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Manuscrit déposé le 6 avril 2009 Ann. Méd. Vét.

, 2009, 153, 112-128

FORMATION CONTINUE –ARTICLE DE SYNTHESE

Les techniques de biologie moléculaire d’analyse


des populations bactériennes complexes

HUYBENS N.1, MAINIL J. 2 ET MARLIER D. 1

1 Clinique Aviaire, des Rongeurs et des Lagomorphes, Département clinique des Animaux de compagnies et des Équidés, Faculté de Médecine vété-
rinaire, Université de Liège, Boulevard de Colonster, 20, bâtiment B42, 4000 Liège, Belgique
2 Secteur de bactériologie, Département des Maladies infectieuses, Faculté de Médecine vétérinaire, Université de Liège, Boulevard de Colonster, 20,
bâtiment B42, 4000 Liège, Belgique
Correspondance : Dr N. Huybens Email : nathalie.huybens@ulg.ac.be

RÉSUMÉ : Aujourd’hui, il est certain que les techniques de culture bactérienne traditionnelles
ne suffisent pas pour étudier les populations bactériennes complexes. Depuis une vingtaine
d’années, une quantité importante d’études ont démontré que la plupart des espèces ne sont
pas cultivables sur des milieux traditionnels et dans un même temps, ont approuvé l’utilisation
de la biologie moléculaire pour l’étude de ces populations complexes, qu’elles soient diges-
tives, aquatiques, des sols… Ces techniques sont nombreuses mais comprennent en général
un canevas semblable. Tout d’abord, l’ADN doit être extrait, puis amplifié, parfois traité et enfin
visualisé ou séquencé. Cette revue donne un aperçu des techniques les plus communément
employées dans l’étude des populations ainsi que les points importants à considérer avant de
choisir la ou les techniques les plus appropriées.

1. Introduction sent une pression de sélection forte de des populations bactériennes ont fait
Depuis une vingtaine d’années, les po- la part des espèces à grande vitesse de l’objet de nombreuses publications
pulations bactériennes sont fréquem- réplication et des nutriments présents dans des domaines très variés, de la re-
ment étudiées par des techniques de en trop grande ou trop faible quantité cherche fondamentale des populations
biologie moléculaire. En effet, l’étude (Nocker et al., 2007). aquatiques (Dorigo, 2005) ou du sol
des populations par isolement de bac- D’après Cases et de Lorenzo (2002), (Brim et al., 1999) à la fabrication du
téries sur milieux de culture ne permet seuls 0,5 à 10 % de toutes les espèces vin (Gonzalez et al., 2005) en passant
la mise en évidence que d’une très fai- bactériennes existantes ont été identi- par l’étude des bioréacteurs en écolo-
fiés, un grand nombre d’espèces n'étant gie (Manz, 1994 ; Wang et al., 2007)
ble proportion des espèces bactérien-
connu que par une séquence génomi- ou de la flore digestive humaine phy-
nes présentes (Nocker et al., 2007).
que. Par ailleurs, certaines bactéries siologique (Macfarlane et al., 2004  ;
Par exemple, seulement 0,01 à 0,1 %
identifiées depuis des décennies ne Bezirtzoglou et al., 2006 ; Gueimonde
des cellules bactériennes océaniques
sont toujours pas cultivables comme et al., 2007) ou pathologique (Hertogh
permettent d’obtenir une colonie sur
Treponema pallidum, bactérie respon- et al., 2006). Ces techniques sont éga-
des milieux de laboratoire (Connon lement utilisées dans des domaines
et Giovannoni, 2002 ; Sharkey et al., sable de la syphilis, identifiée depuis
1905 ou Mycobacterium leprae, res- vétérinaires tels que l’étude des flores
2004)  ; un gramme de sol contient digestives (Abecia et al., 2005  ; Mi-
1010 bactéries dont seulement 0,1 % à ponsable de la lèpre et identifiée de-
puis 1893 (Siqueira et Rocas, 2005). chelland et al., 2008) ou le contrôle sa-
1 % peuvent être cultivées (Torsvik et nitaire des denrées alimentaires d’ori-
al., 1998 ; Kirk et al., 2004) et parmi Norman Pace et collaborateurs (Lane gine animale (Brennan et al., 2002).
les 1012 bactéries contenues dans un et al., 1985  ; Stahl et al., 1985  ; Ol-
gramme de matières fécales seulement sen et al., 1986) sont les premiers à
20  % à 40  % peuvent être cultivées avoir appliqué les techniques de bio- Il existe un grand nombre de techni-
(Macfarlane et al., 2004 ; Suchodolski logie moléculaire à l'étude de la bio- ques, permettant l’étude moléculaire
et al., 2004). En outre, les bactéries diversité. Récemment, les techniques d’une population bactérienne. Ces
isolées sur milieux de culture subis- d’amplification et d’étude de l’ADN outils peuvent servir pour comparer,

