DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA

AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN CIENCIAS AGROPECUARIAS

IASA I

TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE

INGENIERO AGROPECUARIO

AUTOR: ÁLVAREZ ERAZO, PABLO ALEJANDRO

TEMA: EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE DOS GENERACIONES

DE PLANTAS DE ARVEJA (Pisum sativum L.) PROVENIENTES
DE SEMILLAS IRRADIADAS CON RAYOS GAMMA PARA
IDENTIFICAR RESISTENCIA A Ascochyta spp.

DIRECTOR: ING. YÉPEZ, ÁLVARO

CODIRECTOR: ING. BASANTES, EMILIO

Sangolquí, 13 de noviembre de 2013

 i

CERTIFICACIÓN

Ing. Álvaro Yépez e Ing. Emilio Basantes

CERTIFICAN

Que el trabajo titulado: EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE DOS GENERACIONES

DE PLANTAS DE ARVEJA (Pisum sativum L.) PROVENIENTES DE SEMILLAS

IRRADIADAS CON RAYOS GAMMA PARA IDENTIFICAR RESISTENCIA A

Ascochyta spp., realizado por Pablo Alejandro Álvarez Erazo, ha sido guiado y

revisado periódicamente y cumple normas estatutarias establecidas por la ESPE, en

el Reglamento de Estudiantes de la Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE.

Debido a la trascendencia de los nuevos conocimientos generados en el campo del

fitomejoramiento, recomiendan su publicación.

El mencionado trabajo consta de un documento empastado y dos discos compactos

los cuales contienen los archivos en formato portátil de Acrobat (pdf). Autorizan a

Pablo Alejandro Álvarez Erazo que lo entregue a la Ing. Martha Vargas, en su

calidad de Directora de la Carrera.

Sangolquí, 13 de noviembre de 2013.

______________________ ______________________

Ing. Agr. M. Sc. Álvaro Yépez Ing. Agr. M. Sc. Emilio Basantes

DIRECTOR CODIRECTOR
 ii

DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD

Pablo Alejandro Álvarez Erazo

DECLARO QUE:

El proyecto de grado denominado: EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE DOS

GENERACIONES DE PLANTAS DE ARVEJA (Pisum sativum L.)

PROVENIENTES DE SEMILLAS IRRADIADAS CON RAYOS GAMMA PARA

IDENTIFICAR RESISTENCIA A Ascochyta spp. ha sido desarrollado con base a

una investigación exhaustiva, respetando derechos intelectuales de terceros,

conforme las citas que constan al pie de las páginas correspondientes, cuyas fuentes

se incorporan en la bibliografía. Consecuentemente este trabajo es de mí autoría.

En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y alcance

científico del proyecto de grado en mención.

Sangolquí, 13 de noviembre de 2013.

_________________________

Pablo Alejandro Álvarez Erazo

 iii

AUTORIZACIÓN

Yo, Pablo Alejandro Álvarez Erazo

Autorizo a la Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE la publicación, en la

Biblioteca virtual de la Institución, del trabajo: EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE

DOS GENERACIONES DE PLANTAS DE ARVEJA (Pisum sativum L.)

PROVENIENTES DE SEMILLAS IRRADIADAS CON RAYOS GAMMA PARA

IDENTIFICAR RESISTENCIA A Ascochyta spp., cuyo contenido, ideas y criterios

son de mi exclusiva responsabilidad y autoría.

Sangolquí, 13 de noviembre de 2013.

_________________________

Pablo Alejandro Álvarez Erazo

 iv

DEDICATORIA

A mis padres, Tania y Pablo,

y a mi hermana Tatiana, por

ser mi fuente de apoyo,

inspiración y fortaleza

durante toda mi vida.

A los agricultores de todo el

planeta, por su noble labor.

Pablo Álvarez
 v

AGRADECIMIENTO

A mis padres y a mi hermana por su apoyo incondicional para la consecución de

todas mis metas.

A Naty por apoyarme, motivarme y acompañarme durante la realización de este

trabajo. También te amo preciosa.

En forma especial al Programa Nacional de Leguminosas y Granos Andinos de la

Estación Experimental “Santa Catalina” del INIAP, (Ing. Eduardo Peralta, Ing.

Ángel Murillo, Ing. Marco Rivera, Ing. Jenny Garcés, Ing. Diego Rodríguez, Ing.

