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Minister de la santé de la population et de la reforme hospitalière

Ecole para médicale de BISKRA

Memoire professional de fin d’études

Laborantin Diplômé D’état

Thème

L’IMPORTANCE DE NETTOYAGE DES


TUBES ET CUVES AVANT LES ANALYSES
BIOCHIMIQUES EN URGENCE
(GLYCEMIE - L’UREE - CALCEMIE)

Dirigé par: Elaboré et soutenu par:

MER GOUBI DJAMEL Meme LAIZ LAMYA

(Laborantin) Melle TEBBAL FOUZIA

Juin 2011

1
Dédicace

Je dédie ce mémoire à mes parents , mes sœurs ( SOULEF , FETHIA, FARIDA ) et mes
frères ( YOUNES ,SALAH , KARIM , TAREK , KHALED , BADRE-EDDINE)

Et mes collègues, mes amies et tous que m’a encourage.

2
Dédicace

Dédié ce Mémoire :

Mon cher mari, qui assiste pour m'aider toujours à ma mère et mes frères : Asma, Samah,
Haroun, Ibrahim et Abd elouhd

A mon amie chahira et mes amis à L'école de para médicale.

À Latifa, souhila, hafsia, Asma ……….etc.

Pour tous ceux qui ont contribué à m’aider.

3
Remerciements

Après tous l’effort déployé en vue de compléter La mémoire.

Remercier tous ceux qu’ont contribués à la réalisation de la présente note en remerciant le pur
du Mr : Mohamad Bala et Mr : Goubi Djamel et L'école Para Médicale .La nourriture décente
ici et tous Les parents de tous les personnels hospitaliers Djamaa et des membres du
Laboratoire

Je vous remercie beaucoup.

4
Table de matière

- dédicace.

- remercîments.

- choix du thème.

- problématique.

- hypothèse.

- introduction.

Chapitre I :

- partie théorique.

- historique………………………………………………………….05

- rappel sur le sang………………………………………………….06

- description général………………………………………………..06

- les prélèvements…………………………………………………..07

- le condition de prélèvement de glycémie…………………………07

- le condition de prélèvement de l’urée…………………………….07

- le condition de prélèvement de calcium………………………….07

- matériel utilisé……………………………………………………08

- les paramètres…………………….………………………………09

- définition de glycémie………………………………………..….09

- dosage de la glycémie……………………………………………10
5
- méthode de dosage…………………………………………….…10

- méthode Baudouin et Lewin………………………………………10

- dosage de glucose sanguin par la méthode a l’ortho-toluidine….10

- méthode enzymatique……………………………………….……11

- les valeurs normales……………………………………………...11

- l’intérêt clinique……………………………………………..…...11

- variation physiologique…………………………………….….…11

- variation pathologique…………………………………….….….12

- hyperglycémie………………………………………………..….12

- hypoglycémie……………………………………………..……..12

- définition de l’urée………………………………………….…...13

- dosage de l’urée………………………………………….…..…..13

-méthode de dosage de l’urée…………………………….….……13

- méthode a l’hypobromite………………………………………..13

- méthode a diacètyl monoxine……………………………….…..13

- méthode enzymatique……………………………………….…..14
- les valeurs normales…………………………………………….14

- l’intérêt clinique………………………………………..……….14

- variation physiologique…………………………………….…..14

- variation pathologique……………………………………....….14

- définition de calcémie……………………………………….…16

- dosage de la calcémie……………………………………….…16

- méthode de dosage de la calcémie………………………….….16

6
- méthode physique par absorption atomique…………………...16

- méthode de tronchet…………………………………………...16

- méthode colorimétrique…………………………………….….17

- les valeurs normales………………………………………..….17

- l’intérêt clinique…………………………………………….....17

- variation physiologique…………………………………….…17

- variation pathologique………………………………….……..17

- hypocalcémie…………………………………………….……17

- hypercalcémie…………………………………………………18

Chapitre II :

- partie pratique.

- description des terrains d’application……………………….....19

- personnels exerçants………………………………………....20

- méthode utilisé……………………………………………..…21

- méthode enzymatique *GOD-PAP* de glucose…………..….21

- principe…………………………………………………….…21

- réactifs………………………………………………………..21

- préparation et stabilité………………………………………..21

- échantillons………………………………………………..…21

- mode opératoire……………………………………………...21

- linéarité…………………………………………………...….22

7
- méthode Berthelot modifiée de l’urée Colore………………….23

- principe………………………………………………………23

- réactifs………………………………………………………..23

- préparation et stabilité…….....................................................23

- échantillons…………………………………………………..24

- mode opératoire………………………………………….….24

- linéarité………………………………………………………….24

- méthode arsenazo iii. Colorimétrique de calcium…………….…25

- principe……………………………………………………….…25

- préparation du réactif……………………………………….…..25

- stabilité et conservation du réactif……………………………...25

- détérioration du réactif……………………………………….....25

- instruments……………………………………………………...25

- prélèvement et préparation du spécimen……………………..…25

- préparation de la verrerie……………………………………......25

- substances interférentes……………………………………..…..26

- procédure……………………………………………………..…26

- stabilité du mélange de réaction finale……………………….…27

- étalonnage…………………………………………………….....27

- contrôle de qualité……………………………………………….27

- limitations……………………………………………………......27

- résultat……………………………………………………..….…28

- décessions………………………………………………….....…32

8
- conclusion…………………………………………………….…33

- référence bibliographique.