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caractériser des populations ou mettre résultats très variables sont remarqués quantitative peuvent être employées
en évidence certains genres, espèces lors de tests comparatifs entre les pour quantifier la présence d’une es-
ou souches dans un échantillon. Cet kits commerciaux et les techniques pèce ou d’une population bactérienne
article expose une série de techniques internes aux différents laboratoires spécifique. Un gène cible est amplifié
fréquemment employées dans l’étude (Schuurman et al., 2007 ; Duenngai et par Q-PCR. En connaissant le nombre
des populations bactériennes. al., 2008). De même, les échantillons de copies rencontrées dans le géno-
provenant de sols contiennent égale- me bactérien, le nombre de bactéries
ment des inhibiteurs de PCR (Kirk et porteuses de ce gène présentes dans
2. Extraction du al., 2004), en particulier l’acide humi- l’échantillon de départ peu alors être
matériel génétique que (Dong et al., 2006) et les métaux estimé. Le choix du gène permet de
Avant toute chose, l’ADN  bactérien lourds (Wilson, 1997). Différents kits quantifier l’ensemble de la population,
doit être extrait de la matrice de dé- et techniques sont décrits et compa- une famille on une espèce bactérienne
part. Les méthodes d’extraction les rés dans la littérature (Maarit Niemi présente dans l’échantillon (Sharma et
plus utilisées font appel à trois étapes : et al., 2001 ; Kirk et al., 2004 ; Dong al., 2007).
une lyse par un détergent, une incuba- et al., 2006 ; Rosa et al., 2006 ; Whi- L’ADN est très stable dans le milieu
tion avec une protéase et la précipita- tehouse et Hottel, 2007). Enfin des contrairement à l’ARN. L'étude de
tion des acides nucléiques (Meade et techniques très complexes peuvent ce dernier est donc plus intéressante
al., 1982). La technique d’extraction être créées pour s’adapter au mieux si la viabilité d’une population bacté-
d’ADN bactérien la plus simple est à la source d’ADN. Par exemple, les rienne est l'objet des recherches (van
un traitement thermique. Les cultures prélèvements d’origine volcanique der Vliet et al., 1994). Les recherches
bactériennes sont plongées pendant 5 demandent un traitement particulier peuvent cibler aussi bien l’ARN mes-
minutes dans un bain marie à 96°C. d’ultrasons, de broyage, congélation et sager (ARNm) que ribosomial (ARNr)
Cette technique suffit pour extraire décongélation. Ils ont récemment fait (Lahtinen et al., 2008). La quantité et
l’ADN des cellules mais n’élimine l’objet d’un article de synthèse (Her- le type d’ARN présents sont relatifs à
pas les composés inhibiteurs des réac- rera et Cockell, 2007). l’activité et à la croissance bactérienne
tions d'amplification  ; elle convient D’autres éléments à prendre en (McClelland et Welsh, 1994  ; Soren-
donc très bien pour des cultures pures compte lors du choix de la technique sen et Teske, 2006 ; Hoshino et Mat-
mais pas pour des échantillons de ter- d’extraction est le temps nécessaire à sumoto, 2007).
rains (Sweeney et al., 2006). En plus la manipulation et le coût de revient La reverse transcriptase (RT) permet
des différents protocoles mis au point, de chaque extraction. Les techniques la création à partir de l’ARN d’un
il existe des kits commerciaux pour commerciales reviennent toujours brin d’ADN complémentaire (ADNc)
l’extraction d’ADN. Deux techniques plus cher (Zhang et al., 2006) mais, à (Freeman et al., 1999) qui peut ensuite
sont communément employées  ; le l’exception du traitement thermique, être amplifié par une PCR classique.
passage sur colonnes de silice (Boom demandent moins de temps (Schuur- Ces deux réactions peuvent être réali-
et al., 2000) ou l’utilisation de billes man et al., 2007). sées en une ou deux étapes (Sharkey
magnétiques (Alderton et al., 1992).
et al., 2004). La RT-PCR permet donc
Dans les deux cas, le principe est le
la comparaison de la composition, de
même, l’ADN est lié à la membrane 3. Amplification du la viabilité ou de l’activité de popula-
de la colonne ou aux billes magnéti- matériel génétique tions bactériennes. Récemment, Halet
ques et l’échantillon est débarrassé par polymérisation en et collaborateurs (2006) ont étudié
des différents contaminants. Ensuite, chaîne l’évolution de l’activité méthano-
l’ADN est séparé de son support.
trophique d’une flore bactérienne de
a. Principes généraux de la
compost grâce à l’ARNr.
polymérisation en chaîne
Ces différentes méthodes permettent Ces amplifications ne sont pas sans
l’extraction d’une quantité et d’une La quantité d’ADN récupéré lors de
conséquence sur la représentativité
qualité variable d’ADN (Maarit Niemi l’extraction est trop faible pour être
des espèces présentes dans l’échan-
et al., 2001). Il est évident que l’ADN considérée comme un échantillonnage
tillon. En effet, les effets stochastiques
de toutes les espèces bactériennes, représentatif. Afin de comparer ou
des premiers cycles de la PCR peu-
gram+ et gram-, présentes dans un d’étudier l’ADN extrait, celui-ci doit
vent entraîner de grandes différences
échantillon ne peut être extrait avec donc être amplifié par la réaction de
entre les séquences présentes en faible
la même efficacité (Carroll et al., polymérisation en chaîne (PCR). Cette
quantité dans l’échantillon (Peccoud
2000  ; Sharma et al., 2007). Un pre- technique a été mise au point en 1986
et Jacob, 1996), tandis que l'effet pla-
mier biais existe donc dès cette étape. par Mullis et collaborateurs (1986) ce
teau diminue la représentation finale
De nombreux articles de comparaison qui lui valut le prix Nobel de chimie des séquences présentes en grandes
de méthodes d’extractions (Maarit en 1993. La PCR a révolutionné la quantités dans l’échantillon. Ce der-
Niemi et al., 2001 ; Schuurman et al., biologie moléculaire comme peuvent nier effet est expliqué notamment par
2007  ; Whitehouse et Hottel, 2007) le montrer les 247 920 articles publiés le ré-appariement des deux brins entre
ont été publiés. Le premier critère est depuis sa découverte (PubMed, fé- eux lors des derniers cycles (Mathieu-
toujours de choisir la méthode d'ex- vrier 2009). Une vingtaine de cycles Daude et al., 1996). Ces biais sont pré-
traction en fonction de l’origine des permettent de multiplier le nombre de sents dans toutes les études par PCR.
prélèvements. Par exemple, les matiè- molécules d’ADN présentes par un Afin de les contourner, un nombre va-
res fécales contiennent énormément million (Lalam, 2006). riable de cycles peut être comparé ou
d’inhibiteurs des réactions d'ampli- La PCR quantitative (real-time PCR les PCR peuvent être réalisées en triple
fication (Duenngai et al., 2008). Des ou Q-PCR) ainsi que la PCR semi- puis regroupées pour les analyses.

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Enfin, les amorces utilisées lors des ribosomiaux le 23S et le 5S et d’une de population bactérienne (Wang et
PCR sont aussi une source de biais. trentaine de protéines (Noller, 1984  ; al., 2007). Certaines bactéries ne sont
Comme l’ont démontré Yu et collabo- Moore et Steitz, 2003). Les gènes co- connues que par la séquence de leur
rateurs (2004), le choix des séquences dant pour ces trois ARN ribosomiaux gène 16S. Rösch et collaborateurs
étudiées et des amorces différentes sont appelés respectivement 16SrD- (2006) utilisent alors le terme ribotype
utilisées pour des séquences identi- NA, 23SrDNA et 5SrDNA. Ces trois au lieu d’espèce ou souche.
ques donnent des profils parfois très gènes, très conservés au sein de toutes Un inconvénient à l’utilisation du
différents pour une même population. les eubactéries sont situés sur le même gène  16S est son nombre variable de
opéron au sein du génome bactérien. copies. En effet, certaines espèces
b. Les polymérisation en chaîne En fonction des espèces bactériennes, peuvent posséder entre 1 et 15 opé-
ciblant les ARN ribosomiaux ils sont séparés par des zones plus ou rons ribosomiques dans leur génome
Les PCR présentées plus haut, qu’elles moins longues, codantes ou non, que (Fogel et al., 1999), ce qui ne permet
soient aléatoires ou ciblant les REP, ne l’on appelle les Internally Transcribed pas une étude quantitative des espèces
permettent pas toujours d’identifier Spacer (ITS) (Jensen et al., 1993). présentes dans la flore.
l’espèce dont l’ADN a été amplifié,
à l’inverse des gènes présentés dans Un grand nombre de séquences diffé-
i. 16SrDNA
ce chapitre, les gènes des ARN ribo- rentes d'amorces ciblant le gène  16S
Le gène 16SrDNA est composé de a été publié. Elles peuvent être uni-
somiaux. Ces derniers ont été et sont régions conservées permettant l’ap-
toujours fortement étudiés aussi bien verselles (Baker et al., 2003) ou
pariement d’amorces « universelles » spécifiques comme par exemple les
en systématique que dans l’étude de et de 9 zones hypervariables (de V1 à
populations. C’est la présence de zo- amorces pour Alphaproteobacteria,
V9) (Baker et al., 2003) permettant la Betaproteobacteria, Bacilli, Actino-
nes très conservées et de zones hyper- distinction de l’espèce (Van de Peer et
variables qui rend ces gènes très inté- bacteria, Planctomycetes (Blackwood
al., 1996). La séquence du 16SrDNA et al., 2005), ou encore pour les cya-
ressants dans l’étude de populations. est utilisée pour clarifier la taxono- nobactéries (Boutte et al., 2006). Les
Le ribosome bactérien est constitué de mie de certains taxons (McInerney et connaissances dans ce domaine étant
2 sous unités : 50S et 30S (figure 1). al., 1995). Une banque de données, le en évolution exponentielle, de moins
La sous-unité 30S est constituée d’un Ribosomal Database Project lui est en moins d’amorces sont encore qua-
ARN ribosomial, le 16S et d’une ving- presqu’entièrement dédiée (Cole et al., lifiées d’universelles (Baker et al.,
taine protéines, tandis que la sous 2007). Le gène 16SrDNA est de loin 2003).
unité 50S est composé de deux ARN le gène le plus employé dans l’étude

Figure 1 : composition du ribosome procaryote et opéron rDNA

L’opéron rDNA contient les séquences 16SrDNA, 23SrDNA et 5SrDNA codant pour les ARN ribosomiaux (16SrRNA, 23SrRNA et 5SrRNA), et 2
espaces intergéniques appelés ITS. Les protéines constituant les sous unités du ribosome avec les ARN proviennent d’autres opérons du génome.