Luis Lomas, Ing. Laura Vega, Agr. José Pinzón, Ing. Mary Mejía, Ing. Diana

Domínguez, Srta. Adriana Manosalvas, Becario Diego Mina, Sra. Paty, Sra. Charo,

Sra. María y Sra. Micaela), por su guía, apoyo, supervisión y exigencia durante el

desarrollo de esta investigación, así como a los Ing. Carlos Yánez del Programa

Nacional del Maíz e Ing. Javier Garófalo del Programa Nacional de Cereales, por la

ayuda y sugerencias recibidas.

Al personal del Instituto Técnico Superior Simón Rodríguez, y de la Subsecretaría de

Control, Investigación y Aplicaciones Nucleares del Ministerio de Electricidad y

Energía Renovable.

A los ingenieros Álvaro Yépez, Emilio Basantes y Abraham Oleas, por su guía y

supervisión.

A mis amigos del IASA por nuestra amistad fortalecida al compartir distintas

experiencias durante estos años de aprendizaje. Al IASA y a la ESPE, a sus docentes

y empleados, por toda la paciencia y dedicación en la labor de enseñar.

A mis grandes amigos Juan Carlos, Elio Andrés, Andrés Sebastián, Jonathan y Alex.
 vi

HOJA DE LEGALIZACIÓN DE FIRMAS

ELABORADO POR:

____________________________

PABLO ALEJANDRO ÁLVAREZ ERAZO

DIRECTORA DE LA CARRERA DE INGENIERÍA EN CIENCIAS

AGROPECUARIAS

____________________________

ING. MARTHA VARGAS

 vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CONTENIDO Pág.

I. INTRODUCCIÓN................................................................................... 1
1.1. OBJETIVOS.............................................................................................. 4
1.1.1. Objetivo General ....................................................................................... 4
1.1.2. Objetivos Específicos ................................................................................ 4
II. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................. 5
2.1 GENERALIDADES.................................................................................. 5
2.1.1. Origen ........................................................................................................ 5
2.1.2. Descripción Botánica ................................................................................ 5
2.2. ENFERMEDADES DE LA ARVEJA ...................................................... 6
2.2.1. Enfermedades causadas por el “Complejo Ascochyta” ............................. 7
2.2.2. Síntomas .................................................................................................... 7
2.2.3. Ciclo de la Enfermedad ............................................................................. 8
2.2.4. Control de la Enfermedad ......................................................................... 9
2.3. VARIEDADES MEJORADAS DE ARVEJA LIBERADAS POR
EL INIAP ................................................................................................ 10
2.4. LA INDUCCIÓN DE MUTACIONES EN EL
FITOMEJORAMIENTO ........................................................................ 11
2.4.1. Agentes Mutágenos ................................................................................. 12
2.4.1.1. Agentes Físicos ....................................................................................... 12
2.4.1.2. Agentes Químicos ................................................................................... 14
2.4.2. Variedades Mutantes de Plantas Cultivadas............................................ 14
2.4.3. Trabajos de Inducción de Mutaciones realizados en Arveja. .................. 15
2.4.4. Aspectos a Considerar para Seleccionar una Técnica de Mutación ........ 16
2.4.4.1. Objetivos del programa de mejoramiento ............................................... 16
2.4.4.2. El tipo de material a ser tratado ............................................................... 16
2.4.4.3. La frecuencia de mutación del gen responsable de un carácter
deseado .................................................................................................... 16
2.4.4.4. Efectos somáticos del tratamiento ........................................................... 17
2.4.5. Selección de la Dosis de Mutágeno a ser Aplicada ................................. 19
2.4.6. Manejo de la generación M1.................................................................... 21
2.4.7. Manejo de la Generación M2................................................................... 22
 viii

