtabolique. Lidenti-
fication des mtabolites des BPC (Mass et al. 1989 ; Ahmad et al., 1991a ;
Ahmad et al., 1991b) ainsi que ltude des gnes impliqus dans la dgra-
dation ont permis dlucider la voie biochimique responsable de la dgra-
dation des BPC (figure 3.2) (Ahmad et al., 1990, Ahmad et al., 1991a ; Ahmad
et al., 1991b ; Sylvestre et al., 1996b) chez la bactrie Comamonas testosteroni
B-356, que nous avons isole de lenvironnement. La premire tape de
dgradation des BPC est catalyse par la dioxygnase du biphnyle qui
introduit deux atomes doxygne en position ortho-meta, sur le cycle
aromatique. Cette raction conduit la formation de 2,3-dihydro-2,3-
dihydroxybiphnyle qui est ensuite raromatis par la 2,3-dihydro-2,3-
dihydroxybiphnyle-2,3-dshydrognase. Le catchol qui en rsulte est
ensuite oxyd par la 2,3-dihydroxybiphnyle-1,2-dioxygnase qui catalyse
la fission du cycle aromatique. Le mtabolite qui en rsulte, lacide
2-hydroxy-6-oxo-6-phnylhexa-2,4-dinoque (HOPDA) est ensuite hydro-
lys pour former lacide benzoque et lacide pentanoque. Cette voie res-
semble celle qui est prsente chez toutes les autres bactries connues
capables de dgrader les BPC (Unterman, 1996 ; Furukawa et al., 1978 ;
Furukawa et al., 1992 ; Bedard et al., 1986 ; Sylvestre, 1995).
120 cotoxicologie molculaire

Les enzymes de cette voie catabolique ont t isoles et caractrises


afin didentifier leurs limites cataboliques (Haddock et Gibson, 1995 ;
Haddock et al., 1995 ; Erickson et Mondello, 1992 ; Erickson et Mondello,
1993 ; Taira et al., 1992). La biologie molculaire a fourni des outils indis-
pensables pour acclrer notre comprhension des mcanismes molcu-
laires impliqus dans la dgradation des BPC. Des tudes effectues avec
des clones bactriens exprimant individuellement chacune des enzymes
de la voie catabolique ont permis de prciser la spcificit des enzymes
envers les diffrents congnres BPC et leurs mtabolites (Furukawa et
al., 1993 ; Haddock et al., 1995 ; Haddock et al., 1993 ; Hurtubise et al. 1995 ;
Hurtubise et al., 1996 ; Barriault et al., 1998, 1999b). Ces tudes ont montr
que la capacit des bactries dgrader les diffrents congnres BPC varie
considrablement dune bactrie lautre. Le spectre de congnres BPC
dgrads par les diffrentes bactries est en grande partie dtermin par
la spcificit de la premire enzyme de la voie catabolique, la dioxygnase
du biphnyle (Sylvestre, 1995), mais les autres enzymes de cette voie
imposent aussi des restrictions au spectre des BPC qui peuvent tre
dgrads. Pour cette raison, nous avons entrepris ltude molculaire des
deux premires enzymes de cette voie de dgradation. Dans ce document,
je rsumerai nos connaissances actuelles des paramtres biochimiques des
quatre enzymes du tronon catabolique requis pour la conversion de BPC
en chlorobenzoates. Je mattardrai principalement sur les paramtres qui
influencent leur interaction avec les congnres BPC ainsi que sur les
moyens notre disposition pour augmenter leur potentiel catabolique
envers un plus large spectre de congnres BPC. Trois souches ont servi
principalement lucider les mcanismes molculaires de dgradation
des BPC et identifier les dterminants de la spcificit. Il sagit de la
souche Burkholderia sp. LB400 (Fain et Haddock, 2001), qui est la bactrie
la plus performante connue ce jour, de Pseudomonas pseudoalcaligenes
KF707 (Taira et al., 1992) et de Comamonas testosteroni B-356 (Ahmad et al.,
1990).

4.1 PURIFICATION ET MCANISMES RACTIONNELS


DE LA DIOXYGNASE DU BIPHNYLE
Les oxygnases sont des enzymes qui incorporent un ou deux atomes
doxygne un substrat organique partir doxygne molculaire. Ces
enzymes dimportance primordiale dans le mtabolisme des composs
organiques ont t reconnues tardivement au cours de lhistoire de la bio-
chimie. Tandis quon connat les enzymes hydrolytiques depuis plus de
150 ans, la dcouverte des oxygnases remonte moins de 50 ans. Limpor-
tance capitale de loxygne dans les systmes biologique a t reconnue
ds le XVIIIe sicle. Au dbut du XXe sicle, les tudes faisant appel aux
La dpollution des POP 121

mthodes de mesure manomtriques menes par Haldane, Bancroft et


Warburg ont montr une association entre la consommation doxygne et
lactivation des voies mtaboliques. Cependant, les scientifiques croyaient
fermement que loxygne atmosphrique ne pouvait pas tre incorpor
directement dans la matire organique. On croyait plutt que loxygne
prsent dans la matire organique provenait de ractions impliquant un
transfert datome doxygne entre molcules organiques. Ce nest quau
cours des annes 1950 avec les tudes de Hayaishi et al. (1955) et de Mason
et al. (1955) quil a t tabli que les ractions doxygnation catalytique
de la matire organique sont possibles. Par spectromtrie de masse utili-
sant lisotope 18 de loxygne, Hayaishi et al. (1955) ont dmontr lincor-
poration directe du 18O2 sur le noyau benznique. Depuis lors, on a dcrit
un trs grand nombre de dioxygnases bactriennes prsentant des
structures et mcanismes daction varis.
La dioxygnase du biphnyle est lune des nombreuses dioxygnases
bactriennes de grande importance. Cette enzyme est particulirement
sensible aux conditions environnementales et extrmement difficile
purifier par les techniques chromatographiques traditionnelles (Imbeault
et al., 2000). Pour cette raison, nous avons purifi lenzyme par chromato-
graphie daffinit de protines recombinantes portant une tiquette histi-
dine (Hurtubise et al., 1995 ; Hurtubise et al., 1996). Cette technique qui
fait appel la biologie molculaire permet la purification des protines en
une seule tape chromatographique, rduisant ainsi les risques dinactiver
les protines sensibles.
Cette tude a permis dlucider les mcanismes de fonctionnement
de cette enzyme qui comporte trois composants enzymatiques distincts
(figure 3.2) : une rductase encode par le gne bphG chez la souche B-
356, une ferrdoxine encode par le gne bphF et une oxygnase encode
par les gnes bphA et bphE. La rductase et la ferrdoxine sont deux
enzymes qui servent transfrer des lectrons du cofacteur NADH vers
loxygnase qui est le composant interagissant directement avec le substrat
pour y introduire deux atomes doxygne. La rductase est une flavopro-
tine caractrise par son spectre dabsorption typique du FAD, com-
portant des pics maximum 375 nm et 450 nm (Broadus et Haddock,
1998 ; Hurtubise et al., 1995). La structure tridimensionnelle de la rductase
de Pseudomonas sp. KKS102 a t rsolue (Senda et al., 2000). Le pourcen-
tage dhomologie entre les composants rductase des dioxygnases du
biphnyle qui ont t squencs varie considrablement et beaucoup plus
que pour les autres composants des dioxygnases du biphnyle (Sylvestre
et al., 1996b). En dpit de cette variation, la squence des acides amins
qui constituent le site de liaison avec le noyau nicotinamide est haute-
ment conserve (Senda et al., 2000). Il est donc problable que le mcanisme
de transfert dlectrons impliquant ces rductases est le mme pour toutes
Figure 3.2 122
Voie catabolique oxydative du biphnyle et des chlorobiphnyles

cotoxicologie molculaire
La dpollution des POP 123

les dioxygnases. Namoins, ceci explique pourquoi il est possible de rem-


placer lactivit rductase requise pour faire fonctionner la dioxygnase
du biphnyle de la souche B-356 par une rductase provenant de chloro-
plastes dpinards (Hurtubise et al., 1995). Dautre part, en terme de
potentiel catalytique envers les BPC, il semble que linfluence du compo-
sant rductase sur lactivit de la dioxygnase envers les congnres les
plus persistants soit plutt minime.
Le composant ferrdoxine est une petite protine fer-soufre. La struc-
ture de la ferrdoxine de la dioxygnase du biphnyle de Burkholderia sp.
LB400 a rcemment t lucide (Colbert et al., 2000). Contrairement au
composant rductase, la ferrdoxine est trs spcifique une oxygnase
donne (Hurtubise et al., 1995 ; Barriault et Sylvestre, 1999b). Par cons-
quent, en terme dingnierie enzymatique, des modifications majeures du
composant oxygnase devront trs probablement saccompagner de modi-
fications similaires au niveau du composant ferrdoxine pour conserver
une enzyme fonctionnelle.
Bien que la ractivit de la rductase et de la ferrdoxine influence
la capacit de loxygnase dgrader certains congnres BPC (Sylvestre,
1995), comme on le verra plus loin, cest le composant oxygnase qui
dtermine la spcificit de lenzyme envers les substrats BPC.
Le composant oxygnase est constitu de deux sous-units ( et 
codes par les gnes bphA et bphE respectivement). Lenzyme est consti-
tue de trois sous-units  et de trois sous-units  qui sassocient sous
forme dhexamre (Hurtubise et al., 1996). La structure tridimensionnelle
de la dioxygnase du biphnyle nest pas encore compltement lucide,
mais lenzyme a t cristallise (Imbeault et al., 2000). En se basant sur la
structure de la dioxygnase du naphtalne (Kauppi et al., 1998), qui lui est
apparente, lenzyme adopterait la forme dun champignon. Les trois sous-
units  sassocieraient ensemble pour former la tte du champignon alors
que les trois sous-units  formeraient le pied.
Le mcanisme par lequel les lectrons sont transfrs du NADH vers
le site actif du composant oxygnase nest pas encore lucid compl-
tement, mais lhypothse la plus probable est la suivante. La ferrdoxine
et la composante oxygnase sont deux protines Fer-Soufre. Ces deux pro-
tines portent un centre Rieske constitu dune chane de 17 acides amins,
limite chaque extrmit par une paire de rsidus cystine-histidine qui
lieraient deux atomes de fer et de soufre selon le modle prsent la
figure3.3. Llectron serait donc transfr de la composante rductase vers
le centre Rieske de la ferrdoxine, puis transmise au centre Rieske de la
composante oxygnase. Nous avons dmontr que le centre Rieske de la
composante oxygnase est localis sur la chane  (Hurtubise et al., 1996)
et que cette composante ne comporte pas deux, mais trois atomes de fer,

Licence enqc-11-620680-583909-950 accorde le 18 mars 2011


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124 cotoxicologie molculaire

dont deux sont lis au centre Rieske et un troisime fer mononuclaire


serait associ au centre actif (Hurtubise et al., 1996). Cet arrangement est
le mme pour la dioxygnase du biphnyle de la souche LB400 (Haddock
et Gibson, 1995). En se basant sur la structure de la dioxygnase du naph-
talne, il semblerait que le centre Rieske dune sous-unit a serait associ
au fer mononuclaire de la sous-unit  adjacente. Llectron transfr de
la ferrdoxine vers le centre Rieske dune sous-unit  de loxygnase serait
donc ensuite transmis au fer mononuclaire de la sous-unit  adjacente
et le fer rduit servirait activer la molcule doxygne pour initier son
incorporation la molcule de biphnyle (Wolfe et al., 2001). Les mca-
nismes dactivation de la molcule doxygne et les mcanismes par lequels
lenzyme interagit avec le substrat pour permettre son oxygnation en
une position dtermine restent encore lucider.

Figure 3.3
Structure probable du centre Rieske*

* Dans cette structure, les atomes de fer et de soufre sont associs aux noyaux imidazoles
de deux molcules dhistidine et aux atomes de soufre de deux molcules de cystine.

4.2. ACTIVIT ET SPCIFICIT DE LA DIOXYGNASE DU BIPHNYLE


Des tudes comparatives de dioxygnases du biphnyle de diverses
souches bactriennes ont t ralises en vue dassocier la spcificit envers
les congnres BPC certaines caractristiques structurales de lenzyme.
Il est intressant de constater que le spectre des congnres BPC oxygns
par la dioxygnase de P. pseudoalcaligenes KF707 diffre considrablement
du spectre de la dioxygnase de Burkholderia sp. LB400, tandis que les gnes
qui codent ces deux enzymes sont homologues plus de 95 % (Erickson
et Mondello, 1993). La dioxygnase du biphnyle de LB400 catalyse faci-
lement loxygnation des congnres portant un atome de chlore en
La dpollution des POP 125

position ortho sur chacun des deux noyaux du biphnyle (le 2,2'-
dichlorobiphnyle), mais la raction envers le 4,4'-dichlorobiphnyle
(atomes de chlore en position para) est mdiocre (Erickson et Mondello,
1993 ; Gibson et al., 1993) (figure 3.4). Par contre, la dioxygnase de la
souche KF707 catalyse efficacement loxygnation du 4,4'-dichlorobi-
phnyle, mais elle est inactive envers le 2,2'-dichlorobiphnyle (Erickson
et Mondello, 1993 ; Gibson et al., 1993). Une singularit de la dioxygnase
de la souche LB400 est sa capacit doxygner le 2,2',5,5'-ttrachloro-
biphnyle, attribuable sa capacit de catalyser une oxygnation de ce
congnre sur les positions meta-para (Bedard et al., 1986 ; Haddock et al.,
1995) (figure 3.4). La souche LB400 est la seule souche connue capable de
catalyser cette raction, ce qui lui confre la capacit de dgrader plusieurs
congnres BPC quaucune autre souche ne peut dgrader. Il sagit des
congnres dont au moins une position meta et une position ortho sont
occupes par des atomes de chlore sur chacun des deux noyaux (figure3.4).
Se basant sur la technique de mutagnse dirige, Erickson et
Mondello (1993) et Mondello et al. (1997) ainsi que Kimura et al. (1997) ont
montr dans des tudes indpendantes que certains rsidus dacide amin
de la partie en C-terminale de la chane  avaient une grande influence
sur la spcificit de la dioxygnase envers les congnres BPC. Ainsi en
crant des mutants obtenus en changeant certains acides amins de la
chane  de lune des souches par lacide amin qui est retrouv sur la
chane  de lautre souche dans la position correspondante, ces auteurs
ont cr des hybrides qui avaient acquis la possibilit doxygner le 2,2'-
dichlorobiphnyle, le 4,4'-dichlorobiphnyle et le 2,2',5,5'-ttrachloro-
biphnyle. Tel que le prsente la figure 3.5, quatre rgions en particulier
ont t cibles. Les rgions III et IV semblent les plus influentes. La rgion
III serait associe la capacit de lenzyme oxygner le 4,4'-dichloro-
biphnyle (Mondello et al., 1997 ; Kimura et al., 1997), la rgion IV serait
associe la capacit doxygner le substrat en position meta et para
(Suenaga et al., 1999).
Dans notre laboratoire, nous avons caractris la dioxygnase de la
souche B-356. Cette enzyme a volu un peu diffremment des deux
prcdentes. Lanalyse des squences des gnes bphAEFG de la souche
B-356 montre quil y a une homologie gntique de lordre de 80 % avec
les gnes bphAEFG des souches LB400 et KF707 (Sylvestre et al., 1996b).
De plus, contrairement aux dioxygnases des souches LB400 et KF707, la
dioxygnase de la souche B-356 est incapable doxygner le 2,2'-dichlo-
robiphnyle et le 4,4'-dichlorobiphnyle (Hurtubise et al., 1998). Elle est
cependant capable doxygner le 3,3'-dichlorobiphnyle plus efficacement
que les deux autres oxygnases.
126 cotoxicologie molculaire

Figure 3.4
Mode dhydroxylation et proprits catalytiques
des dioxygnases du biphnyle des souches B-356, KF707 et LB400
envers les congnres chlorobiphnyles

LB400 KF 707 B-356

2,2',5,5'-ttrachlorobiphnyl
La dpollution des POP 127

Figure 3.5
Comparaison des squences en acides amins des portions
C-terminales des chanes  des dioxygnases du biphnyle des souches
LB400, B-356 et KF707

Note : Seuls les acides amins diffrents de ceux de la BPDO de LB400 sont indiqus
pour les BPDO de B-356 et KF707. La figure montre aussi (en caractres gras) les
rgionsI, II, III, IV cibles par Mondello et al., 1997.

Des tudes ralises dans notre laboratoire ont montr que les sous-
units  et  des dioxygnases des souches LB400 et B-356 sont interchan-
geables. Lanalyse des hybrides obtenus a montr que la sous-unit 
influence la spcificit de lenzyme envers le substrat (Hurtubise et al.,
1998). Ainsi lhybride B-356LB400 se comporte comme la dioxygnase de
LB400 (tableau 3.1). Si seule la partie C-terminale de la sous-unit 
influenait la spcificit de lenzyme, cet hybride aurait du se comporter
comme la dioxygnase de la souche B-356. De plus, nous constatons que
les squences en acides amins de la rgion III de la chane  de la souche
B-356 sont identiques celles de la dioxygnase de la souche KF707, ce
128 cotoxicologie molculaire

qui devrait, selon les tudes cites plus haut, confrer la dioxygnase de
la souche B-356 la capacit oxygner le 4,4'-dichlorobiphnyle. Ces cons-
tatations nous portent conclure que lassociation entre les sous-units 
et  dterminerait la conformation de lenzyme et que probablement, selon
la structure des sous-units  et , la conformation finale aurait un effet
dterminant sur la capacit du site actif accepter certains congnres
BPC et en rejeter dautres. Selon cette hypothse, il reste possible que
dans certains arrangement  et , certains rsidus dacides amins comme
ceux des rgions III et IV pourraient influencer la spcificit de lenzyme,
mais pour dautres arrangements, ces mmes rgions nauraient pas leffet
escompt.

Tableau 3.1
Quantit de substrat consomm 5 min aprs le dbut
de la raction enzymatique

Substrat nmol de substrat consomm/0,6 nmol enzyme

B-356B-356 LB400LB400 B-356LB400 LB400B-356


ISPBHP ISPBHP ISPBHP ISPBHP
2,2'-dichlorobiphnyle <5 50 50 30
3,3'-dichlorobiphnyle 50 <5 <5 30
4,4,-dichlorobiphnyle T T T T
2,5-dichlorobiphnyle 50 60 30 < 10
2,2',5,5'-ttrachlorobiphnyle 35 40 20

Tableau tir de Hurtubise, Barriault et Sylvestre, 1998. La raction de dioxygnase a t


initie par lajout de 100 nmol de substrat.
() Pas de dgradation ; T : mtabolites produits ltat de trace.

Quoi quil en soit, en se basant sur la structure connue de la dioxy-


gnase du naphtalne (Kauppi et al., 1998 ; Parales et al., 2000b), nous
savons que la partie C-terminale de la chane  est directement implique
dans la raction avec le substrat. En se basant sur le modle de raction
prsent ci-haut, o le centre Rieske dune sous-unit  transmettrait un
lectron vers le fer mononuclaire associ au centre actif de la sous-unit
 adjacente, il est trs probable que la dimension et la forme de la poche
catalytique sera dtermine en partie par lespace entre les sous-units 
de lhexamre form par lassociation des sous-units /. Il est donc pos-
sible que les sous-units  et  influencent la conformation du site cata-
lytique de lenzyme. Quoiquil en soit, lanalyse de la structure de la
dioxygnase du naphtalne indique que le fer mononuclaire serait coor-
donn par trois acides amins de la portion C-terminale de la chane ,
indiquant que cette partie de la molcule serait directement implique
La dpollution des POP 129

dans la raction catalytique (Kauppi et al., 1998 ; Parales et al., 2000b). Il


est aussi intressant de constater que les acides amins de la rgion III de
la dioxygnase du biphnyle correspondent des acides amins de la
dioxygnase du naphtalne qui se trouvent dans la rgion du site actif
(soit dans une rgion de lespace prs des acides amins qui coordonnent
le fer mononuclaire) (Carredano et al., 2000).

5. INGNIERIE DE LA DIOXYGNASE DU BIPHNYLE


Ayant acquis un bagage de connaissances important sur le mcanisme
ractionnel de la dioxygnase du biphnyle ainsi que sur les dterminants
potentiels de la spcificit et sur certains lments structuraux de lenzyme,
nous pouvons planifier de faon plus rationnelle lingnierie dune
dioxygnase potentiel accru de dgradation des BPC. titre dexemple,
nous dcrirons nos travaux portant sur le dveloppement dune dioxy-
gnase modifie par gnie gntique pour intensifier ses capacits cataly-
tiques envers les BPC.
Idalement, les nouvelles enzymes devraient tre capables doxy-
gner un ventail important de congnres BPC et gnrer pour chaque
congnre un nombre minimal de produits. Cest dire que pour chaque
congnre lattaque de la molcule de substrat devrait se faire sur un
nombre restreint de positions. Par exemple, la dioxygnase du biphnyle
de la souche LB400 peut oxygner le 2,2'-dichlorobiphnyle selon trois
modes dattaque. Le mode principal consiste en une attaque des atomes
de carbone 2 et 3 pour gnrer le 2,3-dihydroxy-2'-chlorobiphnyle, causant
la perte dun atome de chlore en position 2. Ce mode reprsente environ
60 70 % de la raction catalytique. Dautre part, cette dioxygnase peut
aussi attaquer le 2,2'-dichlorobiphnyle sur les carbones 5 et 6 pour gnrer
le 5,6-dihydro-5,6-dihydroxy-2,2'-dichlorobiphnyle. Ce mode reprsente
environ 30 % de la raction catalytique. Enfin, une petite partie (moins de
5 %) des molcules de substrats subissent une oxygnation en position 3,4
(meta-para) plutt quortho-meta pour gnrer du 3,4-dihydro-3,4-
dihydroxy-2,2'-dichlorobiphnyle (voir la figure 3.6). On voit quen mul-
tipliant les modes dattaque de la molcule de substrat, on augmente
dautant le nombre de mtabolites dgrader. Loxygnase idale devrait
donc attaquer chaque congnre selon un mode dattaque limit. De plus,
nous avons mentionn plus haut que la dioxygnase du biphnyle de la
souche LB400 peut dioxygner le 2,2',5,5'-ttrachlorobiphnyle en posi-
tion meta-para, ce qui permet doxygner des congnres BPC dont aucune
des positions ortho-meta adjacentes sont libres de chlore. Bien que cette
raction permette la dioxygnase de LB400 de dgrader un plus grand
nombre de congnres BPC que les autres dioxygnases connues, la
raction doxygnation en position meta-para est moins souhaitable sur le
130 cotoxicologie molculaire

Figure 3.6
Modes dattaque du 2,2'-dichlorobiphnyle par la dioxygnase
du biphnyle de LB400

plan mtabolique du fait que la dioxygnase du 2,3-dihdyroxybiphnyle,


la troisime enzyme de la voie du biphnyle est incapable de catalyser
louverture du noyau catchol portant ses groupement hydroxyl en posi-
tion meta-para. Idalement, la dioxygnase du biphnyle devrait pouvoir
oxygner le plus de congnres possibles en position ortho-meta. Dans ce
cas, les congnres portant des atomes de chlore sur les positions ortho-
meta devraient subir une dshalognation concomitante la raction doxy-
gnation. Une telle raction est possible. En effet, nous avons dj
mentionn que la dioxygnase de LB400 dshalognise le 2,2'-dichloro-
biphnyle au cours de loxygnation de cette molcule. Bien que le 4,4'-
dichlorobiphnyle soit un mauvais substrat pour la dioxygnase de la
souche B-356, ce congnre peut quand mme tre mtabolis par cette
enzyme et une partie des mtabolites produits rsultent dune dshalo-
gnation de la molcule au cours de lattaque par la dioxygnase (Ahmad
et al., 1991). Plus rcemment, Suenaga et al. (2002) ont obtenu par ing-
nierie gntique une nouvelle dioxygnase du biphnyle capable de dsha-
logner le 3,3'-dichlorobiphnyle au cours de son attaque. Ces donnes
dmontrent la faisabilit de faire lingnierie dune enzyme capable doxy-
gner les congnres BPC plus forte teneur en chlore en misant sur la
modification du mode dattaque et sur le potentiel de dshalognation de
la molcule de substrat. Cest ce qui est le plus souhaitable long terme,
mais court terme, nous devons miser sur le dveloppement dune enzyme
capable de dgrader les congnres BPC les plus problmatiques, soit ceux
qui prsentent un potentiel toxique lev ou ceux qui persistent malgr
La dpollution des POP 131

leur faible teneur en chlore, comme cest le cas des congnres portant
des atomes de chlore en position ortho comme le 2,6-dichlorobiphnyle
ou le 2,2',6,6'-ttrachlorobiphnyle.
Il existe deux approches pour modifier les capacits catalytiques
dune enzyme : lapproche rationnelle et lapproche empirique.
Lapproche rationnelle se base sur la connaissance de la structure
tridimensionnelle de la protine et sur la modlisation des interactions
protine/ligand pour identifier les modifications structurales quil est
ncessaire dapporter lenzyme pour tendre son spectre dactivit envers
de nouveaux substrats. Bien que cette approche soit sans contredit dun
trs grand intrt pour comprendre les interactions intimes entre la pro-
tine et les ligands BPC (Parales et al., 2000b ; Carredano et al., 2000), son
application ncessite une connaissance approfondie de la structure tridi-
mensionnelle de lenzyme quil reste encore lucider (Imbeault et al.,
2000). On reconnat de plus que plusieurs tentatives de modification ration-
nelle des proprits des enzymes ont chou, car les effets de substitu-
tions dacides amins sur la structure ou la fonction de lenzyme sont
souvent inattendus par rapport aux prdictions des modles (Kikuchi etal.,
1999). Pour ces raisons, nous avons investi nos efforts de recherche sur
une nouvelle approche empirique qui dcoule dune application de la
technique dite de polymerase chain reaction [raction en chane la
polymrase] (PCR).

5.1. VOLUTION MOLCULAIRE IN VITRO PAR RECOMBINAISON ALATOIRE


On peut rpliquer un fragment dADN in vitro en le mettant en prsence
dune polymrase et damorces spcifiques qui sont de courts fragments
dADN homologues (oligonuclotides) situs aux extrmits du fragment
rpliquer. La temprature du milieu ractionnel est dabord augmente
94 oC pour dissocier les deux brins dADN, puis abaisse une temp-
rature qui permet aux amorces de se lier lADN et la polymrase dini-
tier la synthse de la nouvelle chane dADN. Dans la technique de la PCR,
ce cycle de temprature est rpt successivement un grand nombre de
fois pour synthtiser un trs grand nombre de copies du fragment.
Lapproche que nous avons utilise pour faire lingnierie empirique des
protines est appele volution molculaire in vitro par recombinaison
alatoire (DNA shuffling ou directed-in vitro evolution) (Stemmer, 1994).
Elle consiste mimer le processus dvolution des tres sexus lchelle
molculaire, en prenant avantage de la technique de la PCR. Selon la
thorie de lvolution par slection naturelle, lentement, au cours des
gnrations, il apparat des mutations dont certaines sont neutres, dautres
sont bnfiques, dautres sont nuisibles et dautres enfin annulent les effets
132 cotoxicologie molculaire

bnfiques ou nuisibles des prcdentes. La recombinaison gntique com-


bine la pression de slection servent liminer ou neutraliser les muta-
tions nuisibles dans les prognitures subsquentes pour ne garder que les
mutations bnfiques et augmenter ainsi le degr dadaptation du gne
ou de lindividu son environnement. La technique de lvolution mol-
culaire in vitro alatoire reproduit une chelle acclre ce que la slec-
tion naturelle ralise sur des millions dannes (Stemmer, 1994).
Cette technique consiste scinder des fragments dADN portant des
gnes homologues avec une endonuclase non spcifique ; les petits frag-
ments (entre 50 et 100 pb) qui en rsultent sont assembls par la tech-
nique de la PCR pour reconstituer le gne au complet (voir la figure 3.7).
Du fait que le mlange ractionnel comprend un ensemble de fragments
de gnes homologues (qui ont donc des portions de squences communes),
la population de gnes reconstitus est constitue de fragments hybrides
rsultant dvnements de recombinaison gntique entre les diffrents
fragments parentaux prsents dans le mlange. Cette population de nou-
veaux gnes (la progniture) est ensuite insre sur des plasmides vec-
teurs qui servent transformer des bactries. On slectionne ensuite parmi
les bactries rceptrices celles qui ont acquis le caractre phnotypique

Figure 3.7
volution molculaire par recombinaison in vitro alatoire
La dpollution des POP 133

dsir. Par exemple, nous pouvons rechercher les clones capables de


dgrader les BPC plus efficacement que les parents. Ces clones plus
performants de premire gnration peuvent tre groups pour recom-
mencer le processus de recombinaison in vitro et de slection de clones
pour plusieurs autres gnrations, de faon liminer les mutations
ngatives et optimiser la fonction de la protine. Cette approche mime
donc le processus de slection naturelle qui permet de ne retenir que les
meilleurs individus dune population, mais du fait que la recombinaison
se fait in vitro sur des milliards de molcules dADN, la vitesse dvolu-
tion de nouveaux gnes se fait un rythme considrablement plus lev
que dans le processus de lvolution par slection naturelle.