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ii. 23SrDNA bactériennes sont par exemple le gène au maximum le matériel comme la
Le gène 23SrDNA est l’homologue NifH (nitrogénase réductase), très méthode (même polymérase, même
du 16S pour la grande sous unité du conservé chez beaucoup d’organismes cycleur, même manipulateur…), la re-
ribosome. Il contient également des mais pas présent dans toutes les es- productibilité de la manipulation peut
régions conservées et variables mais pèces (Rösch et al., 2006), le gène de être fortement améliorée (Fraga et al.,
sa séquence générale est plus variable la citrate synthétase (gltA) (Birtles et 2005).
que celle du 16S (Van de Peer et al., Raoult, 1996), ou celui de la riboflavi- Bien que cette technique soit le plus
1996). Les résultats obtenus avec le ne synthétase (Bereswill et al., 1999). souvent employée dans des études
gène 23S sont similaires à ceux obte- d. Les polymérisations en chaîne d’écotoxicologie (De Wolf et al.,
nus avec le 16S (Hopfl et al., 1989). 2004  ; Atienzar et Jha, 2006), elle a
aléatoires
été employée récemment pour compa-
Comme dit plus haut, l’amplifica- rer les flores des bioréacteurs (Pravin
iii. Les espaces intergéniques de l'ADN
tion est nécessaire pour travailler sur et al., 2007), les communautés bacté-
ribosomial (ITS) l’ADN ou l’ARN. Il ne faut pas perdre riennes du sous-sol (Findlay et Sinsa-
Beaucoup plus utilisés que le 23SrD- de vue que les cibles des PCR doivent baugh, 2006) et les flores de surface de
NA, les espaces intergéniques de permettre de représenter toutes les es- fromages (Brennan et al., 2002).
l'ADN ribosomial (Internally Trans- pèces présentes dans un échantillon
cribed Spacer ou ITS) sont des sé- dans le cadre d’une étude de popula-
quences très variables en taille et en tion. Une série de techniques utilisant ii. La réaction de polymérisation
composition dans l’opéron des trois des amorces s’hybridant très facile- en chaîne utilisant des amorces
ARNr (16S, 23S, 5S). Le premier et le ment dans tous les génomes permet arbitraires (AP-PCR)
plus utilisé est présent entre l’extrémi- donc d’amplifier des zones inconnues. La réaction de polymérisation en
té 3’ du 16SrDNA et l’extrémité 5’ du Ces amorces sont souvent de faible chaîne utilisant des amorces arbitrai-
23SrDNA (Gonzalez et al., 2003). Sa taille. res (Arbitrarily-Primed Polymerase
taille varie de 400 à 1600  pb (Fisher Chain Reaction ou AP-PCR) a été pour
et Triplett, 1999). Il peut contenir des i. L’amplification aléatoire d'ADN la première fois utilisée par Welsh et
séquences codantes pour des ARN polymorphe McClelland (1990) pour caractériser
de transfert ou aucune séquence co- rapidement cinq souches de staphy-
dante (Boyer et al., 2001). Les régions L’amplification aléatoire d'ADN poly-
locoques et onze souches de strepto-
conservées du gène 16S et 23S l’en- morphe (Random Amplified Polymor-
coques. Des amorces d’environ 20
tourant permettent l’appariement des phic DNA ou RAPD) est une techni-
paires de bases sont sélectionnées au
amorces universelles ou plus spécifi- que qui a été développée par Williams
hasard. La PCR se fait en deux temps,
ques et donc l’amplification de l’ITS. (1990) afin de construire des cartes
une première série de cycles (2 à 5)
génétiques. Le principe consiste à uti-
Tout comme le 16SrDNA, l’ITS peut avec une température d’appariement
liser des amorces d’environ 10 paires
être présent en multiples copies dans basse, de 40°C (Welsh et McClelland,
de bases avec des températures d’ap-
un même génome (Sadeghifard et 1990) à 50°C (Peinado et al., 1992) et
pariement basses, 36°C (Williams,
al., 2006) mais également variable une seconde série de cycles (25 à 35)
1990) à 45°C (Pravin et al., 2007).
d’une copie à l’autre sur le chromoso- avec une température d’appariement
Des appariements plus ou moins spé-
me (Nagpal et al., 1998). L’analyse de plus élevée, de 50°C à 65°C (Sundin
cifiques ou des mésappariements per-
l'espace intergénique de l'ADN ribo- et al., 1994). Le principe est sembla-
mettent l’amplification d’une série de
somial (Ribosomal Intergenic Spacer ble à celui de la RAPD, les amorces
fragments de tailles différentes. Les
Analysis ou RISA) est le nom donné s’hybrident de manière plus ou moins
fragments obtenus dépendent de l’ap-
à l’étude par PCR puis électrophorèse pariement des amorces et de la distan- spécifique dans le génome, favorisées
de l’ITS (Nocker et al., 2007). ce entre ces appariements (De Wolf et par les premiers cycles à température
al., 2004). d’appariement basse. Le nombre de
c. Les autres gènes d’intérêt dans fragments obtenus dépend du nombre
l’étude de populations Le peu de matériel nécessaire à la d’amorces appariées.
RAPD en fait une technique de base
D’autres gènes peuvent être la cible de Un manque de spécificité et de repro-
particulièrement intéressante pour
PCR dans le cadre d’étude de popula- ductibilité est fréquemment mention-
observer des variations de population
tion. La plupart sont composés de zo- né (McClelland et Welsh, 1994) mais
(Atienzar et Jha, 2006) même si la fai-
nes conservées et de zones variables. ble reproductibilité entre laboratoires l’expérience en trois réplica dévelop-
Le gène rpoC1 (RNA polymérase est un sujet fréquent de critiques (Sa- pée par Cusick et O’Sullivan (2000)
C1) par exemple, n’existe qu’en une velkoul et al., 1999). La présence d’ar- permet d’obtenir des résultats fiables.
seule copie dans le génome bactérien téfacts a souvent été décrite, présence Une certaine confusion existe entre
(Bergsland et Haselkorn, 1991). Ceci d’amplification dans le témoin négatif l’AP-PCR et la RAPD. Par exem-
permet une quantification des espèce (Mullis, 1991) et variation entre analy- ple, Prieto et collaborateurs (2007)
présentes plus fidèle que celle obtenue ses d’un même échantillon (Ellsworth utilisent le terme AP-PCR dans leur
en utilisant le gène 16SrDNA (Jame- et al., 1993). Afin de contrôler les ré- comparaison de flore bactérienne des
son et al., 2007). RpoC1 est également sultats obtenus, il convient de multi- vignobles chiliens alors qu’au vu des
employé dans la génétique eucaryote plier les essais en variant la quantité amorces utilisées (10 pb) et des cycles
car il est présent dans l’ADN des chlo- d’ADN de départ (Atienzar et Jha, de PCR programmés (une seule tem-
roplastes (Fritsch, 2001). 2006). En utilisant une concentration pérature d’appariement), la technique
D'autres gènes potentiellement inté- d’ADN suffisante sans être trop élevée employée est vraisemblablement une
ressants pour l'étude des populations (entre 10 et 100ng) et en standardisant RAPD. Plusieurs études comparatives