2.4.8. Efectividad y eficiencia mutagénica ....................................................... 23

III. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................. 24
3.1. UBICACIÓN DEL LUGAR DE INVESTIGACIÓN............................. 24
3.1.1. Ubicación Política ................................................................................... 24
3.1.2. Ubicación Geográfica .............................................................................. 24
3.1.3. Ubicación Ecológica ............................................................................... 24
3.2. MATERIALES........................................................................................ 25
3.3. MÉTODOS.............................................................................................. 27
3.3.1. Dosimetría: .............................................................................................. 27
3.1.1.1. Prueba “Dinámica de Germinación” ....................................................... 28
3.1.1.2. Prueba “Porcentaje de supervivencia” .................................................... 28
3.1.1.3. Prueba “Altura de plántulas” ................................................................... 29
3.3.2. Generación M1......................................................................................... 31
3.3.3. Generación M2......................................................................................... 34
3.3.3.1. Localidad 1. Instituto Técnico Superior “Simón Rodríguez” ................. 34
3.3.3.2. Localidad 2. Estación Experimental “Santa Catalina” ............................ 36
3.3.4. Obtención de la fuente de inóculo de Ascochyta sp. ............................... 38
3.3.5. Cálculo de la efectividad y la eficiencia del tratamiento
mutagénico. ............................................................................................. 42
3.3.6. Siembra, desarrollo y evaluación de la resistencia de plantas M3
bajo condiciones de invernadero. ............................................................ 42
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN........................................................... 44
4.1. ETAPA 1: DOSIMETRÍA ...................................................................... 44
4.1.1. Prueba “Dinámica de germinación” ........................................................ 44
4.1.2. Prueba “Porcentaje de supervivencia” .................................................... 45
4.1.3. Prueba “Altura de plántula” .................................................................... 47
4.2. ETAPA 2: GENERACIÓN M1 ............................................................... 51
4.2.1. Porcentaje de emergencia ........................................................................ 51
4.2.2. Porcentaje de plantas con sectores somáticos mutantes (quimeras) ....... 52
4.2.3. Porcentaje de plantas sobrevivientes hasta la madurez-Letalidad .......... 55
4.2.4. Número de plantas cosechadas y conformación de los grupos de
semillas M2. ............................................................................................. 57
4.3. ETAPA 3: GENERACIÓN M2 ............................................................... 58
4.3.1. Porcentaje de emergencia ........................................................................ 58
 ix

4.3.2. Frecuencias de mutaciones clorofílicas de cada población ..................... 60

4.3.3. Efectividad y eficiencia del tratamiento mutagénico. ............................. 63
4.3.4. Identificación de plantas M2 resistentes a Ascochyta spp. ...................... 64
4.3.4.1. Localidad ITSSR ..................................................................................... 64
4.3.4.2. Localidad EESC ...................................................................................... 64
4.4. GENERACIÓN M3 ................................................................................. 65
V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................. 69
5.1. CONCLUSIONES .................................................................................. 69
5.2. RECOMENDACIONES ......................................................................... 69
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................... 71
 x

LISTADO DE TABLAS

Tabla 2.1. Características de la variedad INIAP 436 Liliana ................................... 11

Tabla 3.1. Escala utilizada para evaluar la severidad de la infección causada
por Ascochyta spp.................................................................................... 41
Tabla 3.2. Escala para medir la severidad de la infección causada por especies
del “Complejo Ascochyta” ...................................................................... 43
Tabla 4.1. Análisis de varianza de la prueba “Dinámica de germinación” .............. 45
Tabla 4.2. Análisis de varianza para la variable “Porcentaje de supervivencia” ..... 46
Tabla 4.3. Prueba de Tukey (α= 0,05) para las medias halladas en la
evaluación de la variable “Porcentaje de supervivencia”........................ 47
Tabla 4.4. Valores promedio de la altura de las plántulas hasta el punto de
inserción del segundo foliolo para cada dosis de radiación gamma
aplicada.................................................................................................... 48
Tabla 4.5. Porcentaje de plantas con sectores somáticos mutantes (quimeras) a
nivel del cuarto, quinto y sexto foliolo.................................................... 53
Tabla 4.6. Número aproximado de semillas en cada uno de los conjuntos
obtenidos en la cosecha de las plantas M1............................................... 58
Tabla 4.7. Análisis de varianza de la emergencia observada en las poblaciones
“Testigo” y “Dosis óptima” en las localidades ITSSR y EESC. ............. 60
 xi

LISTADO DE CUADROS

Cuadro 4.1. Porcentajes de germinación y número promedio de semillas

germinadas por cada dosis de radiación aplicada. .............................. 45
Cuadro 4.2. Número promedio de plantas supervivientes, porcentaje de
supervivencia y porcentaje de reducción con respecto al
tratamiento testigo, observados para cada dosis de radiación
gamma aplicada .................................................................................. 46
Cuadro 4.3. Curva y ecuación de regresión realizada a partir de los datos
expuestos en el tabla 4.4. .................................................................... 49
Cuadro 4.4. Porcentajes de emergencia en la Etapa 3 de las poblaciones
“Dosis óptima” y “Testigo” en el ITSSR y la EESC.......................... 59
 xii

