Universidad Central del Ecuador

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Nombre: Michaela Vega Curso: 3 “A”

Pruebas moleculares y PCR

Introducción
Todos los seres vivos son fundamentalmente similares y la manera más sencilla de explicar estas
semejanzas fundamentales es mediante la teoría evolutiva donde explica que la vida tiene un
antepasado común.
Las especies diferentes tienen homologías genéticas, además de anatómicas. El código del ADN es,
en sí mismo, una homología que une a toda la vida de la Tierra con un antepasado común. El ADN y
el ARN poseen un código simple de cuatro bases que es la “receta” de todos los seres vivos. En
algunos casos, si transfiriéramos material genético de la célula de un ser vivo a la de otro, el receptor
seguiría las nuevas instrucciones como si fueran las suyas propias.
Estas características de la vida demuestran la semejanza fundamental que existe entre todos los seres
vivos de la tierra y sirven de base a los trabajos actuales de ingeniería genética. (Frankel & Collins,
2006)
Pruebas moleculares
Los métodos moleculares están basados en la detección de ciertos cambios en un gen o cromosoma
que pueden causar la presentación de una enfermedad o trastorno específico. Se recurre a estos
métodos cuando los clásicos no dan muy buenos resultados, ya sea porque es muy difícil recrear unas
condiciones viables para el microorganismo de forma artificial, porque sean muy peligrosos pudiendo
haber alto riesgo de contagio o bien porque no sean muy fiables. Se puede realizar una prueba de
ADN en cualquier muestra de tejido, incluso con muestras muy pequeñas. (Frankel & Collins, 2006)
Para realizar las pruebas, se pueden usar diferentes tecnologías moleculares, como las siguientes:

 Análisis cromosómico. Consiste en observar si el cariotipo del paciente es normal, es decir,

si el número de cromosomas es el correcto y si su tamaño y orden es normal.
 Hibridación fluorescente in situ o FISH. Con esta técnica se pueden detectar anomalías
cromosómicas, deleciones en un gen y otras alteraciones que pueden provocar una
enfermedad genética.
 Reacción en cadena de la polimerasa o PCR. Consiste en propiciar la amplificación del
fragmento de ADN que supuestamente posee la mutación que genera la enfermedad, y
realizar sobre este fragmento una prueba accesoria, como el uso específico de alguna enzima
de restricción, hibridación de microsatélites u otras pruebas.
 Secuenciación de ADN. La secuenciación directa del ADN es uno de los mejores métodos
para el diagnóstico molecular, ya que consiste en la lectura del gen o genes implicados en
una enfermedad y la comprobación directa de que existe o no alguna mutación. Actualmente,
la secuenciación se usa muy poco ya que es una técnica muy cara, laboriosa y en la mayor
parte de los casos sustituible por otra técnica molecular. (Genetic Alliance, 2008)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para
hacer muchas copias de una región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa
que le interese al experimentador. Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN
de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN
amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido
para otros experimentos. (Tortora, 2007)
La Taq polimerasa
Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa
que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La
ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria
tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus). La Taq polimerasa es ideal para la PCR
gracias a esta estabilidad térmica. (Khan Academy, 2014)
Cebadores
Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay un cebador,
una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN. En
una reacción de PCR, la región de ADN que será copiada, o amplificada, se determina por los
cebadores que el o la investigadora elija.
Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla, generalmente de unos 20
nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para
flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). Es decir, les agregan secuencias que harán
que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los extremos de la región a copiar. Los
cebadores se unen al molde mediante complementariedad de bases. (Khan Academy, 2014)

Cuando los cebadores se unen al molde, la polimerasa los extiende y la región que se encuentra entre
ellos se copia.
Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y
nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los
cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento
que permiten la síntesis del ADN.
Los pasos básicos son:

 Desnaturalización (96°C): la
reacción se calienta bastante
para separar, o desnaturalizar,
las cadenas de ADN. Esto
proporciona los moldes de
cadena sencilla para el siguiente
paso.
 Templado (55 - 65°C): la
reacción se enfría para que los
cebadores puedan unirse a sus
secuencias complementarias en
el molde de ADN de cadena
sencilla.
 Extensión (72°C): la
temperatura de la reacción se
eleva para que la Taq
polimerasa extienda los
cebadores y sintetice así nuevas
cadenas de ADN. (Tortora,
2007)
Este ciclo se repite 25 - 35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 2 - 4 horas,
según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es eficiente (funciona bien), puede
producir miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región blanco.