5.2. APPLICATION DE LVOLUTION MOLCULAIRE IN VITRO


PAR RECOMBINAISON ALATOIRE LINGNIERIE
DE LA DIOXYGNASE DU BIPHNYLE
La technique de recombinaison alatoire in vitro a t applique avec succs
en recombinant le gne bphA de la souche LB400 avec le gne bphA1de la
souche KF707 qui prsentent un degr dhomologie gntique lev (> 95 %)
(Taira et al., 1992 ; Erickson et Mondello, 1992). Dans ce cas, on a obtenu
des hybrides capables de dgrader la fois le 4,4'-dichlorobiphnyle et le
2,2'-dichlorobiphnyle et capables de dgrader le 2,2',5,5'-ttra-
chlorobiphnyle (Kumamaru et al., 1998 ; Brhlmann et Chen, 1999). Ces
tudes ont aussi permis de confirmer limportance dterminante sur la
spcificit de lenzyme de la portion C-terminale de la chane . Cepen-
dant, aucune nouvelle dioxygnase capable de dgrader les congnres
les plus persistants comme les congnres coplanaires reprsents par le
3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle ou les congnres comportant deux atomes
de chlore en position ortho, reprsents par le 2,6-dichlorobiphnyle et le
2,2',6,6'-ttrachlorobiphnyle, na encore t dcrit. Il est reconnu que les
congnres coplanaires miment structurellement les dioxines et les
furannes et sont les plus toxiques (Van den Berg et al., 1998 ; Romanov et
Hausinger, 1996). De plus, certaines tudes rcentes semblent indiquer
que les congnres ortho seraient susceptibles dtre des modulateurs
endocriniens (Arcaro et al., 1999) et ces congnres pourraient avoir un
effet toxique sur le dveloppement du systme nerveux (Mukerjee, 1998 ;
Seegal, 1999). Comme nous lavons soulign plus haut, les congnres ortho
sont trs rsistants aux dgradations arobies et aux dshalognations
anarobies. Ces congnres sont donc ceux qui saccumulent en plus
grande quantit dans les procds mixtes arobies/anarobies de dgra-
dation des BPC (Maltseva et al., 1999). Dans ce contexte, il est souhaitable
que tout procd de destruction des BPC ne serve pas enrichir la
biosphre en congnres non dsirables.
134 cotoxicologie molculaire

5.3. VOLUTION MOLCULAIRE DE FAMILLES DE GNES


Les congnres portant des atomes de chlore en position meta et para sont
coplanaires et les congnres portant des atomes de chlore en position
ortho prennent une conformation o les deux cycles aromatiques sont per-
pendiculaires, lun par rapport lautre. Du fait que la position et le nombre
datomes de chlore sur le noyau biphnyle influencent grandement la
structure de la molcule, il est prvoir que la dioxygnase du biphnyle
aura subir des modifications majeures pour atteindre un niveau de
relaxation suffisante pour pouvoir catalyser loxygnation de substrats
aussi diffrents. Autrement, il faudra que la dioxygnase se spcialise envers
un groupe de congnres spcifiques, et encore l, il faudra que lenzyme
subisse des modifications structurales majeures pour atteindre cet objectif.
Crameri et al. (1998) ont montr que lapplication de la technique de
lvolution molculaire in vitro alatoire une famille de gnes homo-
logues ayant un degr dhomologie restreint facilite lobtention dune pro-
gniture ayant des caractres phnotypiques voulus en un moins grand
nombre de gnrations. Ainsi, ils ont obtenu aprs une seule gnration
dvolution des cphalosporinases qui confraient une rsistance la
cphalosporine 540 fois plus leve que la meilleure des quatre cphalo-
sporinases ayant servi de parents (Crameri et al., 1998). Dans ce cas, lhomo-
logie entre les squences dacides amins des parents variait entre 82 % et
57 %. On estime que si les parents choisis au dpart avaient t trs sem-
blables, il aurait fallu 50 cycles (ou gnrations) dvolution in vitro ala-
toire pour atteindre ce rsultat (Crameri et al., 1998). Cependant, cette
approche a ses limites. En effet, le fait dexplorer un trs grand nombre de
nouvelles squences au cours du processus volutif qui inclut des gnes
dhomologie restreinte implique quun grand nombre dindividus de la
progniture seront inactifs (Voigt et al., 2001). Une consquence impor-
tante est quil faut analyser un trs grand nombre dhybrides de la prog-
niture pour faire le dpistage des individus dintrt. Une autre limite est
quau cours du procd dassemblage des gnes in vitro par PCR, les recom-
binaisons auront lieu principalement dans les rgions de haute homologie
(Ostermeier et al., 1999). Une consquence est que la frquence des hybrides
qui requirent des recombinaisons dans les rgions les moins homologues
seront trs faibles, impliquant la ncessit danalyser un trs grand nombre
dhybrides pour avoir un inventaire complet des possibilits. Dans le cas
denzymes impliques dans la rsistance un antibiotique, comme la
cphalosporinase, il est possible dliminer facilement les hybrides non
dsirables de la progniture en ajustant la concentration en antibiotique
du milieu de slection. Cependant, dans les cas o la mthode de criblage
ne permet pas dliminer les hybrides non dsirables, lapplication du
procd dvolution in vitro alatoire des gnes dhomologie restreinte
devient trs laborieuse.
La dpollution des POP 135

5.4. MTHODE DE CRIBLAGE POUR UNE DIOXYGNASE AMLIORE


Un protocole utilis dans les tudes dcrites plus haut (Kumamaru et al.,
1998 ; Brhlmann et Chen, 1999) pour le criblage de clones capables de
dgrader les BPC efficacement se base sur lutilisation dune raction
couple pour convertir le 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle en 2-hydro-
6-oxo-6-phnylhexa-2,3-dinoate (HOPDA), qui est le compos rsultant
de la fission catalytique du cycle aromatique (figure 3.2). Le HOPDA tant
un compos jaune intense, les colonies qui le produisent sont faciles
reprer. Pour appliquer ce protocole, les bactries recevant le gne bphA
mut expriment aussi les gnes bphEFGBC qui codent les enzymes nces-
saires pour effectuer cette conversion. Cependant, on sait que le produit
de bphC, la dioxygnase du 2,3-dihydroxybiphnyle, est trs spcifique et
quelle ne peut pas catalyser la fission des mtabolites portant des grou-
pements hydroxyl en position meta/para (Barriault et al., 1998). Ainsi tous
les congnres BPC, dont le 2,2',5,5', ttrachlorobiphnyle, que la
dioxygnase du biphnyle attaque en position meta/para ne peuvent pas
tre convertis en HOPDA. Ce blocage nous limite dans le choix des con-
gnres BPC retenus pour faire le criblage des dioxygnases du biphnyle
hybrides. Par contre, nous avons dmontr avec des enzymes purifies
que le produit de bphB la 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle-2,3-dshy-
drognase est une enzyme trs relaxe qui peut sattaquer un trs grand
nombre danalogues du substrat, dont les mtabolites portant des grou-
pements hydroxyl en position meta/para (Barriault et al., 1999 ; Vedadi et
al., 2000).
Cette observation nous a conduits proposer un nouveau protocole
simple pour la dtection de mutants capables doxygner un congnre
BPC plus efficacement que le parent. Le protocole se base sur le fait que
les catchols, dont le 2,3-dihydroxybiphnyle, sont instables lorsquexposs
lair ambiant et se polymrisent pour prendre une coloration bruntre
aprs quelques heures dexposition. Pour dmontrer lapplicabilit de
notre protocole, nous avons transform une souche dEscherichia coli avec
les plasmides compatibles pDB31[bphAE] et pQE51[bphFGB]. Le plasmide
pDB31[bphAE] permet dexprimer le composant oxygnase portant une
chane histitine lextrmit N-terminale de la chane  (Barriault et
Sylvestre, 1999a) sous le contrle du promoteur lac, inductible lIPTG.
Les gnes bphFGB sur le plasmide pQE51sont aussi induits par lIPTG
(Chebrou et al., 1999). Lorsque les cellules de cette souche cultives sur
une membrane de nylon place la surface dun milieu de culture solide
sont induites lIPTG puis exposes des vapeurs de biphnyle, les
colonies deviennent bruntres en moins de deux heures dexposition
(planche 1). Les colonies dune souche tmoin portant pDB31plus pQE51
[bphFGB] et incube dans les mme conditions restent incolores aprs
plusieurs heures dincubation. Nous avons fait varier plusieurs facteurs
136 cotoxicologie molculaire

pour optimiser lapplication de ce protocole. Des rsultats reproductibles


et vidents taient obtenus lorsque nous utilisions le protocole suivant.
Des cellules de E. coli portant pQE51[bphFGB] plus pDB31[bphAE] taient
inocules la surface dune membrane de nylon place sur une glose LB
(Sambrook et al., 1989) contenant les antibiotiques appropris pour main-
tenir les plasmides. La culture tait incube 18 heures 37 oC puis la mem-
brane portant les colonies dveloppes tait transfre sur une glose LB
frache contenant 0,5 mM dIPTG. Les colonies taient incubes nouveau
37 oC pendant 3 heures avant dajouter des cristaux de biphnyle dans
le couvercle de la bote de Ptri. Les cultures taient incubes pendant 1
2heures 37 oC puis examines visuellement pour vrifier la couleur des
colonies qui deviennent bruntres lorsquexposes aux vapeurs de
biphnyle.

5.5. INGNIERIE DE LA DIOXYGNASE DU BIPHNYLE DE LA SOUCHE


B-356 PAR RECOMBINAISON IN VITRO ALATOIRE
En se basant sur lobservation que les deux sous-units,  et , influen-
cent la spcificit de la dioxygnase (Hurtubise et al., 1998 ; Chebrou et al.,
1999), et en se basant sur le fait que la recombinaison alatoire in vitro
entre gnes homologues dhomologie restreinte nous permette dexplo-
rer un plus grand nombre de structures molculaires diverses, nous avons
appliqu le protocole de recombinaison alatoire in vitro pour crer des
hybrides entre les gnes bphAE des souches LB400 et B-356. Cette appro-
che a chou. Sur un total denviron 7000 hybrides tests, aucun ntait
actif. De fait, comme nous lavons mentionn plus haut, le fait dexplorer
un grand nombre de structures a pour consquence que plusieurs des nou-
velles structures cres perdent leur fonction biologique. Ces rsultats nous
ont amens proposer une approche nouvelle, qui se base sur le fait que
la partie C-terminale de la chane  a une trs grande influence sur la
spcificit de lenzyme et quelle renferme des rsidus dacides amins
importants au niveau du site actif (Barriault et al., 2002).

5.6. ANALYSE DHYBRIDES OBTENUS EN REMPLAANT


LA PARTIE C-TERMINALE DE LA CHANE  DE LA DIOXYGNASE
DE LB400 PAR CELLE DE B-356
Nous avons voulu vrifier sil est possible de remplacer des fragments de
la partie C-terminale de la dioxygnase du biphnyle de la souche LB400
par ceux de la souche B-356 et vice-versa. La premire tape a consist
reprer des sites de restriction communs dans des positions identiques
sur les gnes bphA des souches B-356 et LB400. Le site MluI se situe juste
en amont de la rgion I et immdiatement en aval du centre Rieske
La dpollution des POP 137

(figure3.8), le site ScaI se situe en plein cur de la rgion qui, par rf-
rence la structure de la dioxygnase du naphtalne (Caredano et al., 2000),
serait implique dans le maintien du fer mononuclaire. Comme il nexiste
pas de site commun lextrmit distale de ces gnes, nous les avons
modifis par mutagnse dirige, pour y introduire un site AvrII
(figure3.8). En utilisant ces trois sites, nous avons construit les 12 hybrides
indiqus la figure 3.8. Ces hybrides ont t clons dans le vecteur pDB31
ou pQE31, qui sont des vecteurs conus pour exprimer des protines de
fusion portant une tiquette histidine de faon permettre leur purifi-
cation rapide par chromatographie daffinit (Hurtubise et al., 1995 ;
Barriault et Sylvestre, 1999a). Ces hybrides ont t purifis et caractriss
pour dterminer leur spectre dactivit envers des congnres BPC slec-
tionns. Le tableau 3.2 rapporte les rsultats tirs de Barriault et al. (2002).
Chaque enzyme paraissant sur ce tableau a t purifie par chromato-
graphie daffinit de protine portant une tiquette Histidine. Lactivit
envers le biphnyle a t mesure en valuant la quantit de HOPDA pro-
duit partir du biphnyle dans une raction couple comprenant ht-BphB
et ht-BphC selon un protocole publi prcdemment (Hurtubise et al.,

Tableau 3.2
Activit de dioxygnases hybrides purifies par chromatographie daffinit
de protines recombinantes portant une tiquette Histidine

nmol de substrat consomm ou de mtabolite produit/200 mg denzymeb

Enzymea BPH 2,2'CB 3,3'CB 4,4'CB 2,2',5,5'-TCB


LB400 62,5 10,0 34,2 8 0 4,5 10 33,2 8
B-356 120,8 16 4,6 6 18,1 7,2 0 0
LACD 15,5 4,6 19,0 4 0 9,9 2,8 12,4 5,6
LB 0 ND ND ND 0
LABD 10,8 3,1 9,7 2,7 17,3 1,3 ND T
LC 0 ND ND 0 0
LAD 95 19,6 11,9 5,2 14,6 2 0 T
LBC 2,7 0,6 0 0 12,5 2,9 0
LA 101,1 5,4 0 15,2 2 0 0
LBCD 3,2 0,7 7,3 2,9 0 8,6 2,6 2,8 1,7

a ht-ISPBPH de LB400 et de B-356 sont exprims partir de gnes bphA mutants, ayant un
site AvrII aux positions 1348 et 1354 respectivement, rsultant en un changement dArg453
et dArg451 par une Ser. Les autres enzymes sont des dioxygnases hybrides correspon-
dant aux constructions apparaissant la figure 3.8.
b (ND) Non dtermin. BPH, biphnyle ; 2,2CB, 3,3CB et 4,4CB. 2,2'-, 3,3'- et 4,4'-
dichlorobiphnyle ; 2,2',5,5CB, 2,2',5,5'-ttrachlorobiphnyle.
138 cotoxicologie molculaire

Figure 3.8
Constructions dhybrides entre la dioxygnase de la souche LB400 et celle
de la souche B-356 et leur activit envers le biphnyle

bphA bphE

Note : Lactivit envers le biphnyle a t mesure en valuant la capacit de lenzyme


purifie transformer le biphnyle en HOPDA (de couleur jaune) dans une rac-
tion couple avec BphB et BphC.
La dpollution des POP 139

1996). Lactivit envers le 2,2',5,5'-ttrachlorobiphnyle a t mesure par


HPLC en valuant la production du mtabolite dihydrodiol produit selon
un protocole dj publi (Barriault et al., 1998). Ces donnes sont une
moyenne de lactivit dau moins deux prparations purifies diffrentes
la dviation standard. Elles reprsentent une quantit de mtabolite pro-
duit (pour le biphnyle et le 2,2',5,5'-ttrachlorobiphnyle) ou la quantit
de substrat consomm (pour les 2,2'-, 3,3'- et 4,4'-dichlorobiphnyles) 5min
aprs linitiation de la raction contenant 200 mg denzyme purifie).
Il est intressant de constater que les hybrides o la partie C-termi-
nale de la chane  de la souche LB400 a t remplace par la partie corres-
pondante de la dioxygnase de B-356 (hybrides LACD, LABD, LAD) sont
tous actifs tandis que les hybrides o la partie C-terminale de la chane  de
B-356 a t remplace par la partie correspondante de la dioxygnase de
LB400 (hybrides LB, LC, LBC) sont trs faiblement actifs. Des tudes de
caractrisation des dioxygnases par filtration molculaire ont montr que
les deux sous-units  et  de lhybride LC ne peuvent pas sassembler.
Nous navons pas dexplication dfinitive pour linactivit des hybrides
LB et LBC. Elle pourrait tre attribuable soit linsolubilit des protines
et leur incorporation dans des corps dinclusion, soit au fait que le centre
Rieske ne se reconstituerait pas correctement dans la cellule de E. coli.
Quoi quil en soit, il est intressant de constater que la dioxygnase de la
souche LB400 semble pouvoir tre plus flexible que la dioxygnase de
B-356 et peut exprimenter plusieurs variations de structure dans la
portion C-terminale sans que lenzyme perde sa fonction. De fait, certains
hybrides ont acquis des proprits catalytiques (dgradation du 4,4'-
dichlorobiphnyle) quaucun des deux parents ne possdait. On peut sans
doute imputer ce phnomne le fait que la dioxygnase de LB400 soit la
plus performante connue ce jour.
Ces rsultats nous ont amens suggrer de tenter damliorer les
capacits cataboliques de la dioxygnase de LB400 en modifiant par vo-
lution molculaire la partie C-terminale de la chane  de cette enzyme.
Lavantage de cette approche est quon rduit le nombre total de squences
exploratoires analyser et quon augmente dautant nos chances de trouver
des hybrides dintrt dans la progniture. Nous avons appliqu le pro-
cessus de lvolution molculaire in vitro alatoire sur la partie distale des
gnes bphA des souches LB400, B-356 et Rhodococcus globerulus P6 (Barriault
et al., 2002).
Les rsultats sont trs encourageants. En effet, dj, les hybrides issus
de la premire progniture montrent des activits catalytiques envers des
congnres comme le 2,6-dichlorobiphnyle, quaucune souche connue
ne peut dgrader. Lanalyse des squences des variants obtenus rvle
limportance de la rgion III du domaine C-terminal de la sous-unit  de
140 cotoxicologie molculaire

la dioxygnase. Tous les variants prsents la figure 3.9 ont un potentiel


de dgradation des BPC plus lev que les parents utiliss dans le procd
dvolution in vitro. Les variants les plus actifs, II-9 et III-52, ont hrit de
la presque totalit du gne bphA de LB400, sauf pour un court fragment
qui correspond la rgion III. En se basant sur la squence de la
dioxygnase du naphtalne pour laquelle la structure a t lucide, les
acides amins de la rgion III de BphA (correspondant 310CSGVFKV316
de la dioxygnase du naphtalne) seraient situs au sein de la poche cata-
lytique. Ceci expliquerait leur influence sur la reconnaissance et la ligation
du substrat par lenzyme.
Il est intressant de souligner quune analyse dalignement de
squence BLASTP a montr que la squence en acide amin caractris-
tique de la rgion III de BphA de B-356 et de P6 (GINTIRT) est trs sem-
blable la squence en acides amins de la rgion correspondante dans la
sous-unit  de la plupart des dioxygnases du biphnyle dont la squence
est connue (une quinzaine) ainsi que la squence des sous-units  des
dioxygnases du benzne, du tolune, de lisopropylbenzne et de
lthylbenzne. Considrant que la dioxygnase de LB400 est la seule por-
tant la squence TFNNIRI au niveau de la rgion III, il est curieux de cons-
tater que nos variants issus du procd dvolution molculaire qui
prsentaient les plus hauts potentiels de dgradation des BPC taient ceux
qui, au niveau de la rgion III, prsentaient la squence typique des autres
oxygnases. La dioxygnase de LB400 est la plus performante des
dioxygnases dorigine naturelle. La question reste donc savoir pour-
quoi la rgion III, qui est une rgion critique pour dterminer le potentiel
dactivit envers les BPC, a subi autant une modification au cours de lvo-
lution chez cette dioxygnase. Une rponse possible est le fait que llar-
gissement du spectre dactivit envers les congnres BPC se fait aux
dpens de la spcificit de la raction. Ainsi lenzyme peut accepter un
plus large spectre de substrats, mais larrimage du substrat au site actif
de lenzyme ne se fait pas selon une orientation optimale, conduisant
des ractions catalytiques infructueuses. Ce phnomne, quon nomme
dcouplage, conduit la perte dlectrons qui gnre du peroxyde dhydro-
gne dans le milieu ractionnel. Le peroxyde est un agent inhibiteur pour
les dioxygnases et, de ce fait, est indsirable dans le milieu ractionnel.
Pour dmontrer ce phnomne, nous avons valu lactivit du variant
II-9 envers le 2,2'-dichlorobiphnyle lorsque la raction est effectue en
prsence et en absence de catalase, une enzyme qui catalyse la dcompo-
sition du peroxyde pour former de leau et de loxygne. Lactivit tait
mesure dans une raction couple en prsence de tous les composants
de la dioxygnase du biphnyle, de la 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle
2,3-dshydrognase et de la 2,3-dihydroxy-1,2-dioxygnase. Dans ces con-
ditions, le substrat est converti en 2-hydroxy-6-oxo-6-phnyl-2,4-dinoate,
Figure 3.9
Potentiel catalytique et alignements des squences de variants de la dioxygnase
du biphnyle obtenus par recombiaison in vitro alatoire
La dpollution des POP

Lgende : gauche, potentiel catalytique de diffrentes dioxygnases du biphnyle mesur en : % de dgradation de diffrents congnres BPC
obtenu par des cellules de E. coli DH11S exprimant ces dioxygnases. (NB., les valeurs pour P6 ont t obtenues de prparations
denzyme purifie car cette dioxygnase nest pas active dans E. coli.) droite : alignements des squences de la portion distale des
sous-units  des dioxygnases parentales et variantes. Seules les positions pour lesquelles au moins un variant diffre de la squence
de BphA de LB400 sont montres. Lalignement montre aussi les squences des rgions I, II, III et IV identifies par Mondello et al.
(1997).
Sources : Barriault et al., 2002 ; Chebrou et al., 1999.
141
142 cotoxicologie molculaire

qui est un compos jaune intense mesurable 434 nm. Nous avons observ
que toutes les conditions tant identiques, lactivit mesure en prsence
de catalase tait trois fois plus importante quen labsence de catalase.
Malgr une performance exceptionnelle de ce variant, la production de
peroxyde affecte donc de faon significative son activit envers les BPC et
pourrait causer de problmes au niveau du mtabolisme des bactries qui
lexprime. Nous travaillons donc prsentement rechercher des variants
qui, tout en tant exceptionnellement performants, prsenteraient un ni-
veau de dcouplage enzymatique minimal.

6. AUTRES ENZYMES DE LA VOIE CATABOLIQUE


DU BIPHNYLE
6.1. LA 2,3-DIHYDRO-2,3-DIHYDROXYBIPHNYLE 2,3-DSHYDROGNASE
La seconde tape de la voie catabolique du biphnyle est catalyse par la
2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle 2,3-dshydrognase qui mtabo-
lise le 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle en catchol correspondant.
Lenzyme est une flavoprotine ttramrique (Sylvestre et al., 1996a ;
Hulsmeyer et al., 1998) qui est code par le gne bphB.
La 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybiphnyle 2,3-dshydrognase de la
souche LB 400 a t cristallise et sa structure lucide (Hulsmeyer et al.,
1998). Cette enzyme fait partie de la famille des dshydrognase/rductase
dalcools courtes chanes. Comme les autres membres de cette famille le
site actif comprend une triade dacides amins conservs (Ser, Tyr et Lys.).
En se basant sur la structure de BphB de LB400, il a t suggr que la
triade catalytique de lenzyme est compose des trois rsidus conservs,
Ser142, Tyr155, et Lys159 (Vedadi et al., 2000).
Chaque rsidu de la triade de BphB de B-356 a t remplac par
mutagnse dirige (Vidadi et al., 2000) et savrrent tous cruciaux pour
lactivit catalytique. De plus BphB de B-356 montra une prfrence
marque envers le NAD(+) par rapport au NADP(+) (Vedadi et al., 2000).
Cette prfrence est attribuable la prsence dune aspartate en position
36 de la molcule. Une caractristique importante de cette enzyme est sa
trs grande flexibilit lgard de sa capacit de catalyser une raction de
dshydrognation sur une grande varit de substrats. Cette enzyme est
capable de transformer un trs grand nombre de mtabolites hydroxyls
des BPC, y compris les mtabolites hydroxyls sur les positions meta-para.
Cette enzyme ne prsente donc pas de blocage majeur de la voie
catabolique des BPC.
La dpollution des POP 143

6.2. LA 2,3-DIHYDROXYBIPHNYLE 1,2-DIOXYGNASE


La troisime tape de la voie catabolique du biphnyle est catalyse par la
2,3-dihydroxybiphnyle 1,2-dioxygnase qui catalyse louverture du cycle
aromatique selon un mode extradiol (figure 3.2). Lenzyme catalyse lad-
dition de deux atomes doxygne au noyau catchol, provoquant la fission
du cycle aromatique. Elle transforme le 2,3-dihdyroxybiphnyle en
2-hydroxy-6-oxo-6-phnylhexa-2,4-dinoate (HOPDA) (Eltis et al., 1993 ;
Furukawa et Arimura, 1987). Les dioxygnases qui catalysent louverture
du cycle aromatique selon le mode extradiol comportent un centre actif
constitu dun atome de fer (FeII) non hmique (Cerdan et al., 1994 ; Han
et al., 1995).
Cette enzyme est trs sensible loxygne. Cest pourquoi, pour
obtenir une prparation active, il faut effectuer les tapes de purification
en condition anoxique (Eltis et al., 1993). La 2,3-dihydroxybiphnyl
1,2-dioxygnase de la souche Burkholderia sp. LB400 (Han et al., 1995) et
celle de Pseudomonas sp. KKS102 (Uragami et al., 2001) ont t cristallises
et leur structure a t dtermine. Lenzyme est un homo-octamre.
Chaque monomre renferment deux domaines (Han et al., 1995). Chaque
domaine comprend deux copies dun mme sous-domaine constitu de
chanes  et dune hlice  formant la squence . Cette rptition de
structure suggre que ce sous-domaine a t dupliqu deux reprises au
cours de lvolution (Han et al., 1995).
ce jour nous reconnaissons deux proprits importantes de cette
enzyme qui influencent son activit catalytique lgard des mtabolites
hydroxyls des BPC. La premire proprit est sa grande sensibilit
linhibition par le 3-chlorocatchol (Hein et al., 1998). Les mcanismes
impliqus dans cette inhibition restent encore lucider. Jusqu rcem-
ment, nous navions pas suffisamment de donnes pour vrifier si cette
inhibition tait cause par le 3-chlorocatchol lui-mme ou par son driv
mtabolique, le chloroformyl. Rcemment, Vaillancourt et al. (2002) ont
obtenu des faits montrant que le 3-chlorocatchol inhibe directement
lenzyme en oxydant le fer (FeII) du site actif le transformant en fer (FeIII).
Des tudes antrieures effectues avec C. testosteroni souche B-356
(Sondossi, Sylvestre et Ahmad, 1992), avec Pseudomonas stutzeri (Vrana
et al., 1996) ainsi quavec des populations bactriennes mixtes (Guilbeault
et al., 1994) ont contribu dmontrer limportance de linhibition du
3-chlorocatchol sur le mtabolisme des BPC. Pour comprendre limpor-
tance de cette inhibition, il faut rappeler que la voie catabolique du
biphnyle convertit les congnres BPC en chlorobenzoates correspon-
dants. Ainsi, plusieurs congnres comme le 3-chlorobiphnyle sont
dabord convertis en 3-chlorobenzoate qui peut tre transform en
3-chlorocatchol par les enzymes de la voie catabolique du benzoate, qui
144 cotoxicologie molculaire

est associe celle du biphnyle. Lefficacit de transformation du


3-chlorobenzoate en 3-chlorocatchol est trs faible (Sondossi et al., 1992).
Cependant, cause de la trs grande sensibilit de la 2,3-dihydroxybi-
phnyle 1,2-dioxygnase cette inhibition, la quantit de 3-chlorocatchol
gnre au cours du processus de dgradation du 3-chlorobiphnyle
est suffisante pour compltement inhiber lenzyme (Hein et al., 1998)
(figure3.10). Il va sans dire que la prsence, dans un mlange de BPC, de
3-chlorobiphnyle ou dautres congnres qui peuvent tre convertis en
3-chlorocatchol inhibe de faon indirecte la dgradation des autres con-
gnres du mlange. Heureusement, il est possible de rsoudre ce
problme dinhibition en sassurant que les chlorobenzoates forms au
cours de la dgradation des BPC soient dgrads rapidement. Ainsi de
multiples travaux ont dmontr que, par gnie gntique, il est possible
dajouter des bactries capables de dgrader les BPC de nouvelles voies
capables de dgrader les chlorocatchols de faon efficace. Dans tous ces
exemples, les bactries modifies obtenues taient capables de dgrader
les BPC de faon efficace sans tre affectes par linhibition cause par le
chlorocatchol (Mokross et al., 1990 ; Havel et Reineke, 1993 ; Adams et al.,
1992 ; Hrywna et al., 1999).
La seconde proprit de la 2,3-dihydroxybiphnyle 1,2-dioxygnase
qui affecte la dgradation des BPC est lincapacit de cette enzyme
catalyser louverture des dihydroxybiphnyles portant les groupements
hydroxyl en positions 3 et 4 (Eltis et al., 1993 ; Taira et al., 1988 ; Hein et al.,
1998). Une consquence importante de ce constat est que les congnres
BPC qui, comme le 2,2',5,5'-ttrachlorobiphnyle, sont oxygns en
positions 3 et 4 par la dioxygnase du biphnyle ncessiteront une voie
alternative pour se dgrader compltement. Heureusement, la 1,2-dihy-
droxynaphtalne 1,2-dioxygnase, qui catalyse une tape homologue
celle de la 2,3-dihdyroxybiphnyle 1,2-dioxygnase dans la voie
catabolique du naphtalne, est capable de catalyser louverture du cycle
aromatique du 3,4-dihydroxybiphnyle (Barriault et al., 1998). Bien que
louverture du cycle aromatique du 3,4-dihydroxybiphnyle par la
1,2-dihydroxynaphtalne dioxygnase soit peu efficace, il est possible de
modifier cette enzyme par gnie gntique pour augmenter son potentiel
dactivit envers ce nouveau substrat. En somme, malgr que ltape
catabolique catalyse par la 2,3-dihydroxybiphnyle 1,2-dioxygnase
comporte plusieurs problmes susceptibles de nuire une dgradation
efficace des BPC, les donnes de la littrature sont plutt optimistes quant
aux pronostics de rsolution de ces problmes par ingnierie gntique.
Figure 3.10
Mcanisme dinhibition de la 2,3-dihydroxybiphnyle 1,2-dioxygnase par le 3-chlorocatchol
La dpollution des POP
145
146 cotoxicologie molculaire

6.3. HYDROLASE DU HOPDA


La dernire tape de la voie catabolique du biphnyle est une raction
dhydrolyse catalyse par la HOPDA hydrolase. La HOPDA hydrolase
de Rhodococcus sp. RHA1 a t cristallise (Nandhagopal et al., 2001).
Lenzyme est un octamre comportant 422 points de symtrie
(Nandhagopal et al., 2001). Le site actif est situ au sein du domaine de
liaison avec le substrat. Ce domaine comporte des rgions hydrophobes
et hydrophiles (Nandhagopal et al., 2001).
Des travaux rcents rapportent la caractrisation biochimique de la
HOPDA hydrolase de Burkholderia sp. LB400. De faon gnrale, les
chloroHOPDA portant des atomes de chlore sur le noyau phnyl sont de
bons substrats pour cette enzyme (Seah et al., 2000). Cependant, les 3- et
4-chloroHOPDA sont de mauvais substrats et des inhibiteurs comptitifs
pour lenzyme (Seah et al., 2001). Une consquence importante de ce constat
est que plusieurs congnres BPC portant des atomes de chlore sur chaque
noyau du cycle biphnyle seront convertis en chloroHOPDA qui ne
pourront pas tre dgrads davantage. Cest le cas par exemple du 4,4'-
dichlorobiphnyle. Dautre part, une comparaison du potentiel catalytique
de la HOPDA hydrolase de la souche LB400 avec celui de la HOPDA
hydrolase de R. globerulus P6 montre que contrairement lenzyme de
LB400, celle de P6 est plus spcifique envers le 9- et le 10-chloroHOPDA.
De plus la HOPDA hydrolase de P6 est plus fortement inhibe par le
4-chloroHOPDA que par le 3-chloroHOPDA tandis quau contraire,
la HOPDA hydrolase de LB400 est plus fortement inhibe par le
3-chloroHOPDA que par le 4-chloroHOPDA (Seah et al., 2001). Ce constat
permet desprer que par gnie gntique, il sera possible de reprer les
domaines de lenzyme dterminant la liaison avec les chloroHOPDA et
de moduler ces domaines pour augmenter lefficacit de la conversion
des substrats chlors et rduire leur effet inhibiteur.