LISTADO DE FIGURAS

Figura 3.1. Detalles del Irradiador utilizado en el proyecto ................................. 27

Figura 3.2. Prueba “Dinámica de Germinación” .................................................. 28
Figura 3.3. Bandejas plásticas con sustrato estéril en donde se sembraron las
diferentes unidades experimentales en la prueba “Porcentaje de
supervivencia” .................................................................................... 29
Figura 3.4. Prueba “Altura de plántulas”. ............................................................. 30
Figura 3.5. Medida registrada en la prueba “Altura de plántula” ......................... 30
Figura 3.6. Foliolo que presenta sectores mutantes clorofílicos en forma de
tejido de diferente color al resto de la lámina foliar. .......................... 32
Figura 3.7. Granizada caída el día 27 de noviembre de 2012 en el ITTSR. ......... 36
Figura 3.8. Inoculación en campo de Ascochyta sp. ............................................. 38
Figura 4.1. Disminución en la altura de las plántulas en relación al
incremento en la dosis de radiación a las que fueron expuestas
las semillas.......................................................................................... 48
Figura 4.2. Plántulas correspondientes a cada tratamiento en las que se
observa la reducción en la altura de la plántula .................................. 49
Figura 4.3. Plántulas correspondientes a las dosis de 150 y 200 Gy en donde
se observan la reducción en el crecimiento de las mismas ................. 50
Figura 4.4. Diferencia entre los porcentajes de germinación de un surco de
la población “Dosis óptima” (izquierda) y población “Testigo”
(derecha). ............................................................................................ 52
Figura 4.5. Foliolos con sectores mutantes clorofílicos. ....................................... 54
Figura 4.6. Plantas de la población “Dosis óptima” que han perdido los
sectores mutantes clorofílicos al proseguir el desarrollo. ................... 55
Figura 4.7. Plántula albina .................................................................................... 61
Figura 4.8. Plántula xantha ................................................................................... 61
Figura 4.9. Plántula viridis .................................................................................... 61
Figura 4.10. Plantas M2 con ataque severo por Ascochyta spp. en el ITSSR. ........ 64
Figura 4.11. Plantas M2 con calificación 3 dentro de la escala utilizada para
evaluar la severidad de la infección por Ascochyta spp. .................... 65
Figura 4.12. Foliolo de planta M3 con calificación 5 dentro de la escala
utilizada .............................................................................................. 66
 xiii

Figura 4.13. Plantas M3 mostrando una severa infección por Ascochyta sp........... 66
 xiv

RESUMEN

El cultivo de arveja (Pisum sativum L.) es afectado por hongos del “Complejo

Ascochyta”, que producen notables pérdidas productivas. No existen genotipos que

presenten resistencia completa; para generarlos, se indujeron mutaciones con rayos

gamma en semillas de la variedad INIAP 436 Liliana. La investigación constó de tres

etapas: primero, se determinó que la dosis óptima de radiación para inducir

mutaciones fueron los 120 Gy. En la segunda etapa se irradiaron a esa dosis 30000

semillas, se sembraron en campo junto a una población testigo constituyendo la

generación M1. En la población tratada se observaron: disminución del porcentaje de

emergencia, aparecimiento de plantas quiméricas y estériles. Las semillas cosechadas

originaron la generación M2 (tercera etapa), que se sembró en campo en dos

localidades junto a una población testigo, No existieron diferencias significativas

entre los porcentajes de emergencia de las poblaciones en las dos localidades; se

observaron plantas mutantes clorofílicas de las categorías albina, xantha y viridis. La

frecuencia de mutaciones clorofílicas inducidas fue de 0,22%. Los valores de la

efectividad y eficiencia mutagénica, fueron 0,0018 y 0,0169, respectivamente. Se

inocularon las plantas en etapa de floración con aislamientos de Ascochyta sp. y se

evaluó su reacción. Se seleccionaron dos plantas con resistencia parcial. Su progenie

se desarrolló bajo invernadero y a los 35 días se inoculó con Ascochyta spp.,

demostrando susceptibilidad. El empleo de rayos gamma no fue efectivo porque la

resistencia al “Complejo Ascochyta” es un rasgo poligénico, con una probabilidad de

un cambio simultáneo de esos genes bastante baja.

