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Velocidad de sedimentación globular y recuentos de

reticulocitos.

Cuando uno deja un tubo con sangre


anti coagulada en reposo esta sangre,
al cabo de un tiempo se separa y el
componente celular decanta,
quedando separado el plasma (fase
líquida) y una fase celular (con los
elementos figurados), esto es lo que
debería ocurrir normalmente.

Hay ciertas condiciones fisiológicas o


patológicas que pueden variar la
velocidad en la que este fenómeno sucede. Hay condiciones que van a hacer que la
caída o la sedimentación de estas dos fases sea mucho más rápida o mucho más lenta.

Este fenómeno depende de distintos factores


que están asociados a la agregabilidad
eritrocitaria, este es el principal factor que
comanda la velocidad de sedimentación
(VHS). En la zona más gruesa del frotis uno
puede ver como “pilas de monedas” de
eritrocitos.

La agregabilidad de los eritrocitos depende de


4 factores: 1) Tamaño eritrocitario, lo que
está directamente relacionado con el VCM
(volumen corpuscular medio). 2) Diferencia
de densidad entre el medio y el GR (ó
densidad del plasma V/S la del GR). La
cantidad de Hg presente el GR va a cambiar su
densidad, por lo tanto esto podría afectar la
VHS. 3) La viscosidad plasmática 4) Temperatura, generalmente el ensayo que
hacemos nosotros (que es la hemosedimentacion) se realiza a una Tº ambiente (18 a
25º) y se puede ver que temperaturas por debajo de los 18 o sobre los 25 grados se
altera el resultado.
La VHS tiene 3 etapas bien definidas: La primera es la principal y es la que comanda a
todas las etapas siguientes. La primera se llama Hemaglutinacion (formación de las
pilas de monedas). Si dejamos una mu8estra que esta anti coagulada en reposo, los GR
que eran en suspensión van a formar las pilas de monedas y de esto es que dependen
el resto de los procesos. Si la hemaglutinación se ve favorecida, el resto va a ser más
rápido y viceversa. La segunda etapa es la de sedimentación ya que las pilas de
monedas comienzan a caer hacia el fondo. La última etapa es cuando esas
aglutinaciones ya cayeron y quedan en el fondo, lo que se conoce como acumulo de
eritrocitos.

Existe un concepto que se llama potencial Z es la fuerza de repulsión o atracción de los


GR entre sí. Los GR tienen su membrana una serie de proteínas que le confieren a ésta
una carga determinada lo que permite que los GR cuando estén circulando libre en la
sangre se logren mantener alejados unos de otros para que no se unan
espontáneamente. El potencial Z se puede ver afectado por factores como el
fibrinógeno, el que favorece que los GR disminuyas su potencial Z y por lo tanto
favorece la unión de los mismos. El fibrinógeno se encuentra en un equilibrio con otra
proteína que es la albúmina y esta presenta el efecto contrario, ya que favorece que
los GR se mantengan separados.

El equilibrio y las concentraciones de albumina y fibrinógeno en el plasma van a


modelar el comportamiento del potencial Z. Por ejemplo, el fibrinógeno es una
molécula que puede aumentar en las embarazadas, desde el primer hacia el tercer
trimestre, el fibrinógeno aumenta bastante, por lo tanto en la embarazada no se
pueden aplicar los valores de referencias normales, aunque eso es un proceso
fisiológico, por lo que se considera normal. El fibrinógeno y la albúmina presentan
conformaciones espaciales diferentes, debido a las características tridimensionales es
que presentan la facultad de aumentar o disminuir la VHS.

Existen proteínas de fase aguda las cuales (por ejemplo las Ig, la C reactiva y una seria
de otras proteínas) tienden a tener el mismo efecto que el fibrinógeno, aumentando la
VHS. Si un paciente tiene una infección (por ejemplo, amigdalitis) este tendrá la VHS
muy alta, ya que presenta en su sangre una gran cantidad de proteínas de fase aguda.