- table de matière.

9
Choix du thème

L’analyse biochimique jouent un rôle élémentaire dans les diagnostiques des malade, pour
cette raison l'exactitude de résultats est en fonction de personnel qualifié.

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Problématique

Est-ce que le nettoyage de cuves et tubes de dosage biochimique ont une influence directe
sur la fiabilité des examens biochimiques ?

11
Hypothèse

D après les normes d’analyses biochimique connues, les cuves et tubes de dosage
biochimique doivent être bien propre et ne portant pas de traces soit des réactifs soit de
produits pathologiques (sérums)

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Introduction

Les examens biochimique sont très importantes dans le monde médicale, le bute de notre
travail est améliorer des les conditions d’utilisation des examens ou investigations
biochimiques par les praticiens. Il ne sert à rien de pratiquer des analyses si les principes
de l’exécution et l’utilisation du matériel ne sont pas respectés .Ces connaissances
permettent une fiabilité dans l’interprétation des résultats

Chaque examen, chaque épreuve retenus dans ce récit fond l’objet d’une étude
systématique en commençant par la préparation du malade au prélèvement, préparation du
matériel, le choix de la méthode le respect du temps d’incubation, et de la T° exigée.

En respectant tout ces conditions, les laboratoires soufrent de certaines interférences qui
sont liées à la verrerie mal nettoyée. Ce dernier paragraphe revêt, a nos yeux ; une
importance capitale, car sa connaissance devrait entrainer une régulation de la
consommation d’actes de laboratoire, en même temps que l’amélioration de leur
efficacité et fiabilité des résultats.

13
1- Historiques de biochimie :

La croissance rapide des connaissances scientifiques, de même que évolution du


technique redent souvent difficile pour le non spécialiste la compréhension de but et des
limites de chaque science. Sur le plan pratique, il en résulte que le médecin sétonne parfois de
la répartition des types d examens entre les d’efférents laboratoires, et a tendance a confondre
les disciplines. El est donc bien nécessaire de définir l objet de la biochimie ainsi que son
domaine médical.
La biochimie est la science qui étudie la structure des molécules vivantes, leur concentration
dans chaque cellule ou chaque liquide, biologique leur mode de formation (anabolisme,
biosynthèse) leur transport et leur mode de destruction (catabolisme, dégradation)
Les méthodes biochimique classiques (l utilisation de éprouvette, de la burette, de la
pipette) mais aussi le plus nouvelles, puissantes et l électrophorèse ou des méthodes physique
(spectrophotométrie).

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2- Rappel sur le sang
- Description générale:

Le sang est un textures liquide visqueux d'une forme de couleur rouge dans le tissu
conjonctif remplit le cœur et qui se passe à l'intérieur du corps par les vaisseaux sanguins
(veines et artères et capillaires), et le volume de sang dans le corps 5-6 litres chez un adulte
avec un 8,7 pour % Du poids corporel et la quantité de sang dans le système circulatoire
(cœur et vaisseaux sanguins) des deux tiers de la quantité dans le corps entier tandis que le
tiers restant est stocké dans le foie, la rate et d'autres parties du corps

Le tube échantillon de sérum de contenir une des anti-coagulations ... Tube tandis que
l'échantillon est le plasma contient une substance telle que la preuve de la coagulation
(héparine sodique, le fluorure de sodium, EDTA) et d'autres ne doit donc pas être inversée ou
bien jusqu'à ce que mélangé avec l'inhibiteur de la coagulation du sang.

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3- Les prélèvements :

3 -1- Les conditions de prélèvement de glycémie :

Le sang est prélevé sur fluorure de sodium afin d’inhiber la glycolyse, et maintenu à 4c si
l’analyse n’est réalisée immédiatement .En absence de fluorure, le glycose plasmatique
diminue d’environ 5% par heure dans du sang anti coagulé à température ambiante.

L’hémolyse invalide le test

La mesure de glycémie peut se faire à jeun ou à n’importe quel moment (glycémie aléatoire).

3 -2 - Les conditions de prélèvement de l’urée :

Le dosage est effectué sur sérum, plasma et urines de 24h ; il faut noter que la contamination
par les bactéries possédant une uréase aura pour effet une décroissance (qui peut être
importante). Du taux d’urée des urines de 24h.

3 - 3 - Les conditions de prélèvement de calcémie :

L’analyse est réalisée sur sérum de patient à jeun et sur urines de 24h. Nombreuses
substances (notamment en d’imprégnation ostrogénique) perturbent le test.

Le prélèvement de sang pour la calcémie est effectué sans garrot.