Palabras clave: Pisum sativum L.; semillas irradiadas; resistencia a Ascochyta spp.;

radiaciones gamma; Cobalto 60.

 xv

ABSTRACT

The pea crop (Pisum sativum L.) is affected by Ascochyta blight which causes

remarkable yield losses. There are not complete resistant genotypes. In attempt to

generate such resistance, mutations were induced with gamma rays in seeds of

variety INIAP 436 Liliana. The research had three stages: first, it was determined

that the optimal radiation dose to induce mutations was 120 Gy. At the second stage,

30000 seeds were irradiated at that dose and were sowed at field next to a control

population constituting the M1 generation. In the treated population were observed: a

decrease in the percentage of emergency, chimeras and sterile plants. The seeds

harvested originated the M2 generation (third stage), which was planted at field, with

a control population, in two locations, Over 50000 seeds were planted in each

location. No significant differences between the percentages of emergence of

populations were observed at the two locations. Mutant chlorophyllic plants of

categories albina, xantha and viridis were observed. The frequency of induced

chlorophyll mutations was 0.22 %. The values of mutagenic efficiency and

effectiveness were 0,0018 y 0,0169, respectively. Plants were inoculated in flowering

stage with isolates of Ascochyta sp. and assessed their reaction. Two plants with

partial resistance were selected; its progeny was developed under greenhouse and

after 35 days it was inoculated with Ascochyta spp, showing susceptibility. The use

of gamma rays was ineffective because the resistance to Ascochyta blight is a

polygenic trait, therefore, the probability of a simultaneous change of those genes is

quite low.

Key Words: Pisum sativum L.; irradiated seeds; resistance to Ascochyta spp.;

gamma radiation, Cobalt 60.

 1

EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE DOS GENERACIONES DE

PLANTAS DE ARVEJA (Pisum sativum L.) PROVENIENTES DE

SEMILLAS IRRADIADAS CON RAYOS GAMMA PARA

IDENTIFICAR RESISTENCIA A Ascochyta spp.

La arveja (Pisum sativum L.) es una leguminosa perteneciente a la familia

Fabaceae, del orden de la Fabales (Lawyer, 1984), cuyo cultivo en Ecuador reviste

importancia, es así que, en el año 2011, la producción de arveja fue de 639 toneladas

métricas de grano seco y 11769 toneladas métricas en vaina verde, lo cual coloca a

este rubro en el tercer lugar dentro del grupo de leguminosas de grano, después del

fréjol y el haba (INEC, 2011). La arveja en grano tierno es un producto de consumo

masivo, reportándose que en 1998 el 90,6% de familias del área urbana lo

consumieron (Caicedo y Peralta, 1999). El contenido de proteína en grano seco varía

del 22 al 27% (Lanuza, citado por Castro, 2005).

Este cultivo es afectado severamente por tres especies de hongos pertenecientes

al llamado “Complejo Ascochyta”. Estas especies son Ascochyta pisi,

Mycosphaerella pinodes (Forma anamorfa: Ascochyta pinodes) y Phoma pinodella.

Ocasionan lesiones en hojas, tallos y vainas, pudiendo éstas extenderse hasta la

región del cuello de la planta (Skoglund, et al., 2011). M. pinodes es la especie más

dañina y puede causar una reducción en la productividad de hasta el 75%. Estos

microorganismos se hallan ampliamente distribuidos a nivel mundial (Lawyer,

1984).

Las estrategias de control para esta enfermedad son la rotación de cultivos,

destrucción de rastrojos infectados de la anterior cosecha y tratamiento químico de

 2

las semillas antes de la siembra, lo cual reduce la cantidad de inóculo primario.

Durante el cultivo se realizan aplicaciones foliares de fungicidas, las cuales controlan

en forma efectiva estos organismos. Sin embargo, los costos asociados a estas

aplicaciones pueden reducir significativamente la rentabilidad de este cultivo (Bretag

et al, 2006).

La mejor estrategia a largo plazo para un control efectivo es el desarrollo de

variedades de arveja resistentes a Ascochyta spp. Dentro de los tipos convencionales

de arveja se han encontrado buenas fuentes de resistencia para A. pisi, pero solo

resistencia parcial para M. pinodes y P. pinodella. Las mejores fuentes de resistencia

están presentes en especies primitivas de los géneros Lathyrus y Pisum (Gurung et

al., citados por Bretag et al., 2006) pero los intentos iniciales por transferir esta

resistencia a variedades convencionales de arveja no han sido exitosos (Bretag et al.,

2006).

