Mecanismos de Splicing Claudia Junqueira, Nuno Couto, Pedro Reis , Pedro Sousa

Introdução Orientadora: Professora Delminda Neves

Objectivo dos Mecanismos de Splicing?
Disciplina de Biologia Celular e Molecular, 2004/2005
O nosso DNA é constituído por 25 000 genes distribuídos pelos 23 pares de
cromossomas. Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
O DNA é transcrito no núcleo dando origem a um pré-mRNA que
posteriormente será processado por vários mecanismos, um dos quais é o
Splicing, antes de se tornar num RNA “maduro” ou funcional.
Mas nem todo o DNA codifica proteínas, apenas 5% do DNA total é
codificante, os exões. O restante 95% corresponde a DNA que não é Splicing nos Spliceossomas
codificado que tanto se pode encontrar fora dos genes (sequências não
Onde ocorre? O Splicing do mRNA ocorre no Spliceossoma (fig.2) que é composto por proteínas e RNAs. Os componentes de
codificantes), como dentro dos genes (intrões). Logo, os mecanismos de
RNA são 5 tipos de small nuclear RNAs (snRNAs) ricos em Uracilo chamados U1,U2,U4,U5 e U6. Estes snRNAs têm entre 107 e
Splicing são de extrema importância porque seleccionam as partes
210 nucleotídeos e estão associados a proteínas para formar small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) que têm papel
codificantes do gene de forma a facilitar a tradução dos péptidos e proteínas
central no processo de Splicing, ou seja, os snRNPs são snRNAs ligados a cerca de 6 e 10 proteínas (algumas comuns a todos,
nos ribossomas (processo de tradução), pois existem em média, nos
outras específicas de cada um). Os snRNPs U1,U2 e U5 contêm uma única molécula de snRNA, enquanto que o U3 é nucleolar e o
humanos, 10 vezes mais intrões que exões.
U4 e o U6 formam um único complexo de snRNP (podem aparecer por isso com a seguinte notação U4/U6)
Qual o papel dos Intrões? Os intrões são variáveis tanto em tamanho como
Como ocorre? O primeiro passo é a ligação do snRNP U1 à extremidade 5’ do splice site do pré-mRNA. A seguir, o snRNP U2
em número e são as partes não codificantes que, após serem retiradas do pré-
liga-se ao branch point (ponto de reconhecimento). Ambas as ligações se dão por complementaridade de bases, dado que a
RNA, são destruídas dentro do núcleo gerando nucleotídeos livres que são
sequência de nucleotídeos à volta destas regiões é muito conservada (fig.3). Em seguida, um complexo pré-formado de snRNP
reciclados. Pensa-se que a grande quantidade de intrões deve-se à
U4/U6 + snRNP U5 é incorporado no Spliceossoma. O U5 liga-se ao exão na extremidade 5’ e o U4 dissocia-se do U6. O U4 sai
acumulação de genes (outrora importantes) ao longo da evolução, o que não
juntamente com o U1 e o U6 liga-se ao U2 para a primeira reacção de transesterificação que converte o intrão numa estrutura em
implica forçosamente que os seres mais evoluídos tenham mais intrões que
forma de laço (lariat). Entretanto há a clivagem do exão na extremidade 5’ e o U5 passa para a extremidade 3’. Por fim, ocorre a Fig.1 - Processo geral do Splicing nos Spliceossomas
os seres menos complexos. Podem também ter função reguladora ou
clivagem do exão na extremidade 3’ e a segunda reacção de transesterificação unindo os dois intrões. Os snRNPs dissociam-se do
simplesmente não apresentar qualquer função. Mas desengane-se quem
intrão que vai ser degradado e ficam disponíveis para novo processo.
pensa que não têm utilidade, pois é a sua grande diversidade que permite a
caracterização individual ou de determinados grupos. Esta diferença na
sequência intrónica reflecte a diversidade genética humana, permitindo-nos Fig.3 - Sequências determinadas Fig.2 - Um
à volta das extremidades 5’ e 3’
realizar coisas tão extraordinárias como os testes de paternidade ou a nos pre-mRNA dos vertebrados
Spliceossoma
visto ao ME
identificação de indivíduos envolvidos em acidentes e crimes. onde ocorre o Splicing.

Qual o papel dos Exões? Os exões constituem o RNA funcional e são

sequências semelhantes entre indivíduos, pois codificam as proteínas básicas
à sobrevivência humana. Assim, não podem apresentar grande variabilidade,
contrariamente aos intrões, porque manifestam-se fenotipicamente, o que
significa que qualquer alteração pode tornar-se incompatível com a vida.
Auto-Splicing
Apesar da na maioria dos eucariontes o Splicing ocorrer nos Spliceossomas, encontra-se também um mecanismo de Auto-
Splicing que pode ocorrer no núcleo, nas mitocôndrias, nos cloroplastos e nas bactérias.
Este mecanismo é catalisado pelos seus intrões que agem como uma ribozima (RNA com função catalítica) levando à sua
auto-excisão.
Existem dois grupos de Auto-Splicing (fig.4):

Grupo I de Auto-Splicing de Intrões

Onde ocorre? Nos genes nucleares de rRNA de protozoários (exemplo: pré-RNAr de Tetrahymena thermophila).
Como ocorre? Por duas transesterificações, sendo a primeira entre o grupo 3’-hidróxilo do cofactor Guanosina livre (que não
é interior à cadeia de RNA) e o Fósforo da extremidade do intrão; e a segunda entre a extremidade 3’ do exão livre e a
extremidade 3’onde ocorre Splicing para retirar o intrão sob forma de molécula de RNA aberta.