7. APPLICATION DES ORGANISMES


MODIFIS GNTIQUEMENT DANS DES PROCDS
DE DCONTAMINATION
7.1. EXPRESSION ET FONCTIONNALIT DES ENZYMES MODIFIES
Bien que lingnierie denzymes soit essentielle pour dvelopper des bac-
tries capables de dgrader les POP, dautres manipulations sont aussi
ncessaires. En effet, que ce soit une dioxygnase plus performante ou
nimporte quelle des autres enzymes de la voie de dgradation, il faudra
que ces nouvelles enzymes soient rassembles dans une souche bactrienne
o elles seront fonctionnelles. Limplantation de bactries dveloppes
La dpollution des POP 147

en laboratoire sur des sites contamins, particulirement des bactries


modifies gntiquement, ncessite un certain nombre de prmisses. En
premier lieu, il est ncessaire de sassurer que les bactries implantes
puissent tre viables, quelles puissent exprimer les gnes dintrt et
quelles survivent dans leur nouveau milieu, pendant au moins le temps
ncessaire au traitement.
Lexpression des enzymes dans le milieu environnant est critique
au succs dun biotraitement. Si les enzymes ne sont pas exprimes ou si
elles sont exprimes incorrectement dans les bactries qui les expriment,
le traitement chouera. Le choix des bactries pour le traitement est donc
trs important. Pour linstant, cest la bactrie E. coli qui est la plus utile
pour faire des manipulations gntiques cause du grand nombre doutils
molculaires qui ont t dvelopps et adapts cette bactrie. Cepen-
dant, cette bactrie est mal adapte pour vivre dans un cosystme
environnemental comme leau ou le sol. De plus, nous avons des preuves
que pour des raisons encore inexpliques, le centre Rieske de certaines
dioxygnases recombinantes nest pas reconstitut correctement chez E.
coli tandis quil lest chez Pseudomonas putida (Chebrou et al., 1999). Ce
sont les bactries arobies strictes comme les bactries des genres
Pseudomonas, Aerobacter, Comamonas, Alcaligenes et quelques autres qui sont
le mieux adaptes aux procds de biotraitement (Liu et Suflita, 1993) et
qui peuvent le mieux exprimer les protines recombinantes. Ces bactries
possdent dj plusieurs voies cataboliques pour la dgradation des com-
poss xnobiotiques. De plus, ces bactries produisent des agents
tensioactifs qui augmentent la biodisponibilit des composs lipophiles
(Banat, 2000). Enfin ces bactries peuvent survivre trs longtemps dans
un environnement non favorable (Guerin et Boyd, 1995 ; van Veen, 1997 ;
Molina et al., 2000). Cependant, les outils molculaires pour le gnie gn-
tique (plasmides vecteurs, plasmides dexpression, systmes de rgula-
tion de gnes, etc.) sont moins dvelopps chez ce groupe bactrien. Des
travaux sont en cours dans plusieurs laboratoires pour dvelopper des
outils facilitant lexpression de protines recombinantes chez ces bactries
(Blatny et al., 1997a, 1997b ; Schweizer, 1995).
Dautre part, lexpression des gnes tant sous le contrle de sys-
tmes de rgulation, nous savons que la voie catabolique des BPC nest
pas induite par les BPC. Le biphnyle est ncessaire dans le milieu ambiant
pour que les enzymes de la voie soient exprimes (Barriault et Sylvestre,
1993). Prsentement, chez E. coli, plusieurs promoteurs sont utiliss pour
contrler artificiellement lexpression des gnes clons. Deux promoteurs
frquemment utiliss sont le promoteur lac induit lisopropyl--D-
thiogalactopyranoside (IPTG) et le promoteur T7 induit par la chaleur.
Cependant ces promoteurs, autant que celui de la voie du biphnyle, ne
148 cotoxicologie molculaire

sont pas applicables dans des procds de biotraitements, pour des consi-
drations financires ou pratiques. En effet, lIPTG est un compos labile
et trs coteux, et il ne serait certes pas souhaitable de rpandre du
biphnyle dans lenvironnement pour induire la voie de dgradation des
BPC.
Il existe cependant des alternatives. Dune part, le systme de rgu-
lation des enzymes de lopron xyl responsable de la transformation du
xylne en benzoate a t lucid (Kaldalu et al., 2000 ; Garmendia et
deLorenzo, 2000 ; Duetz et al., 1996 ; Kessler et al., 1994) et appliqu la
construction de nombreux systmes dexpression (Blatny et al., 1997a ;
Blatny et al., 1997b ; Panke et al., 1998 ; deLorenzo et al., 1993). Leffecteur
de la protine rgulatrice XylS qui se lie au promoteur Pm pour induire
lopron xyl est le benzoate ou le mthylbenzoate qui sont des composs
facilement dgradables et peu toxiques. Ce systme de rgulation serait
un candidat possible pour contrler lexpression des enzymes modifies,
impliques dans la dgradation des BPC. Dautres alternatives sont aussi
envisages. Entre autres, il a t dmontr que par manipulation gn-
tique, il est possible de changer la spcificit des protines rgulatrices
envers leur effecteur (Skarfstad et al., 2000 ; Wise et Kuske, 2000 ; deLorenzo
et Prez-Martin, 1996). Ainsi, il serait possible de changer la spcificit de
XylS pour quelle soit active par une molcule naturelle, comme par
exemple une flavonode, qui est un mtabolite de plante, plutt que par
le benzoate. Un tel systme dexpression serait moins dommageable pour
lenvironnement et plus conomique, puisque leffecteur servant induire
la voie de dgradation de polluants, comme les BPC pourrait tre produit
in situ partir de plantes semes sur le site contamin.

7.2. SURVIE DES ORGANISMES MODIFIS GNTIQUEMENT


Prsentement, lutilisation dorganismes modifis gntiquement fait
lobjet dune lgislation trs svre au Canada. La loi exige quavant duti-
liser un organisme modifi gntiquement dans un procd ouvert sur
lenvironnement, comme dans le cas dun systme de traitement de sol
ou deau in situ, il est ncessaire de faire la dmonstration que cet orga-
nisme ne se rpandra pas dans lenvironnement, quil ne causera pas de
dommage lcosystme dans lequel il a t implant, et enfin quil
naffectera pas la biodiversit des espces qui se trouvent dans cet cosys-
tme. Lapplication dorganismes modifis gntiquement pour les bio-
traitements in situ semble trs contingente, notamment en ce qui a trait
aux possibilits de transfert gntique horizontal (Nielsen et al., 2000) des
gnes modifis, transfert des organismes peu apparents la bactrie
implante. Bien que nous ayons maintenant en main plusieurs outils nous
permettant de suivre le transfert des gnes modifis entre les diffrents
La dpollution des POP 149

organismes prsents dans la nature, les tudes en ce sens ne font que


dbuter (Ripp et al., 2000 ; Layton et al., 1998 ; Thiem et al., 1994 ; Sarand et
al., 2001 ; Poelarends et al., 2000 ; Peters et al., 2000 ; Theron et Cloete, 2000 ;
Molina et al., 2000). Pour cette raison, dans un avenir prvisible, il est peu
probable que des organismes modifis servent des procds de biotrai-
tement in situ. Par contre ces bactries peuvent servir dans des procds
de traitement en bioracteurs clos. Ces procds sont plus onreux que
les procds in situ, mais ils restent moins coteux que les procds chi-
miques et plus intressants sur le plan environnemental que le simple
lavage des sites par des solvants organiques ou le transport vers des sites
dentreposage (Doucet, 1999 ; Glass, 1999 ; Glass, 1993). Par exemple, on
estime que lincinration cote en moyenne 1000 $ US/m3, les procds
de solidification/stabilisation cotent environ 150 $ US/m3, les lavages
de sols cotent entre 50 et 95 $ US/m3 et ces procds conduisent une
dgradation souvent irrversible du sol, alors que la biorhabilitation cote
entre 10 et 50 $ US/m3 (Doucet, 1999 ; Environmental Science Group of
the PIAS, <www.sway.com>).
Il est possible daugmenter le niveau de scurit des bactries modi-
fies gntiquement dans des bioracteurs. En effet, des travaux rcents
ont montr la faisabilit de lusage de gnes suicides pour tuer les bac-
tries implantes dans un nouvel environnement (Jensen et al., 1993 ;
Molina et al., 1998). Les protines de la famille HG sont de petites pro-
tines (environ 50 acides amins) ; cette famille comprend entre autres les
protines Gef et Hok quon retrouve chez toutes les bactries (Gerdes, et
al., 1990 ; Poulsen et al., 1991). Ces protines toxiques comportent une por-
tion N-terminale hydrophobe qui traverse la membrane cytoplasmique.
Lorsquelles sont surexprimes, ces protines tuent les cellules en fragili-
sant leur membrane. La fonction exacte de ces protines est inconnue, mais
il est suggr quelles fassent partie dun systme complexe de program-
mation de la mort des cellules. Ce qui est intressant, cest quen assujet-
tissant le gne gef un systme de rgulation spcifique, il est possible de
contrler son expression et la mort des cellules implantes dans un sol
(Molina et al., 1998) ou en bioracteur.
Avec lavnement de la gnomique et surtout de la protomique, un
grand nombre de nouveaux gnes et de nouvelles fonctions biologiques
seront dvoils dans les prochaines annes. Parmi ceux-ci, on trouvera
certainement de nouveaux outils pour amliorer les systmes de confi-
nement biologique des bactries modifies gntiquement. Cependant,
entre temps, il est vident quon doit respecter svrement les rglements
adopts dans la plupart des pays industriels au sujet de lusage des orga-
nismes modifis gntiquement dans lenvironnement. En effet, les risques
associs leur usage restent dterminer prcisment. Le principal risque
150 cotoxicologie molculaire

reste que la dissmination dans lenvironnement de la bactrie supplante


les autres espces et cause ainsi des dommages la biodiversit. Lautre
risque important est la dissmination du nouveau gne introduit dans
lenvironnement et son effet sur les populations. Cest ce niveau que la
gnomique, la protomique et les mthodes utilisant des micropuces pour
le criblage ou la dtection de gnes ainsi que pour valuer leur dissmi-
nation dans lenvironnement seront dune grande utilit. On connat encore
trs mal les mcanismes de transfert horizontal des gnes et la consquence
de ces transferts chez les espces. Ainsi un nouveau gne bactrien res-
ponsable de la dgradation dun polluant comme les BPC pourrait sil
tait transfr chez une plante, causer la production de mtabolites qui
auraient des effets nfastes sur la viabilit de cette plante. Dans quelques
annes, nous devrions avoir une image beaucoup plus prcise des mca-
nismes de transfert de gnes et des risques rels qui y sont associs. Une
connaissance de ces mcanismes nous permettra alors dlaborer des stra-
tgies visant prvenir le transfert des gnes nouveaux implants dans
une niche cologique. Cependant, dici l, la prudence devrait tre le mot
dordre. Cest exactement lattitude des instances gouvernementales
actuelles.

8. CONCLUSION
Il est clair que le dveloppement de procds biologiques efficaces pour
la dpollution de POP ncessitera le dveloppement dorganismes
modifis gntiquement. ce jour, plusieurs laboratoires ont fait des
efforts pour mieux comprendre comment voluent les voies cataboliques
microbiennes, principales responsables du recyclage de la matire orga-
nique. Ces tudes sont rendues possibles grce lapport des nouveaux
outils molculaires que nous fournit la biologie molculaire. On pense
entre autres aux techniques disolement et de clonage de gnes aussi bien
quaux techniques permettant lexpression des protines clones en trs
grande quantit. On pense galement aux techniques permettant de
gnrer des mutations cibles au sein des gnes pour crer de nouvelles
protines dont on connat la nature exacte des modifications structurales
apportes.
Dans ce chapitre, nous avons dcrit lexemple de ltude dune
enzyme dimportance capitale dans le recyclage de la matire organique
et en particulier pour la dgradation des composs polluants persistants
comme les BPC et le HAP. Il sagit de la dioxygnase, qui effectue la pre-
mire raction dactivation de la molcule pour augmenter sa ractivit et
faciliter sa dgradation biologique. Lapplication doutils molculaires
nous a permis didentifier certains dterminants de la spcificit de cette
La dpollution des POP 151

enzyme envers les congnres BPC et dlaborer des stratgies pour aug-
menter son potentiel catabolique envers les BPC. Cette approche peut aussi
tre applique pour lingnierie des autres enzymes ncessaires la dgra-
dation des BPC dont nous avons dcrit certaines caractristiques princi-
pales. La voie est maintenant ouverte pour le dveloppement de procds
biologiques efficaces pour la dgradation des POP. Namoins, lapplica-
tion de cette technologie des procds environnementaux ncessitera
encore plusieurs annes defforts de recherche, dune part pour optimaliser
le processus et, dautre part, pour assurer lutilisation scuritaire des
bactries modifies gntiquement.
152 cotoxicologie molculaire

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CHAPITRE

4
DFAILLANCE DE LA SYNTHSE DES
HORMONES CORTICOSTRODES
Exposition de poissons et amphibiens
aux mtaux et aux pesticides

ALICE HONTELA*
Centre de recherche en toxicologie
de lenvironnement (TOXEN),
Universit du Qubec Montral

J. JOHN DORVAL*
Centre de recherche en toxicologie
de lenvironnement (TOXEN),
Universit du Qubec Montral

* Nous tenons remercier tous les tudiants dont les tra-


vaux ont t discuts dans ce chapitre, Alexandra
Lacroix, Amlie Gravel, Martin Lacroix, Benot Goulet,
Marjolaine Bisson, Haude Levesque, Jean-Sbastien
Laflamme, ainsi que nos collgues avec qui nous avons
collabor, Drs P.G.C. Campbell, J.B. Rasmussen et
T.W.Moon, et M. Vincent Leblond, lagent de recher-
che dans notre laboratoire. Nos travaux ont t finan-
cs par le programme FODAR, le CRSNG, le RCCT, le
MITE-RN et Sant Canada, ainsi que le Centre TOXEN
et lUQAM.
162 cotoxicologie molculaire

RSUM
Les effets toxiques induits par lexposition chronique aux polluants environnementaux
impliquent des drglements physiologiques qui vont affecter les fonctions essentielles
de lorganisme, parmi lesquelles les fonctions endocriniennes et immunitaires. Les per-
turbations induites par la prsence de polluants dans le milieu environnant vont affecter
le rle que joue le systme endocrinien dans le maintien de lhomostasie et de lintgrit
physiologique. Ces effets vont se rpercuter sur la croissance, le mtabolisme et sur la
reproduction, mettant ainsi en danger la survie de la population.
Parmi les polluants environnementaux, les modulateurs endocriniens tels que les
pesticides et les mtaux sont aujourdhui largement tudis. Capables de mimer ou daltrer
la synthse et le mtabolisme hormonal, ces toxiques affectent la rponse normale de lorga-
nisme un stress en affectant le rle que joue le systme endocrinien dans la coordination
des processus physiologiques et dans le maintien de lhomostasie. Aprs avoir pntr
dans lorganisme, ces polluants pourront interfrer avec les processus hormonaux en agis-
sant plusieurs niveaux dorganisation anatomique et fonctionnelle, tel laxe hypotha-
lamus-hypophyse-interrnale.
Dans ce chapitre sont prsents diffrents travaux dexpositions chroniques in situ
ou dexpositions in vitro et in vivo aux mtaux et aux pesticides chez les poissons et les
amphibiens, ainsi que les notions essentielles la comprhension des mcanismes en jeu
dans la dfaillance du statut hormonal. Lutilisation, ainsi que les avantages et les limita-
tions des biomarqueurs endocriniens sont galement dcrits. La grande sensibilit des
paramtres hormonaux constitue en effet un avantage important dans leur utilisation
comme biomarqueurs, mme si lutilisation de tels biomarqueurs ne peut se faire que par
une approche multicritres qui combine la mesure de paramtres variables avec des
paramtres dj tablis comme des biomarqueurs dexposition.
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 163

1. INTRODUCTION
1.1. PROBLMATIQUE DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS
Des travaux rcents publis dans les principales revues scientifiques aussi
bien que dans la littrature grand public ont attir notre attention sur
un phnomne nouveau, celui des perturbateurs endocriniens. Substances
dorigine anthropognique quon retrouve dans lenvironnement de faon
ubiquiste, les perturbateurs endocriniens, aussi appels modulateurs endo-
criniens, ont la capacit de perturber et daltrer de faon anormale la fonc-
tion endocrinienne des organismes vivants. La libration de tels composs
dans lenvironnement ne va pas sans poser de problme, car les normes
tablies et suivies actuellement ne tiennent pas compte des effets prcoces
de ces substances qui ont le potentiel dinterfrer avec les processus
homostatiques et le dveloppement, sans immdiatement diminuer la
capacit de survie. La problmatique des perturbateurs endocriniens a de
ce fait cr une controverse, aussi bien dans la communaut scientifique
que dans lindustrie et les organismes lgislatifs (OCDE, EDSTAC) qui
doivent se prononcer sur cette question difficile et potentiellement
coteuse, savoir sil y a lieu de modifier les normes.
Parmi les polluants environnementaux, les modulateurs endocriniens
tels que les pesticides (Colborn, 1995) et les mtaux lourds (Hontela et
Lacroix, 2004) sont aujourdhui largement tudis. Bien que les proprits
physicochimiques de ces nombreux composs capables daffecter le sys-
tme endocrinien soient bien dcrites dans la littrature, autant chez les
mammifres que chez les poissons, trs peu dtudes ce jour ont permis
de mettre en vidence les mcanismes daction de ces derniers au niveau
cellulaire. La fonction du systme endocrinien peut tre perturbe soit
par des effets directs sur les cellules endocrines localises dans lhypotha-
lamus, lhypophyse ou au niveau de lorgane endocrinien lui-mme, soit
par des effets secondaires induits via des rponses du systme endocri-
nien un tat physiologique pathologique caus par lexposition divers
polluants (Harvey, 1996). Le systme endocrinien se caractrise par : 1)une
extrme sensibilit des stimulus externes tels que les variations de la
temprature, de la photopriode, la prsence dindividus de la mme
espce (mles, femelles, juvniles), de prdateurs ou de proies, ou des sti-
mulus internes tels que les variations des concentrations ioniques
intracellulaires, du glucose et dautres substances qui gnrent de lATP,
ou des variations du pH ; 2) une activation ou une inhibition des compo-
santes du systme endocrinien de faibles concentrations en hormones
(phnomne de cascade enzymatique/signaltique dans laquelle une
hormone qui se lie son rcepteur active une chane dvnements cellu-
laires qui se magnifient chaque tape ou, loppos, qui induit le pro-
cessus de rtroinhibition) ; et 3) des interactions complexes au niveau
164 cotoxicologie molculaire

anatomique et fonctionnel via des synergies ou des antagonismes entre


les diffrentes composantes du systme endocrinien. Ces diffrentes carac-
tristiques sont essentielles et doivent tre prises en compte dans lutili-
sation des rponses du systme endocrinien comme biomarqueurs
dexposition ou deffets et lutilisation des rponses hormonales dans
lvaluation de la sant des organismes exposs des polluants dans
lenvironnement (Cooper et Kavlock, 2001 ; Van Der Kraak et al., 2001).

1.2. CIBLES ENDOCRINES DES POLLUANTS ENVIRONNEMENTAUX


ET AXE HYPOTHALAMO-HYPOPHYSO-ADRNAL
Les polluants, une fois quils ont pntr dans lorganisme, peuvent inter-
frer avec les processus hormonaux en agissant plusieurs niveaux dorga-
nisation anatomique et fonctionnelle, comme lillustre la figure 4.1. Le
systme nerveux et lhypothalamus, le centre responsable de la scrtion
des neurohormones telles que la corticostimuline (CRH), sont des cibles
potentielles des xnobiotiques. Linterfrence avec la rponse normale aux
stimulus externes et internes pourra modifier, dune faon suboptimale,
la synthse des neurotransmetteurs et des neurohormones. La glande
hypophyse, glande matresse , qui scrte plusieurs hormones telles que
les gonadotropines (FSH et LH), la prolactine, lhormone de croissance, la
thyrotropine (TSH) et la mlanostimuline (MSH) ainsi que lhormone
adrnocorticotropique (ACTH), est une autre cible des polluants. Les con-
centrations en hormones dans le milieu extracellulaire sont maintenues
dune faon trs prcise pour assurer le maintien de lhomostasie et la
stabilit du milieu intrieur de lorganisme dans un environnement externe
variable. Or, les polluants, en interfrant avec la glande hypophyse et les
processus de synthse des hormones hypophysaires, auront un effet
dltre sur les concentrations de ces mmes hormones dans la circula-
tion sanguine. Lactivit des organes dpendant des hormones tropiques
tels que lovaire et le testicule (sensibles la FSH et la LH), la thyrode
(sensible la TSH), ou la mdullo-surrnale chez les mammifres ou les
organes homologues (sensibles lACTH) chez les autres vertbrs, sera
videmment perturbe si les concentrations en hormones deviennent trop
faibles ou trop leves, perturbations induites par une anomalie au niveau
de lhypophyse. De plus, les xnobiotiques peuvent aussi interfrer direc-
tement au niveau des organes cibles, les rendant ainsi insensibles aux hor-
mones ou incapables dactiver une rponse normale. Ces effets au niveau
des organes cibles hormono-dpendants peuvent se manifester par des
anomalies de la synthse de plusieurs hormones telles que les strodes
sexuels (testostrone ou strognes) par lovaire ou le testicule, les hor-
mones thyrodiennes (thyroxine, T4 et triiodothyronine, T3) par la glande
thyrode ou les hormones corticostrodes (cortisol, corticostrone) par la
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 165

mdullo-surrnale (chez les mammifres) ou le tissu adrnocortical (chez


les autres vertbrs). Finalement, des anomalies au niveau des organes
impliqus dans le mtabolisme des hormones, notamment le foie et le rein,
peuvent aussi influencer les concentrations sanguines et la pharmaco-
cintique, en modifiant la demi-vie des hormones ou la disponibilit des
protines de transport (Brouwer et van den Berg, 1986).

Figure 4.1
Niveaux dorganisation anatomique et fonctionnelle de laxe HHI

Les interactions au niveau du systme endocrinien sont complexes


et les xnobiotiques environnementaux ne sont pas ncessairement spci-
fiques un systme particulier. De nombreux xnobiotiques peuvent exer-
cer leurs effets simultanment sur plusieurs organes cibles, endocriniens
ou autres. Pour caractriser limpact des polluants sur la sant des orga-
nismes exposs dans lenvironnement et lucider les mcanismes daction
cellulaire ou molculaire, il est important dutiliser des approches expri-
mentales complmentaires, in vivo et in vitro, en laboratoire sous condi-
tions contrles et sur le terrain, et dlaborer des hypothses cibles et
166 cotoxicologie molculaire

vrifiables. Le chapitre qui suit prsentera les approches utilises pour


valuer les effets des mtaux et des pesticides sur un systme endocri-
nien spcifique, laxe hypothalamo-hypophyso-adrnal de poissons et
amphibiens, systme qui scrte les hormones corticostrodes. Le terme
adrnal ou adrnocortical sera utilis dans ce chapitre, qui se veut
comparatif entre plusieurs groupes de vertbrs, pour dsigner lorgane
homologue de la mdullo-surrnale des mammifres. Les termes utiliss
dans la littrature classique, soit interrnale pour les poissons tlostens et
surrnale pour les amphibiens, ont t rviss rcemment (Norris, 2002) et
le terme adrnocortical est propos pour faciliter lapproche comparative.

2. ENDOCRINOLOGIE COMPARE
DU TISSU ADRNOCORTICAL
ET HORMONES CORTICOSTRODES
2.1. ANATOMIE COMPARE : POISSONS TLOSTENS,
AMPHIBIENS ET MAMMIFRES
Les hormones corticostrodes, le cortisol chez les poissons tlostens et
la corticostrone chez les amphibiens, sont synthtises partir du choles-
trol dans les cellules strodogniques situes dans le tissu adrnocortical
(interrnal), lhomologue de la mdullo-surrnale des mammifres. Chez
les mammifres, vertbrs suprieurs du point de vue volutif, les cel-
lules sont organises dans le cortex en trois couches : la zona glomerulosa
(couche externe), qui scrte laldostrone, la zona fasciculata, qui scrte
surtout les glucocorticostrodes (cortisol ou corticostrone selon lespce),
et la zona reticularis, couche la plus interne du cortex, qui scrte les andro-
gnes ainsi que les glucocorticostrodes. La mdulla des mammifres,
situe lintrieur de la glande, scrte les catcholamines, ladrnaline et
la noradrnaline (Bentley, 1998). Lorganisation anatomique est bien dif-
frente chez les vertbrs infrieurs. Chez les poissons tlostens tels que
la truite, la perchaude ou le brochet, les cellules strodogniques qui
scrtent les corticostrodes sont disperses dans la partie antrieure du
rein, aussi appel le pronphros ou le rein cphalique (head kidney). Les
lots de ces cellules sont localiss surtout proximit des sinus de la veine
cardinale qui draine le pronphros. Les cellules chromaffines, homologues
des cellules de la mdulla des mammifres, sont aussi prsentes dans ces
lots. La matrice du rein cphalique est constitue des cellules lymphodes,
trs nombreuses et plus petites que les cellules strodogniques ou les
cellules chromaffines (figure 4.2). Lorganisation du tissu interrnal des
amphibiens varie selon lespce. La grenouille africaine Xenopus laevis,
souvent utilise dans les tests toxicologiques (p. ex., le test FETAX), pr-
sente un arrangement trs similaire au poisson, avec quelques diffrences
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 167

(Goulet et Hontela, 2003). Les lots des cellules strodogniques sont dis-
perss travers lorgane, cette fois-ci dans le rein entier et non pas seule-
ment dans le rein antrieur comme chez le poisson, avec une concentration
des lots sur la partie ventrale du rein. Dautres espces telles que le
ouaouaron (Rana catesbeiana), une espce indigne du Qubec, prsentent
un tissu adrnal distinct, soit une bande mince constitue des cellules
strodogniques, longeant le ct ventral du rein (Goulet et Hontela, 2003).
Ces diffrences anatomiques doivent tre considres avant de com-
mencer tous travaux en toxicologie endocrinienne sur diffrentes espces
de la faune aquatique, car leur anatomie est distincte de celle des mammi-
fres et des variations importantes entre espces existent (Hontela, 1997 ;
Bentley, 1998).

2.2. CELLULE CORTICOSTRODOGNIQUE ET VOIES DE SIGNALISATION


Malgr les diffrences anatomiques majeures dans lorganisation du tissu
adrnal entre espces, le fonctionnement de la cellule strodognique est
plutt similaire chez les poissons, les amphibiens et les autres vertbrs.
Le scrtagogue principal pour cette cellule est lhormone adrnocor-
ticotropique (ACTH) scrte par lhypophyse. La liaison de lACTH
son rcepteur membranaire (figure 4.3 ; Lacroix, 2002) va activer des voies
signaltiques impliquant une cascade enzymatique qui amplifie le signal
initial o lAMP cyclique agit comme deuxime messager (Patio et al.,
1986) et o la protine kinase A semble activer la synthse des hormones
strodogniques, tandis que la protine kinase C exerce un effet inhibi-
teur (Lacroix et Hontela, 2001). Si les voies signaltiques ont t assez bien
caractrises chez les mammifres, les connaissances chez les poissons sont
moins compltes. Le rle des protines G, bien caractrises chez les mam-
mifres, reste en effet dmontrer chez les poissons. Les voies signal-
tiques de la strodognse adrnale ont t bien caractrises chez les
amphibiens par lquipe du professeur Vaudray, de lUniversit de Rouen
(Cartier et al., 1999).
Le cholestrol, substrat des enzymes strodogniques localises dans
le rticulum endoplasmique et la mitochondrie, est graduellement modifi,
tout dabord par un clivage de sa chane latrale par la cytP450 scc
(figure4.3), situe dans la membrane mitochondriale. Cette premire rac-
tion est rgule par la protine StAR (Steroid Acute Regulatory protein), qui
contrle le transfert du cholestrol de lextrieur de la membrane
mitochondriale vers lintrieur et dont le rle reste dterminer chez les
poissons. Des travaux trs intressants utilisant la biologie molculaire
ont par ailleurs dmontr dans les cellules strodogniques ovariennes
que la StAR joue un rle important dans la rgulation de la synthse rapide
168 cotoxicologie molculaire

Figure 4.2
Lorganisation cellulaire du tissu interrnal chez le poisson tlosten

ST : cellules strodogniques ; LT : tissu lymphode ; CC : cellules chromaffines ; V : veine.