En el año 2009 el Programa Nacional de Leguminosas y Granos Andinos

(PRONALEG-GA) del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones

Agropecuarias (INIAP) probó la resistencia para A. pisi de 250 accesiones del banco

de germoplasma del INIAP. Todas fueron susceptibles, en consecuencia, no existen

fuentes de resistencia que puedan ser utilizadas en un programa de fitomejoramiento.

Una de las estrategias para generar variabilidad a partir de la cual se pueda

seleccionar genotipos de interés es la inducción de mutaciones, la cual ha permitido

la generación a nivel mundial de más de 250 variedades mutantes oficiales (Shu y

Lagoda, 2007).

Para inducir mutaciones se emplean agentes de tipo químico y físico. En el

primer grupo se tiene sustancias que actúan sobre el ADN y producen una amplia
 3

gama de alteraciones que conllevan cambios en la información genética. Ejemplos de

esas sustancias son la azida sódica o los agentes alquilantes. En el segundo grupo se

tienen las radiaciones ionizantes. De estas, los rayos gamma se han empleado con

mayor frecuencia para generar mutaciones (Maluszynski et al. citados por

Ahloowalia et al., 2004). Maluszynski et al. (2009) recomiendan que en un programa

de inducción de mutaciones se emplee una variedad ya liberada en la cual se

incremente su valor agronómico a través del mejoramiento de una o dos

características.

La variedad de arveja INIAP 436 Liliana, de tipo decumbente, posee buenas

características agronómicas, tales como: ciclo medianamente precoz, buen vigor y

carga, grano de tamaño grande con buena demanda en el mercado y aptitud para

elaboración de harina (Peralta et al., 2010b), sin embargo, es afectada severamente

por los hongos del “Complejo Ascochyta”.

Con la finalidad de generar un genotipo resistente a Ascochyta spp. se indujeron

mutaciones en semillas de arveja de la variedad mencionada empleando rayos

gamma. El proceso se dividió en tres etapas. En la primera se determinó la dosis

óptima de radiación para inducir mutaciones. La segunda correspondió al desarrollo

de las semillas irradiadas a la dosis óptima previamente determinada (generación

M1). En la tercera etapa se evalúo la resistencia de las plantas de la generación M2 a

Ascochyta spp. Finalmente, después de seleccionar dos plantas de esta última

generación con menor severidad en los síntomas de la enfermedad, se evalúo la

progenie de las mismas para confirmar esa reacción de resistencia.

 4

1.1. OBJETIVOS

1.1.1. Objetivo General

• Evaluar fenotípicamente dos generaciones de plantas de arveja provenientes

de semillas irradiadas con rayos gamma, para identificar plantas resistentes a

Ascochyta spp.

1.1.2. Objetivos Específicos

• Establecer la dosis óptima de rayos gamma para inducir mutaciones en la

variedad de arveja INIAP 436 Liliana.

• Determinar en el campo los efectos somáticos que se presenten en la

población M1.

• Determinar la frecuencia de mutaciones clorofílicas en la población M2.

• Evaluar la reacción de la población M2 de arveja a hongos del “Complejo

Ascochyta”.

• Difundir la nueva información generada por la presente investigación en un

boletín técnico.
 5

II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 GENERALIDADES

2.1.1. Origen

El centro de origen de la arveja (Pisum sativum L.) está ubicado en las regiones

montañosas del Suroeste de Asia, en especial Afganistán e India, así como

Transcaucasia y Etiopía (Govarov, citado por Lobo et al., 1989). La arveja ha sido

cultivada desde el periodo Neolítico, es decir, desde hace 8000 a 9000 años (Lawyer,

1984).

2.1.2. Descripción Botánica

La arveja es una leguminosa, perteneciente al orden de las Fabales y a la familia

Fabaceae. Su nombre científico es Pisum sativum L. y engloba diferentes variedades

y subespecies. Es un organismo diploide, con un número básico de cromosomas n=7

(Khvostova citado por Lobo et al., 1989).

Es una planta herbácea, anual y de hábito monopodal. La semilla esférica está

conformada por dos cotiledones que guardan reservas nutritivas para el crecimiento

inicial de la plántula. En los granos secos, el color de los cotiledones puede ser

amarillo o verde. La cubierta puede ser lisa o rugosa (Lawyer, 1984).