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Figure 2 : principe général de l’Amplified Fragment-Length Polymorphism (AFLP)

entre des souches de Pseudomonas iv. Le polymorphisme de longueur des à-dire simuler des PCR et des gels
résistantes aux antibactériens ont été fragments amplifiés grâce à des programmes informatiques
réalisées grâce à l’AP-PCR (Sundin et En raison des difficultés rencontrées (Bikandi et al., 2004). Ces simulations
al., 1994 ; Bultreys et Gilbert, 2003). avec les techniques d’amplification permettent de cibler au mieux les en-
aléatoires, Vos et collaborateurs (1995) zymes et amorces à utiliser lors de la
iii. L’empreinte génétique de produits ont développé une nouvelle technique réalisation de l’expérience mais néces-
d’analyse génomique, le polymor- sitent de connaître la séquence géno-
d'amplification
phisme de longueur des fragments mique complète de certaines espèces
L’empreinte génétique de produits présentes dans l’échantillon.
amplifiés (Amplified Fragment-Length
d'amplification (DNA Amplification Polymorphism ou AFLP). Le principe L’AFLP est une technique puissante
Fingerprinting ou DAF) est analo- de cette technique est schématisé dans pour différencier des espèces voire
gue à la RAPD et l’AP-PCR (Atienzar la figure 2. L'ADN génomique est di- des sous-espèces (Savelkoul et al.,
et Jha, 2006). Les différences sont  : la géré par deux enzymes. Des adapta- 1999). Elle a été utilisée pour com-
longueur des amorces, généralement de teurs sont ajoutés aux extrémités des parer des populations bactériennes de
5 à 10 pb (Jayarao et al., 1992) et une sites de restriction. Les amorces peu- sols subissant une faible augmentation
température d’appariement très basse de vent ensuite se fixer sur les fragments en hydrates de carbone (Rosa et al.,
30°C (Baird et al., 2006). La longueur obtenus et ceux-ci sont amplifiés. La 2006), caractériser des types de Clos-
des amplicons peut être très courte, à PCR peut être réalisée en plusieurs tridium botulinum (Keto-Timonen et
partir de 50 pb (Atienzar et Jha, 2006 ; étapes : une première avec des amor- al., 2005) ou encore observer l’impact
Baird et al., 2006). Cette technique a été ces dont la séquence est identique à des dilutions sur la croissance d’une
utilisée pour contrôler l’évolution de po- celle des adaptateurs et qui amplifie population bactérienne (Franklin et
pulations bactériennes de bioréacteurs ainsi tous les fragments  ; la seconde al., 2001).
(Breen et al., 1995). avec des amorces possédant de 1 à 3
nucléotides supplémentaires en 3’ sé-
Une confusion existe entre les trois tech- v. Les zones avec répétitions
lectionnant ainsi un plus petit nombre
niques de PCR aléatoire (DAF, AP-PCR de fragments étant donné que ceux- palindromiques extragéniques
et RAPD). En effet, excepté la longueur ci peuvent être très nombreux (Vos Les zones avec répétitions palindromi-
des amorces utilisées et une série de cy- et al., 1995). L’utilisation d’amorces ques extragéniques (Repetitive Extra-
cles différents pour l’AP-PCR, ces trois fluorescentes permet une comparaison genic Palindromic ou REP) séparent
techniques sont très semblables. Men standardisée de cette technique par les zones codantes sur le génome des
et collaborateurs (1999) utilisent une électrophorèse capillaire (Savelkoul eubactéries (Stern et al., 1984). Ces sé-
technique correspondant à la définition et al., 1999). Il existe de nombreuses quences sont présentes en grande quan-
de AP-PCR ; cependant ils la nomment possibilités pour réaliser des AFLP in tité dans le génome bactérien, il peut
DAF dans leur article. silico (Meudt et Clarke, 2007), c’est- en exister jusqu’à 1000 copies dans le