Le panneau du bas reprsente le tissu adrnocortical de la perchaude en coupe histolo-
gique colore par trichrome de Masson (X400).
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 169

des hormones strodes (Stocco, 2000). Suite au clivage de la chane lat-


rale du cholestrol, une srie des ractions est initie, impliquant des cyt
P450, des isomrases et des dshydrognases, pour obtenir partir du
cholestrol la pregnnolone, la progestrone et, finalement, le cortisol ou
la corticostrone. Ces hormones ne sont pas stockes dans la cellule mais,
tant trs lipophiles, elles se diffusent travers la membrane de la cellule
strodognique vers la circulation sanguine. Les corticostrodes peuvent
tre transports par des protines de transport, telle la protine de liaison
des glucocorticostrodes (GBP, Glucocorticosteroid Binding Protein). Lhor-
mone lie possde une demi-vie plus longue que lhormone libre qui est
celle capable de se lier aux rcepteurs dans les cellules cibles. La dispo-
nibilit des protines de transport pourrait donc influencer lactivit
biologique des hormones glucocorticostrodes.

2.3. LES HORMONES CORTICOSTRODES ET LEURS EFFETS PHYSIOLOGIQUES


De nombreux organes possdent des rcepteurs spcifiques pour les hor-
mones corticostrodes. Les rcepteurs pour le cortisol ont t identifis
chez le poisson tlosten dans les branchies, le foie, le rein, le cerveau et
lintestin (figure 4.1). Cette omniprsence nest pas surprenante puisque
dans ce groupe, le cortisol joue un rle important aussi bien dans losmo-
rgulation et le mouvement des ions travers les surfaces osmorgulatrices
(branchies, reins, intestin), que dans la rgulation du mtabolisme inter-
mdiaire, notamment au niveau du foie et des muscles (Mommsen et al.,
1999). La fonction de la corticostrone est similaire chez les amphibiens,
lhormone tant importante dans losmorgulation et le mtabolisme, ainsi
que dans la mtamorphose. Notons que chez les mammifres, les
corticostrodes ont un rle dans la rgulation du mtabolisme tandis que
laldostrone, une hormone minralocorticode presque non dtectable
chez les poissons, joue un rle effecteur de losmorgulation. Chez tous
les vertbrs, les corticostrodes sont aussi de puissants immunosuppres-
seurs. De plus, un rle inhibiteur dans la maturation des oocytes a t
rapport chez les poissons (Pankhurst et Van Der Kraak, 2000). De nom-
breuses interactions avec dautres hormones ont aussi t signales,
particulirement avec les hormones thyrodiennes, lhormone de crois-
sance et les catcholamines.
La multitude et la complexit des effets des hormones corticost-
rodes signifient que toute anomalie au niveau de la synthse ou du mta-
bolisme pourrait avoir des consquences nfastes pour la sant de
lorganisme. De plus, ces nombreuses interactions avec diffrents systmes
hormonaux rendent le diagnostic de ces anomalies plus difficile, car plu-
sieurs caractristiques physiologiques peuvent tre modifies en mme
temps.
170 cotoxicologie molculaire

Figure 4.3
Voies signaltiques de la synthse du cortisol
dans la cellule strodognique

3. TRAVAUX SUR LE TERRAIN ET EFFETS


DES EXPOSITIONS CHRONIQUES CHEZ LES POISSONS
3.1. LA DFAILLANCE CORTISOLIQUE
Lexposition chronique aux mtaux dans lenvironnement, des concen-
trations sublthales, induit une altration de la scrtion de corticost-
rodes ainsi quune altration de la capacit de rponse dautres stresseurs
tels que la prdation ou le confinement (Hontela, 1998). Cette incapacit
scrter du cortisol, comparativement aux poissons de lacs non conta-
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 171

mins, a t dcrite chez le grand brochet (Esox lucius) expos au Hg


(Lockhart et al., 1975), chez la perchaude (Perca flavescens) prleve dans
diffrents lacs de la rgion minire de Rouyn-Noranda, au nord-ouest du
Qubec (figure 4.4, tableau 4.1) et chez la truite brune (Salmo trutta) de la
rivire Eagle au Colorado (Norris et al., 1998). La stimulation lACTH a
clairement dmontr chez les perchaudes provenant de lacs contamins
par diffrents mtaux (Cu, Cd, Zn) un dysfonctionnement du tissu adrnal
avec une incapacit rpondre un stress. Pralablement, des tests ra-
liss en laboratoire, in vitro et in vivo, ont galement permis de diffrencier
les poissons physiologiquement sains (tissu adrnocortical fonctionnel et
capacit de rpondre un stresseur) et ceux prsentant un dysfonction-
nement de ce mme tissu et incapables de rpondre un stress, caract-
riss par une incapacit scrter du cortisol malgr une stimulation
lACTH (figure 4.4, Laflamme et al., 2000). Plusieurs de nos tudes ralises

Figure 4.4
Sites chantillonns dans ltude cotoxicologique de la perchaude Perca
flavescens dans la rgion minire de Rouyn-Noranda*
Cortisol plasmatique (ng/ml)

Cortisol in vitro (ng/ml)

Aucune
Tableau 4.1 172
Concentrations tissulaires en mtaux (g/g poids sec) de la perchaude, Perca flavescens,
prleve dans la rgion minire de lAbitibi

Foie Rein Rein cphalique


Lacs tmoins Zn Cu Cd Zn Cu Cd Zn Cu Cd
Opasatica 92,4 10,4 2,9 673,3 9,7 16,0 104,6 2,3 0,9
Dasserat 98,6 10,8 5,3 697,2 11,6 19,0 118,0 2,9 1,7
Lacs intermdiaires
Bousquet 106,5 20,4 20,3 561,9 11,2 74,5 96,0 2,2 3,8
Vaudray 108,9 12,9 25,1 N.D. N.D. N.D. 127,6 2,7 5,7
Lacs fortement contamins
Osisko 177,2 246,5 45,7 1565,2 17,4 90,5 153,6 6,5 8,0
Dufault 151,1 148,5 61,3 1862,2 15,8 150,7 227,0 6,4 12,6

cotoxicologie molculaire
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 173

sur des perchaudes provenant de lacs contamins par des mtaux lourds
ont permis dtablir une relation significative entre les teneurs tissulaires
en mtaux et le niveau dinhibition de la scrtion de cortisol en rponse
un stress. Notons aussi quune relation trs significative entre la charge
tissulaire en mtaux et les teneurs en mtallothionines a t dmontre
dans les reins, le foie et le tissu adrnocortical (interrnal) chez la
perchaude expose dans le milieu naturel (Laflamme et al., 2000). Les tests
fonctionnels de stimulation avec ACTH ou le confinement physique se
sont rvls particulirement pertinents et reprsentatifs du milieu naturel
o les poissons doivent non seulement se dfendre contre la pollution,
mais galement contre leurs prdateurs, les conspcifiques ainsi que divers
stresseurs environnementaux, chroniques ou aigus. La survie des poissons
dans leur habitat dpend donc de leur capacit rpondre un stress via
le systme endocrinien caractris par une lvation du niveau en cortisol.
Un dysfonctionnement de ce systme pourra de ce fait avoir des cons-
quences directes sur la survie mme de la population.

3.2. EFFETS DES MTAUX SUR LA CAPACIT DOSMORGULATION


De nombreuses tudes ont permis de mettre en vidence des perturbations
de lhomostasie ionique et des changements biochimiques au niveau plas-
matique chez des animaux exposs des mtaux, en particulier chez les
poissons tlostens (McDonald et Wood, 1993). Parmi les drglements
physiologiques observs la suite dune exposition des concentrations
leves mais subltales en mtaux, la perturbation de la concentration
ionique au niveau plasmatique et urinaire, lanmie et lhypocalcmie sont
les plus documents. Plusieurs de ces changements sont causs par des
dommages au niveau des branchies (planche 2) et des reins, ce qui rend ces
organes incapables de remplir leur fonction dosmorgulation. Les ano-
malies peuvent aussi tre induites, comme rponse secondaire, par une
altration de la synthse et de la scrtion dhormones osmorgulatrices
clefs telles que le cortisol, les hormones thyrodiennes (Bleau et al., 1996 ;
Hontela et al., 1996) ou la prolactine. Les travaux rcents de Bury et al.
(1998) ont par ailleurs permis dobserver chez le tilapia (Oreochromis
mossambicus) une ncrose des cellules chlorure de branchies exposes
au Cu et un effet protecteur du cortisol favorisant lapoptose de ces m-
mes cellules plutt que la ncrose, peut-tre par limination des cellules
dfectueuses, sans induire dinflammation. De plus, les mtaux peuvent
interfrer avec le flux ionique travers lpithlium des cellules de
branchies ou de reins, par des processus physicochimiques agissant sur
le gradient lectrochimique et sur les pompes ioniques telle la Na+/K+
ATPase. Plusieurs tudes rcentes dcrivent une diminution de lactivit
Na+/K+ ATPase au niveau des branchies de poissons tlostens exposs
174 cotoxicologie molculaire

sur le terrain ou en laboratoire Pb et Cd, des mtaux connus pour inter-


frer avec Ca2+ (Levesque et al., 2003). De plus, des tudes dtailles par le
professeur C. Wood et ses collgues sur les effets de Cu et Ag et la capa-
cit dosmorgulation chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) ont
t publies (McGeer et al., 2000). Si les altrations de lquilibre osmoio-
nique induites par lexposition aux mtaux sont bien documentes aussi
bien chez les poissons que chez les mammifres, les connaissances au sujet
des effets de mtaux sur la capacit dosmorgulation chez les amphi-
biens sont trs partielles. Les mcanismes de toxicit des mtaux dans les
organes cibles impliqus dans losmorgulation sont nombreux et leur
importance relative dans ltiologie des pathologies reste dterminer.
Les effets des mtaux sur la capacit dosmorgulation illustrent
parfaitement les nombreuses cibles de ces derniers. Tout dpendant de la
concentration, du temps dexposition et de la sensibilit spcifique
chaque espce, les mtaux peuvent agir sur la morphologie et la fonction
des organes chargs de la rgulation osmotique, ainsi que sur la scrtion
dhormones osmorgulatrices sur lactivit denzymes rgulatrices et sur
les pompes ioniques.

3.3. EFFETS DES MTAUX SUR LA CROISSANCE ET LE MTABOLISME


La croissance est un processus complexe rgule par divers facteurs phy-
siologiques, tels que la disponibilit en nourriture et les niveaux en sub-
strats nergtiques qui sont contrls par diffrentes hormones et enzymes
et utiliss dans les processus cataboliques et anaboliques. Tous ces fac-
teurs peuvent tre, directement ou indirectement, modifis par la prsence
de mtaux, rendant ainsi difficile dtablir une relation mcanistique de
cause effet, en particulier sur le terrain (Sherwood et al., 2002b).
Les effets des mtaux sur la croissance ont t tudis principale-
ment chez les poissons, exposs en laboratoire ou de faon chronique dans
lenvironnement. Dans la plupart de ces travaux, une diminution de la
croissance et du facteur de condition [(poids/longueur3)  100] a t rap-
porte (Laflamme et al., 2000 ; Levesque et al., 2002). Il est nanmoins trs
difficile dinterprter les rsultats obtenus sur le terrain, car linfluence
dautres facteurs, tels que la comptition pour la nourriture et lexposi-
tion aux contaminants et les consquences de cette exposition sur les pr-
dateurs, les proies et ltat physiologique de lanimal, est relle et doit
tre prise en compte dans linterprtation des effets de la pollution sur la
population ltude. De nouvelles mthodes fondes sur lutilisation des
signatures isotopiques (p. ex., le radioisotope Cs137) ont t dveloppes
et se sont rvles utiles pour estimer lefficacit de croissance qui repr-
sente lefficacit convertir la nourriture consomme en biomasse

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Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 175

(Sherwood et al., 2000, 2002a, 2002b). Ces nouvelles approches sont de ce


fait utiles pour mieux comprendre et lucider le lien entre exposition aux
mtaux sur la fonction hormonale et mtabolique, et la croissance de
poissons exposs (bionergie et capacit de croissance).
Les effets des mtaux sur le mtabolisme intermdiaire ont, l encore,
t principalement tudis chez les poissons, avec quelques tudes chez
dautres groupes de vertbrs (Sjbeck et al., 1984 ; Pratap et Wendelaar
Bonga, 1990 ; Sastry et al., 1997 ; Ricard et al., 1998 ; Levesque et al., 2002).
Lexposition aigu aux mtaux augmente les niveaux en cortisol et en glu-
cose plasmatique et diminue les rserves en glycogne hpatique, para-
mtres qui peuvent tre considrs comme une adaptation dans la mesure
o ils permettent daugmenter la disponibilit en substrats nergtiques
ncessaires pour maintenir lhomostasie. Ces changements suggrent
galement que lexposition aux mtaux active des mcanismes homosta-
tiques coteux sur le plan nergtique, comme le dcrit Heath (1995). Les
effets dune exposition chronique sur le mtabolisme intermdiaire sont
moins bien dcrits. Des changements, suivant la saison, au niveau des
rserves hpatiques en glycogne et en triglycrides ont t signals chez
la perchaude expose aux Cd, Zn et Cu dans la rgion minire de Rouyn-
Noranda (Levesque et al., 2002). Les poissons des lacs contamins prsen-
tent une capacit rduite restaurer leurs rserves nergtiques, en
comparaison aux poissons des sites rfrences non contamins, et pr-
sentent galement des diffrences significatives dans lactivit denzymes
gluconogniques et lipolytiques clefs. De plus, la fonction thyrodienne,
importante dans la rgulation du mtabolisme et de la respiration cellu-
laire, sest rvle inhibe chez les poissons les plus contamins par les
mtaux, car leurs teneurs plasmatiques en thyroxine (T4) et en triiodothy-
ronine (T3) taient faibles (Levesque et al., 2003) et des anomalies morpholo-
giques ont t observes au niveau des follicules thyrodiens (planche 2).
Ces anomalies du mtabolisme chez les poissons contamins peuvent
expliquer les diffrences de croissance et le retard dans le dveloppement
des gonades observes (planche 2), la croissance et le dveloppement
gonadal tant en effet des processus coteux du point de vue nergtique,
en particulier en milieu contamin o la disponibilit en nourriture peut
tre limite.

4. EXPOSITIONS IN VITRO : MCANISMES IMPLIQUS


DANS LA DFAILLANCE CORTISOLIQUE
Les mcanismes par lesquels la fonction de scrtion du tissu adrnal peut
tre perturbe suite une exposition chronique aux mtaux ont t carac-
triss par stimulation ex vivo lACTH de ladrnale de truite arc-en-ciel
(Oncorhynchus mykiss) aprs une exposition par leau au Cd pendant 1, 7,
176 cotoxicologie molculaire

14 et 30 jours. Les rsultats obtenus montrent une rponse lACTH


maintenue, y compris chez les poissons exposs 30 jours une plus forte
dose en Cd, soit 1 g/L (Brodeur et al., 1998). Une exposition au Cd dans
leau, jusqu 30 jours en laboratoire, ninduit donc pas de dfaillance
cortisolique, contrairement ce qui a t observ sur le terrain suite des
expositions rellement chroniques, pendant plusieurs annes in situ. Les
travaux de Leblond et Hontela (1999) ont par contre montr quune expo-
sition in vitro pendant 60 min de cellules corticostrodogniques au Cd,
Zn, Hg et CH3HgCl induisait une incapacit dose-dpendante scrter
du cortisol et ce, des doses en mtaux relativement leves mais
ninduisant pas de mortalit cellulaire. Cette tude, complte par des
tudes sur le terrain o les charges des reins cphaliques en mtaux ont
pu tre mesures (tableau 4.1), a permis de dfinir la notion de seuil des
charges tissulaires en mtaux (ou autres toxiques), valeur partir de
laquelle la fonction du tissu adrnocortical peut tre perturbe. Ce seuil,
qui peut tre dpass suite une exposition environnementale chronique
ou dans des tudes in vitro o des fortes concentrations en mtaux sont
utilises en contrepartie dun temps dexposition court, est un lment
essentiel pour mieux comprendre les mcanismes impliqus dans la
dfaillance cortisolique.
Jusque rcemment, les mcanismes daction des mtaux lourds au
niveau cellulaire du systme endocrinien taient peu connus, avec seule-
ment quelques tudes portant sur lidentification des sites daction de ces
substances toxiques au niveau des cellules endocrines. Plusieurs publica-
tions rapportent nanmoins une action directe des mtaux sur la
strodognse dans le tissu adrnal (Mgbonyebi et al., 1994 ; Mathias et
al., 1998 ; Leblond et Hontela, 1999) et dans les gonades (Laskey et Phelps,
1991). Des tudes in vitro ralises sur des tissus strodogniques expo-
ss aux mtaux ont rapport deux types deffets, rponse qui dpend de
lespce et de la nature du toxique (spciation, dose, temps dexposition) :
1) certains mtaux semblent altrer directement la fonction de ladrnale
et des gonades en inhibant des enzymes strodogniques spcifiques et
2)de nombreux mtaux lourds divalents tel le cadmium (Cd2+) vont
modifier les concentrations intracellulaires en Ca2+ et altrer ainsi les
processus Ca2+ qui en dpendent.

4.1. LES INTERACTIONS DES MTAUX AVEC LE CA2+ INTRACELLULAIRE


Le Ca2+ est essentiel de nombreux processus biologiques. Il joue un rle
important comme second messager dans les voies de signalisation intra-
cellulaire, dans le systme endocrinien de tous les vertbrs tudis jusqu
prsent. Le Ca2+ est ncessaire pour que lACTH se fixe sur son rcepteur,
premire tape de la cascade enzymatique permettant la synthse et la
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 177

scrtion des strodes au niveau du tissu adrnal. Le cadmium (Cd2+),


mtal divalent, peut agir soit en se fixant sur un site Ca2+ des membranes
plasmatiques, soit en bloquant les canaux calciques ou en induisant le
relargage du Ca2+ stock au niveau des mitochondries ou du rticulum
endoplasmique via lactivation de rcepteurs membranaires (Mathias et
al., 1998). Le Cd peut passer travers les canaux calciques des cellules
phochromocytaires, ligne cellulaire de mammifre fonction neuro-
scrtrice (Hinkle et Osborne, 1994), et altrer ainsi linflux de Ca2+. Les
travaux raliss sur une ligne de cellules hypophysaires par Hinkle et al.
(1987) ont par ailleurs montr que la nimodipine, un bloqueur des canaux
calciques, pouvait assurer une protection contre les effets toxiques de Cd,
ce qui indiquerait que le Cd peut entrer dans les cellules via des canaux
Ca2+ dpendants du voltage, rsultat confirm par lutilisation dun
agoniste des canaux Ca2+, le BAY K 8644.
Le rle protecteur du Ca2+ contre les effets toxiques du Cd a t
dmontr par Mathias et al. (1998) sur des cellules tumorales dadrnale
de souris (cellules Y-1) en utilisant un milieu riche en calcium. Une aug-
mentation de la concentration intracellulaire en Ca2+ par le ionophore
A23187 induit une augmentation de la scrtion, basale et aprs stimula-
tion, dans les cellules adrnales traites au Cd. Ces rsultats suggrent
que le Ca2+ extracellulaire pourrait protger la cellule des effets du Cd et
maintenir la synthse de lAMPc au niveau de la membrane ainsi que le
mtabolisme basal du cholestrol au niveau mitochondrial. Dautre part,
des mesures par fluorescence montrent que le Cd2+, par comptition avec
le Ca2+, peut entrer dans la cellule, entre qui sera acclre par une sti-
mulation lACTH. Ces travaux fournissent de nouvelles donnes sur les
cibles cellulaires potentielles du Cd au niveau des cellules endocrines.
Cependant, les effets des mtaux sur les processus cellulaires impliquant
le Ca2+ chez dautres vertbrs sont encore peu connus.
De nombreux processus cellulaires sont rguls par la calmoduline,
protine ubiquiste capable de lier Ca2+ et de stimuler lactivit de
plusieurs cibles protiques. Aprs lactivation de la strodognse par la
Ca2+-calmoduline (Ca/CaM) dans des cellules tumorales Y-1 dadrnale,
on a observ que le Ca2+ facilitait la liaison de lACTH sur son rcepteur
jouant ainsi un rle de rgulation. La liaison du Ca2+ avec la CaM va activer
la CaM, qui pourra se lier ensuite diffrentes enzymes telles que la
phosphorylase kinase et lAMPc phosphodiestrase, dont les activits
seront alors modifies. Il existe une comptition entre mtaux et Ca2+ pour
de nombreux sites intracellulaires et la CaM semble tre une cible poten-
tielle pour les mtaux divalents. Les travaux rcents effectus dans notre
laboratoire (Lacroix et al., en prparation) dmontrent que les interactions
entre Cd2+ et Ca2+ dans les cellules strodogniques sont parmi les mca-
nismes de toxicit endocrinienne du cadmium chez la truite arc-en-ciel.
178 cotoxicologie molculaire

En utilisant la nicardipine et lagoniste BAY K 8644, on a dmontr le rle


protecteur du calcium in vitro. Des travaux sont en cours pour identifier
les voies dentre du cadmium dans les cellules strodogniques.

4.2. EFFETS DES MTAUX ET DES PESTICIDES


SUR LES ENZYMES STRODOGNIQUES
Ds 1977, Freeman et Sangalang (1977) ont dmontr in vitro que certains
mtaux (Cd, Hg, As) ainsi que des polluants organiques pouvaient inhiber
la synthse des hormones strodes dans le tissu adrnal et les testicules
de baleine grise (Halichoerus grypus), linhibition de lactivit 3b-hydro-
xystrode dshydrognase par ces xnobiotiques ayant un effet direct sur
le produit final de la synthse. Les mcanismes daction des mtaux sur la
synthse des corticostrodes ont aussi t tudis in vivo (Veltman et
Maines, 1986). Les activits denzymes strodogniques ont t mesures
chez des rats traits avec Hg2+ et lenzyme 21a-hydroxylase fut identifie
comme une cible potentielle de ce mtal. Linhibition de cette enzyme par
Hg a galement put tre corrle avec des niveaux plasmatiques en st-
rodes rduits. Mgbonyebi et collgues (1994) ont rapport un effet inhi-
biteur du Cd sur la scrtion, basale et aprs stimulation lACTH, de
cortisol sur des cellules du cortex adrnal de rats en culture, bien que ces
rsultats ne puissent pas tre interprts comme une toxicit du Cd sur
lensemble des paramtres de lanimal. des concentrations plus faibles
en mtaux, aucun effet sur la strodognse aprs stimulation lACTH
de cellules strodogniques de rat en culture na t observ par
Nishiyama et al. (1985). Une altration de la synthse et de la scrtion de
strodes na t observe quavec le Pb, scrtion pouvant tre restaure
avec du dbc-AMP (dibutiryle AMP cyclique) ; ainsi, le Pb agirait au niveau
de la membrane plasmique.
Pour mieux comprendre les mcanismes de toxicit et identifier les
sites daction des mtaux sur la production de testostrone, Laskey et
Phelps (1991) ont stimul la production de testostrone dans des cellules
Leydig de rats en utilisant des substrats biosynthtiques et des agonistes,
tels la hCG (gonadotrophine chorionique dhumain) ou le dbc-AMP. Les
rsultats montrent une inhibition dose-dpendante de la production de
testostrone aprs traitement avec Cd2+, Co2+, Cu2+, Hg2+, Ni2+ et Zn2+. La
production de testostrone fut restaure dans les cellules exposes Cd2+,
Co2+, Ni2+ et Zn2+ lorsque stimules avec lhydroxycholestrol et la pregn-
nolone, deux substrats prcurseurs de la testostrone. Ces rsultats
montrent que ces cations peuvent agir diffrents niveaux de la strodo-
gnse et permettent didentifier comme cible des mtaux les tapes com-
prises entre la liaison de lACTH son rcepteur et les tapes prcdant
la transformation enzymatique des strodes au niveau mitochondrial. Les
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 179

travaux de Leblond et Hontela (1999) ont de plus dmontr une inhibi-


tion dose-dpendante de la rponse lACTH des cellules strodog-
niques de truite arc-en-ciel exposes Cd2+, Hg2+, Zn2+ et au o,p'-DDD,
un pesticide organochlor. La scrtion de cortisol aprs exposition aux
mtaux ne pouvait tre rtablie par stimulation au dbcAMP, contrairement
aux cellules exposes au pesticide.
Ces rsultats font apparatre que les mtaux agissent au niveau de
la voie de signalisation implique dans la synthse et la scrtion de cor-
tisol une tape situe aprs la formation dAMPc alors que le o,p'-DDD
semble agir un niveau prcdant cette tape. Rcemment, nous avons
rapport (Lacroix, A., en prparation) que les effets inhibiteurs du Cd sur
la strodognse adrnale dans les cellules de la truite et la perchaude
peuvent tre renverss en substituant la pregnnolone dans le milieu
dincubation. Ces rsultats indiquent que le Cd agit en amont de ltape
o la pregnnolone est utilise dans la chane enzymatique (figure 4.3)
puisque ces tapes demeurent fonctionnelles mme en prsence de Cd.
Lapproche base sur la substitution des substrats spcifiques diffrentes
tapes de la biosynthse de lhormone permet didentifier, dune manire
cible, les sites endommags par le xnobiotique. Les effets de Cd au niveau
de la strodognse adrnale sont similaires chez les amphibiens. Une
inhibition dose-dpendante de la capacit de synthse de corticostrone
en rponse la stimulation par lACTH et le dbcAMP a t dmontre in
vitro dans les cellules strodogniques de Xenopus laevis (Goulet et
Hontela, 2003). Le bioessai (figure 4.5) utilis pour valuer la toxicit
adrnale chez les amphibiens et les poissons tait le mme, permettant
ainsi dobtenir des donnes importantes sur la sensibilit des diffrentes
espces des vertbrs et le mode daction de polluants environnementaux.
De plus, notre quipe a aussi compar diffrents toxiques dans le mme
modle animal (tableau 4.2), notamment la truite arc-en-ciel, en valuant
la toxicit des diffrents mtaux et pesticides (Leblond etal., 2001 ; Bisson
et Hontela, 2002), donnes qui pourraient servir lvaluation du risque
environnemental.
lexception de quelques tudes sur les poissons et les amphibiens
prsentes ci-dessus, lessentiel des tudes sur les mcanismes daction
des polluants environnementaux sur les cellules endocrines ont t effec-
tues chez les mammifres. Si les donnes concernant les effets physiolo-
giques des mtaux sur les espces aquatiques sont nombreuses, les
connaissances concernant les mcanismes par lesquels les xnobiotiques
environnementaux altrent la voie de signalisation dans les cellules endo-
crines chez les vertbrs autres que mammifres sont encore pauvres. De
nouveaux outils exprimentaux bass sur une approche toxicologique en
rapport avec les caractristiques dj connues sur le systme endocrinien
180 cotoxicologie molculaire

Figure 4.5
Le bioessai utilis pour valuer in vivo et in vitro la toxicit adrnale
chez les poissons et les amphibiens

permettront de mieux comprendre les mcanismes impliqus et dlargir


ainsi nos connaissances dans ce domaine. Lutilisation de techniques mol-
culaires constitue galement un bon outil pour identifier les sites daction
des mtaux dans la rgulation de lexpression de gnes ou protines
impliqus dans la strodognse dans les cellules endocrines. Quelques
tudes rcentes chez les mammifres illustrent bien cette direction de
recherche. Lquipe de D. Stocco (Walsh et al., 2000, 2001) a dmontr que
lexpression et lactivit de la protine StAR, la protine qui contrle le
transfert du cholestrol dans la mitochondrie (figure 4.3), une tape clef
dans la strodognse, sont inhibes par des pesticides tels que le lindane
et le glyphosate Roundup ou N-(phosphonomthyl) glycine. La cons-
quence de lexposition ces pesticides est une diminution dose-dpendante
de la synthse des strodes. Lapproche molculaire a permis didentifier

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Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 181

dune faon cible le site daction dun polluant et de caractriser son


mcanisme daction. On ne peut exclure dans cette tude la possibilit
que les pesticides tudis perturbent aussi lhomostasie du calcium
cellulaire, tel que rapport pour les mtaux, ou quils agissent par dautres
mcanismes simultanment. Des travaux futurs permettront probablement
dtablir cette possibilit dactions cellulaires multiples pour un mme
toxique.