Grupo II de Auto-Splicing de Intrões

Onde ocorre? Em genes que codificam proteínas e alguns genes tRNA da mitocôndria e cloroplastos de plantas e fungos.
Como ocorre? Também por duas transesterificações, mas que apresentam algumas diferenças. A primeira ocorre entre o
grupo 2’-hidroxilo de um nucleótido de Adenina reactivo (interior à cadeia de RNA) e o Fósforo da extremidade do intrão; e a
segunda é análoga à do grupo I sendo, no entanto de salientar que neste caso, o intrão é removido em forma de laço (lariat).
Fig.4 - Os dois diferentes tipos de Auto-Splicing

Splicing Alternativo
Onde ocorre? Este processo é frequente em eucariontes complexos, permitindo ampliar a diversidade de proteínas. Como
ocorre de forma diferente em cada tecido é importante na diferenciação tecidular (exemplo: cínase da tirosina).
Como Ocorre? A existência de múltiplos intrões e exões num gene abre a possibilidade de combinar os vários exões em mais
do que um mRNA. Isto significa que um pré-mRNA pode originar múltiplos mRNA e consequentemente várias proteínas
(fig.5).
Para que serve? Múltiplos mecanismos estão envolvidos na regulação do Splicing Alternativo que, por permitir grande
variabilidade, contribui para a multiplicidade de proteínas expressas durante o desenvolvimento e diferenciação (exemplo: o
mesmo mecanismo, no mesmo pré-RNA, pode dar origem tanto a um inibidor como a uma activador do mesmo processo).

Splicing dos tRNA Fig.5 - Diferentes proteínas resultantes do mesmo gene por Splicing
alternativo
Onde ocorre? Ocorre no núcleo, em alguns tRNA mas está presente em todos os eucariontes. Pensa-se estar relacionado com
mecanismos de regulação, embora esta matéria não esteja bem esclarecida.
Como ocorre? O mecanismo de Splicing dos pré-tRNA difere em certos aspectos dos outros mecanismos. Durante o
processo de Splicing o intrão é "retirado" da sequência havendo uma clivagem em ambos os lados do mesmo. Forma-se então
um 2',3'-fosfomonoester cíclico na extremidade 3' do exão 5'. Este processo é efectuado por enzimas em vez de RNA.
Posteriormente, para a reacção de "ligação" dos dois exões, são necessários dois nucleosídeos trifosfatos: um GTP que
contribui com um grupo fosfato para a ligação 3‘ - 5' no final da molécula de tRNA e um ATP que forma um intermediário
da AMP-ligase activa.
No passo final, o 2'-fosfato da extremidade 5‘ do exão é removido.

Splicing nos Auto-Splicing CURIOSIDADES

Spliceossomas Grupo I Grupo II
- Um exemplo específico de Splicing Alternativo é o caso da determinação do sexo na espécie Drosophila,
Sequências de intrões
libertadas sob forma X onde o Splicing do mesmo pré-mRNA determina se a “mosca” é macho ou fêmea.
linear - Num caso extremo, um gene de Drosophila pode produzir 38 000 proteínas diferentes a partir de um único
Sequências de intrões gene através de Splicing alternativo, apesar de apenas alguma combinações terem sido observadas
X X
libertadas em “lariat” experimentalmente.
Cofactor nucleótido G - Nos vertebrados e nos insectos o mRNA forma-se a partir de um único pré-mRNA, enquanto que em dois
X
livre tipos de protozoários (tripanossomas e euglenóides) a molécula de mRNA é construída por Splicing de
“Cofactor” nucleótido
X moléculas de RNA separadas: Trans-Splicing.
Adenina reactivo
Duas transesterificações - Splicing “normal” de DNA ocorre nos linfócitos B e T, apesar de ser muito mais raro. Fig.6 - Processo geral do Splicing dos pre-RNAt
X X X
sem consumo de energia
Precisam de intrões para
Referências:
manutenção da sua forma
tridimensional que lhe X X ALBERTS Bruce, JOHNSON Alexander, LEWIS Julian, RAFF Martin, ROBERTS Keith, WALTER Peter, Molecular Biology of the Cell, 4th ed, Garland Publisher, New York, 2002, pp 454-458.

atribui actividade LODISH Harvey, BERK Arnold, ZIPURSKY S. Lawrence, MATSUDAIRA Paul, BALTIMORE David, DARNELL James E., Molecular Cell Biology, 4th ed, W. H. Freeman & Co., New York, 2000, pp 527-528.
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No núcleo, Núcleo, mitocôndrias, DA SILVA AD., GRAMAXO F., SANTOS, M.E., MESQUITA A.F., BALDAIA L., Terra, Universo de Vida, 1º parte – Biologia, 11º ano, Porto Editora, Porto, 2001, pp 101-114.
Onde ocorre
Spliceossoma cloroplastos e bactérias BROWN T. A., Genomes, 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK, 2002.