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4- Matériel utilise
seringue
Cotton
Garrot
Alcool
Tubes héparine ou sec
Tubes en verres
Les réactifs
Portoir
L’haricot
Pipette de 1000µl
Pipette de 10µl
Cuve à1cm
Centrifegeuse
Minuterie
L’étuve
spectrophotomètre

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I. Les paramètres :

1) La glycémie :

Les hydrates de carbone alimentaires (principalement sous forme d’amidon et de glycogène)


subissent au niveau du tractus digestif une hydrolyse enzymatique libérant le monomère
quantitativement le plus important ; le glucose, l’absorption du glucose est quasi complète.

La pénétration intracellulaire du glucose sanguin résulte d’un processus actif initié et accéléré
par l’insuline.

La régulation hormonale de la glycémie est un processus plurifactoriel complexe :le système


hyperglycémiant par le glucagon ,le cortisol, l’hormone de croissance et l’adrénaline.

La somatostatine a pour effet d’inhiber la sécrétion d’insuline et de glucagon.

La destinée métabolique du glucose est fonction de besoins de l’organisme : stockage sous


forme de glycogène, catabolisme permettant l’obtention d’énergie utilisable sous forme
d’ATP, transformation en céto-acides, acides aminés et protéines, transformation en lipides
de réserves si la quantité de glucose absorbée dépasse largement les besoins énergétique.

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2) Dosage de glycémie :

2.1 Méthodes de dosage du glycémie:

2.1.1 Méthode de BOUDOUIN et LEWIN:

Réactif :

Le sang est déféqué par nitrate mercurique puis traité par une solution d’odo-mércureate en
milieu alcalin.

Prélèvement :

Sérum ou plasma, le sang recueilli sur fluorure de sodium

- Mode d’opératoire :

Le dosage comprend 3temps distincts :

Défection.

Réduction d’odo-mercurique.

Dosage du mercure.

2.1.2 Dosage du glucose sanguin par la méthode à l’ortho-toluidine :

Réactifs :
- Réactif n°1 : solution étalon de glucose à 2g /l.
- Réactif n°2 : solution de l’ortho-toluidine :
• Ortho-toluidine….60ml.
• Thio-urée………..1.5g.
• acide –acétique…..940ml.
- Prélèvement :

Prélevé le sang sur fluorure de sodium.

- Mode d’opératoire :

Bien agiter, plonger tous les tubes pendant 8minutes dans bain-marie bouillant .Refroidir dans
un bain d’eau froide. Après 10 minutes ; lire à630nm les tubes dosage et étalon contre le blanc
réactif, la coloration reste stable pendant au moins 30mn.

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2.1.3 Méthode enzymatique:

Réactif :

Glucose-oxydase.

- Prélèvement :

Sérum ou plasma, le sang recueilli sur fluorure de sodium.

- Mode d’opératoire :

Réactif +sérum ; mélanger et incuber 10mn à37°C ou 30mn à20-25 °C et lire à505nm.

3) La valeur normale :

Plasma à jeun : 70_110 mg /dl

4) Intérêt clinique :

4.1 Variations physiologiques :

La valeur fondamentale 5.5mmol sur sang total reste schématiquement exacte la


remarquable stabilité de cette constante biologique, souvent citée en exemple pour illustrer le
principe d’hémostasie, est le résultat d’une régulation neuro-hormonale complexe dont tous
les détails d’ailleurs ne sont pas encore complètement connus.

1- Chez le sujet à jeun depuis plus 10 h et ayant reçu dans les jours précédant une
alimentation équilibrée en glucides (250 à300g /jour). Les méthodes chimiques donnaient des
résultats nettement plus élevés entre 5 et 7.2 m mol.

Aujour d’hui, on ne parlera d’hypoglycémie que pour une valeur répété à plusieurs examens
inférieur à2.75mmol mais on évoquera l’hyperglycémie diabétique désque la valeur de base
dépasse habituellement 6mmol.

2-Dans l’heure qui suit un repas normal, il existe chez le sujet sain une (flèche
d’hyperglycémie) qui en principe, ne doit pas dépasser 6.5mmol. Entre 6.5 à7.25mmol, on ne
peut affirmer un diabète, mais il est prudent de pratiquer une épreuve d’hyperglycémie
provoqué, le retour à la norme est souvent suivi d’une légère hypoglycémie transitoire.

3-Chez le nouveau né, il existe une hypoglycémie physiologique très nette, entre 1.75 et2.25
m mol entre la 3et 8h, qui doit remontrer et se stabiliser autour de 2.75mmol dés la 48 h le
nourrisson conserve normalement pendent un an une glycémie à jeun assez instable, voisine
de 2.75 m mol.

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4.2 La variation pathologique :

4.2.1 Hyperglycémie :

Les critères diagnostiques du diabète les plus récents (OMS 1999) sont :

-symptômes du diabète (polyurie, polydipsie, perte de poids…) +glycémie


aléatoire>=200mg /dl

-glycémie à jeun >=126mg/dl

-glycémie 2h après 75g de glucose (pendant une épreuve d’hyperglycémie


provoquée>=200mg/dl

En absence de symptômes évident, le diagnostic de diabète ne peut jamais être établir sur la
base d’une valeur anormale de glycémie=au moins une deuxième valeur normale et requise
(à jeun, aléatoire ou lors d’une épreuve) on parle d’intolérance au glucose lorsque :

• La glycémie à jeun est>110mg/dl, mais <126mg /dl,


• La glycémie 2h après 75g de glucose >140mg /dl, mais<200mg/dl.