Esta propiedad de la sangre fue estandarizada por una persona llamada Westergreen,
que tiene el método de referencia con su mismo nombre el cual mide la VHS. La
unidad en la cual se mide es en mm a la primera hora. Se tienen que observar cuántos
mm a descendido la columna de GR en 1 hora. En la foto lo que se puede ver es un
aparato que se rige por el método de Westergreen que consiste en un soporte que
permite que las columnas estén en una posición perfectamente vertical en relación al
soporte, en 90º. Tiene pipetas graduadas desde 100 a 0 y tiene un groso adecuado y
abajo tiene un tubo que tiene anticoagulante. Con este método es que se tienen que
estandarizar la técnica ya que presenta todas las condiciones necesarias para hacerlo y
podremos darnos cuentas que pequeñas variaciones, por ejemplo, en la verticalidad de
los tubos darán resultados erróneos por falas técnicas.

Acá podemos ver otro método, el de Wintrobe (no es el método de referencia). En


este caso se trató de usar el capilar del macrohematocrito. Este método trató de
replicar el otro método pero aplicando materiales que se encontraban en todos los
laboratorios (como lo son las pipetas para el macrométodo). Cuando uno habla de
método de referencia significa que cualquier otro método, antes de que salga al
mercado, tiene que ser comparado o validado con el de referencia, es lo mismo que el
método de la cianmetahemoglobina.

También existe el método automatizado, El primer equipo presenta una serie de


diluyentes y se pueden aprecias las columnas de sedimentación y un sensor (para ver
cuánto ha bajado la columna de los GR), la muestra es tomada automáticamente por
aspiración, llena el capilar, hace una dilución adecuada y comienza el proceso. El
equipo que se encuentra en la imagen de la derecha es el que tenemos en el
laboratorio (los tubos están descontinuados). Los equipos automatizados, no entregan
el resultado en 1 hora ya que hace una interpolación (a los 15 0 20 minutos) y
transforman el resultado en el valor a la hora. Evidentemente las interpolaciones
fueron comparadas con el método de referencia. También hay otro equipo (que no se
ve en la imagen) que mide la VHS en micro capilares, que toma sangre desde un tubo,
la hace pasar por un capilar y el equipo analiza el comportamiento de los GR y se
puede tener el resultado en 5 minutos con una buena correlación en comparación al
método de referencia.

La muestra de elección para hacer VHS es sangre venosa anticoagulada con citrato de
sodio (con una concentración de 0,106M o 3,8%) en proporción 1:4 (1 parte de
anticoagulante y 4 de muestra), eso sería la muestra de elección. Los tubos necesarios
para tomar esta muestra son los de tapa negra. Muchas veces solo tendremos a
disposición el tubo de tapa lila, entonces en ese caso el frotis se hace antes de las 2
horas (para evitar cambios morfológicos) pero ¿Qué pasa con la VHS? Lo que uno hace
es tomar sangre desde el tubo lila y mezclarla con el tubo de tapa negra, a veces estos
tubos tienen una marca de llenado, lo que asegura una proporción de 1:4 pero cuando
uno no tiene el anticoagulante, para mantener la proporción de 1:4 agrega una parte
de suero fisiológico y lo mezcla con 4 partes de sangre y de esta forma se mantiene la
proporción. Si tuviese un tubo con citrato, lo agrego directamente a este ya que la
función del citrato no es la anti coagulación (en este caso) sino que es la de mantener
la proporción.

Independientemente de que la muestra esté anticoagulada, se necesita una muestra


homogénea, por lo tanto siempre hay que procurar, (antes de cargar los tubos)
mezclar muy bien (al menos 10 veces). Otro detalle que hay que tener en
consideración es llenar el tubo hasta la marca correspondiente (la marca 0). La
posición de la pipeta con respecto al mesón debe ser perfectamente vertical ya que
variaciones de más de 1 grado hacen que la velocidad sea mayor.

Existen condiciones que pueden aumentar la VHS y son de tipo fisiológicos como el
embarazo, envejecimiento y crecimiento, pero todos son de tipo fisiológico, por lo
tano todos los valores de referencia tienen que estar ajustados (según edad, sexo, etc).
Pero también existen condiciones patológicas que pueden aumentar la VHS como la
anemia intensa (por el cambio en la densidad del GR), procesos inflamatorios crónicos
que mantienen las proteínas de fase aguda elevadas (leer power). Las gamapatías
monoclonales están relacionadas con una producción exacerbada de una proteína que
es una Ig. Si en una infección, la VHS aumenta hasta 30 o 40 mm a la hora, en una
gamapatía monoclonal, el aumento puede llegar a ser incluso mayor a 100 o 140 mm
en la hora (ya que las proteínas afectaron al potencial Z).