Uso de la electroforesis en gel para visualizar los resultados de una PCR

Habitualmente, los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen visibles) al usar
electroforesis en gel. La electroforesis en gel es una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa
fragmentos de ADN a través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su
tamaño.
Los fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda" en el gel que se puede identificar
a simple vista si el gel se tiñe con un pigmento que se una al ADN.

Una banda de ADN contiene muchas copias de la región blanco de ADN y dado que el ADN es
microscópico, deben existir muchas copias de este para poder verlo a simple vista. Esto es una parte
importante de por qué la PCR es una herramienta importante: produce suficientes copias de una
secuencia de ADN para poder ver o manipular esa región de ADN. (Khan Academy, 2014)
Ejemplo:
Acabas de recibir una muestra de ADN de un cabello encontrado en la escena de un crimen junto con
muestras de ADN de tres posibles sospechosos. Tu trabajo es examinar un marcador genético
determinado y ver si alguno de los tres sospechosos coincide con el ADN del cabello para este
marcador.
¿Cuál es el sospechoso cuyo ADN coincide con el de la escena del crimen para este marcador?
Sabiendo que:
• Si una persona tiene dos alelos diferentes del marcador (es heterocigota), la PCR amplificará
dos bandas de diferentes tamaños (200 pb y 300 pb). Los productos de la PCR aparecerán
como bandas de 300 pb y 200 pb de ADN en el gel.
• Si una persona tiene dos copias del mismo alelo (es homocigota), la PCR solo amplificará
una banda. Si la persona es homocigota para el alelo de 200 pb, en el gel solo se verá una
banda de 200 pb. De igual forma, si la persona es homocigota para el alelo de 300 pb, en el
gel solo será visible una banda de 300 pb.
• La muestra de ADN de la escena del crimen y la muestra de ADN del sospechoso 3 son
homocigotas para la versión de 200 pb del marcador. Es decir, las dos muestras coinciden
para este marcador. (Khan Academy, 2014)
Resumen
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas copias de una
determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo).
La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y requiere de cebadores
de ADN diseñados específicamente para la región de ADN de interés.
La técnica de PCR es un procedimiento usado para amplificar los segmentos deseados de ADN a
través de la repetición de los ciclos de desnaturalización (separación del ADN de doble cadena
inducida por calor), el apareamiento (unión de cebadores específicos del segmento deseado a una
cadena parental de ADN) y la elongación (extensión de las secuencias cebadoras para formar una
nueva copia de la secuencia deseada).
Preguntas
1) De donde proviene la Taq polimerasa?
a. Bacteria
b. Alga
c. Hongo
d. Todas las anteriores
e. Ninguna de las anteriores
2) Cuántos cebadores mínimos son necesarios para realizar la PCR?
a. 3
b. 2
c. 5
d. Ninguno
3) El orden correcto para el procedimiento de la PCR es?
1. Apareamiento
2. Elongación
3. Desnaturalización
a. 3.2.1
b. 2.1.3
c. 3.1.2
Ayuda Nemotécnica

Bibliografía
Frankel, J., & Collins, J. (2006). Pruebas celulares y moleculares. Obtenido de Science Education:
https://www.sesbe.org/evosite/lines/IIDmolecular.shtml.html
Genetic Alliance. (2008). MÉTODOLOGÍAS DE PRUEBAS GENÉTICAS. Obtenido de NCBI:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK132206/
Khan Academy. (2014). Reacción en cadena de la polimerasa. Obtenido de KhanAcademy:
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-
electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
Tortora, G. (2007). Introducción a la Microbiología. Buenos Aires: Médica Panamericana.