4.2.2 Hypoglycémie :

La plupart des épisodes d’hypoglycémie surviennent chez les patients diabétiques, en cas :

• prise insuffisante d’hydrates de carbone.


• dose excessive d’insuline ou de sulfonylurée.
• efforts trop intensifs.
• absorption excessive d’alcool.

En absence de diabète l’hypoglycémie peut existe à jeun ou être réactive.

Hypoglycémie à jeun :
• insulinome (tumeur des cellules B des ilots de Langerhans).
• atteinte hépatique grave.
• trouble de stockage du glycogène.
• insuffisance surrénalienne.
Hypoglycémie réactive :
• injections d’insuline.
• après un repas en cas de gastrectomie.
• abus d’alcool.

21
L’urée :

L’urée est formée dans le foie, la synthèse résulte de processus métaboliques se déroulant
dans le l’oruithine(ou cycle de Crèbs-Henseleit) et constitue la voie métabolique principale
d’excrétion du surplus d’azote corporal, l’urée filtrée par les glomérules, est partiellement
réabsorbée par les tubules.

Son taux plasmatique reflète l’équilibre entre sa production et son excrétion.

5) Dosage de l’urée :

6.1 Méthodes de dosage de l’urée :

6.1.1 Méthode à l’hypobromite :

Réactifs :
• l’hypobromite de sodium.
• acide trichloracétique.
• solution de soude.
• -solution alcoolique de phénolphtaléine.
Prélèvement :

Sérum ou plasma sur tube sec ou héparine, ou sang total incoagulable.

Mode d’opératoire :

L’appareillage était représenté par l’uréomètre « d’YVON » et une cuve à mercure.

Cette techniques, applicable aussi bien au depuis longtemps, mais c’est qui à donné le nom
d’azotémie au taux d’urée dans le sang.

La défection du sérum est effectuée par une solution d’acide trichloracétique.

6.1.2 Méthode à diacétyl_monoxine :

Réactif :
• Diacétyl_monoxine.
Prélèvement :
• Sérum ou plasma sur tube sec ou l’héparine.
Mode d’opératoire :
• Diacétyl-monoxine en milieu acide à chaud donne en présence d’urée une coloration
jaune utilise pour le dosage colorimétrique.

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Cette méthode est souvent utilisée après dèproténisation, mais elle peut aussi être utilisée
directement.

La parfaite proportionnalité entre l’absorbance et le taux de l’urée autorise l’emploi de 2ou3


étalon seulement.

6.1.3 Méthode enzymatique :

Réactif :
• L’uréase.
Prélèvement :

Sérum ou plasma recueilli sur l’héparine.

Mode d’opératoire :

Sérum+réactif, bien mélangé, laissé 30mn à la T° du laboratoire lire les tubes à 650 nm.

6) Valeur normale :

Dans le sérum : homme : 15-36 mg/dl

Femme : 19_43mg/dl.

7) Intérêt clinique:

8.1 Variations physiologiques :

L’urée sanguine(parfois appelée important azotémie se suite aux alentours de 5m mol


chez l’adulte sains disposant d’une ration protéique normale en climat tempéré, il est très
difficile de suite la limite supérieure au de la quelle le taux d’urée devient pathologique :la
valeur de 8.33 m mol à jeun est un signe d’ alarme très discutable ;une néphropathie
évolutive peut s’installer avec une urémie à 5 m mol, inversement, une urémie à 13mmol
n’est pas synonyme d’atteinte grave du rein.

Après 50 ans, l’urémie à 8.33mmol est normale.

8.2 Variations pathologiques:

Une chute du taux d’urée sanguine de 2mmol chez l’adulte avec des taux de l’urée urinaire
s’observe au stade terminal des grandes insuffisances hépatiques, témoignant d’une
déchéance profonde et irréversible de la fonction uréogénique du foie ,en moment temps
l’installent l’hyperammoniémie,encephalopathie et le coma hépatique .Beaucoup plus
fréquent est le « syndrome de rétention azotée » qui associe une urémie élevée a des taux

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d’urée urinaire variables ,dans le cadre très général des « insuffisances rénales aigues ou
chronique ».L’urée sanguine reste un paramètre de dépistage grossier des maladies rénales.

En pathologie néphrologique, elle est toujours associe à la clairance de la créatinine, plus


faible et parce qu’indépendante de la diurèse et l’apport protéique.

L’urée urinaire et sanguine reste le témoin majeur du catabolisme azoté.

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8) Définition de calcium :

L’ion calcium ca++ est le plus abondant de l’organisme son métabolisme, étroitement lié à
celui des phosphates, est complexe : il participe à la régulation de perméabilité des
biomembranes, à l’activation ou l’inhibition de nombreux enzymes, à l’action de plusieurs
hormones, à l’excitabilité neuromusculaire, à la coagulation sanguine. Du point de vue
quantitatif, la principale fonction du calcium consiste à réaliser la minéralisation du tissu
osseux, essentiellement sous forme de phosphate tricalcique isomorphe aux apatites.