Así como hay factores que pueden aumentar la VHS, hay otras que la disminuyen (son
más difíciles de pesquisar) tales como: Leer power. En el caso de la hipofibrinogenemia
se rompe el balance albúmina-fibrinógeno. Además existen muchas variaciones de
origen desconocido. La VHS como valor individual es completamente inútil ya que es
muy inespecífico y puede ser alterado por una gran cantidad de factores, por lo tanto
como valor solo no sirve de nada. La VHS es de utilidad cuando se interpreta con
respecto a otros valores, también es de utilidad en pacientes que ya fueron
diagnosticados porque por ejemplo si un paciente tiene un mieloma y cuando se le
hizo la primera VHS tuvo 140mm a la hora y ese paciente que fue además trasplantado
y tratado, es muy útil la VHS porque la respuesta al tratamiento o al trasplante se va a
ver reflejada en la disminución de la VHS, lo que indica que la proteína que se
encuentra dando vueltas y que produjo el aumento de la VHS, está disminuyendo.

Es importante conocer los factores técnicos que puedan afectar el procedimiento ya


que es algo que controlamos nosotros. Causas de aumento: Leer power. El aumento de
la Tº es por sobre los 24 o 25º C ya que se cambian las condiciones físico-químicas del
plasma.

RETICULOCITOS:

La VHS no necesariamente “va de la


mano” con los reticulocito, o sea si se
hace VHS no necesariamente hay que
hacer reticulocitos. En el laboratorio
haremos recuento reticulocitario. Los
reticulocitos son eritrocitos que se
encuentran en una fase previa de
maduración total. Al decir una fase previa
a la maduración total, no se hace
referencia a células nucleadas sino que es
una fase que ese encuentra entre un eritroblasto que ya expulsó su núcleo y el GR que
se conoce como tal. Los reticulocitos se pueden ver en sangre periférica, pero no
reciben el nombre de reticulocitos sino que el de policromatófilos y son ovalados,
grisáceo y con un tamaño un poco mayor al del GR normal. El aumento de los
reticulocitos en la sangre periférica se denomina como policromatofilia, esto se puede
apreciar en anemias hemolíticas, anemia ferropriva en tratamiento, etc. La tonalidad
grisácea se debe principalmente al contenido del RNA ya que desde que expulsan el
núcleo quedan remanentes de RNA.

Si nosotros lo vemos normalmente, cuando el eritroblasto ortocromático libera su


núcleo al exterior (en médula ósea), el policromatófilo permanece en la médula ósea
de 48 a 72 horas y al cabo de ese tiempo el policromatófilo sale a la circulación y este
no es un GR 100% maduro sino que tienen que pasar 24 horas más para que sea un GR
100%, o sea en total, la maduración de ese reticulocito policromatófilo, dese que libera
el núcleo hasta ser un GR funcional y como tal, es de 3 a 4 días. Lo normal es que gran
parte de su maduración se haga en médula ósea y solo 1 día en sangre periférica y a
medida que va madurando, lo que hace es perder el RNA. Se pueden reconocer en
frotis que estén teñidos con MG giemsa, en ese caso se puede observar la
policromatofilia.

Se puede realizar tinción supravital, pero se ha visto que puede haber una diferencia
de hasta 20% entre observadores lo cual es un % importante. Nosotros contaremos un
total de 2 mil células y mientras más se cuenten, menor es el error pero si nos
comparamos con el método automatizado, este tiene una variación menor al 8% e
incluso menor al 5% entre las determinaciones, este se equivoca menos ya que ocupa
un marcaje y además cuenta entre 30 mil a 50 mil células en 1 minuto. En cada sentido
el método automatizado es el mejor pero el problema es el costo. No necesariamente
se necesita de un equipo para hacer eso, los contadores hematológicos más nuevos
permiten, junto con hacer el hemograma, hacer el recuento de eritrocitos, pero ahí
también está el tema del reactivo, ya que este es un reactivo especial que va a marcar
el RNA y esto va a ser leído por el equipo. En el caso de los métodos automatizados se
requiere utilizar un fluorocromo que puede ser el naranja de tiazol o la auramina, los
cuales son capaces de marcar el RNA, entonces cuando los policromatófilos que tienen
RNA pasan por un sensor determinado, el sensor detecta al fluorocromo y lo reconoce
como reticulocito. Los contadores o los equipos automatizados también pueden medir
la intensidad de la señal, es capaz de clasificarlos en tipo 1, 2, 3 y 4 (según el grado de
inmadurez que presenten) según la cantidad de RNA que presenten. Lo anterior es
importante ya que muchos pacientes que tienen anemia y están en tratamiento, si
presentan una mayor cantidad de reticulocitos que tienen mucho RNA v/s los que
tienen poco RNA significa que están respondiendo bien al tratamiento.