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chromosome d’E. coli (Higgins et al., La MDA permet essentiellement de l’ADN à des sites bien précis ou les
1988). Les séquences présentent entre pré-amplifier des échantillons pauvres substances dénaturant l’ADN, c'est-à-
les REP peuvent être très variables au en ADN ou contenant de fortes doses dire séparant les deux brins de la mo-
sein d’une même espèce. En effet, les d’inhibiteurs. Les premiers à avoir lécule d’ADN.
séquences palindromiques permettent utilisé la MDA sur des populations
l’insertion ou la délétion d’opérons ou bactériennes sont Gonzalez et collabo- a. Les restrictions
d’éléments génétiques mobiles (Tobes rateurs (2005). Une simple extraction La digestion des amplicons obtenus
et Pareja, 2006). et une MDA a permis d’obtenir un au moyen d'une ou plusieurs enzy-
Les amorces employées lors des REP- ADN de qualité suffisante pour réali- mes de restriction permet d’obtenir
PCR sont des séquences consensus de ser leur PCR alors qu’auparavant, une des fragments de différentes tailles.
différents REP contenant beaucoup complexe technique d’extraction était Cette technique porte le nom de poly-
d’inosine. Cette dernière est capable nécessaire pour éliminer, souvent peu morphisme de longueur des fragments
de s’apparier avec des liaisons faibles efficacement, les inhibiteurs de PCR. de restriction (Restriction Fragment
aux quatre nucléotides de base (Versa- Depuis, plusieurs études ont utilisé la Lenght Polymorphism ou RFLP). Une
lovic et al., 1991). Cette technique a MDA pour pré-amplifier de l’ADN, fois la restriction réalisée, les frag-
récemment été employée dans l’ana- notamment une étude métagénomique ments peuvent être visualisés sur gel
lyse des flores présentes sur les raisins de la population bactérienne des tour- d’agarose, de polyacrylamide ou par
(Gonzalez et al., 2005) et dans la mise bes (Chen et al., 2008). une électrophorèse en champs pulsés
en évidence de bactéries productrices Une autre application directe du MDA (Soultos et Madden, 2007). Ils peu-
de biosurfactant (Bodour et al., 2003). est l’amplification de l’ADN d’une vent également être séquencés après
cellule unique (Raghunathan et al., extraction du gel et clonage (Nocker
2005). Les quelques femtogrammes et al., 2007). L’Amplified Ribosomal
4. L’amplification d’ADN contenu dans une seule cellule DNA Restriction Analysis (ARDRA)
par déplacements peuvent être amplifiés pour obtenir est une RFLP réalisée sur le gène 16S
multiples une pureté finale de minimum 30  % (Moyer et al., 1994).
Les extractions d’ADN et d’ARN ainsi d’ADN génomique, les 70  % restant L’ARDRA est une technique analy-
que leur amplification par PCR et RT- étant des artefacts et quelques conta- tique particulièrement intéressante
PCR sont devenus monnaie courante minations. La MDA sur cellule unique pour détecter des changements au sein
dans les laboratoires de bactériologie. permet de séquencer sans amplifica- de populations connues, mais moins
Par contre, de nouvelles techniques, tion secondaire 62 à 66 % du génome efficace pour étudier la biodiversité
telles que l’amplification par dépla- (Zhang et al., 2006). Il existe différen- globale d’un échantillon (Kirk et al.,
cements multiples sont en développe- tes méthodes d’isolation des cellules : 2004). Elle a été récemment employée
ment. Cette technique, beaucoup plus les dilutions (Zhang et al., 2006), les pour la caractérisation et la comparai-
récente que la PCR, permet d’amplifier manipulations sous microscope (Las- son des populations bactériennes de
de très faibles quantités d’ADN, ce qui ken, 2007  ; Ishoey et al., 2008), la réserves de pétrole (Sette et al., 2007)
est très utile pour des échantillons pré- cytométrie de flux (Dean et al., 2001 ; ou des populations bactériennes du
cieux comme ceux de médecine légale Podar et al., 2007) ou sur des micropu- plancton arctique (Zeng et al., 2007).
ou de paléontologie. ces (Marcy et al., 2007). Dans ce der- D’autres gènes sont employés comme
nier cas, les MDA sont réalisées dans base de RFLP, notamment l’ITS (Toth
L’amplification par déplacements mul- des réacteurs de 60 nl.
tiples (Multiple Displacement Ampli- et al., 2001), également utilisé pour les
fication ou MDA) est une technique La seule étude de population ayant uti- populations fungiques (Medina et al.,
d’amplification génétique mise au point lisé le MDA sur cellule isolée est celle 2005), et le gène rpoC1 (Jameson et
par Dean et collaborateurs (2001). Les de Kvist et collaborateurs (2007) qui al., Epub).
propriétés de la polymérase du bacté- ont étudié après analyses traditionnel-
les, une des archéobactéries les plus b. La dénaturation
riophage φ29 sont utilisées pour réaliser
une amplification non spécifique des représentées dans leur échantillon de Le Polymorphisme de conforma-
génomes présents dans un échantillon. sol. Cette technique pourrait être des tion des simples brins (Single Strand
Cette polymérase possède le potentiel plus efficaces pour faciliter les ana- Conformation Polymorphism ou
de séparer les brins hybridés ce qui rend lyses des clonages shotgun (Lasken, SSCP) est une technique mise au point
inutiles les cycles de dénaturation. Elle 2007). par Orita et colaborateurs (1989) dans
possède une activité 5’exonucléase la le cadre de l’analyse du génome hu-
rendant très spécifique. Elle est active main. La première équipe à l’avoir
à 30°C et est inactivée à 65°C (Dean et 5. Traitement de utilisée pour une étude de population
al., 2001). Enfin, elle permet d’ampli- l’ADN amplifié avant bactérienne est celle de Lee et colla-
fier des fragments jusqu’à 12 kb (Las- visualisation borateurs (1996). L’ADN double brin
ken, 2007). Ce principe a été développé Une fois l’ADN ou l’ARN extrait, la est dénaturé par un agent chimique,
pour amplifier quelques femtogrammes ou les séquences amplifiées, les am- le plus fréquent étant la formamide
d’ADN précieux comme par exemple plicons peuvent soit être visualisés di- mais l’hydroxyde de sodium, l’urée et
en médecine légale. Malheureusement, rectement soit, après traitement (s’ils l’hydroxyde de méthylmercurique ont
cette technique génère souvent des sont de la même taille par exemple), également été employés (Nataraj et al.,
biais de surreprésentation de certaines afin d’afficher les différences au sein 1999). L’ADN simple brin adopte en-
zones du génome et de sous représen- de la population étudiée. Parmi les suite une structure tridimensionnelle,
tation d’autres (Lasken, 2007 ; Ishoey traitements possibles, il existe les possédant un encombrement stérique
et al., 2008). enzymes de restrictions qui coupent particulier. Cette configuration peut