En biochimie clinique : la calcémie totale plasmatique ou sérique doit figurer sur la liste des
paramètres urgents dans tout laboratoire d’analyses. Elle complète la colonne cationique de
l’ionogramme plasmatique ; d’autre part, en pédiatrie elle peut résoudre dans l’immédiat le
problème posé par la survenue de convulsion chez le nourrisson et le jeune enfant.

9) Dosage de calcémie :

10.1 Méthodes de dosage de calcémie :

10.1.1 Méthode de tronchet :

Réactifs :
1) Solution d’E.D.T.A
2) Solution alcaline de KCN
3) Indicateur de Patton et Reader
4) Solution étalon de calcium à 100mg/l
Prélèvement :

7 ml de sang recueilli dans un tube sans anticoagulant

Mode d’opératoire :

Dans un erlenmeyer de 25ml, introduire le sérum non hémolyse (2ml) avec eau distillé +
solution alcaline de KCN+ indicateur de Patton-Reeder .

-Le mélange est rose, titrer avec la solution d’EDTA jusqu’au virage bleu-vert. Soit n ml

-Parallèlement faire un titrage de la solution de complexons en remplaçant la prise d’essai de


sérum par 2 ml de la solution de calcium, titrer jusqu’au virage bleu-vert soit n ml.

10.1 .2 Méthode physique (par absorption atomique) Réactifs :

- Acide chlorhydrique

- Solution étalon de calcium à 0,1 g/l

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Prélèvement :

-Sérum ou plasma

Mode d’opératoire :

Diluer le sérum ou le plasma au 1/50 avec la solution de chlorure de lanthane. Si un léger


trouble se produisait, rajouter un peu d’acide chlorhydrique. Effectuer la lecture dans les
mêmes conditions opératoires que ci-dessus. Se reporter à la courbe d’étalonnage.

10.1.3 Méthode colorimétrique :

Réactif :

Cresolphtaline

Prélèvement :

Sérum, plasma recueilli sur l’héparine

Mode d’opératoire :

20 ml de sérum + 1 ml de réactif et incuber 5 min à température ambiante et lire à 570 n m.

10) Valeur de référence :


- 8,5 à 10,5 mg/dl

11) Intérêt clinique :

12.1 Variations physiologiques :

Il y’a une hypocalcémie physiologique vers 2 m mol qui doit céder en quelques jours. Penser
au rachitisme, avec phosphatémie abaissé, phosphatase alcaline élevée, devant une
hypocalcémie transitoire du nourrisson.

12.2 Variations pathologiques :

12.2.1 Hypocalcémie : les causes principales de l’hypocalcémies

- A part les hypo protéinémies, puisque la moitié du calcium plasmatique est liée aux
protéines (état de dénutrition, cirrhose confirmé, néphrose lipoïdique, stéatorrhee massive.

-En pédiatrie NEO-NATALE : la tétanie à avec vomissement et accès de cyanose pose un


véritable problème de réanimation.

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-Chez l’adulte et l’adolescent trois causes principales l’hypocalcémie :

a) l’hypoparathyroïde souvent iatrogène après chirurgie thyroïdienne calcémie < 1,75 m mol

b) ostéomalacie « rachitisme de l’adulte » : hypocalcémie, hypophosphatémie, phosphatases


alcalines élevés.

c) Insuffisance rénale chronique associant hypocalcémie hypocalciurie à hyperphosphatémie.

12.2.2 Hypercalcémie

L’hypercalcémie est souvent cliniquement muette, ce qui justifie la présence du calcium


plasmatique dans le bilan systématique de dépistage qui peut révéler l’adénome
parathyroïdien. Des signes digestifs neuro-musculaires et physiques.

Syndrome cardiovasculaire s’assoient à un syndrome rénale.

Les principales causes de l’hypercalcémie :

1- Destruction osseuse : cancers secondaires des os à forme ostéolyque (sein, rein,


bronches au départ) avec hypocalciurie considérable (1g d’os détruit libère 1,5 m mol
de calcium)

*l’adénome hyperparathyroïdien

*le myélome multiple et autres ostéopathies oséolysantes.

*l’ostéoporose d’immobilisation (poliomyélite, poly fractures)

2- Excès d’absorption intestinal plus rare : surdosage en vitamine D –sarcoïdose-


ulcéreux gastroduodénaux gavés de lait et poudres alcalines

27
I - Description du terrain d'application :
Le laboratoire externe de cette polyclinique est étroit. La direction prévoit son extension a fin
qu'il répond à L'inspiration de la population de Djamaa.

Le laboratoire de L'établissement public de la santé de proximité de Djamaa disposé des


paillasses suivantes :

* Hématologie

* Biochimie

* Parasitologie

* Sérologie

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II - Personnel exerçant :
Il disposé d'un personnel spécialisé :

_0 1. I.E.P (infermière d’état principal).