Las tinciones supravitales pueden variar de un laboratorio a otro, en algunos se usa el


azul de cresil brillante en solución acuosa y en otros en solución alcohólica. Existen
errores por la distribución en lo extendido (por el frotis). Muchas veces la variabilidad
entre los observadores se debe a que estas células son muy parecidas a otras células.
Nosotros ocuparemos el azul de cresil brillante que tiñe RNA, esto se puede utilizar en
solución alcohólica o en una solución de suero fisiológico (nosotros usaremos suero
fisiológico) y así es como se pueden ver los reticulocitos (en la imagen), que en este
caso la reticulocitosis es intensa. El reticulocito que se encuentra en la imagen del
medio, justo en el centro, puede ser uno que recién haya sido expulsado ya que
presenta un color intenso, en cambio en la primera imagen se ven algunos que ya
están más maduros. En primera instancia esto se informa de manera porcentual (con
regla de 3), pero también se puede expresar en mm cúbico.

Para contar los reticulocitos se requiere tener el microscopio en 100X, elegir un campo
correcto y dividirlo por 4 (con líneas imaginarias) y se cuenta el total de elementos (GR
y reticulocitos). En el caso de la imagen, se pueden ver 13 elementos en el primer
cuadrante, si es un campo homogéneo y ese segmento tiene 13 elementos ¿Cuántos
elementos debería tener el campo completo? 52 elementos totales, por lo tanto un
campo con esas características tiene 52 elementos y eso es mi 100%. En el campo
completo se pueden ver 7 reticulocitos pero se tienen que contar mínimo 2 mil células,
entonces se tienen que contar tantos campos como sea necesario hasta completar las
2 mil células y en cada campo se cuentan los reticulocitos, o sea si yo conté en un
campo 52 elementos, me baso en eso y en los otros campos solo cuento los
reticulocitos. Luego de eso voy a llegar a las 2 mil células y la sumatoria de los
reticulocitos e esos X campos (X= número de campos contados). ¿De qué manera es
que nosotros podemos llevar este valor porcentual a uno por mm cúbico? Lo que
nosotros contamos en el fondo son eritrocitos, por lo tanto si mi paciente tiene 5
millones de eritrocitos X mm cúbico y al hacer la tinción supravital para recuento de
reticulocitos y se encontraron 10%, entonces se aplica una regla de 3 y se informa X
mm cúbico. El porcentaje de reticulocitos no sirve de nada, por ejemplo: El porcentaje
normal de reticulocitos es de 0,5 a 1,5%. En un paciente 1 cuyo hemograma es normal
se hace el recuento reticulocitario y da como resultado un 1%, por lo tanto está dentro
del rango, pero tengo un paciente 2 con una Hb de 5 gr/dL, HTCTO de 15% y el
recuento eritrocitario es de 2 mill X mm cúbico y el recuento de reticulocitos es del
1,2%, esto si se encuentra dentro del rango normal pero los reticulocitos son un reflejo
de lo que está produciendo la médula. En un paciente normal necesitamos una
producción que no supere al 1,5% siempre y cuando las condiciones de Hb y HTCTO
sean normales, ya que la oxigenación de ese paciente es normal, pero en un paciente
como el Nº 2 que tiene una anemia severa, no será suficiente 1,2% de reticulocitos, ya
que si esa médula tiene todo lo necesario, la médula debería aumentar la producción y
liberación temprana de los reticulocitos, por lo tanto ese 1,2% debería ser aprox 15%
hasta el 40% de reticulocitos, eso no indica que el paciente sea anormal, sino que
indica que el paciente está respondiendo. Si el cuerpo está hipóxico la médula debería
liberar todas las células a la periferia. Entonces para saber si el % de reticulocitos es
normal para un paciente que tiene anemia, se debe calcular el índice reticulocitario, lo
que representa la estimación de la producción diaria de eritrocitos en médula ósea.
Este valor, considera 2 variables: 1) El porcentaje de reticulocitos se toma y se
compara con el hematocrito del paciente, al compararlo con el HTCTO estamos viendo
como él % de reticulocitos se está ajustando al grado de anemia del paciente y luego
de esta corrección se le debe hacer una segunda corrección que tiene que ver con el
tiempo de maduración.