117
varier suite à la mutation d’un seul nu- d’ADN, chargées négativement, sont Gel Electrophoresis ou DGGE) et les
cléotide (Orita et al., 1989). La sépara- soumises à un courant électrique qui électrophorèses en gradient de tem-
tion des différents brins peut ensuite se les fait migrer dans le gel. En fonction pérature (Temperature Gradient Gel
réaliser sur un gel de polyacrylamide de la concentration de celui-ci en aga- Electrophoresis ou TGGE) sont des
(Hayashi, 1991) ou par électrophorèse rose, certaines tailles de fragment se- techniques d’électrophorèse dénatu-
capillaire (Baba et al., 2003). ront mieux séparées que d’autre. Alors rantes mises au point par Fischer et
Les espèces représentant moins qu’un gel à 0,5 % permet la séparation Lerman (1983) pour la première et Ro-
de molécules de 30 kb à 1 kb, il faudra senbaum et collaborateurs (1987) pour
d’1,5 % de la population étudiée peu-
une concentration de 1,5  % pour sé- la seconde. Les molécules d’ADN de
vent être mises en évidence par la
parer des fragments de 3 kb à 200 pb petites tailles (entre 80 et 500  pb) se
SSCP (Lee et al., 1996). Un des plus
(Ausubel et al., 1989). Les gels d’aga- déplacent au sein du gel et subissent
gros problèmes de la SSCP est le ré-
rose sont utilisés pour l’analyse des une dénaturation progressive durant
appariement des brins séparés (Sel-
ITS (Nagpal et al., 1998), des RFLP l’électrophorèse en fonction de leur
vakumar et al., 1997). La conséquence
(Toth et al., 2001), des PCR aléatoires température de fusion (Tm). Une fois
de ce ré-appariement est la présence
(Pravin et al., 2007) et des REP-PCR les brins dénaturés, leur encombre-
de trois (au lieu de deux) bandes pour
(Versalovic et al., 1991). ment stérique est trop important pour
le même amplicon (double brin, sim-
continuer la migration dans le gel.
ple brin Watson et simple brin Crick) b. Sur gel de polyacrylamide Ces techniques permettent donc de
(Schwieger et Tebbe, 1998). Ce phé-
Les gels de polyacrylamide (Poly- séparer des fragments de même taille
nomène peut être diminué par l’ajout
Acrylamide Gel Electrophoresis ou en fonction de leur Tm, c'est-à-dire
d’un groupe phosphate à l’extrémi-
PAGE) sont utilisés pour des frag- de leur composition nucléotidique :
té  5’ lors de la PCR et une dénatura-
ments plus petits que les gels d’aga- une augmentation du pourcentage en
tion employant l’exonucléase lambda GC (3 ponts hydrogènes) par rapport
(Schwieger et Tebbe, 1998). rose, en général inférieurs à 1  kb. À
nouveau, les échantillons déposés au pourcentage en AT (2 ponts hydro-
Récemment, Ye et collaborateurs (Ye sur le gel sont séparés en fonction de gènes) augmente le Tm de la molé-
et al., 2007) ont utilisé cette techni- leur taille. Tout comme pour les gels cule pour une taille donnée (Fischer et
que pour étudier les effets du pH sur d’agarose, une concentration plus éle- Lerman, 1983).
les populations bactériennes lors de la vée permet une séparation plus nette Afin d’éviter la séparation complète
fermentation des composts. des fragments de très petites tailles des deux brins d’ADN, une séquence
(Ausubel et al., 1989). Ils sont utilisés riche en GC est ajoutée à l’une des
pour séparer les PCR d’ITS (Jensen et amorces lors de la PCR. Cette pince
6. Visualisation de l’ADN al., 1993 ; Prieto et al., 2007), les frag- GC permet de garder les deux brins
par électrophorèse ments de RFLP (Prieto et al., 2007) ou d’ADN attachés par cette extrémité
Une fois les différentes étapes décri- les simples brins des SSCP (Lee et al., grâce à la série de triples liaisons hy-
tes plus haut réalisées, il faut visuali- 1996 ; Smalla et al., 2007). drogènes entre les guanines et les cy-
ser le résultat de l’amplification ou du tosines (Myers et al., 1985). L’ajout de
traitement réalisés sur les amplicons. c. En champ pulsé cette pince GC entraine un rendement
Pour ce faire, différents types d’élec- L’électrophorèse en champ pulsé faible de la PCR. Pour augmenter le
trophorèses peuvent être réalisés, de la (Pulsed Field Gel Electrophoresis ou rendement, différentes techniques
plus classique sur gel d’agarose à des PFGE) est une électrophorèse sur gel peuvent être employées.  Le nombre
processus complexes tels que des gels d’agarose utilisant des champs électri- de cycles, temps d’appariement et la
contenant des gradients d’agents dé- ques alternés. Les changements de di- quantité d’ADN de départ peuvent
naturants et alliant donc dans la même rection des molécules en fonction de être augmentés (Abecia et al., 2005).
étape le traitement de l’ADN et sa vi- leur structure tridimensionnelle durant Des PCR nichées, qui amplifient
sualisation. la migration font varier leur distance l’ADN en deux temps, avec deux cou-
L’électrophorèse permet de sépa- totale de migration (Lai et al., 1989). ples d'amorces dont le second amplifie
rer des particules en fonction de leur La PFGE permet de séparer des frag- un fragment interne au premier, peu-
charge électrique et de leur taille. Les ments de très grande taille, jusqu’à vent être employées (Randazzo et al.,
molécules d’ADN, chargées négati- 10  Mb, alors que les électrophorèses 2005 ; Boutte et al., 2006) ou des PCR
vement, sont attirées vers l’anode au traditionnelles séparent des fragments «  touchdown  », dont la température
travers d’un réseau solide non mobile de maximum 50 kb (Herschleb et al., d’appariement augmente progressive-
(généralement un gel en agarose ou 2007). ment à chaque cycle (Suchodolski et
polyacrylamide). Ce réseau permet La PFGE peut être utilisée sur des al., 2004 ; Yu et Morrison, 2004).
de retenir les molécules en fonction génomes ou métagénomes entiers res- Cette technique offre des résultats
de leur taille, les plus petites gagnant treints avec des enzymes de restrictions semblables à la SSCP, une différence
plus rapidement l’anode que les gran- coupant peu fréquemment (Quelle et d’un seul nucléotide pouvant être
des. Plus le réseau est dense, mieux Catalano, 2001 ; Nagase et al., 2002), détectée lorsque l’espèce représente
les molécules de petites tailles seront sur des PCR aléatoires (Brennan et al., plus de 2  % de la population étudiée
séparées (Ausubel et al., 1989). 2002) ou des RFLP (Satokari et al., (Myers et al., 1985). Cependant, des
2003 ; Soultos et Madden, 2007). trainées d’ADN sont souvent présen-
a. Sur gel d’agarose tes sur les gels lorsque la population
Les gels d’agarose permettent la sépa- d. En gradient de dénaturant est trop riche. De plus, cette technique
ration de fragments d’ADN de relati- Les électrophorèses en gradient de ne permet pas la mise en évidence des
vement grandes tailles. Les molécules gel dénaturant (Denaturing Gradient populations minoritaires (Rösch et al.,