_ 03 .L D.E (laborantines diplômé d’état).

_ 01. Breveté

_ 03 biologistes.

29
III - Méthode utilisés
1. Méthode enzymatique (GOD – PAP) de glucose ( biomagrèb ):
A. Principe
Détermination enzymatique du glucose sel ou les réactions Suivantes :

Glucose + O2 + H2O glucose Oxydase Acide gluconique + H2o2

2H2o2 + phénol + 4 - Amino – antipyrine quinoneimine – rose + 4 H2O

B. Réactifs :

Réactif 1 : Tampon tsis PH = 7 100 m mol/l

Solution tampon phénol 0.3 m mol/l

Réactif 2 : Glucose oxydase 10 000 u/l

Enzymes : peroxydase 1000 v/l

Amino 4 – Antipyrine 2.6 m mol/l

Réactif 3 : glucose 100 mg/dl

Standard 5.56 m mol/l

C. Préparation et stabilité :

Dissoudre le lyophilisat R2.dans le tampon R1 protéger de la lumière.

Stabilité du réactif de travail.

-1 mois à 20- 25 C0
- 2 mois à 2- 8 C0
D. Echantillons

Sérum ( non hémolysé )

Plasma recueilli sur fluorure – héparine ou héparine – iodacétate (non hémolysé )

E. Mode opératoire :

Longueur d'onde : 505 nm (492-550)

Température : 37 C0 (20-25 C0 )

Cuve : 1 cm d'épaisseur

30
Ajuster le zéro du spectrophotomètre sur le blanc réactif

Blanc standard Echantillon


- Standard - 10 µl -
- Echantillon - - 10 µl
- Réactif de travail 1 ml 1 ml 1 ml

Mélanger lire les DO après une incubation de 10 minutes à 37 C0

Ou 30 min à 20 – 25 C0

La coloration est stable 30 minutes.

F. Linéarité :

La méthode est linéaire jusqu'à 5 g/L (500mg/dl – 27,8 m mol /l)

Si la concentration en glucose est supérieure à 5 g/L

Recommence le dosage sur l'échantillon dilué au 1/2 avec une solution de NaCl à 9g/L
Multiplier le résultat par 2

31
2 -Méthode Berthelot modifié d’Urée colore (biomagrèb) :
A. Principe

L'urée est dosée en cinétique selon la réaction suivante

Uréase

Urée + H2O 2NH3 + CO2

Les ions ammonium, en présence de salicylate et d'hypochlorite de sodium réagissent en


formant un composé de couleur verte (Dicarboxylindophenol) dont l'intensité est
proportionnelle à la concentration en urée.

B. Réactifs

Réactif 1: Tampon

Réactif 2 : EDTA 2m mol/l

Salicylate de sodium 60 m mol/l

Nitroprussiate de sodium 32mmol/l

Uréase 30000u/l

Phosphate pH 6,7 60m mo/l

Réactif 3 : Etalon urée 0.50 g/L

8.325m mol/l

Réactif 4 : hypochlorite de sodium 40 m mol/l

10 × [ ] hyroxyde de sodium 150 m mol/l

Préparation et stabilité :

Le réactif 4 est à compléter avec 90 ml d'eau distillée

Réf. 20141,450mL d'eau distillée Réf. 20146 ou Réf. 20148

Dissoudre le flacon R2dans le tampon réactif 1 : réactif A

Les réactifs de travail sont stables : 6 mois à 2 –8°c ,14 jours à 20 – 25°c

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C. Echantillons:

Sérum, plasmas recueilli sur héparine.

Urine diluée au 1/50 avec de l'eau distillée.

D. Mode opératoire:

Longueur d'onde :…………………… 590 nm (578 hg)

Température : ………………………… 25 – 30 - 37 ◦c

Cuve …………………………………. 1 cm d'épaisseur

Ajuster le zéro du spectrophotomètre sur le blanc réactif.

Blanc Etalon Echantillon


Etalon - 10 uL -
Echantillon - - 10 uL
Réactif de travail 1 ml 1 ml 1 ml

Mélanger, incuber 5 min, à 37◦c ou 10 min, à 20 - 25 ◦c ajouter ensuite

Réactif 4 1 ml 1 ml 1 ml
Mélanger, incuber 5 min, à 37◦c ou 10 min. à 20-25 ◦c lire contre le blanc.
Stabilité de la coloration 2 heures à l'abri de la lumière

E. Linéarité:

La méthode est linéaire jusqu'à 4 g/L (66.6 m mol/l)

Dans les urines, la méthode est linéaire jusqu'à 100g /L

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3) Méthode Arsenazo III – colorimétrique de calcium (spinréact) :

A. Principe :

2 Arsenazo III + 2 Ca++ complexe Ca-Arsenazo++ (bleu-pourpre)

L'Arsenazo III [2,2'-(1,8-dihydroxy-3,6-bisulfonaphthylène-2,7-bisazo) acide arsénique di


benzénique] réagit avec le calcium dans une solution acide pour former un complexe coloré
bleu pourpre. La couleur obtenue a un taux d'absorption maximal de 650 nm et l'absorption
est proportionnelle à la concentration de calcium de l'échantillon.