Tableau 4.2
Sensibilit de cellules adrnocorticales de la truite aux mtaux et pesticides

Produit Viabilit Scrtion de cortisol LC50/EC50


LC50 (M) EC50 (M)
Atrazine >50 000 >50 000
CdCl2 10 800 168,0 64,29
ZnCl2 22 800 355,0 64,22
Mancozeb >5 000 207,0 24,16
Endosulfan 308 17,3 17,85
CH3HgCl 1 140 116,0 9,83
HgCl2 199 22,3 8,92
o,p'DDD 385 130,0 2,96
Diazinon 184 109,0 1,68

5. PESTICIDES ET STRESS OXYDATIF


La toxicit de loxygne est un fait connu depuis longtemps. Sil est vital
pour les organismes arobies, loxygne est galement dltre au travers
de la formation, lors des processus mtaboliques endognes, des drivs
extrmement ractifs que sont les radicaux libres. Leur production est con-
trle par des systmes endognes, enzymatiques ou non. De nombreux
contaminants vont favoriser la formation de ces oxyradicaux, notamment
par lintermdiaire des composs potentiel redox (Otto et Moon, 1996).
Les radicaux libres sont hautement ractifs en raison de leur structure lec-
tronique instable puisquils possdent un lectron non appari ou cliba-
taire. Ces drivs peuvent conduire dans la cellule la peroxydation des
lipides membranaires, loxydation des groupements thiols de certaines
enzymes ou coenzymes, laltration des acides nucliques (adduits
lADN, cancrogense, apoptose) (Gutteridge et Halliwell, 1990 ; Stegeman
et al., 1992).
182 cotoxicologie molculaire

5.1. DFINITION DU STRESS OXYDATIF


Le stress oxydatif peut tre dfini comme un dsquilibre entre les sys-
tmes prooxydants et antioxydants en faveur des premiers et impliquant
la production despces ractives de loxygne (Sies, 1991). La formation
incontrle despces ractives de loxygne comme lanion superoxyde
(O2), le peroxyde dhydrogne (H2O2) ou le radical hydroxyle (OH) aura
des consquences souvent lourdes pour lorganisme. Mais la formation
despces ractives nest pas toujours synonyme de toxicit. En effet, cer-
taines sont des intermdiaires de processus physiologiques normaux. Ce
nest que lorsque les systmes de dfense sont dpasss et ne suffisent
plus neutraliser la surproduction de ces espces que la toxicit apparat.
Un stress oxydatif pourra tre induit lors de la surproduction despces
ractives et/ou par suite de linhibition des systmes antioxydants qui
peuvent tre inactivs, soit directement, soit par dfaut de synthse. Parmi
les espces ractives de loxygne, le radical hydroxyle, prsent comme
le plus toxique malgr sa faible diffusion, peut attaquer tous les types de
constituants cellulaires et engendrer diverses altrations (dgradation pro-
tique, inactivation enzymatique, lipoperoxydation, adduits lADN, etc.)
(Michiels et al., 1994 ; Dringen et Hamprecht, 1997). Il rsulte de la fission
homolytique de la liaison O-O du peroxyde dhydrogne et peut aussi
tre produit par les ractions de Fenton et de Haber-Weiss :
O2 + Fe(III) O2 + Fe(II)
Fe(II) + H2O2 Fe(III) + OH + OH (Fenton)
O2 + H2O2 OH + OH + O2 (Haber-Weiss)

5.2. LES SYSTMES DE DFENSE ANTIOXYDANTS


Pour faire face ces attaques, les organismes ont dvelopp des systmes
daction antioxydante qui visent : 1) liminer les espces ractives et les
catalyseurs de leur formation, 2) induire la synthse des antioxydants et
3) augmenter lactivit des systmes de rparation et dlimination des
molcules endommages. Trois types denzymes antioxydantes sont mis
en uvre pour la destruction des espces ractives de loxygne, comme
lillustre la figure 4.6 :
1. Les peroxydases qui catalysent la rduction conjointe dun hydro-
peroxyde et dun peroxyde organique, le glutathion (GSH), suivant
la raction :
ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + H2O
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 183

Figure 4.6
Enzymes impliques dans la dfense oxydative

Le maintien dactivit peroxydase implique le recyclage NADPH-


dpendant du glutathion rduit par une glutathion rductase,
le NADPH tant produit par la voie des pentoses phosphates
(GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+)
2. Les superoxydes dismutases, mtalloenzymes capables de dismuter
lanion superoxyde en peroxyde dhydrogne, moins ractif, suivant
la raction :
2 O2 + 2 H + H 2 O 2 + O 2
3. Les catalases, qui catalysent la rduction du peroxyde dhydrogne
en eau et en oxygne molculaire :
2 H2O2 O2 + 2 H2O
184 cotoxicologie molculaire

Des antioxydants non enzymatiques agissant comme rducteurs ou


capteurs de radicaux vont renforcer laction des enzymes dcrites prc-
demment. Parmi les rducteurs fonction thiol libre, le glutathion joue
un rle trs important. Le glutathion (tripeptide glutamyl-cystinyl-
glycine) est le thiol protique le plus abondant dans les organismes vivants.
Il est prsent majoritairement ltat rduit (GSH) dans les cellules ; une
augmentation de la forme oxyde (GSSG) traduit un stress oxydatif.
Il agit comme donneur dlectrons permettant dliminer les espces
ractives comme OH mais surtout comme substrat des glutathion
peroxydases pour la rduction des peroxydes. Les vitamines D et E parti-
cipent galement llimination des espces ractives de loxygne et ce
diffrents niveaux.

5.3. TRAVAUX EN LABORATOIRE


5.3.1. Exposition in vitro lendosulfan
Des tudes rcentes ont permis dtablir un lien entre lexposition cer-
tains pesticides organochlors (Endrin, Lindane, hexachlorocyclohexane
et autres) et induction de stress oxydatif dans diffrents tissus de mam-
mifres. Chez le poisson, les travaux de Pandey et al. (2001) ont permis de
mettre en vidence une modulation des systmes antioxydants au niveau
hpatique suite une exposition chronique lendosulfan. Des travaux
raliss dans notre laboratoire avec lendosulfan, compos trs toxique
pour les poissons (CL50 96 h truite arc-en-ciel = 1,5g/L), ont permis de
dcrire les effets dose-dpendants de ce dernier sur la synthse cortisolique
(Leblond et al., 2001 ; Bisson et Hontela, 2002) et de dmontrer les effets
spcifiques adrnotoxiques de celui-ci.
Lexposition aigu (60 min) lendosulfan de cellules corticostro-
dogniques de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) a dmontr une
altration des systmes action antioxydante (CAT, GPx et GSH) ainsi
quune activation de la peroxydation des lipides, comme lillustre la
figure4.7 (Dorval et al., 2003), rsultats confirms par lutilisation dacti-
vateurs ou dinhibiteurs de ces diffrents systmes (Dorval et Hontela,
2003). Sans connatre prcisment encore les mcanismes daction par les-
quels lendosulfan inhibe la fonction du tissu adrnocortical des poissons,
ces rsultats, mis en relation avec la prsence en grand nombre dans ce
tissu de cytochromes P450s (Hornsby, 1989), permettent de penser que
les effets de lendosulfan sont mdis par linduction dun stress oxydatif
(inhibition des enzymes du stress oxydatif) et par laltration du cycle
cytochrome P450s lorigine de la production despces ractives de loxy-
gne tel que dcrit par Dawson (1988). Les espces ractives ainsi formes
pourraient agir en inhibant lactivit denzymes directement impliques
dans la synthse et la scrtion de cortisol telle que la 11- hydroxylase.
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 185

De plus, les rsultats obtenus ont permis de dmontrer que le main-


tien du cycle redox du glutathion et, dans une moindre mesure, de lacti-
vit de la CAT, tait essentiel au maintien de la fonction des cellules
corticostrodogniques exposes lendosulfan.
5.3.2. Travaux sur le terrain
Des travaux, toujours en cours, dans la rgion agricole du Qubec (rivire
Yamaska) nous permettent dutiliser lactivit des enzymes antioxydantes
(CAT, GPx), les niveaux en glutathion rduit ainsi que les niveaux de
lipoperoxydation comme des biomarqueurs sensibles dune exposition
chronique divers pesticides parmi lesquels latrazine ou le mtolachlore
(Dorval et al., soumis).

Figure 4.7
Effet dune exposition in vitro lendosulfan sur la scrtion de cortisol
par les cellules corticostrodogniques de la truite arc-en-ciel

La scrtion de cortisol est indique par la ligne pointille. GPx : glutathion peroxydase ;
CAT : catalase ; GSH : glutathion rduit ; LOOH : hydroxyperoxydes de lipides.
186 cotoxicologie molculaire

Lobjectif principal de cette tude est de vrifier limpact sur la qualit


de leau et dtudier les effets sur la physiologie des poissons retrouvs
dans la rivire de lutilisation des pesticides dans la culture du mas, lune
des plus importantes en superficie au Qubec, couvrant prs de 17 % du
territoire cultiv. Les approches et les protocoles exprimentaux que nous
avons dvelopps et valids dans les rgions minires de lAbitibi et les
travaux cotoxicologiques avec la perchaude seront utiliss dans cette
nouvelle problmatique des pesticides avec une nouvelle espce, le
meunier noir, Catostomus commersoni.

6. UTILISATION DES BIOMARQUEURS HORMONAUX


6.1. RECOMMANDATIONS ET PROTOCOLES
POUR LUTILISATION SUR LE TERRAIN
Un biomarqueur est un changement mesurable au niveau molculaire,
biochimique, cellulaire, physiologique ou comportemental qui rvle
lexposition prsente ou passe dun organisme au moins une substance
chimique caractre polluant (Lagadic et al., 1997). Concernant la sur-
veillance de lenvironnement, les biomarqueurs peuvent tre utiles non
seulement pour lvaluation de lexposition aux toxiques prsents dans le
milieu, mais aussi pour lvaluation des effets de ces toxiques sur les orga-
nismes. Cependant, en ltat actuel des connaissances, ces biomarqueurs
ne peuvent tre considrs que comme des indicateurs de la prsence de
polluants dans le milieu et/ou dans les organismes, leur validation pour
prdire les effets sur les niveaux dorganisation plus levs ntant pas
encore vraiment tablie.
La premire tape de toute tude cotoxicologique, quel que soit le
biomarqueur utilis, est la slection de sites dchantillonnage permettant
de mettre en vidence des relations entre les concentrations des polluants
dans les compartiments abiotiques (eau, air, sol), la charge tissulaire de
ces contaminants dans les organismes que nous valuons et les effets sur
les paramtres mesurs (p. ex., biomarqueurs hormonaux). Plusieurs
approches peuvent tre utilises dans la slection : 1) chantillonnage dun
site en amont et dun site en aval dune source ponctuelle de pollution
(p.ex., usine de production de pte papier, voir Hontela et al., 1997) ; 2)
chantillonnage des sites situs le long dun gradient de contamination
(p. ex., Rouyn-Noranda et les lacs alentours, voir Laflamme etal., 2000 ;
Levesque et al., 2002, 2003 ; figure 4.4) ; 3) chantillonnage des organismes
et recherche de corrlation entre charges tissulaires et paramtres physio-
logiques, une approche utiliser avec les espces qui se dplacent et
effectuent des migrations. Les documents gouvernementaux rendent
souvent disponibles des donnes importantes sur la contamination des
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 187

cosystmes aquatiques, donnes qui peuvent tre utilises dans la slec-


tion des sites avant la campagne dchantillonnage. Des donnes de chimie
analytique sur les concentrations en polluants dans lenvironnement et
dans les organismes sont essentielles toute tude cotoxicologique. Des
biomarqueurs dexposition, telles les activits de lAChE (actylcholine
estrase) dans le systme nerveux ou le sang des animaux exposs aux
pesticides organophosphates ou carbamates, peuvent aussi complter la
caractrisation du profil de la contamination.
Une considration importante dans la slection des sites chan-
tillonner, en plus des gradients de la contamination, est la similarit des
caractristiques physicochimiques. Il est vident que de nombreux facteurs
(p. ex., la temprature, la disponibilit de la nourriture, le niveau deau)
peuvent varier entre les sites et influencer le biomarqueur. Il est de ce fait
essentiel de choisir des sites prsentant des caractristiques physico-
chimiques semblables, except les niveaux de contamination, afin de
faciliter linterprtation des variations des paramtres physiologiques
considres comme biomarqueurs dexposition. Les travaux avec les hor-
mones corticostrodes sont possibles si les facteurs tels que la saison
dchantillonnage (p. ex., t ou automne), lheure dchantillonnage dans
la journe (matin ou aprs-midi), le statut reproducteur des poissons
(sexuellement mature ou immature) sont contrls. Ces exigences sont
indispensables et doivent tre prises en compte pour ne pas biaiser linter-
prtation des rsultats obtenus. Il existe en effet des variations nycthm-
rales dans les concentrations plasmatiques de cortisol, et la temprature,
la photopriode et le statut de maturation sexuelle influencent la scr-
tion de cortisol chez les poissons (Audet et Claireaux, 1992 ; Pottinger et
al., 1995 ; Hontela, 1997).
Le choix de lespce sentinelle chantillonne afin dvaluer ltat
du milieu peut tre parfois difficile. Des connaissances dtailles de la
biologie de lorganisme, de son cycle reproducteur, ses cycles hormonaux,
variations nycthmrales et autres sont essentielles une juste interprta-
tion des rsultats. La grande majorit des donnes physiologiques ont t
obtenues en tudiant la truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss, ou le pois-
son rouge, Carassius auratus, deux espces souvent utilises en laboratoire
et rarement prsentes sur des sites pollus, la truite en raison de sa grande
sensibilit et le poisson rouge du fait quil nest pas une espce endmique
de lAmrique du Nord (Scott et Crossman, 1973).
Parmi les tests fonctionnels possibles, la stimulation lACTH ou le
confinement physique afin de maximiser la synthse en hormones corti-
costrodes et de faciliter ainsi la dtection de toute anomalie dans la
synthse de lhormone sont couramment utiliss.
188 cotoxicologie molculaire

6.2. AVANTAGES ET LIMITATIONS


La grande sensibilit des paramtres hormonaux est un avantage impor-
tant dans leur utilisation comme biomarqueurs. Nanmoins, il existe de
nombreuses interactions entre les diffrents systmes hormonaux, par-
ticulirement en ce qui concerne les corticostrodes et les hormones
thyrodiennes. De plus, les diffrents paramtres physiologiques de lorga-
nisme quel quil soit sont soumis des variations saisonnires, nycthm-
rales, etc., variations quil faut prendre en compte et interprter en relation
avec la biologie et lendocrinologie fondamentale de lorganisme avant
de pouvoir interprter les donnes obtenues sur le terrain.
La recherche de biomarqueurs a pour but dvaluer les risques
deffets long terme, rsultant de lexposition chronique, donc prolonge,
des polluants prsents des concentrations faibles dans lenvironnement.
Si les paramtres hormonaux tels que la scrtion de cortisol ont t dfinis
comme de bons biomarqueurs dexposition en laboratoire, il est en
revanche plus difficile de les utiliser pour valuer limpact des polluants
dans lenvironnement (contamination par plusieurs types de polluants,
niveaux dexposition diffrents suivant les espces [chane trophique en
particulier], mcanismes dadaptation physiologique, carts dans la dure
dexposition, etc.). Par consquent, lutilisation de biomarqueurs hormo-
naux ne peut se faire que par une approche multi-critres qui combine la
mesure de paramtres variables (cortisol, hormones thyrodiennes par
exemple) avec des paramtres dj tablis comme de bons biomarqueurs
dexposition (activit de lEROD et contamination par les hydrocarbures
aromatiques polycycliques par exemple), approche qui consiste en la
validation, indispensable, dun ou de plusieurs biomarqueurs. Il convient
donc de mesurer un maximum de paramtres de faon viter tout biais
dans linterprtation des rsultats. Lutilisation de biomarqueurs, quels
quils soient, impose donc beaucoup de prcautions. Il est notamment
essentiel et primordial de caractriser avec prcision les cosystmes
tudis (variation naturelle des facteurs cologiques, physicochimiques,
connaissances de la biologie de chaque espce). Un biomarqueur, hormonal
ou non, ne peut donc en aucun cas tre utilis comme outil unique pour
dtecter la prsence de polluants dans lenvironnement et pour dcrire
les effets sur les organismes vivants. Il sagit par consquent dutiliser
plusieurs biomarqueurs et situs diffrents niveaux dorganisation bio-
logique (molculaire, cellulaire, tissulaire). Nanmoins, lutilisation de
biomarqueurs comme outil de prdiction ouvre des perspectives davenir
importantes pour la recherche pour les annes venir.
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 189

7. PERSPECTIVES
Les donnes dj connues et retrouves dans la littrature sont essentielles
et utiles lextrapolation dautres espces que les poissons et amphi-
biens dj tudis. Il est de plus intressant dutiliser ces donnes comme
base pour tudier dautres systmes contamins par diffrents types de
polluants tels que les pesticides ou les hydrocarbures.
Ces tudes sont ncessaires afin damliorer les connaissances sur
les mcanismes daction des perturbateurs endocriniens ou dautres
toxiques pour tablir des liens de cause effet entre exposition et effets
sur la sant, dfinir ainsi des normes compatibles avec la sant physiolo-
gique optimale des organismes vivants dans les milieux perturbs par les
activits humaines et dvelopper de nouvelles technologies pour rduire
les missions dans leau ou lair dans un souci de prservation et de
maintien de lintgrit du biotope.

8. CONCLUSION
Lune des consquences dune dmographie mondiale en pleine expan-
sion et de laccroissement parallle des besoins dans les domaines de la
nutrition, de la sant et du dveloppement conomique a t laugmen-
tation remarquable de la production de lindustrie chimique (De Voogt,
1996). Plusieurs des substances utilises dans lindustrie ou lagriculture
se retrouvent dans lenvironnement et en particulier dans les milieux aqua-
tiques, ce qui ne va pas sans poser de srieux problmes environne-
mentaux. Lamlioration de la connaissance des effets cotoxicologiques
de ces substances au cours de la dernire dcennie a conduit restreindre,
voire interdire, lusage de certaines dentre elles avec la mise en vidence
de leurs effets persistants sur lenvironnement (Hargrave et al., 1992). La
recherche dans le domaine de lcotoxicologie doit cibler les liens de cau-
salit entre lexposition des polluants environnementaux dans le milieu
et les effets nfastes la sant afin dtablir des seuils sans effets pour ces
nombreuses substances chimiques utilises par nos socits. La recherche
mcanistique, qui vise lucider les mcanismes daction au niveau des
organes et des cellules cibles, gnre des donnes irrfutables et essentielles
pour lvaluation du risque environnemental.
Les biomarqueurs constituent des outils intressants pour la sur-
veillance de lenvironnement ; cependant, linterprtation des rsultats doit
tre faite avec prcaution notamment dans lvaluation dune atteinte ven-
tuelle des cosystmes. En effet, lun des principaux problmes qui se
posent dans lvaluation du risque reste lextrapolation des rsultats
190 cotoxicologie molculaire

obtenus sur un petit nombre dindividus la population entire et lco-


systme entier tant donn les variations intra- et interspcifiques qui
existent. La plupart des tudes ralises in situ montrent quil est difficile
de dtecter des modifications dactivit mtabolique ou enzymatique sur
un chantillonnage de faible effectif. Chez le poisson, des travaux prc-
dents ont en effet largement dmontr lamplitude des variations
individuelles (Roche et Bog, 1996). Ce type dtude fait appel, pour linter-
prtation des donnes, des analyses statistiques plus complexes qui ne
peuvent tre ralises quavec des chantillonnages plus importants pour
chaque groupe dindividus. Une approche multidisciplinaire runissant
des mthodologies propres lcotoxicologie, lendocrinologie et phy-
siologie fauniques, ainsi qu lcologie et la biochimie, est essentielle pour
une estimation valable des impacts de la pollution sur la sant des orga-
nismes exposs dans lcosystme. Les biomarqueurs hormonaux doivent
tre considrs comme des outils de dtection des effets sur la sant
qui nous permettront, dune part, de prendre des dcisions concernant
ltat de nos cosystmes et, dautre part, de nous fournir des infor-
mations prcieuses sur les processus et les mcanismes physiologiques
que les espces fauniques utilisent pour rpondre aux perturbations
environnementales.
Dfaillance de la synthse des hormones corticostrodes 191

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CHAPITRE

5
RTINODES
Biomarqueurs et base molculaire
deffets de substances toxiques

MONIQUE BOILY
Centre de recherche en toxicologie
de lenvironnement (TOXEN) et
Dpartement des sciences biologiques,
Universit du Qubec Montral

MARJOLAINE BISSON
Centre de recherche en toxicologie
de lenvironnement (TOXEN) et
Dpartement des sciences biologiques,
Universit du Qubec Montral

PHILIP A. SPEAR
Centre de recherche en toxicologie
de lenvironnement (TOXEN) et
Dpartement des sciences biologiques,
Universit du Qubec Montral
198 cotoxicologie molculaire

RSUM
Les rtinodes sont des composs dont la structure ressemble celle du rtinol et qui sont
forms partir des carotnodes acquis par le biais de la nourriture. Un certain nombre de
rtinodes, associs la vitamine A , sont responsables deffets biologiques ou sont des
prcurseurs de formes biologiquement actives. Puisque les animaux nont pas la capacit
de synthse de novo des rtinodes, le stockage de fortes concentrations est une stratgie
pour pallier des carences transitoires dues des facteurs environnementaux ou physio-
logiques. Les rtinodes sont essentiels une vaste gamme de fonctions dans lorganisme
comprenant divers aspects de la reproduction, du dveloppement de lembryon et de la
croissance. Une carence ou un excs en rtinodes ainsi que des effets sur le systme de
signalisation de lacide rtinoque peuvent occasionner des effets nfastes pour lorganisme.
La recherche complte ce jour dmontre que les contaminants de type hydrocar-
bures halognes polyaromatiques et hydrocarbures aromatiques polycyliques affectent
les rtinodes chez plusieurs groupes danimaux. Leffet le plus courant rside dans la
diminution des rtinodes stocks au niveau du foie. Cet effet est utilis comme
biomarqueur chez les oiseaux et poissons. Une extension de cet effet, le stockage/
mobilisation de rtinodes dans les ufs doiseaux, sert galement de biomarqueur. Une
relation directe de cause effet entre les contaminants et les rtinodes na pas t tablie.
Et bien que lactivit des enzymes LRAT et HER (responsables de lassimilation des rti-
nodes) soit affecte par des contaminants de type organochlor, lensemble des rsultats
nindique toujours pas de mcanisme daction probable.
Par ailleurs, des corrlations ngatives sont souvent repres entre les concentra-
tions hpatiques de rtinodes et les enzymes dpendantes du systme CYP450 (EROD,
AHH), ou linduction du CYP1A. Ces corrlations sont associes des organismes qui
subissent diffrents niveaux dexposition aux substances inductrices du CYP450 ; les plus
exposs ont les plus faibles concentrations de rtinodes. Ces corrlations nimpliquent
pas de relation de cause effet entre le CYP450 et le stockage de rtinodes. Cependant, le
systme CYP450 est capable de mtaboliser lacide rtinoque, une forme trs active, par
le biais de sa liaison avec les rcepteurs nuclaires RAR et RXR. Un tel changement pour-
rait amener de multiples effets dans diffrents types de cellules par la diminution dun
ligand de la voie de signalisation de lacide rtinoque et par la production de mtabolites
(p. ex., lacide 4-oxo-rtinoque) ayant aussi une grande affinit pour ces rcepteurs.
La concentration plasmatique de rtinol, ou de dhydrortinol pour certaines
espces, est le rsultat de plusieurs interactions homostatiques. Les effets des substances
toxiques sur ces formes de rtinodes sont difficiles interprter, mais quelques tudes de
terrain dmontrent des corrlations intressantes.
Nous prsentons deux projets de biosurveillance incluant les rtinodes qui
permettent de statuer sur leur utilisation comme biomarqueurs.
Rtinodes 199

1. INTRODUCTION
Les rtinodes sont des composs essentiels plusieurs fonctions biolo-
giques de base : diffrenciation cellulaire, croissance, dveloppement,
reproduction et vision. Un excs ou un manque de rtinodes peut entraner
des consquences nfastes pour un organisme et, dans certains cas, com-
promettre sa survie. Certaines formes de rtinodes peuvent avoir des effets
nuisibles ; par exemple, le rtinol peut tre cytotoxique en endommageant
les membranes cellulaires et lacide rtinoque a des pouvoirs tratognes.
En contrepartie, le rtinol est la forme de transport sanguine privilgie
et lacide rtinoque est indispensable au dveloppement embryonnaire.
Rcemment, on a mis en vidence le rle jou par les rtinodes dans la
migration des cellules lors de la formation du tube et de la crte neurale
(Pijnappel et al., 1993 ; Maden et al., 1998) et dans le patron des structures
embryonnaires par leur activation des gnes Hox (Marshall et al., 1996).
Les rtinodes sont donc des composs physiologiques essentiels et, parce
que leur concentration est critique toutes les tapes de la vie, le systme
de signalisation rtinode est quip denzymes et de rcepteurs spci-
fiques, primordiaux sa rgulation.
Traditionnellement, les rtinodes ont fait lobjet de nombreuses
tudes dans le domaine de la nutrition et des revues exhaustives concer-
nant leurs fonctions et leurs proprits ont t publies (Goodman et
Blaner, 1984 ; Underwood, 1984 ; Blomhoff et al., 1991 ; Barua et Furr, 1998).
Utiliss dans des programmes de biosurveillance, les rtinodes se sont
avrs sensibles la prsence de contaminants environnementaux. Dans
les premires tudes de terrain impliquant des biomarqueurs et des
colonies doiseaux des Grands Lacs, les rtinodes se sont avrs efficaces
pour rvler les conditions environnementales de cet cosystme et ltat
de sant des populations doiseaux. Depuis, les recherches se sont tendues
dautres cosystmes et dautres espces animales. Combine une
technologie qui ne cesse de samliorer, la recherche sur les rtinodes est
en plein essor et la littrature abonde pour faire tat des aspects physiolo-
giques, cellulaires et molculaires, continuellement remis jour.
Les pages qui vont suivre rsument les principales connaissances se
rattachant aux rtinodes dans des conditions dhomostasie et lors de
dsquilibres provoqus par des substances toxiques. Nous accordons une
attention particulire lutilisation des rtinodes comme biomarqueurs
tout en faisant tat des recherches les plus rcentes dans le domaine.
200 cotoxicologie molculaire

2. BIOCHIMIE, MTABOLISME ET ACTION MOLCULAIRE


2.1. ABSORPTION, MTABOLISME,
STOCKAGE ET TRANSPORT DES RTINODES MAJEURS
Les rtinodes sont des molcules dont la structure sapparente au rtinol,
mieux connu sous le nom de vitamine A . De faon gnrale, les mol-
cules de rtinodes consistent en une chane de carbones dont les extr-
mits sont occupes par un cycle mthyl et un groupe fonctionnel
(figure5.1). Les rtinodes peuvent tre biologiquement actifs (rtinol,
acide rtinoque) ou constituer une rserve dans diffrents tissus. La
rserve la plus importante se trouve au niveau du foie, o les rtinodes
sont estrifis ; environ 90 % de ces esters sont sous forme de palmitate de
rtinol chez les mammifres.