La raíz es pivotante y bien desarrollada con ramificaciones secundarias capaces

de portar nódulos fijadores de nitrógeno. Los primeros dos nudos que se desarrollan

sobre los cotiledones presentan hojas rudimentarias llamadas brácteas trífidas, a las

cuales siguen las hojas verdaderas que brotan de nudos bien definidos a lo largo del

tallo. Los internudos son huecos. Las hojas son compuestas y pinnadas. En su base se

hallan dos estípulas semejantes a hojas. Cada hoja posee de uno a varios pares de
 6

foliolos, y zarcillos terminales. Las primeras hojas en brotar presentan solo un par de

foliolos (Lawyer, 1984).

El meristemo apical está protegido por una cubierta formada por estípulas no

desplegadas. Las inflorescencias aparecen en las axilas de las hojas. Una vez que la

floración ha empezado, generalmente cada nudo sucesivo posee una inflorescencia.

La mayoría de cultivares posee una o dos flores por pedúnculo aunque existen

aquellos que pueden tener tres o más (Lawyer, 1984).

El género Pisum es autógamo. Sus flores poseen simetría bilateral. La corola está

formada por 5 pétalos libres. El superior recibe el nombre de estandarte, y está

flanqueado por 2 laterales o alas. Existen 2 pétalos inferiores fusionados que forman

la quilla. Esta cubre las partes generativas. El pistilo es un carpelo simple. El

androceo está formado por nueve anteras fusionadas y una libre que forman un tubo

estaminal que rodea al pistilo. La fertilización ocurre aproximadamente un día antes

de que las flores se abran (Lawyer, 1984).

El fruto lo constituye una legumbre. Dependiendo de las condiciones de

temperatura, las vainas necesitan de 7 a 10 días para alcanzar una longitud completa,

después de lo cual los óvulos ganan rápidamente peso y volumen por elongación

celular. La madurez fisiológica se alcanza a los 24 a 30 días después de la floración,

a lo cual le sigue el estado de semillas secas (Lawyer, 1984).

2.2. ENFERMEDADES DE LA ARVEJA

Una enfermedad es el resultado de la interacción entre el patógeno, el hospedero

y las condiciones ambientales. Los patógenos de la arveja incluyen hongos, bacterias,

virus y nematodos. Los organismos fúngicos son la causa más común de enfermedad

en la arveja (Lawyer, 1984).

 7

2.2.1. Enfermedades causadas por el “Complejo Ascochyta”

El “Complejo Ascochyta” está formado por tres organismos fúngicos separados.

Estos son: Ascochyta pisi Lib., Mycosphaerella pinodes (Berk y Blox) Vestergr y

Phoma pinodella (L.K. Jones) Morgan-Jones y K.B. Burch. Estos microorganismos

se hallan dispersos en todo el mundo. (Lawyer, 1984; Punithalingam y Holliday;

Punithalingam y Gibson, citados por Bretag et al., 2006).

2.2.2. Síntomas

La infección por Ascosporas de M. pinodes produce abundantes manchas de

color púrpura y tamaño reducido en las hojas. En un ambiente seco, las lesiones se

mantienen pequeñas y sin márgenes claras, mientras que bajo condiciones húmedas,

éstas se agrandan, volviéndose de color marrón oscuro, con bordes definidos. Su

crecimiento se da en forma secuencial, por lo cual adquieren una forma característica

de anillos concéntricos (Bretag et al., 2006; Lawyer, 1984).

Las lesiones en el tallo son similares a las de las hojas en cuanto al color y

tamaño, y a menudo se extienden hacia arriba y abajo del punto de inserción de una

hoja enferma. Conforme aumenta su tamaño, las lesiones se unen afectando por

completo el tallo y dando a la parte baja de la planta un color azul oscuro. Cuando

son afectadas las flores, el hongo frecuentemente ataca los sépalos y produce la caída

de la flor o de las vainas en crecimiento. Es usual que la producción de granos se vea

limitada (Bretag et al., 2006; Lawyer, 1984).

Cuando las semillas son infectadas, su tamaño se reduce y adquieren una

coloración marrón oscura. Las plántulas que se desarrollan a partir de estas semillas

mueren o pueden sufrir un retraso en el crecimiento que las vuelve improductivas

(Bretag et al., 2006; Lawyer, 1984).

 8

P. pinodella ocasiona síntomas muy similares a aquellos causados por M.

pinodes aunque el daño ocasionado a hojas, tallos y vainas es menor, la afectación al

cuello de la planta es más severa y la infección puede extenderse hacia la raíz (Bretag

et al., 2006).