B. préparation du réactif :

Le réactif fournis est prêt à utiliser.

C. Stabilité et conservation du réactif :

Le réactif inclus demeure stable jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l’étiquette à 18-26°C.

D. Détérioration du réactif :

Le réactif doit être clair. La turbidité serait signe de détérioration.

E. Instruments :

Tout instrument muni d'un contrôle de température de ± 0.5 °C et pouvant fournir une lecture
d'absorption précise à 0.001 unité à650 nm peut être utilisé. La largeur de la bande ne doit
pas dépasser 10 nm et la lumière parasite ne doit pas excéder 0.5 %. La Longueur d'onde doit
être précise à 2 nm près.

F. Prélèvement et préparation du spécimen :

Le sérum frais, clair et non hémolysé est le spécimen de choix.

G. Préparation de la verrerie :

Toute verrerie utilisée pour le dosage du calcium devrait être décontaminée en la laissant
tremper jusqu'au matin dans du HCl 1 N, ou pendant 6 heures dans du HCl 6 N. La verrerie
devrait être bien rincée avec de l'eau dé ionisée avant l'usage.

Les seringues des distributeurs devraient aussi être rincées dans du HCl 6 N, puis avec de
l'eau dé ionisée avant de servir au dosage du calcium.

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H. Substances interférentes :

Dans les dosages de calcium, la contamination de l'environnement entraîne des résultats


erronés à moins de prendre les mesures de décontamination susmentionnées.

On peut trouver un résumé de l'influence des drogues sur les dosages en laboratoire chez
Young, D.S. (2).

I. Procédure :

-Matériaux fournis :

Le réactif nécessaire pour le dosage du calcium est inclus.

-Matériaux requis :

1. Tout instrument répondant aux exigences énoncées à la section Instruments.

2. Cuvettes de 1 cm ou cellules de circulation pouvant transmettre la lumière à 650 nm.

3. Éprouvettes de capacité appropriée.

4. Pipettes de capacité appropriée.

5. Eau dé ionisée.

6. Une minuterie appropriée.

J. Paramètre :

Longueur d'onde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 650 nm

Température . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18-26°C

Chemin optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm

Principe de dosage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Réaction complété

Durée de la réaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 secondes

Volume d'échantillon requis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 L

Volume de réactif ajouté . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.0 ml

Volume total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.02 ml

Rapport volume d'échantillon/volume de réactif . . . . 1/100

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K. Méthodologie :

1. Dans des éprouvettes distinctes, pipette 20 :L d'eau dé ionisée, de standard ou de sérum à


doser.

2. Ajouter 2.0 ml de réactif et mélanger.

3. Laisser incuber au moins 30 secondes à 18-26°C.

4. Déterminer, dans les 30 minutes, l'absorption du standard (As).

et de chaque sérum (A) à 650 nm, en utilisant l'échantillon d'eau

dé ionisée comme blanc de réactif.

L. stabilité du mélange de réaction finale :

La couleur de la solution après la réaction finale est stable pendant 30 minutes.

M. Étalonnage :

Un standard de calcium équivalent à 2.5 m mol/L (10 mg/dl) de calcium est fourni avec 140-
20 et 140-S7 et doit être utilisé tel

Qu’indiqué pour calibrer la procédure. Le numéro de catalogue 140-24, 140-15 n'incluent pas
de standard. Cependant, on doit en utiliser un d'après les instructions, pour calibrer la
procédure.

N. Contrôle de qualité :

On devrait analyser un sérum contrôle à niveau normal et un autre à niveau anormal pour
chaque série d'échantillons.
Les résultats de ces contrôles devraient donner en deçà de deux déviations standard de la
valeur déjà établie.

O. Limitations :
Un échantillon avec un niveau calcium dépassant la limite de linéarité doit être dilué avec un
salin de 0.9 % et dosé de nouveau en tenant compte du facteur de dilution dans les calculs.

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** Pour mon étude j ai utilise comme outils de travail.

Une étude de cas (comparaison) partant sur : 30 patients :

Les résultats de glycémie

Tableau I :

N° de malade Résultat de gly avec cuve non propre Résultat de gly avec cuve propre

1 0.69g/l - 0.88 g/l N


2 1.05 g/l N 1.36 g/l +
3 1.93 g/l + 2.01 g/l +
4 1.64 g/l + 2.02 g/l +
5 1.21 g/l + 1.41 g/l +
6 1.08 g/l N 1.01 g/l N
7 0.73 g/l N 0.81 g/l N
8 0.90 g/l N 1.06 g/l N
9 0.78 g/l N 0.94 g/l N
10 0.85 g/l N 1.14 g/l N
11 0.90 g/l N 0.69 g/l -
12 0.75 g/l N 0.69 g/l -
13 0.75 g/l N 0.67 g/l -
14 0.63 g/l - 0.78 g/l N
15 0.80 g/l N 1.04 g/l N
16 0.79 g/l N 0.96 g/l N
17 0.76 g/l N 1.41 g/l +
18 1.38 g/l + 0.71 g/l N
19 0.78 g/l N 0.56 g/l -
20 2.08 g/l + 1.92 g/l +
21 0.82 g/l N 0.69 g/l -
22 2.23 g/l + 1.87 g/l +
23 0.75 g/l N 0.64 g/l -
24 1.20 g/l N 0.85 g/l N
25 1 g/l N 0.92 g/l N
26 0.90 g/l N 0.63 g/l -
27 3.23 g/l + 2.40 g/l +
28 2.38 g/l + 1.93 g/l +
29 1.04 g/l N 0.70 g/l N
30 0.65 g/l - 0.57 g/l -