Figure 5.1
Structure gnrale des rtinodes

Les rtinodes sont issus de prcurseurs, des carotnodes, que la


majorit des vertbrs assimilent par le biais de la nourriture. Faute de
pouvoir synthtiser la vitamine A de novo, les animaux peuvent stocker
des quantits relativement leves de rtinodes dans le foie, ce qui leur
permet de compenser les fluctuations dues la disponibilit de la nourri-
ture. La vitamine A ainsi stocke peut tre mobilise de faon ponctuelle
pour rpondre certaines exigences physiologiques (besoins accrus pour
la formation des ufs, par exemple) ou un apport nutritionnel inad-
quat (dite associe lhivernage ou la migration).
Selon Underwood (1984) les sources les plus importantes de
rtinodes pour les animaux sont les isoformes ,  et  de la carotne
ainsi que la cryptoxanthine. Les carotnodes sont des provitamines qui
peuvent tre converties en rtinodes (figure 5.2). Dans la muqueuse in-
testinale, lenzyme 15,15'-dioxygnase peut convertir le -carotne en
rtinaldhyde, qui est ensuite rduit en rtinol sous laction rversible de
la rtinaldhyde rductase. Plusieurs xanthophylles naturelles nont pas
la structure molculaire ncessaire pour tre scindes sous laction de cette
enzyme et, par consquent, ne sont pas reconnues comme des provita-
Rtinodes 201

Figure 5.2
Schma gnral des interactions concernant les rtinodes

mines. Par exemple, la lycopne, la zaxanthine et la lutine, qui sont des


carotnodes que lon retrouve en abondance, ne produisent pas de
rtinodes biologiquement actifs (Underwood, 1984). Chez le poisson, du
rtinol peut tre gnr partir des carotnodes oxygns comme
lastaxanthine, la cantaxanthine et lisozanthine (Gross et Budowski, 1966 ;
Barua, 1978 ; Olson, 1983, 1989). En plus du rtinol et des esters de rtinol,
on retrouve galement chez le poisson du dhydrortinol et des esters
drivs du dhydrortinol stocks dans le foie. Ceci est d un mtabo-
lisme spcialis sur la lutine, lanhydrolutine et possiblement dautres
carotnodes. Des tudes nutritionnelles dmontrent quil existe des
variations interspcifiques considrables dans les voies mtaboliques de
labiosynthse des rtinodes. Par exemple, chez le poisson xiphophore,
Xiphophorus variatus, les rtinodes de type rtinol sont les plus abondants,
tandis que les rtinodes de type dhydrortinol sont prdominants chez
le guppy, Lebistes reticulates, aprs labsorption de rgimes riches en
-carotne (Gross et Budowski, 1966). Goswami et Barua (1981) ont class
202 cotoxicologie molculaire

les poissons deau douce de lInde selon la dominance du rtinol ou du


dhydrortinol dans les tissus sans tre capables de spcifier si les diff-
rences interspcifiques observes taient dues des caractristiques bio-
chimiques gntiquement dtermines ou une alimentation diffrente
en termes de carotnodes.
Lors de labsorption par les cellules intestinales, le rtinol est est-
rifi par les enzymes LRAT (Lcithine rtinol acyltransfrase) ou ARAT
(Acyl-coenzyme A rtinol acyltransfrase) et les esters ainsi forms sont
incorpors dans les chylomicrons. Ceux-ci sont transports au foie par le
systme lymphatique o ils sont stocks dans les hpatocytes et, dans une
plus grande proportion, dans les cellules toiles. Dautres organes
peuvent galement emmagasiner des rtinodes : les reins, les intestins et
les poumons pour ne nommer que ceux-l. Ganguly (1989) a suggr que
le hareng, le saumon et la truite (genre et espces non spcifis) peuvent
stocker une plus grande quantit de vitamine A dans leurs tissus visc-
raux, plus particulirement dans le caecum pylorique, que dans le foie.
De la mme faon, la partie antrieure de lintestin de lomble de fon-
taine, Salvelinus fontinalis, et de lesturgeon jaune, Acipenser fulvescens, a
t identifie comme tant un site de stockage du palmitate de rtinol et
du palmitate de dhydrortinol (Ndayibagira et al., 1995).
Selon les besoins de lorganisme, les esters du rtinol peuvent tre
hydrolyss par une enzyme comme la HER (hydrolase des esters du
rtinol) et atteindre les cellules cibles par le biais de la circulation san-
guine ; le rtinol est alors li une protine de transport (Retinol-Binding
Protein ou RBP) pour former le complexe rtinol-RBP, lui-mme li la
transthyrtine (TTR). Lorsquil atteint un site cible, le rtinol se dissocie
des protines de transport, entre dans la cellule et se lie une autre pro-
tine intracellulaire (Cellular Retinol-Binding Protein ou CRBP). Il peut tre
transform en rtinaldhyde et ensuite en acide rtinoque. qui a son
propre transporteur cytosolique (Cellular Retinoic Acid-Binding Protein ou
CRABP). La production dacide rtinoque intracellulaire confirme lhypo-
thse que la rgulation de lactivit de la vitamine A est dtermine en
partie par le mtabolisme de cette forme trs active dans les cellules cibles
(voir les sections 2.2 et 2.3).
Pour passer de la circulation sanguine une forme de rserve et,
inversement, tre mobiliss du foie vers une distribution priphrique,
les rtinodes sont tour tour hydrolyss et estrifis. Harrison (1993) a
publi une revue des principales activits dhydrolisation des esters de
rtinol. Des hydrolases desters de rtinol (HER) ont t identifies dans
le pancras, les poumons et les tissus oculaires, mais les activits dhydro-
lyse dans le foie et les intestins sont davantage documentes.
Rtinodes 203

La raction dhydrolyse, qui consiste couper la longue chane des


esters, nest pas spcifique aux hydrolases ; in vitro, des lipases et des car-
boxylases peuvent catalyser la raction. Des efforts ont toutefois t con-
sentis pour identifier et caractriser lactivit de la HER et ce jour,
plusieurs hydrolases ont t rpertories selon linfluence des sels biliaires
sur leur activit. Dautres facteurs jouent un rle dans lidentification de
ces isoenzymes : la quantit et la nature du substrat, le tissu ou les frac-
tions cellulaires utiliss, la temprature, le pH et mme la concentration
des protines de transport, notamment la forme libre de CRBP (apo-CRBP).
Si le manque de spcificit caractrise lhydrolyse des esters de
rtinol, lestrification, en revanche, se limite deux enzymes pour assurer
la conversion du rtinol sous forme desters : la LRAT et lARAT. Jusqu
maintenant, lactivit ARAT a t associe au rtinol libre alors que lacti-
vit de la LRAT se rapporte au rtinol li sa protine de transport (RBP-
CRBP). La plupart des tudes impliquant lenzyme LRAT ont t effectues
chez le rat, au niveau du foie et des intestins (Levin et al., 1987 ; Ong et al.,
1988 ; Herr et Ong, 1992). Les tests in vitro se ralisent pH neutre ou
alcalins et lemploi dinhibiteurs spcifiques permet de circonscrire
lactivit de la LRAT, qui, contrairement lenzyme ARAT, nest pas
dpendante dun donneur acyl .
Parce que la LRAT semble implique dans la rgulation de la vita-
mine A, plusieurs recherches lui sont consacres. Dernirement, cette
enzyme a t identifie et caractrise dans les microsomes hpatiques de
lomble de fontaine (Ndayibagira et Spear, 1999) et dans le sac vitellin de
la caille japonaise (Boily, 2000). Lactivit de la LRAT pourrait tre
influence par lhormone thyrodienne T3 (Matsuura et al., 1996) et par
lexpression de lacide rtinoque (Matsuura et Ross, 1993 ; Shimada et al.,
1997 ; Ross etal., 1997). Certains contaminants organochlors peuvent avoir
un impact sur les activits dhydrolisation et destrification associes aux
rtinodes (voir la section 2.1). Des substances endognes peuvent ga-
lement influencer le taux dhydrolisation. Entre autres, on identifie des
substrats comme le rtinol pour lactivit de la LRAT (Randolph et Ross,
1991) et lacide rtinoque (formes cis et all trans) pour lactivit de la HER
(Ritter et Smith 1996). Enfin, un effet inhibiteur sur la HER a t associ
aux vitamines E et K1 (Napoli etal., 1984 ; Napoli et Beck, 1984).
Chez les vertbrs ovipares, le vitellus des ufs constitue un autre
site de stockage des rtinodes. Les oiseaux et les reptiles pondent des
ufs dits clidoques , cest--dire des ufs dont la coquille dure isole
lembryon du monde extrieur et contient, ds la ponte, tous les lments
ncessaires son dveloppement. Chez les oiseaux, les ufs tlolcithes
sont trs riches en lments nutritifs et le jaune occupe la majeure partie
de luf (Needham, 1963 ; Hamilton, 1965). Dans ce jaune se trouvent le
204 cotoxicologie molculaire

carotne et les rtinodes dposs par la femelle. Dans luf non incub,
le rtinol est la forme de rtinode dominante, mais avec lincubation, il
tend diminuer, alors que dans les 10 jours prcdant lclosion, le pal-
mitate de rtinol augmente (Parrish et al., 1951 ; Joshi et al., 1973). Parce
que les esters de rtinodes augmentent avec lincubation, Joshi et al. (1973)
ont mis lhypothse que les esters pouvaient tre synthtiss dans le sac
vitellin et transports dans le foie de lembryon pour y tre emmagasins.
Il se peut galement que les esters soient transports dans lintestin et
suivent ensuite la voie de transport connue pour les mammifres : hydro-
lyse dans le lumen intestinal, r-estrification du rtinol dans les
entrocytes et transport vers le foie par le biais des chylomicrons. Cette
dernire possibilit implique un sytme lymphatique performant. Or, chez
les oiseaux, du moins les adultes, le systme lymphatique est trs peu
dvelopp (Burley et Vadehra, 1989). Et en acceptant lide quil en soit
autrement pour lembryon, lhypothse mise par Joshi et al. (1973) pour-
rait expliquer labsorption et le mtabolisme des rtinodes lors de la der-
nire partie du dveloppement de loiseau, quand le foie est suffisamment
form pour stocker des lipides. Des tudes ralises par Noble (1987) sur
lembryon de poulet ont clairement dmontr que les lipides sont absorbs
un rythme soutenu, jusqu 0,1 g par jour, pendant la dernire semaine
dincubation. Ses recherches ont par ailleurs prouv que les lipides taient
bel et bien estrifis dans le sac vitellin pour tre retourns dans le vitellus.
Les rtinodes, de nature lipophile, pourraient donc suivre un patron
similaire.
Ces diffrents lments fournissent des renseignements importants
sur labsorption et le transport des rtinodes pour lembryon doiseau,
vers la fin de son dveloppement. Mais le dbut de la vie embryonnaire,
caractris par une grande diffrenciation cellulaire, ncessite un apport
soutenu de rtinodes biologiquement actifs. Or, aucune contribution scien-
tifique na t en mesure dclairer la manire utilise par le jeune embryon
doiseau pour sapprovisionner en rtinodes.
Une ou deux possibilits retiennent toutefois lattention. Au dbut
de lembryognse, certaines structures sphriques du vitellus appeles
granules sont utilises pour lobtention de certains lments nutritifs de
base. Dans le vitellus duf de la poule domestique, Gallus sp., on a pu
identifier que les granules sont constitues, entre autres, de lipides, de
lipoprotines, de lipovitellines  et  et de lcithine. Leur structure laisse
supposer un libre accs aux diffrents lments qui les constituent pour
une utilisation immdiate. Les carotnodes du vitellus peuvent tre uti-
liss de manire similaire et constituer, pour lembryon, une source de
rtinol par la mtabolisation du -carotne. Avec lincubation, le dve-
loppement du sac vitellin saccentue et cette structure assure le lien entre
Rtinodes 205

le vitellus (source dlments nutritifs) et lembryon. Fortement vascu-


larise sur la couche externe, la couche interne est, quant elle, circon-
volutionne pour maximiser un contact avec le vitellus. Le sac vitellin
assure des fonctions qui seront plus tard attribues aux organes comme
le foie, lintestin et lestomac, en plus dtre le lieu de synthse de plu-
sieurs produits impliquant la prsence de nombreuses enzymes, y com-
pris des enzymes inductibles : ladnosine daminase, laldrine poxydase,
lECOD (thoxycoumarine-O-dthylase) et lEROD (thoxyrsorufine-O-
dthylase) (De Boeck et al., 1975 ; Henrich-Hirsch et al., 1990). Rcem-
ment, des enzymes propres au systme des rtinodes ont t caractrises
dans le sac vitellin de la caille japonaise au sixime jour dincubation
dmontrant ainsi quun systme de rgulation des rtinodes est prsent,
et ce, tt dans le dveloppement (Boily, 2000).
Ce type de recherche se rapportant lutilisation des rtinodes in
ovo remplit un double mandat. Dabord, en contribuant lacquisition de
connaissances dans un domaine encore obscur de lembryologie. Ces
informations permettent, par la suite, une meilleure interprtation des
rsultats obtenus lors de lutilisation des rtinodes de luf comme
biomarqueurs.

2.2. MTABOLISME DE LACIDE RTINOQUE ET FORMES APPARENTES


Lacide rtinoque est form partir de rtinaldhyde par des dhydro-
gnases daldhyde ou par les isoformes du cytochrome P450, les CYP1A1
et CYP1A2 (Duester, 1996). Ces oxydations sont essentiellement irrver-
sibles. Puisque les concentrations intracellulaires ncessaires au dclen-
chement des rponses biologiques sont trs faibles, dans la gamme de
quelques nanomolaires, on peut imaginer une rgulation trs prcise entre
la formation et le mtabolisme de lacide rtinoque. Ceci peut impliquer
la protine de liaison CRABP, la concentration de lacide rtinoque et des
isomrases (interconversions entre les formes all-trans, 9-cis et 13-cis) ;
toutefois, nous navons quun aperu rudimentaire de ces interactions.
Quant au mtabolisme de lacide rtinoque, la recherche se concentre
sur deux voies : lhydroxylation/oxydation inities par le systme
multifonctionnel dpendant du cytochrome P450 terminal et la conjugaison
par lUDP-glucuronyltransfrase. Dans leurs publications cls, Roberts et
al. (1979 ; 1980) ont rvl que les microsomes hpatiques et intestinaux
de cobaye, incubs en prsence de NADPH, doxygne et dacide
rtinoque, formaient les acides all-trans-4-hydroxy- et all-trans-4-oxo-
rtinoque. Des inhibiteurs du cytochrome P450 empchaient la forma-
tion de ces mtabolites, tandis que les inducteurs, phnobarbital,
3-mthylcholanthrne et mme le substrat, augmentaient cette activit.
206 cotoxicologie molculaire

Roberts et al. (1979) ont pu dmontrer que le mtabolite 4-hydroxy est le


produit direct du cytochrome P450 et quil est ensuite transform en acide
all-trans-4-oxo-rtinoque en prsence de NAD ou de NADP par une rac-
tion indpendante du cytochrome P450. Deux dcennies plus tard, on sait
que lhydroxylation de lacide all-trans-rtinoque est catalyse par cer-
taines isoformes des cytochromes P450 cods par des gnes qui se
retrouvent parmi les sous-familles suivantes : CYP1A, CYP2A, CYP2B,
CYP2C, CYP2D, CYP2E, CYP2G, CYP3A et CYP26 (Leo et al., 1989 ; Roberts
et al., 1992 ; Martini et Murray, 1993 ; Muindi et Young, 1993 ; Abu-Abed
et al., 1998 ; Nadin et Murray, 1999). De plus, lisoforme P450RAI de la
famille CYP26 a t clon chez le danio zbr et est le seul spcifiquement
identifi chez le poisson capable de mtaboliser lacide all-trans-rtinoque
(White et al., 1996). Ces expriences in vitro ont dmontr que le mta-
bolite principal est lacide all-trans-4-hydroxyrtinoque avec la formation
de quantits infrieures dautres mtabolites tels que le 14-hydroxy et le
18-hydroxy.
Lhydroxylation de lacide all-trans-rtinoque et loxydation de
lacide all-trans-4-hydroxyrtinoque par les microsomes hpatiques ont
t dmontres pour la truite arc-en-ciel et lomble de fontaine (Gilbert
etal., 1995 ; Boyer et al., 2000), tandis que seule lhydroxylation a t dcele
dans le cas de lesturgeon jaune (Doyon et al., 1999). Outre les poissons, le
mtabolisme oxydatif de lacide rtinoque a t constat chez la caille
japonaise (Bilodeau 1996), le ouaouaron, Rana catesbeiana (K. Boucher,
Universit du Qubec Montral, rsultats non publis) et plusieurs
espces de mammifres.
Lacide all-trans-rtinoque incub dans une suspension microsomale
hpatique avec lacide uridine diphosphoglucuronique est transform en
all-trans-rtinoylglucuronide (RAG) (Lippel et Olson, 1968). Cette rac-
tion est catalyse par luridine diphosphoglucuronyltransfrase (UDP-GT).
Cependant, les isoformes de cette enzyme responsables de la conjugaison
avec lacide rtinoque nont pas t identifis. La formation de RAG a
aussi t dmontre dans les microsomes de lintestin et du rein chez les
mammifres (Frolik, 1984) et dans les microsomes hpatiques de lomble
de fontaine (Boyer et al., 2000).

2.3. INTERACTIONS AU NIVEAU DES RCEPTEURS NUCLAIRES


Lactivit biologique associe la vitamine A se produit suite aux liaisons
entre ligands et rcepteurs nuclaires. Depuis lidentification des premiers
rcepteurs de lacide rtinoque (Gigure et al., 1987 ; Petkovich et al., 1987)
ils ont t classs, selon leur homologie, comme membres de la
superfamille des rcepteurs strodiens-thyrodiens (Evans, 1988). Deux
Rtinodes 207

sries de rcepteurs existent : les RAR ou rcepteurs de lacide rti-


noque et les RXR ou rcepteurs X des rtinodes . Chaque srie com-
prend plusieurs types (, , ), et chacun de ces types comprend plusieurs
isoformes ; au total, on compte 14 rcepteurs diffrents (Chambon, 1996).
Les RAR lient principalement les acides all-trans et 9-cis-rtinoque, tandis
que les RXR lient davantage lacide 9-cis-rtinoque. Cependant, une
gamme de rtinodes, y compris lacide all-trans-4-oxo-rtinoque et lacide
all-trans-3,4-dhydrortinoque, dmontrent la capacit de lier avec haute
affinit les rcepteurs et de produire les effets typiquement associs la
vitamine A (Beckett et Petkovich, 1999). Une fois lis par leurs ligands, les
rcepteurs RAR et RXR forment les htrodimres RAR:RXR qui peuvent
se lier lADN et, plus spcifiquement, aux lments de rponse de lacide
rtinoque (retinoic acid response elements ou RARE) des gnes cibles.
Linfluence sur la transcription gntique peut tre une activation ou une
rpression : la fixation du complexe ternaire (RAR-RA-RXR) sur les RARE
en position 5' induit la transcription tandis que sa fixation sur les RARE
en position 3' la rprime. Il faut noter que la formation des homodimres
RXR:RXR est aussi possible et que les rcepteurs sans ligands peuvent
lier lADN, mais la signification des ces interactions in vivo nest toutefois
pas vidente.
La multiplicit deffets biologiques, ou effets plotropiques , de la
vitamine A (voir section 2.4) sexplique par le grand nombre de combi-
naisons possibles entre les ligands, les isoformes de RAR et les isoformes
de RXR. La distribution des isoformes des rcepteurs peut varier en
fonction du tissu et du stade de dveloppement de lorganisme, mais les
RXR semblent bien conservs entre lamphibien, le poisson, loiseau et le
mammifre (Beckett et Petkovich, 1999). Ces chercheurs ont dmontr que
les fonctions mmes des RXR sont trs semblables chez le poisson et le
mammifre, ce qui suggre limportance de la signalisation des rtinodes
au cours de lvolution des vertbrs.
Le nombre disoformes des rcepteurs et le nombre de ligands
potentiels se distinguent des hormones connues, comme lestrogne, qui
na que deux rcepteurs. Par contre, les interactions sont encore beaucoup
plus complexes dans le cas des rtinodes. Les htrodimres peuvent se
former entre les RXR et autres rcepteurs (p. ex., le rcepteur de lhor-
mone thyrodienne, TR) avec leurs ligands respectifs (p. ex. : le triiodo-
thyronine, T3 ) (Chambon, 1996). Dans plusieurs cas, tel que celui de
lhormone thyrodienne, lhtrodimre ainsi form (9-cis-AR+RXR:TR+T3)
peut lier llment de rponse de lhormone avec une plus grande affinit
que le complexe TR+T3 seul. Donc, le RXR peut coordonner lexpression
des gnes impliqus dans la signalisation de lacide rtinoque et celle de
208 cotoxicologie molculaire

plusieurs autres facteurs (p. ex., hormones thyrodiennes et strodiennes,


vitamine D3, facteur de prolifration des peroxisomes, facteur de
croissance, cholestrol) (Chambon, 1996 ; Beckett et Petkovich, 1999).
Trs peu de publications portent sur leffet dun contaminant
environnemental sur les rcepteurs. Harmon et al. (1995) ont dmontr
que le mtabolite acide mthoprne, un produit de dgradation du pesti-
cide mthoprne, est capable de lier et dactiver les rcepteurs mamma-
liens RXR, . Cependant, ces effets ont t produits aux concentrations
relativement leves de 105 104 M, tandis que laffinit de lacide 9-cis-
rtinoque est nettement plus forte pour les RXR 108 M (Mangelsdorf et
al., 1994). Suite aux rsultats de Harmon et collgues, plusieurs groupes
de recherche ont propos que les malformations chez les amphibiens pou-
vaient sexpliquer par un tel mcanisme. Cependant, ni une gamme de
concentrations de mthoprne, ni le mthoprne irradi avec une lumire
ultraviolette afin de produire lacide mthoprne, nont caus des malfor-
mations chez la grenouille lopard, Rana pipiens (Ankley et al., 1998). Des
fractions deffluents dusines de ptes et papiers ainsi que le 2,3,7,8-TCDD
diminuent lexpression gntique induite par lacide rtinoque (Weston
et al., 1995 ; Scoff et Ankley, 2002).

2.4. ASPECTS NUTRITIONNELS DE LA VITAMINE A ET EFFETS


DUN EXCS EN ACIDE RTINOQUE SUR LEMBRYON
La vitamine A est obtenue par la nourriture sous forme de rtinodes et
de carotnodes. Les rtinodes, auxquels les effets biologiques de la
vitamine A sont attribus, se retrouvent uniquement dans les aliments
dorigine animale (p. ex. : foie, rein). Les carotnodes sont des antican-
crignes connus comme des antioxydants naturels diminuant les radi-
caux libres qui endommagent lADN (Davison et al., 1993 ; Lo et al., 1993).
Les carotnodes sont prsents principalement dans les vgtaux, mais
aussi chez certains invertbrs. Selon la voie biochimique, une molcule
de -carotne produirait une molcule de rtinaldhyde et ensuite du
rtinol (figure 5.2). Cependant, selon Sommer (1995), il faudrait environ six
fois plus de -carotne pour obtenir le mme effet biologique que le rtinol
parce que les carotnodes se transforment et sabsorbent moins bien.
Les animaux insectivores, tels que plusieurs espces doiseaux,
acquirent leur vitamine A par les carotnodes concentrs dans lhmo-
lymphe et dans le tgument des insectes sous forme dastanxanthine. Chez
les poissons planctivores et insectivores, les sources de vitamine A com-
prennent le zooplancton et certaines larves aquatiques. Les crevettes,
crabes et homards renferment de lastaxanthine dans leurs tguments
(Moore, 1957). Grangaud et al. (1949) ont observ, plusieurs reprises,
Rtinodes 209

des crevettes demi digres et compltement dcolores dans le tractus


digestif des merluches (Merluccius vulgaris) en Mditerrane. Lutilisation
de lastanxanthine, qui est le pigment carotnoque responsable de la
coloration des crustacs, servirait probablement la synthse de la vita-
mine A chez ce poisson. Christiansen et al. (1994) ont dmontr que
lastaxanthine est essentielle aux alevins de saumon de lAtlantique, Salmo
salar, au dbut de leur alimentation.
Lors dun niveau trop lev de vitamine A dans lorganisme, des
mcanismes biochimiques sactivent pour retrouver un niveau normal. Il
y a rduction de labsorption de vitamine A, une augmentation de son
oxydation et de son excrtion biliaire, fcale et urinaire (Olson, 1994). Par
contre, comme tout systme a ses limites, des carences ou des excs
peuvent survenir. Chez lanimal, un dbalancement au niveau de ces
formes, est associ plusieurs types danomalies.
Les symptmes dune dficience en vitamine A sont connus depuis
des milliers dannes. Dj, quelque 1550 ans av. J.C., les gyptiens trai-
taient les problmes de ccit, associs une carence en vitamine A, avec
des compresses dextrait de foie de buf broy sur les yeux (Wolf, 1996).
Malgr des connaissances de plus en plus prcises sur les mcanismes
biochimiques et molculaires de la vitamine A dans lorganisme, les pro-
blmes relis sa dficience sont encore trs nombreux tre observs
chez les humains et les animaux.

Effets dune carence (hypovitaminose)


Les effets dune carence en vitamine A risquent dapparatre davantage
chez les jeunes individus qui nont pas eu le temps demmagasiner des
concentrations importantes de rtinodes ; un adulte auparavant bien
approvisionn en vitamine A peut survivre longtemps en mobilisant ses
rserves de rtinodes sans dmontrer de symptmes de carence. Presque
tous les organes ou tissus peuvent tre affects par une carence en
rtinodes lors du dveloppement de lembryon. Le cerveau postrieur,
la vue, loue, plusieurs organes ou tissus drivant de la crte neurale, les
structures crnio-faciales et pharyngiennes, la glande thyrode et les para-
thyrodes requirent diffrentes concentrations de vitamine A lors dune
certaine priode de lembryogense (Luo et al., 1996 ; Clagett-Dame et
Plum, 1997 ; Maden, 1999 ; Ross et al., 2000 ; Wendling et al., 2000). Une
augmentation de lapoptose et une altration de la migration des cellules
de la crte neurale seraient responsables des anomalies attribues une
carence en vitamine A (Maden, 1999). On peut galement noter que les
carences en rtinodes peuvent entraner la mortalit embryonnaire, ce
qui vient masquer la manifestation de ces malformations.
210 cotoxicologie molculaire

Les oiseaux ont fait lobjet de recherches dtailles sur les effets dune
carence en vitamine A. Parmi les symptmes les plus importants on cons-
tate des effets au niveau de la vue, de la croissance osseuse, de la repro-
duction et du maintien des tissus pithliaux (Thompson, 1976). Cet auteur
a mme attribu plusieurs effets dhypovitaminose A des manques de
diffrenciation et de fonctions des cellules pithliales comme la krati-
nisation de lpithlium des voies respiratoires, alimentaires et urogni-
tales, et des glandes salines et lacrymales pour ne nommer que celles-l.
Un apport nutritionnel inadquat en vitamine A affecte plusieurs aspects
de la reproduction chez les oiseaux, y compris des caractristiques secon-
daires sexuelles, le poids des testicules, la spermatogense, la ponte des
ufs, la taille des ufs, la survie des embryons, le temps dincubation et
lclosion. Un supplment dacide rtinoque peut contrer les effets de
carence, en gnral, et mme les effets de la dgnrescence testiculaire
observe chez des oiseaux dficients en vitamine A (Thompson, 1976).
Quelques tudes par Zile et ses collaborateurs portent sur les effets dune
carence alimentaire en vitamine A sur le dveloppement cardiovasculaire
des cailles japonaises, Coturnix coturnix japonica, lors de lembryogense.
Dans 75 % des cas, une carence cause une asymtrie cardiaque. De plus, il
est propos que cest la forme biologiquement active, all-trans acide
rtinoque, qui intervient directement dans le dveloppement cardio-
vasculaire lors des premires 22 28 heures de lembryogense des oiseaux
(Dersch et Zile, 1993 ; Zile et al., 1998).
Peu dtudes portent sur le rle de la vitamine A chez les tlostens.
Selon Taveekijakarn et al. (1994), une carence en vitamine A dans la dite
du cherry salmon, Oncorhynchus masou, a dmontr une diminution de la
croissance, une dpigmentation cutane, un museau tronqu, des hmor-
ragies au niveau des nageoires et une anmie svre. Les observations
microscopiques ont rvl diffrentes altrations telles que la dgnration
du tissu squelettique et des fibres musculaires cardiaques, latrophie et la
ncrose du parenchyme hpatique. Ces effets ont diminu ou disparu suite
ladministration dune dite complte. De jeunes alevins qui ont t
nourris avec un rgime dficient en vitamine A ds le tout dbut de leur
alimentation ont dmontr une croissance ralentie, des dbuts ddmes
et des lsions cornennes avec dgnration de la rtine. Toutefois, ces
observations nont pas t notes chez ceux plus gs nourris avec la mme
dite dficiente mais qui avaient pralablement bnfici dune nourri-
ture quilibre (Poston et al., 1977).
Chez les mammifres, Underwood (1984) a identifi comme symp-
tmes les plus importants la susceptibilit linfection, la perte dapptit,
llvation de la pression du fluide crbrorachidien et la diminution du
taux de croissance. Les effets sur la reproduction des mammifres
Rtinodes 211

comprennent linhibition de la spermatogense, lincapacit maintenir


limplantation, rsultant en avortements ou fausses couches, la rsorp-
tion du ftus et la kratinisation vaginale accompagne dune suscepti-
bilit accrue linfection. Une carence aigu en vitamine A est associe
linhibition du cycle stral. Chez les mammifres, un supplment dacide
rtinoque peut rtablir plusieurs symptmes causs par une carence en
vitamine A, lexception de la vue et de la reproduction.

Effets dun excs (hypervitaminose)


Les excs de vitamine A causent des symptmes caractriss, en gnral,
par la fragilit des os, des lsions cutanes, des malformations, une perte
de poids et linhibition de la croissance (Thompson, 1976 ; Kamm et al.,
1984).
Chez des juvniles de truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss, les
signes de toxicit dus une hypervitaminose A se manifestent par une
diminution de croissance, une augmentation de la mortalit, la ncrose
des nageoires ainsi quun foie dune couleur jauntre. Suite une dite
enrichie en vitamine A, celle-ci augmente dans le foie en mme temps
quon y observe une diminution de la concentration de fer (Hilton, 1983).

Effets dun excs en acide rtinoque sur lembryon


Au cours du dveloppement, le systme de signalisation de lacide
rtinoque dclenche la transcription gntique des gnes Hox responsables
du patron axial et de la polarit antro-postrieure des membres chez les
vertbrs (Hofmann et Eichele, 1994 ; Tabin, 1995 ; Lu et al., 1999 ; Stratford
et al., 1999 ; Ross et al., 2000). Par exemple, au niveau du bourgeon des
membres, un gradient dacide rtinoque assure le patron des doigts. Un
excs en acide rtinoque provoque labsence, la duplication ou lorienta-
tion anormale des phalanges (Eichele et al., 1985 ; Sundin et Eichele, 1992).
Le dveloppement du patron morphologique du cerveau est aussi sous
rgulation du systme de signalisation de lacide rtinoque, et les
concentrations lgrement en excs causent des malformations crnio-
faciales. Ces effets sont produits chez les mammifres, les oiseaux, les
amphibiens et les poissons (Morris-Kay et al., 1991 ; Sive et al., 1990 ; Hill
et al., 1995 ; Tabin, 1995 ; Alexandre et al., 1996 ; Zhang et al., 1996 ;
Vandersea et al., 1998).
Le parallle entre les symptmes de carence ou dexcs en vitamine
A et les effets constats dans les populations fauniques contamines par
les substances toxiques mrite une considration particulire. Un affai-
blissement du systme immunitaire a t associ la mortalit accrue dans
plusieurs populations de mammifres marins qui ont subi de fortes
expositions aux substances toxiques. De plus, la diminution du taux de
212 cotoxicologie molculaire

reproduction, les malformations, la frquence des cancers et des lsions


dermiques peuvent tre associes aux dsquilibres en rtinodes chez les
mammifres marins (voir la section 3.2). Dans le cas des oiseaux, les effets
sur la reproduction, la mortalit des embryons et les malformations crnio-
faciales (p. ex., le bec-crois) sont les effets majeurs constats galement
lors dune carence (voir les sections 3 et 4.1). Chez les poissons et les amphi-
biens, les problmes de reproduction et les malformations (surtout
labsence ou la multiplication des nageoires et des pattes, ainsi que les
malformations crnio-faciales chez les poissons) sont semblables aux
effets caractristiques du systme de signalisation des rtinodes (voir les
sections 3 et 4.2).