El primer arreglo que se le hace al valor es el siguiente: Ya tenemos él % de


reticulocitos X el HTCTO del paciente pero comparado con el HTCTO ideal (45). Lo que
estamos haciendo acá es ver que tan anémico está el paciente y que tan bajo están los
valores del paciente en comparación a alguien normal. Si uno tiene un 18% de
reticulocitos, se podría considerar como un valor elevado, pero como los valores se
comparan con uno de un paciente normal para ver la magnitud de la anemia, se tiene
que saber si la cantidad de reticulocitos son suficientes para poder responder a la
anemia y al hacer el cálculo nos da un valor de 6.

En la segunda corrección hay que afinar otro detalle: Como se envían tempranamente
los reticulocitos a la sangre periférica, los tiempos de maduración cambian, ya no son
48 en médula ósea y 24 en periférica y se ha visto que hay una relación proporcional,
para HTCTOS normales, el tiempo de maduración en sangre periférica sigue siendo 1
día, pero a medida que desciende el HTCTO el tiempo de maduración en días en sangre
periférica aumenta (en condiciones normales, donde la médula ósea responde) y en
este caso en particular, para un HTCTO de 15, el tiempo de maduración en días,
debería ser de 3 días en sangre periférica. Ese valor de 3 se aplica de la siguiente
manera: Se toma la primera corrección (que consideraba el grado de anemia del
paciente) y lo divido por el tiempo de maduración en días y eso da un valor total de 2.

Cuando ese valor (el cual fue


corregido por el HTCTO y después
fue vuelto a corregir pero
considerando el tiempo de
maduración en sangre periférica) es
= o menor a 2, se habla de una
anemia arregenerativa (paciente
con anemia y su médula no es
capaz de regenerar GR, por lo tanto
no está respondiendo al estímulo hipóxico, como lo es el caso de la anemia ferropriva,
ya que la médula ósea no va a ser capaz de generar reticulocitos por la falta de hierro,
si a esa médula se le da el hierro necesario, comenzará a producir reticulocitos y habrá
un aumento de reticulocitos periféricos por lo tanto el índice reticulocitario estará
mucho más alto). Si el índice es mayor a 3 se dice que la médula ósea está
regenerando, por lo tanto será una anemia regenerativa, el ejemplo típico son las
anemias hemolíticas, en las hemolíticas no hay un problema de producción, sino que
se produce una destrucción del GR fuera de la médula ósea, por lo tanto la médula
ósea trata de responder con lo que pueda, ahora si la hemólisis se hace crónica con el
tiempo, los depósitos de hierro se van a acabar igual, entonces podemos tener una
anemias que en un principio era regenerativa y luego arregenerativa.

Es mejor aplicar los valores de 0,5 a 1,5 para hombres y mujeres adultos. (lo que dice
en cordón de recién nacido de 4 a 19 años está malo, no considerarlo). ¿Cómo se
calcula el valor de reticulocitos normal de una mujer? Primero que nada el rango de
eritrocitos normales en una mujer va desde 4,2 mill hasta 5,4 mill. Solo sabiendo estos
datos se puede calcular de la siguiente manera. Mi 4,2 sería mi 100%, pero 5,4 también
sería mi 100%, por lo tanto hay que aplicar una regla de 3 con los valores mínimos
asociados a los reticulocitos, en el caso del valor menor, mi 100% es de 4,2 mill de GR y
mi 0,5% ¿Cuánto será? Y en el caso del valor más alto mi 100% será 5,4 mill, por lo
tanto 1,5% ¿Cuánto será? Y esto se aplica para las mujeres y para los hombres se aplica
según el rango de referencia para los eritrocitos.

En la policromatofilia se tiende a ver una macrocitosis ya que los reticulocitos tienen


un 8% mayor de tamaño en comparación con el eritrocito, por lo tanto en el resultado
del examen saldrá una VCM elevada.