118
2006). Les bandes obtenues peuvent technique. Les fragments terminaux La dynamique des populations bacté-
être séquencées directement après ex- fluorescents d’ADN restreints pos- riennes est l’objet d’études fréquentes
traction ou après un clonage. sèdent une taille variable en fonction par ARISA, par exemple l’effet de la
La validation de la DGGE comme de leur séquence et, donc, des pics de composition minérale du sol (Carson
technique d’étude de population a été fluorescence sont enregistrés à diffé- et al., 2007) ou la colonisation de l’in-
réalisée par Muyzer et collaborateurs rents moments. Les profils obtenus testin des dindes (Scupham, 2007).
(1993). Yu et Morrison (2004) ont par T-RFLP possèdent une grande Cette dernière étude a identifié une
comparé les différentes régions hy- répétabilité (Kitts, 2001). Le gène le période de transition de la flore in-
pervariables du gène 16S par DGGE. plus souvent employé est le 16SrD- testinale des dindes vers 12 semaines
Des flores caecales de lapins traités NA. Les profils obtenus peuvent être d’âge. L’ARISA est également em-
aux antibiotiques ont été comparées enregistrés dans des bases de données, ployée dans l’étude des populations
par DGGE (Abecia et al., 2005) dé- comme, par exemple, la Ribosomal fongiques (Ranjard et al., 2001).
montrant un changement de flore spé- Database Project (Cole et al., 2007),
ce qui permet aujourd’hui d’identifier c. Avec ADN simple brin
cifique en fonction de l’antibiotique
utilisé. Récemment, des flores bacté- une espèce présente sur un profil de T- Les différents brins obtenus par SSCP
RFLP sans passer par un séquençage peuvent aussi être séparés par élec-
riennes du sol ont été comparées par
(Marsh et al., 2000). Récemment, un trophorèse capillaire. Cette technique
différentes techniques de biologie mo-
outil informatique permettant une aide est appelée l’électrophorèse capillaire
léculaire notamment la DGGE (Smalla
au choix de l’enzyme lors de T-RFLP du polymorphisme de conformation
et al., 2007).
a été mis en place (Collins et Rocap, des simples brins (Capillary Electro-
e. Sur gel de polyacrylamide en deux 2007). phoresis Single-Strand Conformation
dimensions (PAGE-2D) La taille des pics de fluorescence est Polymorphism ou CE-SSCP). Elle a
un bon outil de quantification. En effet été utilisée très récemment dans une
Les PAGE-2D sont des électrophorè- comparaison de flores des matières
ses en deux temps. La première migra- les pics les plus élevés sont les séquen-
ces le plus souvent mises en évidence fécales et des cæcotrophes de lapins
tion a lieu sur un gel non dénaturant avant et après intervention chirurgi-
et permet de séparer les molécules lors de clonages (Rahalkar et Schink,
2007). De part sa rapidité, sa sensibi- cale sur le tractus digestif (Michelland
en fonction de leur taille. La colonne et al., 2008). Cette étude démontre que
est excisée et déposée sur le second lité et sa reproductibilité, la T-RFLP
peut être un outil de diagnostic effi- les flores des matières fécales et cæ-
gel contenant un gradient de dénatu- cotrophes sont semblables et qu’une
rant, tout comme dans la DGGE. La cace (Thies et al., 2007).
intervention sur le tractus digestif du
seconde migration permet donc de Jensen et collaborateurs ont très ré- lapin entraîne un changement notable
séparer les amplicons en fonction de cemment utilisé cette technique pour de la flore.
leur séquence. Une pince G-C est donc étudier la flore des racines et des
nécessaire dans cette technique. La feuilles de la zostère marine (Jensen et d. Séquençage
PAGE-2D a été employée sur les ITS al., 2007). Les effets de la déforesta- Le séquençage est la technique appor-
de bactéries des sols (Jones et Thies, tion et de la reforestation sur les po- tant le plus d’informations phylogé-
2007). pulations de bactéries méthanotrophi- nétiques lors d’études de flores bacté-
ques ont également été étudiés grâce à riennes (Nocker et al., 2007). Des ban-
la T-RFLP (Singh et al., 2007). des intéressantes excisées des gels ou
7. Profils automatisés de
des fragments d’ADN clonés dans un
visualisation de l’ADN b. Les espaces intergéniques de vecteur peuvent ainsi être séquencés.
Outre les profils d’électrophorèse sur l'ADN ribosomial Dans le premier cas, l’ADN extrait
gels, il existe également des méthodes L’analyse automatisée de l'espace du gel peut être séquencé directement
automatisées pour visualiser l’ADN. intergénique de l'ADN ribosomial (Nagpal et al., 1998), après réamplifi-
Ces profils automatisés sont réalisés (Automated Ribosomal Intergenic cation ou après clonage (Zeng et al.,
grâce à des électrophorèses sur ca- Spacer Analysis ou ARISA) est un 2007). Le séquençage des produits de
pillaire. Ils demandent un marquage profil automatisé de RISA. L’ITS est PCR après clonage est fréquemment
préalable par des molécules fluores- amplifié par PCR en ajoutant un mar- employé avec le gène 16S (Kassinen
centes et permettent d’obtenir des pro- queur de fluorescence aux amorces. et al., 2007  ; Kjeldsen et al., 2007  ;
fils précis, reproductibles et de haute Les amplicons sont ensuite séparés par Shinzato et al., 2007). En effet, le
résolution. électrophorèse capillaire et les pics de séquençage de ce gène permet géné-
fluorescence sont enregistrés (Nocker ralement l’identification de la souche
a. Les fragments de restriction et al., 2007). Fisher et Triplett (1999) jusqu’à l’espèce (Van de Peer et al.,
terminaux ont mis au point cette technique. L’in- 1996). La comparaison de différentes
La technique de polymorphisme de convénient principal est toujours lié au bibliothèques de clones du gène 16S
longueur des fragments de restric- nombre de copies différentes de cette permet d'estimer les flores en fonction
tion terminaux (Terminal Restriction séquence intergénique, 85  % des es- des milieux. La dynamique au sein
Fragment Length Polymorphism ou pèces produisant deux voire trois pics d’un milieu est par contre difficile-
T-RFLP) est une RFLP automatisée (Jensen et al., 1993). L’ARISA fournit ment étudiable grâce à cette technique
grâce à des produits de PCR marqués rapidement des profils contenant peu (Singleton et al., 2001). Le séquençage
par des amorces fluorescentes et à la d’informations mais permettant des peut également avoir comme cible des
migration des fragments sur capillai- comparaisons entre les populations. fragments de restrictions de génomes
res. Avaniss-Aghajani et collabora- Tout comme la T-RFLP, elle a une très clonés. Cette approche, appelée sho-
teurs (1994) sont les pionniers de cette bonne répétabilité (Jones et al., 2007). tgun à permis le séquençage du premier