3. DSQUILIBRES DES RTINODES


3.1. DSQUILIBRE DES FORMES DE STOCKAGE
La capacit daccumuler des rtinodes est une fonction commune de tous
les vertbrs tudis ce jour et les formes de rtinodes stocks sont rela-
tivement constantes entre diffrents groupes taxonomiques. Les formes
dhydro (p. ex., 3,4-didhydrortinol, souvent nomm dhydrortinol
dans la littrature) sont frquentes dans les organismes habitant les co-
systmes aquatiques ; cependant les diffrences interspcifiques sont
normes. Par exemple, le foie de la barbotte brune, Ameiurus nebulosus,
contient presque la totalit de sa vitamine A en formes dhydro, tandis
que chez le meunier noir, Catostomus commersoni, et le meunier rouge,
Catostomus catostomus, les formes non dhydro prdominent. Longtemps
ignors, peut-tre cause de leur faible reprsentation chez les mammi-
fres, les formes dhydro ont dernirement t reconnues comme prcur-
seurs des ligands capables de lier haute affinite les rcepteurs nuclaires
de lembryon avien et mammalien (Repa et al., 1996).
Typiquement, aux stades du dveloppement les plus rudimentaires,
les sources externes telles que le vitellus chez les amphibiens, reptiles,
poissons et oiseaux, ou le sang maternel chez les mammifres fournissent
les rtinodes. Par exemple, chez certaines espces de poissons et doiseaux,
peu de temps suivant lclosion, une masse importante de vitellus passe
du ct de lembryon et les jeunes profitent ainsi de rserves accumules
par la gnration prcdente. Les tudes chez les mammifres et les pois-
sons suggrent que laccumulation de rtinodes a tendance continuer
pendant toute la vie dun organisme en sant et, par consquent, les con-
centrations augmentent en fonction de son ge. De nombreuses publica-
tions portent sur les effets de contaminants environnementaux sur le
stockage des rtinodes dans les organes et une compilation de ces tudes
est prsente au tableau 5.1.
Rtinodes 213

Tableau 5.1
Effets des contaminants sur le stockage de rtinodes majeurs
au niveau du foie

Effet sur
les rtinodes
stocks dans
Espce Xnobiotique le foie Rfrences
Oiseaux :
Pigeon domestique DDT Jeffries et French, 1971
Caille japonaise DDT Cecil et al., 1973
Caille japonaise BPC Cecil et al., 1973
Goland argent Environnement
contamin dioxine,
BPC, OC Spear et al., 1986
Tourterelle collier 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle Spear et al., 1986 ; 1989
Eider duvet 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle Murk et al., 1994b
Grand cormoran Environnement
contamin-dioxine,
furanne, BPC Sans effet van den Berg et al., 1994
Hirondelle bicolore Environnement
contamin BPC, OC Bishop et al., 1999
Goland bourgmestre Environnement Sans
contamin OC corrlation Henriksen et al., 2000
Poissons :
Notopterus HgCl Verma et Tonk, 1983
Touladi 3,3',4,4',5-
pentachlorobiphnyle Palace et Brown, 1994
Truite arc-en-ciel 3,3',4,4',5-
pentachlorobiphnyle Brown et al., 2002
Omble de fontaine 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle Ndayibagira et al., 1995
Omble de fontaine 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle Boyer et al., 2000
Truite arc-en-ciel 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle Sans effet Gilbert et al., 1995
Ombre arctique 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle Sans effet Palace et al,. 2001
Flet commun BPC Sans effet Besselink et al., 1996
Flet commun Sdiments
contamins BPC, HAP Besselink et al., 1998
Esturgeon jaune Furanne Sans effet Palace et al., 1996
214 cotoxicologie molculaire

Tableau 5.1 (suite)


Effets des contaminants sur le stockage de rtinodes majeurs
au niveau du foie

Effet sur
rtinodes
stocks dans
Espce Xnobiotique le foie Rfrences
Truite arc-en-ciel Furanne Brown et al., 1998
Meunier noir Environnement
contamin BPC Branchaud et al., 1995
Esturgeon jaune Environnement
contamin BPC Doyon et al., 1998
Touladi Environnement
contamin Palace et al., 1998a
Touladi Environnement
contamin Fe Payne et al., 1998
Barbotte brune Environnement Arcand-Hoy et
contamin HAP Metcalfe, 1999
Choque-mort Environnement
contamin BPC Nacci et al., 2001
Amphibiens :
Grenouille tigre DDT Keshavan et Desmukh,
1984
Grenouille tigre Carbaryl Keshavan et Desmukh,
1984
Mammifres :
Rat, lapin 1,2-dibenzanthracne Goerner et Goerner,
1939a,b
Rat 1,2-dibenzanthracne Bauman et al., 1941
Rat 3-mthylcholanthrne Bauman et al., 1941
Rat Benzo(a)pyrne Bauman et al., 1941
Rat DDT Phillips, 1963
Rat BPC Bitman et al., 1972
Rat Dioxine Thunberg et al., 1979
Vison dAmrique BPC Hakansson et al., 1992 ;
Kakela et al., 1999
Vison dAmrique Cu Sans effet Kakela et al., 1999
Loutre dEurope BPC Relation
ngative Murk et al., 1998
Rat Poissons contamins
BPC, dioxine, furanne Iverson et al., 1998
Rtinodes 215

3.1.1. Stockage au niveau du foie et certains organes

Oiseaux
Chez les oiseaux, les expriences de laboratoire ont dmontr une dimi-
nution typique des rtinodes hpatiques suite des expositions aux
organochlors. Par exemple, Jeffries et French (1971) ont observ quune
exposition au DDT avait caus une diminution des niveaux de la vita-
mine A dans le foie du pigeon domestique, Columba livia. Par ailleurs, des
expositions au DDT ou lAroclor 1242 (un mlange de BPC) durant deux
mois, ont entran une diminution de la concentration de vitamine A dans
le foie de la caille japonaise (Cecil et al., 1973). Dans la mme optique,
deux injections dun BPC coplanaire, le 3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle, ont
diminu les concentrations de rtinol dans le foie de la tourterelle col-
lier, Streptopelia risoria, deux mois aprs la premire injection, alors que le
palmitate de rtinol ntait pas affect (Spear et al., 1986 ; 1989). Le mme
congnre de BPC inject aux oisillons deiders duvet, Somateria
mollissima, a provoqu une baisse de palmitate de rtinol hpatique dix
jours suivant linjection, sans toutefois affecter le niveau de rtinol et de
starate de rtinol (Murk et al., 1994b). Quand les oisillons deider duvet
ont reu une injection de Clophen A50, un mlange de BPC, dans le cadre
de cette dernire exprience sur les oisillons deiders duvet, le stockage
de rtinodes hpatiques na pas t affect. Cette exprience, qui na dur
que dix jours, tait peut-tre trop courte pour une valuation des effets
possibles sur le stockage de rtinodes.
Une autre tude effectue sur des oisillons avec des BPC a donn
des rsultats similaires. Des oisillons dhirondelle bicolore, Tachycineta
bicolor, ont t prlevs lge de 16 jours sur 7 sites des Grands Lacs et
du fleuve Saint-Laurent. Parmi ces sites, deux prs de Cornwall sur le
fleuve, o les plus fortes concentrations en BPC ont t dtectes dans les
ufs, ont obtenu les plus faibles taux de rtinol et de palmitate de rtinol
hpatiques. Ces chercheurs ont galement dmontr que les faibles con-
centrations en rtinodes ntaient pas relies lalimentation, puisque
les niveaux de rtinol et de -carotne dans les insectes consomms par
les oisillons taient les plus levs ces sites (Bishop et al., 1999).
Des ufs de grand cormoran, Phalacrocorax carbo, provenant de deux
sites aux Pays-Bas, ont t examins afin dvaluer les concentrations en
rtinodes stocks au moment de lclosion. Aucune diffrence significa-
tive entre les sites na t observe pour les concentrations de rtinol ou
de palmitate de rtinol hpatique. Les rsultats de ces observations sont
cohrents puisque les concentrations en substances toxiques (BPC,
dioxines, furannes) et lactivit EROD ntaient pas diffrentes entre les
deux colonies (van den Berg et al., 1994). Une autre tude, cette fois en
216 cotoxicologie molculaire

Norvge, na dmontr aucune relation entre les concentrations dorgano-


chlors hpatiques des individus, le rtinol et le palmitate de rtinol qui
ont t quantifis dans les foies de 31 golands bourgmestres, Larus
hyperboreus, chantillonns sur un seul site (Henriksen et al., 2000).

Poissons
Des effets ont t dmontrs au niveau des rtinodes hpatiques chez
diffrentes espces de poissons vivant dans des sites contamins ou
exposs en laboratoire. Verma et Tonk (1983) ont observ une hausse de
la concentration en vitamine A hpatique accompagne dune diminu-
tion dans les ovaires et les muscles du tlosten deau douce de lordre
des Clupiformes, Notopterus notopterus, expos au chlorure de mercure
pendant quatre jours. Une diminution de la vitamine A dans le tissu mus-
culaire a aussi t constate chez un tlosten deau douce de la famille
des Ictaluridae, Heteropneustes fossilis, suite une exposition de 30 jours
au chlorure de mercure (Gupta et Shastry, 1981).
Les rsultats obtenus suite lexposition aux diffrents congnres
de BPC chez les poissons semblent relativement constants. Huit semaines
aprs une seule exposition de 3,3',4,4',5-pentachlorobiphnyle chez le
touladi, Salvelinus namaycush, des chutes de rtinol, de dhydrortinol et
de palmitate de rtinol hpatique ont t constates (Palace et Brown, 1994).
Des ombles de fontaine ayant reu une seule injection dun congnre
coplanaire, le 3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle, ont vu leur taux de croissance
affect et leurs teneurs en palmitate de rtinol et en palmitate de dhydro-
rtinol diminuer dans lintestin, huit semaines aprs linjection (Ndayibagira
et al., 1995). Lors de cette mme exprience, la concentration du palmitate
de dhydrortinol hpatique a significativement diminu dans le groupe
expos au BPC coplanaire (Ndayibagira et al., 1995 ; Boyer et al., 2000). Par
contre, avec le mme protocole exprimental, les concentrations en
rtinodes hpatiques de la truite arc-en-ciel nont pas t affectes (Gilbert
et al., 1995). Cette observation peut sexpliquer par une diffrence de sensi-
bilit propre aux espces tudies. Chez lomble arctique, Thymallus arcticus,
expos au 3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle, les concentrations de rtinodes
hpatiques ntaient pas affectes (Palace etal., 2001).
Une tude sur un poisson marin, le flet commun, Platichthys flesus, a
dmontr que les rtinodes stocks ne sont pas affects 2 et 10 jours aprs
linjection de diffrentes doses dun mlange de BPC (Besselink et al., 1996).
Ces auteurs ont galement remarqu que lactivit dEROD, mme
significativement leve en fonction des doses de BPC, tait relativement
faible comparativement dautres espces de poissons. Il est possible que
la courte dure de cette exprience ne permette pas de dpister des effets
sur le stockage des rtinodes. Lors dune autre exprience avec le flet
Rtinodes 217

commun expos pendant trois ans aux sdiments contamins provenant


du port de Rotterdam, aux Pays-Bas, une diminution de la concentration
de rtinol hpatique ainsi quune hausse de lactivit dEROD et des pro-
tines CYP1A hpatiques ont t observes comparativement un groupe
tmoin (Besselink et al., 1998). Lors de cette mme tude, toujours avec le
flet commun, mais cette fois-ci expos au lixiviat des sdiments conta-
mins (mais pas aux sdiments), les effets sur la vitamine A taient plus
marqus : le rtinol et le palmitate de rtinol taient en plus faibles concen-
trations. Cependant, ni lEROD, ni la concentration de protines CYP1A
nont t changes par une exposition au lixiviat.
Des composs de furannes ont t tests sur deux espces de
poissons, des juvniles desturgeon jaune et des mles de la truite arc-en-
ciel. Aucun effet sur les rtinodes hpatiques na t remarqu pour les
esturgeons 27 jours aprs avoir t exposs per os au 2,3,7,8-ttrachlo-
rodibenzofurane (Palace et al., 1996). Par contre, lactivit de lEROD avait
doubl dans le groupe desturgeons exposs. Des effets sur les rtinodes
stocks ont t constats seulement chez les truites ayant reu une injec-
tion de 2,3,4,7,8-pentachlorodibenzofurane (Brown et al., 1998). De faon
plus spcifique, les concentrations hpatiques de rtinol, de dhydrortinol
et de palmitate de rtinol taient plus faibles chez les truites mles 10 mois
et demi aprs linjection au furanne. On a galement remarqu une forte
induction dEROD.
Plusieurs recherches sur le terrain ont t effectues sur des sites
contamins avec diffrents polluants et les rsultats sont trs similaires
ceux obtenus en laboratoire. Des meuniers noirs ont t chantillonns
sur un site contamin proximit de Montral et sur un site tmoin situ
dans la rgion dAbitibi (Branchaud et al., 1995). Les poissons provenant
du site prs de Montral avaient des concentrations hpatiques nettement
plus faibles en rtinol et en palmitate de rtinol comparativement aux
poissons tmoins. Le stockage de rtinodes par les poissons du site de
rfrence augmentait significativement avec lge, ce qui ntait pas le cas
des poissons capturs prs de Montral. De plus, une frquence plus leve
de la mortalit des embryons et de la tratogense ainsi quune plus grande
induction dEROD ont t observes chez les poissons chantillonns prs
de Montral. Lors de cette mme tude, il a t not que le taux de malfor-
mations parmi les larves tait positivement corrl avec lactivit de
lEROD chez les mres (Branchaud et al., 1995). Ces rsultats sont compa-
rables avec ceux obtenus pour la tratogense, lactivit de lEROD et les
rtinodes relats pour lesturgeon jaune (section 4.2).
Palace et al. (1998a) ont observ, lors dune tude avec le touladi
chantillonn au lac Suprieur (moins contamin) et au lac Ontario (le
plus contamin des Grands Lacs), de plus fortes concentrations en
218 cotoxicologie molculaire

dhydrortinol hpatique chez les touladis adultes du lac Ontario. Toute-


fois, de plus faibles concentrations de rtinol et de palmitate de rtinol
ont aussi t obtenues. Ces rsultats ne dmontrent pas une association
entre la contamination chimique et le stockage de rtinodes hpatiques.
Cependant, les analyses du rein ont dmontr que les touladis du lac
Ontario avaient de plus fortes concentrations en rtinol, en dhydrortinol
et en palmitate de dhydrortinol comparativement aux poissons du lac
Suprieur. Ces auteurs ont aussi observ une hausse du palmitate de
rtinol rnal lors dune exprience en laboratoire (Palace et Brown, 1994)
et ils en ont dduit que la contamination augmente la rsorption rnale
du rtinol (Palace et al., 1998a). Toujours chez les touladis, on a enregistr
des concentrations hpatiques de rtinol et de palmitate de rtinol nette-
ment infrieures pour des femelles adultes captures dans un site conta-
min par les effluents dune mine de fer Terre-Neuve-et-Labrador par
rapport des femelles provenant dun site de rfrence. Un lien a t tabli
entre les concentrations de rtinodes hpatiques et une hausse deffets
associs au stress oxydatif sur lADN (Payne et al., 1998).
Une autre tude, ralise cette fois sur les Grands Lacs et avec la
barbotte brune, a dmontr des concentrations de dhydrortinol et de
palmitate de rtinol hpatiques significativement plus faibles pour les
poissons associs deux sites contamins par des hydrocarbures aroma-
tiques polycycliques (HAP) compars aux sites de rfrence (Arcand-Hoy
et Metcalfe, 1999). De plus, la diminution des rtinodes ces sites tait
corrle avec la prsence de lsions hpatiques, une hausse de lactivit
de lEROD, des augmentations de la fluorescence biliaire (indicateur de
composs semblables aux HAP) et lapparition de lsions dermiques.
Dans le port de New Bedford au Maine, une rgion situe sur la cte
atlantique, des femelles choque-morts, Fundulus heteroclitus, ont t cap-
tures sur deux sites contamins par les BPC et sur un site de rfrence.
Les concentrations en palmitate de rtinol hpatiques taient plus leves
au printemps (avant la priode de reproduction) quen automne (aprs la
priode de reproduction) et ce, pour les trois sites (Nacci et al., 2001). Cepen-
dant, lors de lchantillonnage printanier, le palmitate de rtinol tait d-
tect en concentrations plus faibles aux sites contamins comparativement
au site de rfrence. Cette observation tait toutefois moins vidente en
automne puisquun seul site contamin tait diffrent du site de rfrence.

Amphibiens
Des adultes de grenouille tigre, Rana tigrina, placs dans leau contenant
du DDT ou du Sevin (carbaryl) ont subi une baisse de la concentration en
vitamine A au niveau du foie aprs 4 jours dexposition (Keshavan et
Desmukh, 1984).
Rtinodes 219

Mammifres
Comparativement aux autres groupes danimaux, une littrature proli-
fique porte sur les effets de substances toxiques chez les mammifres. Nous
nous limiterons ici quelques exemples afin de prioriser les tudes
pertinentes se rattachant aux espces fauniques.
Il y a soixante ans, les recherches effectues en laboratoire avec les
rats ont rvl que le 1,2-dibenzanthracne, le 3-mthylcholanthrne et le
benzo(a)pyrne causaient une baisse de la concentration de vitamine A
dans le foie (Goerner et Goerner, 1939a, 1939b ; Bauman et al., 1941). Lors
de lpoque de la grande production industrielle des organochlors, on
note lapparition des premiers articles dmontrant que les contaminants
environnementaux persistants comme les DDT, BPC et TCDD provoquent
le mme genre deffet sur le stockage de rtinodes chez les mammifres
(Phillips, 1963 ; Bitman et al., 1972 ; Thunberg et al., 1979).
Certaines expriences supportent lhypothse que laction des sub-
stances toxiques implique une situation physiologique semblable une
carence en vitamine A. Dans le cas des animaux exposs au dibenzan-
thracne, au phnobarbital, un mlange de BPC ou un biphnyle
halogn coplanaire et soumis des rgimes alimentaires faible teneur
en vitamine A, des symptmes de carence en vitamine A sont apparus
(Bauman et al., 1941 ; Backes et al., 1979 ; Darjono et al., 1983). Cependant,
des animaux ayant gard le mme rgime alimentaire mais non exposs
aux contaminants ntaient pas symptomatiques. Une autre exprience
effectue dans cette optique porte sur la non-apparition des symptmes
chez les rats exposs un mlange de BPC cause par un supplment
alimentaire de vitamine A (Innami et al., 1974). Ces expriences dmon-
trent donc une association entre la diminution des stocks de rtinodes
par des contaminants et les symptmes de carence en vitamine A. Une
des diffrences importantes entre les cas dintoxication et ceux de carence
nutritionelle rside dans lpuisement des rserves hpatiques. Typique
dune carence nutritionnelle, lpuisement est rarement observ lorsque
lorganisme est affect par des substances toxiques. Ce constat amne lide
que lintoxication est plutt associe aux drangements mtaboliques ou
fonctionnels de la vitamine A et, de cette faon, lintoxication se distingue
dune simple carence.
Une diminution importante des stocks de rtinodes hpatiques a
t signale chez les visons dAmrique femelles adultes, Mustela vison,
exposs par le biais de la nourriture un mlange commercial de BPC, le
Clophen A50 (Hakansson et al., 1992). Un mlange de BPC non-ortho dans
des proportions gales celles du mlange commercial a eu le mme effet,
tandis que dautres mlanges de congnres BPC spcifiques nont pas
affect le stockage de rtinodes totaux (Hakansson et al., 1992). Une autre
220 cotoxicologie molculaire

exprience chez le vison dAmrique expos aux BPC a dmontr une


diminution des dhydrortinodes au niveau du foie. Cependant, les
rtinodes nont pas t affects (Kakela et al., 1999). Quand les visons
femelles ont subi une exposition au cuivre ou au cuivre + BPC, aucun
effet sur le stockage de rtinodes na t constat (Kakela et al., 1999).
Chez les carcasses de loutres dEurope, Lutra lutra, retrouves au
Danemark et en Europe centrale, Murk et al. (1998) ont dmontr des
relations ngatives entre les TCDD-EQ base de BPC analyss dans le
foie et les concentrations de rtinol et de palmitate de rtinol.
Lors dune exprience impliquant plusieurs gnrations, plusieurs
groupes de rats ont t nourris de rgimes quilibrs (y compris lapport
vitaminique) et prpars base de saumon chinook, Oncorhynchus
tshawytscha, provenant des Grands Lacs et contamins par les BPC,
dioxines et furannes. Seul le palmitate de rtinol a t analys au niveau
du foie. Dans le cas du rgime contenant 20 % du saumon du lac Ontario,
le niveau dexposition tait le plus fort en TCDD-EQ et le palmitate de
rtinol hpatique a subi une diminution chez les rats adultes F0, chez les
rats F1 au sevrage et chez les F1 femelles adultes (Iverson et al., 1998).

3.1.2. Corrlations entre enzymes et rtinodes hpatiques stocks


Les expriences sur les oiseaux dvoilent une tendance, autant sur le terrain
que dans le laboratoire, quant une baisse des rtinodes stocks au niveau
du foie et linduction des enzymes de la famille CYP1A. Chez la tourte-
relle collier ayant reu une injection de BPC coplanaire, le rtinol hpatique
a diminu avec laugmentation de lactivit dhydroxylase dhydro-
carbures aryls (AHH) (Spear et al., 1986). Dans le cas des golands argents
du lac Ontario, une corrlation ngative entre le rtinol hpatique et lAHH
a t dmontre (Spear et al., 1992). Des oisillons dhirondelle bicolore ont
t chantillonns lge de 16 jours sept sites sur les Grands Lacs et le
fleuve Saint-Laurent le rtinol hpatique tait ngativement corrl avec
lactivit de lEROD (Bishop et al., 1999). Lors dune tude sur les go-
lands bourgmestres en Norvge, aucune relation na t identifie entre
les enzymes CYP1A et le stockage de rtinodes hpatiques (Henriksen et
al., 2000).
Chez les poissons, trois articles mentionnent un rapport entre
rtinodes et enzymes CYP1A. Dans le cas du flet commun expos aux
sdiments contamins, la diminution de rtinol hpatique tait associe
une hausse de la concentration protique en CYP1A, mais pas lactivit
enzymatique de lEROD (Besselink et al., 1998). Pour la barbotte brune,
chantillonne cinq sites sur les Grand Lacs, une corrlation ngative
hautement significative a t signale entre lactivit de lEROD et la con-
centration de palmitate de rtinol hpatique (Arcand-Hoy et Metcalfe,
Rtinodes 221

1999). Chez des ombles arctiques femelles exposes au 3,3',4,4'-


ttrachlorobiphnyle, le rtinol hpatique tait positivement corrl avec
lactivit de lEROD (Palace et al., 2001).
Lorsque des rats ont reu une injection de diffrents congnres de
BPC, la diminution de la vitamine A totale (rtinol + palmitate de rtinol)
au niveau des microsomes hpatiques a t ngativement corrle avec
les activits de lAHH et de lUDP-GT (Narbonne et al., 1990).
lorigine, ce type de relation a t peru comme une preuve que
les contaminants environnementaux peuvent diminuer les rtinodes hpa-
tiques, peut-tre par le mtabolisme des rtinodes associ aux enzymes
CYP1A (Spear et al., 1986). Entre-temps, les recherches ont bien dmontr
que les substances toxiques peuvent intervenir plusieurs tapes de la
voie mtabolique des rtinodes, y compris par la modification des activits
de plusieurs cytochromes P450.

3.1.3. Rserve au niveau des ufs


Oiseaux (voir aussi la section 4.1)
Lorsquon a inject des tourterelles collier adultes du 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle, on a remarqu des retards dans la ponte des ufs
et une mortalit embryonnaire avoisinant les 43 % entre le 4e et le 7e jours
dincubation (Spear et al., 1989). Au niveau du vitellus, les concentrations
de rtinol et de palmitate de rtinol nont pas chang dans les ufs pro-
duits par les femelles tmoins au cours de cette fentre de mortalit.
Dans le groupe expos, par contre, le rtinol et le palmitate de rtinol ont
diminu entre les jours trois et huit dincubation (Spear et al., 1989).
Lorsque les ufs de grand hron ou de goland argent ont t pr-
levs dans le systme des Grands Lacs et fleuve Saint-Laurent, les con-
centrations des rtinodes du vitellus ont t corrles avec les teneurs en
substances toxiques dans les tissus (Spear et al., 1990 ; Boily et al., 1994).
Dans le cas des grands hrons, le palmitate de rtinol tait corrl ngati-
vement avec les teneurs en mono-ortho-ttrachlorobiphnyles et avec deux
congnres mono-ortho-pentachlorobiphnyles ou leur TCDD-EQ. Chez
les golands argents, le ratio molaire rtinol : palmitate de rtinol dans le
vitellus tait positivement corrl avec la TCDD-EQ base des dioxines
et furannes analyss dans les ufs, avec les concentrations en 2,3,7,8-TCDD
et avec la sommation des diffrents congnres de dioxines et furannes.
Dans le cadre dune exprience sur neuf colonies de sternes
pierregarins, Sterna hirundo, en Europe, les concentrations de dhydrorti-
nodes dans le sac vitellin lclosion taient nettement moindres dans
les colonies contamination forte ou moyenne au mono-ortho-BPC que
dans la colonie dont le degr de contamination tait le plus faible (Murk
222 cotoxicologie molculaire

et al., 1996). De plus, la teneur en palmitate de rtinol dans le vitellus des


ufs chantillonns pendant la priode dincubation tait nettement plus
leve dans la colonie plus faible contamination comparativement aux
autres colonies.
Dans une exprience mene par Zile et al. (1997), on a nourri des
poules domestiques pendant sept semaines au moyen dun rgime
contenant de la carpe, Cyprinus carpio, provenant dun site hautement con-
tamin des Grands Lacs. Un autre groupe de poules, servant de groupe
de rfrence, a reu un rgime prpar partir des poissons non conta-
mins. Les concentrations et la quantit totale en rtinol (dhydrortinol
+ rtinol) taient significativement plus faibles dans les ufs pondus par
les poules contamines. La quantit totale de palmitate de rtinol tait
plus grande dans les ufs du groupe expos, ce qui correspondait une
diminution du ratio molaire rtinol : palmitate de rtinol.
Des rsultats diffrents caractrisent une autre tude effectue avec
deux groupes de cailles japonaises ; dans un groupe, les femelles ont reu
des injections dun BPC coplanaire (dissous dans lhuile de mas) pen-
dant six semaines, alors que dautres femelles composant un groupe
tmoin nont reu que des injections dhuile de mas (Boily, 2000 ; Boily et
al., 2003a). Chez les femelles traites avec le BPC, les concentrations de
rtinol dans le vitellus ont augment de faon significative dans les ufs
pondus, aux 5e et 6e semaines de traitement. Cependant, aprs six jours
dincubation, leffet sur le rtinol tait ngligeable, mais les concentrations
de palmitate de rtinol ont augment de faon trs significative partir
de la 3e semaine de traitement. Dans cette tude, les rtinodes ont t
analyss dans les trois plus gros jaunes des ovaires et ce moment-l,
leffet du BPC a sembl se manifester sur le rtinol, car les concentrations
taient plus leves chez les femelles exposes au BPC que chez les femelles
du groupe de rfrence.

Poissons
Un taux lev de mortalit a t enregistr au moment o des larves de
touladi du lac Ontario ont commenc nager dans la colonne deau (swim-
up stage) (Mac et Gilbertson, 1990). Ce stade larvaire concide avec la
rsorption du sac vitellin et un transfert important des BPC contenus dans
le vitellus. Afin dexaminer limplication du stress oxydatif et des vita-
mines antioxydantes dans ce phnomne, Palace et al. (1998b) ont pch
le touladi dun lac de rfrence et du lac Ontario. Les ufs ont t prle-
vs des femelles et les embryons ont t levs de manire identifier les
deux groupes : (i) les gnitrices dont les ufs sont associs un taux lev
de mortalit au stade larvaire et (ii) les gnitrices produisant des ufs
ayant peu de mortalit une fois dvelopps au stade larvaire. La concen-
Rtinodes 223

tration totale des carotnodes tait plus leve dans les ufs du site de
rfrence que dans ceux des deux groupes du lac Ontario et cette ten-
dance (non statistiquement significative) sest maintenue jusqu lclosion
(Palace et al., 1998b). Cependant, on na constat aucune diffrence entre
les groupes pour la concentration du dhydrortinol dans les ufs, les
embryons ou les larves. Chez les femelles gnitrices, on na trouv aucun
lien entre les rtinodes hpatiques et la mortalit larvaire.
Des choque-morts provenant de sites contamins aux BPC du port
de New Bedford, Maine, ont t compars un site de rfrence. Les con-
centrations en rtinaldhyde taient plus faibles dans les ufs provenant
des sites contamins (Nacci et al., 2001). Une corrlation positive a aussi
t constate entre le rtinaldhyde des ufs et le palmitate de rtinol
hpatique. Par ailleurs, ces chercheurs ont propos que la population de
choque-morts du port de New Bedford se serait adapte aux BPC au point
de dmontrer une grande rsistance quant aux concentrations de BPC nor-
malement ltales aux premiers stades de dveloppement (Nacci et al., 1999).
La reproduction et la survie des embryons ne semblaient pas menaces
par la contamination aux BPC dans le port de New Bedford (Nacci et al.,
1999).