37
Les résultats de L'urée

Tableau II :

N° de malade Résultat de l’urée avec cuve non Résultat de l’urèe avec cuve propre
propre
1 0.19 g/l N 0.24 g/l N
2 0.14 g/l - 0.20 g/l N
3 0.10 g/l - 0.06 g/l -
4 0.13 g/l - 0.18 g/l N
5 0.10 g/l - 0.09 g/l -
6 0.10 g/l - 0.09 g/l -
7 0.10 g/l - 0.13 g/l -
8 0.10 g/l - 0.10 g/l -
9 0.11 g/l - 0.14 g/l -
10 0.21 g/l N 0.30 g/l N
11 0.20 g/l N 0.23 g/l N
12 0.11 g/l - 0.10 g/l -
13 018 g/l N 0.26 g/l N
14 0.10 g/l - 0.10 g/l -
15 0.31 g/l N 0.33 g/l N
16 0.14 g/l - 0.14 g/l -
17 0.25 g/l N 0.26 g/l N
18 0.19 g/l N 0.18 g/l N
19 0.15 g/l N 0.18 g/l N
20 0.22 g/l N 0.31 g/l N
21 0.12 g/l - 0.12 g/l -
22 0.11 g/l - 0.23 g/l N
23 0.19 g/l N 0.29 g/l N
24 014 g/l - 0.27 g/l N
25 0.21 g/l N 0.23 g/l N
26 0.15 g/l N 0.29 g/l N
27 0.20 g/l N 0.29 g/l N
28 0.13 g/l - 0.22 g/l N
29 0.12 g/l - 0.22 g /l N
30 0.12 g/l - 0.12 g/l -

38
Les résultats de Calcémie

Tableau III :

N° de malade Résultat de calcémie avec cuve non Résultat de calcémie avec cuve
propre propre
1 65 mg/l - 115 mg/l +
2 64 mg/l - 95 mg/l N
3 76 mg/l - 99 mg/l N
4 72 mg/l - 119 mg/l +
5 79 mg/l - 97 mg/l N
6 97 mg/l N 86 mg/l -
7 83 mg/l - 114 mg/l +
8 116 mg/l + 108 mg/l +
9 56 mg/l - 99 mg/l N
10 83 mg/l - 87 mg/l -
11 116 mg/l + 97 mg/l N
12 111 mg/l + 73 mg/l -
13 93 mg/l N 113 mg/l +
14 103 mg/l N 76 mg/l -
15 158 mg/l + 70 mg/l -
16 91 mg/l N 89 mg/l -
17 86 mg/l - 94 mg/l N
18 78 mg/l - 72 mg/l -
19 76 mg/l - 100 mg/l N
20 99 mg/l N 85 mg/l -
21 180 mg/l + 84 mg/l -
22 88 mg/l - 110 mg/l +
23 77 mg/l - 98 mg/l N
24 41 mg/l - 94 mg/l N
25 59 mg/l - 104 mg/l N
26 27 mg/l - 103 mg/l N
27 73 mg/l - 100 mg/l N
28 24 mg/l - 162 mg/l +
29 16 mg/l - 96 mg/l N
30 22 mg/l - 96 mg/l N

39
Tableau 1 :

Les résultats de tableau résultent une petite variation de glycémie entre ceux réalisées dans un
cuve propre et ceux réalisée dans une cuve in propre

Tableau II :

Idem pour l'urée

Tableau III :

Pour le calcémie on remarque une grande incidence des impuretés sur les résultat car ce
dernier set très sensible.

40
Discussions

D'après les résultats obtenus, notre hypothèse est justifiée et le travail confirme qu'un bon
nettoyage du matériel mène vers des résultats proches aux normes.

41
Conclusion

Chaque praticien du service de laboratoire doit veiller sur la propreté du matériel et la


stérilisation de certains matériels afin d'aboutir à des résultats fiable. Actuellement, il est
exigé de métriser d'automate et de comparer les résultats obtenus avec d’autres laboratoires.
Tout cela pour le bien du malade.

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Références bibliographiques :

- Serge Bernard. Instruments et techniques de laboratoire diagnostique médicaux


chirurgicaux. 1985

-MALOINE –S-A EDITEUR ; comment prescrire et interpréter un examen de biochimie 1984

- www. RXLIST.com

-www.goole.dz

-www.mediadeco.com

-Pierre Valdiguié – biochimie clinique

-G. Janssens Répertoire d’analyses de biologie clinique 2006

43