119
chromosome bactérien (Fleischmann en fonction de ce choix. L’ARN re- démontre un changement de flore bac-
et al., 1995). Venter et collaborateurs flète beaucoup mieux l’activité de la térienne dans les sols enrichis en mi-
(2004) ont énormément contribué à la population (Sorensen et Teske, 2006). néraux grâce à l’ARISA.
base de données des séquences proca- Mais il est également plus difficile à
ryotiques grâce à leur séquençage sho- manipuler et est facilement contaminé
tgun des espèces présentes dans la mer par de l’ADN ou des RNAse qui le dé- 9. Quelles sont les
des Sargasses. Ils ont été les premiers à gradent (Halet et al., 2006 ; Lahtinen méthodes utilisées pour
employer cette technique pour l’étude et al., 2008). les études sur la flore
d’une population entière. Les inconvénients et avantages des digestive ?
De nouvelles techniques de séquen- différentes techniques sont présentés Toutes les techniques d’études de
çage permettent d’éviter la pré-ampli- au tableau I. Parmi toutes les techni- populations peuvent potentiellement
fication et le clonage des échantillons ques présentées, une différence doit être utilisées pour l’étude de flore di-
qui sont des activités chronophages être faite entre les profils automatisés gestive. Néanmoins certains critères
(Cardenas et Tiedje, 2008). Grace à et les autres techniques. L’automatisa- doivent être pris en compte lors d’un
ces techniques de séquençage à ultra tion permet une comparaison rapide, travail sur matières fécales ou conte-
haut débit, des milliers de simples d’un nombre important d’échantillons nus intestinaux.
brins d’ADN peuvent être séquen- avec une reproductibilité importante Tout d’abord le stockage des prélè-
cés en même temps. Trois techniques pour un moindre coût une fois l’ap- vements se font en général à -80°C
commerciales (SOLiD, Helicos, Illu- pareil amorti (Nocker et al., 2007). (Suchodolski et al., 2004  ; Scupham,
mina) font appel à des principes simi- Le gros inconvénient des techniques 2007) en attendant l’extraction.
laires  : le matériel génétique est res- automatisées est l’impossibilité de sé- Certains auteurs utilisent, avec de bons
treint en fragments de 30 à 36pb et un quencer les pics  intéressants (tableau résultats, d’autres méthodes de conser-
adaptateur (queue poly A ou un oligo) II). Leur utilité est donc de déceler des vation par exemple à -20°C (Fenicia
est fixé à une extrémité. Ces fragments différences entre populations (Jensen et al., 2007  ; Peng et al., 2007) ou à
sont ensuite fixés sur des lames grâce à et al., 2007 ; Rahalkar et Schink, 2007) 4°C dilué dans un tiers d’éthanol 98 %
des billes magnétiques et/ou des oligo. ou au sein de la même population au (Badiola et al., 2005). Si les extrac-
Des PCR universelles sont réalisées cours du temps (Scupham, 2007) ou tions ne peuvent être réalisées peu de
sur la lame pour les techniques de lors d’un changement d’environne- temps après la récolte d’échantillons,
SOLiD et Illumina tandis qu’un seul ment (Carson et al., 2007). la conservation à -80°C ou -20°C est
brin est employé pour le séquençage Comme le décrivent Kirk et collabo- recommandée.
lors d’une Helicos. Les émissions de rateurs (2004) dans une synthèse sur
fluorescence des nucléotides utilisés Comme dit plus haut, les matières fé-
l’étude de la biodiversité des flores du cales contiennent énormément d’inhi-
pour le séquençage sont localisées sol, les biais présents dans les diffé-
sur la lame et permettent de séquen- biteurs de PCR (Duenngai et al., 2008),
rentes techniques entraînent souvent les extractions doivent donc éliminer
cer simultanément une quantité de la nécessité d’en utiliser plusieurs afin
fragments allant de 100 000 à 400 000 un maximum ces inhibiteurs. Des kits
d’obtenir une vision globale et plus commerciaux donnent de bons résul-
(Steemers et Gunderson, 2005). La complète de la, ou des, populations
réunion de ces différentes séquences tats mais souvent inférieurs à une mé-
étudiées. Par exemple, Smalla et col- thode développée spécifiquement pour
grâce à des algorithmes permet d’ob- laborateurs (2007) étudient les flores
tenir le génome ou méta-génome com- un type de prélèvement (Schuurman
du sol avec la DGGE, la T-RFLP et la et al., 2007). Le kit le plus populaire
plet de l’échantillon dans des temps SSCP. Les conclusions qu’ils en ont
record (Huang et al., 2009). D’autres et très efficace pour les extractions de
tirées sont les suivantes  : les profils matières fécales est le QIAamp DNA
techniques de séquençage à ultra haut obtenus avec les DGGE et SSCP sont
débit sont en cour de développement, Stool Mini Kit (QIAGEN®) (Li et al.,
comparables tandis que les profils obte- 2003).
notamment l’utilisation de nanopores nus avec la T-RFLP sont moins riches.
(Oxford Nanopore Technology, 2009). Ces derniers, bien qu’apportant moins Les amorces utilisées sur des flores
Ces techniques devraient bientôt être de résultats permettent d’obtenir des digestives dépendent de la flore type
utilisées pour les études de popula- arbres phylogénétiques de bonne qua- de l’animal étudié. Par exemple, pour
tions bactériennes. lité, ils sont donc très intéressants pour une flore riche en bactéries gram posi-
Ces différentes méthodes permettent une étude de routine à réaliser sur du tives, des amorces riches en guanine et
d’étudier l’évolution d’une popula- long terme. D’un autre côté, seuls les cytosine généralement plus fréquentes
tion bactérienne et/ou d’en comparer profils de SSCP et DGGE permettent chez les bactéries gram positives se-
plusieurs. Ces techniques sont plus ou d’identifier les espèces présentes dans ront privilégiées. Des amorces spécifi-
moins coûteuses ; certaines donnent des les populations par séquençage. ques ciblant les gènes codant pour les
informations complémentaires ; d’autres ARN ribosomiaux des entérobactéries
D’autres auteurs se contentent d’une ou des bifido- et lactobactéries (Sato-
des informations semblables. L’impor- seule technique. Il s’agit en grande ma-
tant est de trouver la ou les techniques kari et al., 2003) peuvent être utilisées
jorité d’études démontrant une simple pour des études sur ces populations
les plus appropriées à l’étude choisie. variation de population. Par exemple, particulières.
Abecia et collaborateurs (2005) n’ont
utilisé que la DGGE afin de démon- Il existe des articles de revue spécifi-
8. Choix des techniques ques à l’étude des populations digesti-
trer que des traitements antibiotiques
La première alternative à envisager est modifiaient fortement les flores diges- ve, humaines ou animales (Macfarlane
l’étude de l’ADN ou de l’ARN. Des tives des lapins. Ou encore l’étude de et al., 2004 ; Richards et al., 2005).
informations différentes sont obtenues Carson et collaborateurs (2007) qui

120
Tableau I : Avantages et inconvénients des techniques présentées

Pas besoin d’équipement spécifique


PCR aléatoire Avantages
Les bandes d’intérêts peuvent être excisées du gel
(RAPD, AP-PCR
et DAF) Manque de reproductibilité
Inconvénients
Présence d’artefacts (amplification dans le témoin négatif)
Possibilité de tester in sillico pour choisir les enzymes intéressantes
Avantages Permet de différencier des espèces voir des sous espèces
Compatible avec une analyse automatisée
AFLP
Inconvénients Demande beaucoup de temps

Pas besoin d’équipement spécifique


Avantages
Les bandes d’intérêts peuvent être excisées du gel
REP
Les séquences présentent entre les REP peuvent être très variables au sein d’une
Inconvénients
même espèce

Pas besoin d’équipement spécifique


Avantages
Les bandes d’intérêts peuvent être excisées du gel
RISA
Inconvénients Une seule espèce peut avoir plusieurs signaux

Avantages Pas besoin d’équipement spécifique


ARDRA
Plusieurs restrictions nécessaires pour trouver une résolution adéquate
Inconvénients
Demande beaucoup de temps
Pas besoin d’amorce avec pince GC
Avantages Les bandes d’intérêts peuvent être excisées du gel
Compatible avec une analyse automatisée (CE-SSCP)
SSCP
Taux élevé de ré appariement des brins d’ADN
Inconvénients
Une espèce peut présenter plusieurs bandes

Les bandes d’intérêts peuvent être excisées du gel


Avantages
Peu cher
DGGE / TGGE
Sensibilité limité
Inconvénients La pince GC diminue la rentabilité de la PCR et favorise la formation de dimère
La manipulation du gel demande de l’expérience
Haute sensibilité
Avantages Rapide
Permet une comparaison entre les différents essais
T-RFLP
Restriction incomplète entraine une surestimation d’une espèce
Inconvénients Plusieurs restrictions sont nécessaires pour une analyse complète
Les profils complexes sont difficiles à interpréter phylogénétiquement
Permet de détecter de très légères différences de population
Avantages
Compatible avec RFLP et séquençage pour des analyses complémentaires
ARISA
Inconvénients Une seule espèce peut avoir plusieurs signaux

La plus haute résolution phylogénétique


Avantages
Permet l’identification de l’espèce
Séquençage
Inconvénients Prend du temps si passe par le clonage

121
Tableau II : Techniques permettant un séquençage des bandes d’intérêts

Après clonage
Après extraction du gel Impossible
RAPD
DGGE / TGGE AP-PCR T-RFLP
SSCP DAF ARISA
RISA REP CE-SSCP
AFLP ARDRA

10. Conclusion Abstract origin, digestive, aquatic, from the


Il existe beaucoup de choix au niveau Today, traditional bacterial cultu- soil… These methods are nume-
des techniques de biologie moléculaire rous but follow generally the same
res techniques aren’t sufficient for
pour l’étude des populations bactérien- framework. The DNA is extracted
nes. La technique utilisée dépendra du studying complex bacterial popu-
but de l’étude, du budget, des habitu- lation. For the past twenty years, then amplified, sometimes treated
des du laboratoire, de la complexité de a lot of studies have shown that and finally visualized or sequen-
la population étudiée et du temps dis- a wide majority of bacterial spe- ced. This review discussed the
ponible. Même si les profils automa- cies can’t be grown on traditio- more common methods used to
tisés sont les plus faciles à comparer assess bacterial population and
nal culture media. They’ve also
et reproduire, ils ne permettent pas de
séquençage ultérieur. La plupart des approved the use of biomolecular the different points to consider
études actuelles utilisent et comparent methods to assess complex bac- before choosing one or several
plusieurs méthodes. terial populations whatever their appropriated methods.

BIBLIOGRAPHIE

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