Amphibiens
Des adultes femelles de deux espces danoures ont t exposes par
gavage un mlange de BPC, le Clophen A50, et les rtinodes ont t
analyss dans les embryons entiers provenant de ces femelles (Gutleb et
al., 1999). Aucun effet sur les rtinodes na t constat dans le cas de la
grenouille africaine, Xenopus laevis, mais pour les embryons de la grenouille
rousse, Rana temporaria, on a observ des hausses de la teneur en rtinol et
en palmitate de rtinol dans le groupe expos (Gutleb et al., 1999).

3.1.4. Effet des contaminants sur la HER, la LRAT, et lARAT


tant donn quon a constat un dsquilibre des rtinodes chez des orga-
nismes vivant dans des sites contamins, il est tout fait plausible que
des contaminants puissent affecter les activits des enzymes HER, LRAT
et ARAT et ainsi provoquer des changements dans les concentrations de
rtinodes.
Des contaminants de type organochlor ont t tests en laboratoire
sur ces enzymes. Daprs lensemble des tudes, les contaminants de type
organochlor semblent produire une baisse de lactivit dhydrolisation
tandis que linfluence sur lactivit de la LRAT varie davantage (tableau
5.2). Au point o en sont les recherches dans ce domaine, les rsultats
obtenus avec les enzymes (augmentation ou diminution de lactivit), ne
peuvent pas toujours expliquer les concentrations de rtinodes mesures
224 cotoxicologie molculaire

dans les tissus. Ainsi, bien que la teneur en palmitate de rtinol augmente
dans la muqueuse intestinale de rats traits avec le TCDD, les activits de
lARAT et de la LRAT sont comparables celles mesures chez le groupe
tmoin (Hanberg et al., 1998). Des constats similaires caractrisent ltude
de Nilsson et al. (2000) mene sur le mme contaminant et sur la mme
espce animale. Malgr une baisse de la teneur en esters hpatiques chez
les rats traits avec le TCDD, aucun changement nest rapport pour
lactivit dhydrolyse de la HER.

Tableau 5.2
Effets des organochlors sur lactivit de lARAT, de la LRAT et de la HER

Enzyme Xnobiotique Espce/tissu Effet Rfrences


ARAT 2,3,7,8-TCDD Rat/reins Jurek et al., 1990
ARAT 2,3,7,8-TCDD Rat/intestin Sans effet Hanberg, 1996
LRAT 2,3,7,8-TCDD Rat/intestin Sans effet Hanberg, 1996
LRAT 2,3,7,8-TCDD Rat/foie Sans effet Nilsson et al., 1996
LRAT 3,3',4,4'-TCB Poisson/foie Sans effet Ndayibagira et
Spear, 1999
LRAT 2,3,7,8-TCDD Rat/rein Nilsson et al., 2000
LRAT 3,3',4,4'-TCB Caille/sac vitellin
In vivo Boily, 2000
In vitro Sans effet Boily et al., 2003a
LRAT 2,3,3',4,4'-PCB Caille/cas vitellin
In vitro Sans effet Boily et al., 2003b
LRAT 2,3',4,4'-TCB Caille/cas vitellin
In vitro Boily et al., 2003b
HER 3,3',4,4'-TCB Rat/rein Powers, 1987
HER 3,3',4,4'-TCB Rat/foie Mercier et al., 1990
HER 3,3',4,4',5,5'-HBB Rat/foie Jensen et al., 1987
HER 2,3,7,8-TCDD Rat/foie Sans effet Nilsson et al., 1996
HER 3,3',4,4'-TCB Caille/sac vitellin
In vivo Boily, 2000
In vitro Boily et al., 2003a
HER 2,3,3',4,4'-PCB Caille/sac vitellin
In vitro Boily et al., 2003b
HER 2,3',4,4'-TCB Caille/sac vitellin
In vitro Sans effet Boily et al., 2003b
HER 3,3',4,4'-TCB Poisson/foie Ndayibagira et
Spear, 1999
Rtinodes 225

Il faut donc supposer que laction des contaminants peut se mani-


fester de faon indirecte et quil faudra tester dautres paramtres qui
interviennent dans le mtabolisme des rtinodes.
Les enzymes ARAT, LRAT et HER nont pas fait lobjet dune atten-
tion particulire en ce qui a trait dautres espces animales. Lactivit de
la LRAT a t identifie dans les intestins de poulets gs de 14 jours (Goda
et al., 1993) mais aucun contaminant na t test sur cette activit. Cepen-
dant, quand des femelles de cailles japonaises reoivent par injection du
3,3',4,4'-TCB, on observe une diminution de lactivit de la HER et de la
LRAT dans le sac vitellin des embryons gs de 6 jours (Boily, 2000 ; Boily
et al., 2003a). Dans la mme tude, le congnre de BPC, inject directement
dans luf, a provoqu une augmentation de lactivit HER. Un rsultat
similaire est obtenu avec linjection du 2,3,3',4,4'-PCB tandis que le 2,3',4,4'-
TCB a plutt entran une hausse de lactivit de la LRAT (Boily et al., 2003b).
En somme, les rsultats de la contamination sur les activits enzy-
matiques de lARAT, de la LRAT et de la HER demeurent difficiles
interprter. Plusieurs aspects du mtabolisme des rtinodes restent
claircir et des recherches plus pousses seront ncessaires pour tablir
un lien entre la contamination, les enzymes et les rtinodes stocks. Il est
toutefois intressant de constater que ces activits enzymatiques sont sen-
sibles une contamination de type organochlor. Les enzymes HER, ARAT
et LRAT sont des atouts dans la comprhension du systme rtinode et
pourraient ventuellement contribuer, du moins en partie, expliquer
certains dsquilibres observs au niveau du stockage.

3.1.5. Conclusions propos du stockage de rtinodes


Le nombre dexpriences effectues par des quipes de recherche ind-
pendantes, en laboratoire et sur le terrain, a dmontr que le stockage de
rtinodes est un biomarqueur fiable chez les oiseaux et les poissons. Pour
lensemble des publications, se dgage une tendance vers la diminution
des rtinodes stocks en prsence de contaminants lipophiles et persistants
(p. ex., les BPC, dioxines, furannes, pesticides organochlors) et parfois
non persistants (p. ex., les hydrocarbures aromatiques polycycliques). Pour
dautres catgories de polluants, tels les pesticides (non organochlors) et
les mtaux, la littrature est insuffisante pour porter un jugement sur des
effets concernant le stockage des rtinodes. Dans le cas des mammifres,
une littrature abondante se rapporte aux tudes de laboratoire. Par contre,
les tudes sur le terrain avec des populations de mammifres indignes
sont des cas isols. Le manque dinformation scientifique est encore plus
vident dans le cas des amphibiens, mais les rsultats en ce sens ne
devraient tarder tant donn lintrt pour la sauvegarde de cette classe
dorganismes et les hypothses impliquant les rtinodes dans les malfor-
mations observes chez les amphibiens.
226 cotoxicologie molculaire

Bien quil existe de nombreuses preuves scientifiques concernant les


effets des contaminants sur les rtinodes emmagasins dans les tissus,
leur utilisation comme biomarqueurs est plus efficace dans le cadre
dtudes multidisciplinaires impliquant plusieurs biomarqueurs. Les
tudes cotoxicologiques doivent prendre en considration certaines
variables, autres que lexposition aux substances toxiques, qui risquent
dinfluencer les rsultats. Des expriences ont dmontr une diminution
des stocks de rtinodes chez les mammifres et les oiseaux dlevage
atteints dune maladie infectieuse ou parasitaire. Dans ces cas, une va-
luation pathologique peut tre avantageuse. La quantit de carotnodes
et de rtinodes ingre peut varier entre les sites dchantillonnage et en
fonction de la disponibilit et de la qualit de la nourriture. Par exemple,
une seule espce de plante peut contenir des quantits variables en
carotnodes entre le printemps et lautomne. Cette plante peut tre
consomme en grande quantit par un organisme juvnile ayant une
certaine taille. Cependant, le choix de la nourriture peut changer quand
lorganisme atteint une taille plus importante. Puisque laccumulation de
rtinodes semble continuer au fil des annes, les concentrations retrouves
chez les organismes plus grands ou plus gs ont tendance tre plus
importantes. La planification dune campagne dchantillonnage doit donc
minimiser leffet de ces variables (p. ex., slectionner des ges/tailles sp-
cifiques) ou couvrir une gamme relativement complte de ces variables
chaque site. Parfois, la diffrence entre sexes est significative et, en thorie,
le stockage de plus faibles concentrations en rtinodes chez la femelle
peut tre attribu linfluence de la mobilisation des stocks lors de
lovogense.
La majorit des expriences en cotoxicologie qui impliquent les
rtinodes utilisent un protocole dchantillonnage destructif, entranant
la mort des animaux lors du prlvement des tissus. Les chercheurs doivent
explorer davantage des modes dchantillonnage non destructifs ou ayant
un impact minimum sur les populations fauniques quils souhaitent
protger (p. ex., prlvement sanguin et collecte dufs).

3.2. RTINOL SANGUIN


Les rsultats des expriences de laboratoire sont toujours contradictoires
quant aux effets de substances toxiques sur le rtinol sanguin. Ce dernier
a t rapport par diffrents groupes de recherche comme tant augment,
diminu, inchang ou simplement variable chez les organismes exposs.
Mme en nutrition, il est difficile dinterprter les concentrations de rtinol
dans le sang, qui sont considres de faible utilit quant au diagnostic
dune carence en vitamine A (Underwood, 1984). Lutilisation du rtinol
Rtinodes 227

sanguin comme biomarqueur en cotoxicologie a dj t qualifie de pr-


mature (Spear et Bourbonnais, 1998). Nanmoins, certaines tudes
rcentes de terrain suggrent que lexposition chronique faible niveau
chez les populations fauniques puisse tre associe une baisse de rtinol
sanguin, mais cette tendance nest pas universelle (voir aussi la section 4).
Le rtinol sanguin peut tre affect, en prsence de substances
toxiques, par la liaison dun mtabolite du 3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle
avec la protine de transport, ce qui correspond aussi une baisse du
complexe rtinol-RBP-TTR. Brouwer et van den Berg (1986) ont propos
que les BPC, dioxines et furannes ou leurs mtabolites peuvent diminuer
le transport du rtinol dans le sang.
Un autre mcanisme implique une diminution de la teneur en TTR
dans le sang. Une forte dose de 3,3',4,4',5,5'-hexabromobiphnyle peut
diminuer la consommation de nourriture et, consquemment, provoquer
une baisse du rtinol srique (Spear et al., 1988). Lorsquune dose moins
forte est utilise, ce congnre diminue lingestion de nourriture pendant
1 jour seulement, ce qui correspond galement une baisse transitoire du
taux de rtinol srique (Spear et al., 1994). De plus, une restriction alimen-
taire cause une diminition importante du rtinol et du TTR dans le groupe
expos. Ces rsultats vont dans le sens dun effet sur la synthse du TTR,
probablement associ un faible apport calorifique en protines, donc un
effet toxique indirect.
Un troisime mcanisme implique la mobilisation en masse des
stocks hpatiques de rtinodes. Plusieurs groupes de recherche ont trouv
que lintoxication par les BPC et dioxines amorce une augmentation
importante du flux de rtinol du foie vers les reins, ce qui expliquerait
une hausse du taux de rtinol dans le sang (Zile, 1992).

Oiseaux
Dans une tude de Spear et al. (1989), des tourterelles collier ont reu
linjection dun BPC coplanaire, le 3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle. Compa-
rativement au groupe de rfrence, le taux de rtinol srique tait plus
lev chez les mles et les femelles exposs. Il est intressant de noter que
ces oiseaux ont produit des ufs dont les embryons se sont dvelopps
normalement.
Chez les eiders duvet juvniles ayant reu une injection de 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle, le taux de rtinol plasmatique a diminu aprs 1jour,
mais a augment aprs 10 jours (Murk et al., 1994b). De plus, le taux de
rtinol plasmatique tait positivement corrl avec la teneur du congnre
de BPC dans le tissu adipeux.
228 cotoxicologie molculaire

Le rtinol plasmatique des oisillons de sternes pierregarins tait dif-


frent entre diverses colonies chantillonnes aux Pays-Bas, mais aucune
relation avec la contamination aux BPC na t tablie (Murk et al., 1994a).
Dans les tudes de van den Berg et al. (1994) impliquant des grands
cormorans frachement clos provenant de deux colonies aux Pays-Bas,
aucun effet sur le rtinol plasmatique na t relev en prsence de
contaminants comme les BPC, les furannes ou les dioxines.
Dans le cadre des tudes sur le goland argent et le grand hron
dans le systme des Grands Lacs et du fleuve Saint-Laurent, des corrla-
tions ngatives ont t obtenues entre le rtinol plasmatique et la concen-
tration de contaminants lipophiles et persistants (Grasman et al., 1996 ;
Champoux et al., 2000) (voir la section 4.1).
Le rtinol plasmatique de quinze golands bourgmestres capturs
un seul site en Norvge tait positivement corrl avec lactivit de lEROD
hpatique, mais non avec les BPC analyss dans le mme tissu (Henriksen
et al., 1998). Le mme groupe de recherche a chantillonn dix oisillons de
cormoran hupp, Phalacrocorax aristotelis, un seul site peu de temps aprs
lclosion et tabli une corrlation positive entre le taux de rtinol
plasmatique et la teneur en BPC dans le vitellus (Murvoll et al., 1999).

Poissons
Le 3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle a provoqu une baisse du taux de rtinol
plasmatique chez lomble de fontaine et la truite arc-en-ciel (Ndayibagira
et al., 1995 ; N. Gilbert, Dpartement des sciences biologiques, Universit
du Qubec Montral, rsultats non publis).
Chez le flet commun expos aux sdiments contamins ou au lixiviat
de ces sdiments, une baisse du taux de rtinol plasmatique a t rapporte
(Besselink et al., 1998). Cependant, le mlange de BPC Clophen A50 na
pas eu deffet sur ce paramtre biochimique (Besselink et al., 1996).

Mammifres
La population de blugas, Delphinapterus leucas, du fleuve Saint-Laurent
a accumul des teneurs levs en BPC, en DDT et en autres organochlors
dans les tissus. Cette population est seulement 10 % de son niveau pr-
industriel et plusieurs pathologies graves, y compris le cancer biliaire et
les infections opportunistes, ont t documentes (Martineau et al., 1987,
1988 ; DeGuise et al., 1995). Outre les pathologies, les scientifiques
souponnent limmunodpression et laltration de la reproduction. En
incorporant de la graisse contamine de blugas du Saint-Laurent la
Rtinodes 229

nourriture de rats, on a dtect la prsence du mtabolite acide all-trans-


4-oxo-rtinoque dans le plasma (P.A. Spear, M.J. Cloutier, S.De Guise et
M.Fournier, Universit du Qubec, rsultats non publis).
Des maladies infectieuses sont apparues dans plusieurs autres popu-
lations de mammifres marins contamines par les organochlors ; ces
pisodes ont t souvent associs un taux de mortalit lev. Parce quune
immunodpression peut tre cause par un dsquilibre en vitamine A
(voir la section 2.4), le rtinol sanguin a fait lobjet dtudes en tant que
biomarqueur. Lors dune exprience semi-contrle, des phoques com-
muns femelles, Phoca vitulina, ont t exposs aux BPC par le biais de la
nourriture. Le taux de rtinol plasmatique chez les femelles gestantes et
non gestantes a chut dans les groupes exposs (Brouwer et al., 1989). Chez
les jeunes phoques communs (avant sevrage) chantillonns du ct Paci-
fique nord-amricain, la teneur en contaminants de type BPC, dioxines et
furannes (TCDD-EQ) dmontrait une corrlation positive avec le taux de
rtinol sanguin (Simms et al., 2000). Cependant, dans le cas des jeunes
lphants de mer, Mirounga angustirostris, et phoques gris, Halichoerus
grypus, des corrlations ngatives ont t obtenues entre les contaminants
organochlors et le taux de rtinol sanguin (Jenssen et al., 1995 ; Shaw, 1998).
Chez la loutre dEurope, garde dans des centres de rhabilitation
en Angleterre et aux Pays-Bas et sans exposition intentionelle, les concen-
trations de rtinol plasmatique ne dmontraient aucune relation avec les
TCDD-EQ base de BPC analyss galement dans le sang (Murk et al.,
1998). Dans le cas du vison dAmrique expos aux BPC dans la nourri-
ture, le taux de dhydrortinol (mais pas de rtinol) tait plus faible com-
par aux tmoins (Kakela et al., 1999). Lorsque les visons femelles ont subi
une exposition au cuivre ou au cuivre + BPC, le dhydrortinol et le rtinol
plasmatique ont diminu par rapport aux tmoins (Kakela et al., 1999).

3.3. EFFETS SUR LE MTABOLISME DE LACIDE RTINOQUE


Plusieurs auteurs ont signal que lhydroxylation in vitro de lacide all-
trans-rtinoque et loxydation subsquente (voir la section 2.2) augmentent
suite une exposition aux HAP, aux BPC ou aux dioxines. Chez le
cobaye, le taux dhydroxylation/oxydation de lacide rtinoque dans les
microsomes hpatiques tait plus lev chez les individus exposs au
3-mthylcholanthrne ou au phnobarbital (Roberts et al., 1979). Le ph-
nobarbital a eu le mme effet chez le rat (Martini et Murray, 1994). Le
3,3'4,4',5,5'-hexabromobiphnyle inject aux rats augmentait lhydro-
xylation/oxydation de lacide rtinoque par les microsomes du foie (Spear
et al., 1988). Fiorella et al. (1995) ont rapport une induction de lhydro-
xylation in vitro de lacide rtinoque par des microsomes du foie, du rein
230 cotoxicologie molculaire

et du poumon suite lexposition des rats la 2,3,7,8-ttrachlorodibenzo-


p-dioxine. Chez les poissons, le 3,3'4,4'-ttrachlorobiphnyle a provoqu
une hausse de lhydroxylation de lacide rtinoque une fois inject chez
la truite arc-en-ciel et une hausse de lhydroxylation/oxydation au niveau
des microsomes hpatiques de lomble de fontaine (Gilbert et al., 1995 ;
Boyer et al., 2000). Les tudes sur le terrain suggrent que les contaminants
de type BPC coplanaires peuvent augmenter lhydroxylation de lacide
rtinoque chez lesturgeon jaune (voir la section 4.2).
Quant la glucuronidation de lacide rtinoque par lUDP-GT, Spear
et al. (1988) ont constat une hausse de cette activit dans les microsomes
hpatiques de rats exposs au 3,3',4,4',5,5'-hexabromobiphnyle. Dans le
cas des rats gavs de 2,3,7,8-ttrachlorodibenzo-p-dioxine, une augmen-
tation du taux de glucuronidation in vitro a t signale au niveau du rein
et du foie (Bank et al., 1989). Chez lomble de fontaine, le 3,3',4,4'-
ttrachlorobiphnyle a augment la glucuronidation de lacide rtinoque
telle que mesure dans des microsomes du foie (Boyer et al., 2000).

4. EXEMPLES DES RTINODES COMME


BIOMARQUEURS DANS LE CONTEXTE DTUDES
COTOXICOLOGIQUES
4.1. PROGRAMMES DE SURVEILLANCE DES COLONIES AVIENNES
SUR LES GRANDS LACS ET LE FLEUVE SAINT-LAURENT

Les Grands Lacs


Depuis environ 30 ans, le Service canadien de la faune et son homologue
amricain, le U.S. Fish and Wildlife Service, ont entrepris une bio-
surveillance formalise par lAccord de 1978 relatif la qualit de leau dans
les Grands Lacs. Cet accord, remani en 1989 par la Commission mixte inter-
nationale tats-Unis et Canada, comprend, entre autres responsabilits
gouvernementales, la mise au point et lutilisation de paramtres bio-
chimiques, physiologiques et de reproduction chez la faune, le poisson et
ltre humain pour servir dindicateurs deffets1 . Ceci a t conu dans
le contexte dun systme intgral de biosurveillance afin de prvoir les
problmes associs aux substances toxiques. En 1998, lAccord tait
toujours une priorit de la Commission mixte internationale.

1. Le terme bioindicateur est utilis ici au lieu de biomarqueur , qui ntait pas connu
lpoque.
Rtinodes 231

Pour exercer cette biosurveillance, on a slectionn le goland


argent, Larus argentatus, comme espce sentinelle. Cette espce occupe
un maillon trophique suprieur (principalement carnivore et piscivore) ;
elle est fidle son site de nidification et ne migre que rarement des Grands
Lacs en hiver. De plus, les niveaux de contamination des tissus du go-
land argent dmontrent des variations selon les sites dchantillonnage
(Peakall et al., 1978 ; Mineau et al., 1984). Il faut souligner quau plus fort
des effets exercs par la pollution environnementale, plusieurs popula-
tions doiseaux ont connu des baisses importantes de leur effectif de sorte
que peu despces se trouvaient reprsentes par un nombre suffisant
doiseaux pour faire partie dun programme de surveillance. Le choix
dune espce sentinelle sest donc arrt sur le goland argent, une espce
relativement rsistante aux contaminants et prsentant des effectifs de
population suffisants, distribus sur tous les lacs.
Avec la slection dune espce sentinelle, toute une panoplie de
biomarqueurs ont t tests. Parmi ces biomarqueurs, les enzymes induc-
tibles associes laction du cytochrome P450 ont t largement utilises.
Lactivit denzymes hpatiques comme AHH et EROD tait plus leve
chez les golands argents des Grand Lacs lorsque compare des oiseaux
de la mme espce de la cte atlantique (Ellenton et al., 1985 ; Boersma et
al., 1986). Ces activits accrues denzymes ont t associes la prsence
dominante dans la rgion des Grands Lacs de contaminants organochlors :
dioxines, furannes, BPC et HAP. Des corrlations ont t tablies entre la
concentration de ces molcules xnobiotiques et les activits enzymatiques
mesures dans le foie. Les BPC coplanaires (et leurs quivalents toxiques
en TCDD) ont galement t corrls avec des malformations observes
chez la sterne caspienne, Sterna caspia, et le cormorans aigrette,
Phalacrocorax auritus (Ludwig et al., 1996). Toute une srie deffets ont alors
t rpertoris pour lensemble des oiseaux des Grands Lacs sous la dsi-
gnation de GLEMEDS (Great Lakes embryo mortality, edema, and deformity
syndrome) (Gilbertson et al., 1991). Ces donnes qualitatives ont permis de
faire un suivi des consquences nfastes de la contamination des Grands
Lacs sans fournir dindices prcis sur les mcanismes lorigine de ces
malformations, de potentiels biomarqueurs.
Dautres outils de biosurveillance ont t tests ; on a pu constater
que les porphyrines hpatiques des golands argents des Grands Lacs
taient 25 38 fois plus leves que chez les golands argents de la cte
atlantique (Fox et al., 1988). Ces rsultats concernent les porphyrines
totales , dont un grand nombre taient fortement carboxyles, un effet
du blocage de la voie mtabolique. Des effets de la contamination se sont
galement manifests sur le systme immunitaire. On a pu dterminer
232 cotoxicologie molculaire

une relation entre un gradient de contamination mesur pour certains sites


des Grands Lacs et le degr dimmunosuppression chez les golands
argents et les sternes caspiennes rattachs ces sites (Grasman et al., 1996).
Tous ces rsultats ont constitu des tapes marquantes dans lta-
blissement dun systme de biosurveillance, sans toutefois dmontrer de
relations de cause effet. Le lien tangible entre la manifestation cellu-
laire de ces effets et le pitre succs reproducteur des oiseaux des Grands
Lacs demeurait difficile cerner. Trois facteurs retiennent lattention
cependant : lamincissement des coquilles des ufs d au DDE, les
malformations et le comportement des couples nicheurs. En effet, dans
des sites trs contamins, les oiseaux ngligent la couvaison, le soin accord
aux oisillons et la dfense de leur territoire. Ces facteurs ont certainement
contribu au dclin de certaines populations doiseaux, et bien quils tra-
hissent les effets ultimes dune contamination environnementale grave,
la dsignation de biomarqueurs ne saurait leur tre applique.
Parmi les biomarqueurs pouvant avoir un impact sur la reproduc-
tion des oiseaux, il faut commenter les essais effectus sur les hormones
thyrodiennes et les rtinodes. Toujours en comparant les golands
argents des Grands Lacs et de la cte est du Canada, on a constat des
diffrences notables pour la glande thyrode (masse plus grande pour les
golands argents des Grands Lacs), y compris une hyperplasie des tissus.
En 1992 et 1993, les concentrations de thyroxine plasmatique varient de
faon significative selon le site et lanne dchantillonnage (Grasman et
al., 1996). Cependant, aucune association avec des contaminants organo-
chlors na pu tre dmontre. On a obtenu des rsultats plus encoura-
geants avec les rtinodes. Les analyses ont principalement port sur les
rtinodes hpatiques (rtinol et palmitate de rtinol) et lon a pu dmontrer
que des concentrations significativement plus basses de ces formes de
rtinodes caractrisaient les golands argents des Grands Lacs compa-
rativement aux oiseaux de la cte atlantique. On a galement trouv que
les concentrations de rtinodes hpatiques variaient entre les diffrents
sites chantillonns des Grands Lacs et, surtout, que ces concentrations
taient inversement proportionnelles la contamination en dioxine asso-
cie ces sites (Spear et al., 1986). Dans le cas des golands argents du lac
Ontario, on a tabli une corrlation ngative entre le rtinol hpatique et
lAHH (Spear et al., 1992). Cependant, la corrlation ntait vidente que
pour lchantillonnage de 1987, quand les rtinodes taient leurs plus
faibles concentrations comparativement aux campagnes dchantillonnage
de 1982 et 1986 pour la mme colonie de golands.
Ces rsultats ont t corrobors dans des expriences contrles en
laboratoire dans lesquelles la tourterelle collier a servi de modle (Spear
et al., 1986) (voir les sections 3.1.1 et 3.1.2). Une autre tude portant sur la
Rtinodes 233

tourterelle collier a dmontr que le 3,3',4,4'-ttrachlorobiphnyle pou-


vait avoir des effets nfastes sur la reproduction, ce qui correspondait aux
dsquilibres en rtinol srique et en rtinodes dans le vitellus des ufs
(Spear et al., 1989) (voir les sections 3.1.3 et 3.2). Un rsultat portant aussi
sur le rtinol sanguin et les contaminants a t rapport par Grasman et
al. (1996) pour de jeunes golands argents des Grands Lacs. Dans cette
exprience, les concentrations plasmatiques de rtinol taient ngativement
corrles avec lexposition aux organochlors (BPC et DDE) pour les cinq
sites chantillonns. Les rsultats de ces tudes nous amnent consi-
drer deux points fort importants. Dabord, les rtinodes semblent affec-
ts par la contamination de type organochlor. Ils peuvent donc savrer
des biomarqueurs intressants. De plus, un dsquilibre des rtinodes
chez les oiseaux reproducteurs peut avoir un impact direct sur la repro-
duction et, consquemment, sur le maintien des populations doiseaux.
En priode de reproduction, la femelle pondeuse doit incorporer dans
les ufs en formation tous les lments dont lembryon aura besoin pour
connatre les meilleures chances de survie possibles. Entre autres lments,
les rtinodes sont dposs dans le vitellus de luf, par le biais de la cir-
culation sanguine. Non seulement les rtinodes doivent se retrouver en
quantit suffisante dans luf, mais encore faut-il que les proportions entre
les diffrentes formes de rtinodes soient respectes pour assurer les
conditions indispensables au dveloppement normal de lembryon. Si un
dsquilibre des rtinodes est perceptible chez les oiseaux nichant dans
des sites contamins, quelles en sont les rpercussions sur les ufs pondus,
garants du maintien de lespce ? La recherche sur le mtabolisme des
rtinodes in ovo sest alors impose comme une extension ce qui tait dj
connu en terme de rtinodes chez les couples doiseaux reproducteurs.
Pendant la priode de nidification de 1986 et de 1987, on a analys la
concentration en rtinodes des ufs de golands argents provenant de
sept sites des Grands Lacs. Les ufs avaient t incubs entre 2 et 12 jours,
priode pendant laquelle peu de changements mtaboliques intervien-
nent sur les rtinodes. Les rsultats dmontrent que les concentrations
de rtinol et de palmitate de rtinol varient de faon significative entre les
sites chantillonns (Spear et al., 1990). Le ratio molaire rtinol:palmitate
de rtinol a suivi la mme tendance et des corrlations significatives ont
t dmontres avec des contaminants mesurs dans ces mmes ufs :
2,3,7,8-TCDD (r = 0,87), sommation de PCDD et PCDF (r = 0,76) et leurs
quivalents toxiques en TCDD (r = 0,87). Ces rsultats, ainsi que ceux des
expriences de laboratoire (voir la section 3.1.3), nous amnent constater
que les dsquilibres en rtinodes stocks in ovo peuvent se manifester
trs tt dans le dveloppement.
234 cotoxicologie molculaire

Hormis lavantage de considrer les rtinodes de luf comme


biomarqueurs, la collecte des ufs vite davoir supprimer des oiseaux
reproducteurs pour obtenir des tissus. De plus, loutil de biosurveillance
reprsent par luf doiseau amne incontestablement la notion de trans-
fert de la femelle jusqu luf et linfluence des contaminants lors de ce
transfert ; de nouvelles avenues de recherches.
Ces expriences de terrain et de laboratoire ont valid lutilisation
des rtinodes comme biomarqueurs. Non seulement les rtinodes
peuvent trahir la contamination environnementale de type organochlor,
mais leur impact direct sur certains paramtres de la reproduction leur
donne, par rapport dautres biomarqueurs, un statut particulier et
avantageux dans un systme de biosurveillance.

Le S