Las lesiones ocasionadas por A. pisi son ligeramente hundidas, de color café

claro con bordes definidos de color marrón oscuro. Su forma es circular en hojas y

vainas, y alargada en el tallo. A menudo existe la presencia de picnidios negros. Rara

vez ataca la base de la planta y no ocasiona pudrición del pie (Bretag et al., 2006)

2.2.3. Ciclo de la Enfermedad

En aquellos terrenos donde la arveja se ha cultivado por ciclos sucesivos, M.

pinodes se considera endémico y se lo encuentra colonizando residuos de cosecha de

arveja, tanto los que están sobre la superficie como los enterrados. Compite bien

como saprófito contra otros organismos del suelo. Sobrevive en forma de esclerocios,

clamidosporas y picnidios. Ante condiciones favorables, los picnidios maduran, se

forman nuevos picnidios y pseudotecios y sus esporas se liberan para infectar al

nuevo cultivo (Lawyer, 1984).

Las ascosporas pueden ser transportadas por el viento a distancias superiores a

una milla. Las conidias, al contrario, tienen un patrón infectivo más localizado. La

mayoría cae sobre las hojas inferiores del dosel del cultivo. Incuban y producen

tubos germinativos que penetran el tejido de la planta a través de la cutícula y dentro

de las paredes celulares. Los síntomas se presentan en 2 a 4 días para M. pinodes y P.

pinodella, y en 6 a 8 días para A. pisi. En las nuevas lesiones se desarrollan picnidios

y más conidias, que bajo condiciones húmedas, diseminan la enfermedad

rápidamente (Lawyer, 1984).

 9

P. pinodella tiene una presencia persistente en los campos debido a que produce

clamidosporas y picnidios. Antes de que la desinfección de semillas sea una práctica

común, este organismo era a menudo responsable de la muerte de plántulas poco

después de la emergencia (Lawyer, 1984).

La mayor parte del inóculo de A. pisi es transportado en pequeñas partículas de

residuos de cosecha y polvo. Los hospederos alternantes no son una fuente

significativa de inóculo (Lawyer, 1984).

2.2.4. Control de la Enfermedad

La producción de semillas de arveja se debería realizar en áreas secas, y, de darse

en zonas con mayor humedad, se debería cosechar aquellos lotes menos enfermos. Se

debe realizar la desinfección de semillas preferentemente con fungicidas sistémicos

como benomilo y tiabendazol. Los rastrojos deben ser enterrados y destruidos antes

del establecimiento del nuevo cultivo para evitar que el hongo se disperse por medio

del viento o la lluvia (Lawyer ,1984 y Bretag et al., 2006).

La rotación de cultivos en áreas donde la producción de arveja es predominante

año tras año, no reduce significativamente la infección por M. pinodes. Sin embargo,

se la recomienda para minimizar pérdidas por pudrición del pie en plántulas, dada la

persistencia en el suelo de P. pinodella. Se deben dejar pasar de 3 a 6 años entre

cultivos sucesivos de arveja y emplear especies no leguminosas (Lawyer ,1984 y

Bretag et al., 2006).

Las aplicaciones foliares de fungicidas resultan efectivas para controlar esta

enfermedad. Se recomienda emplear sustancias del grupo de los benzimidazoles,

como benomilo, carbendazim y tiabendazol, dado su efecto preventivo y curativo, así

como su buena actividad residual. La aplicación de estos productos debe ser

 10

realizada antes del establecimiento de la enfermedad porque las aplicaciones

preventivas resultan más efectivas que las curativas. Múltiples aplicaciones son

necesarias para un efectivo control de Ascoquitosis (Bretag et al., 2006).

Pese a que se han evaluado en forma global numerosos genotipos de arveja para

resistencia a M. pinodes, este carácter no ha sido hallado (Bretag et al., 2006;

Lawyer, 1984). Las plantas de arveja ven incrementada su susceptibilidad a la

enfermedad conforme maduran. En cuanto a A. pisi, las razas de este patógeno

aparentemente varían en forma geográfica y se deben escoger cultivares que se

desempeñen mejor en forma local (Lawyer, 1984).

2.3. VARIEDADES MEJORADAS DE ARVEJA LIBERADAS POR EL INIAP

El INIAP ha generado variedades mejoradas de arveja utilizando el método de

mejoramiento genético por introducción, selección e hibridación, empleando

diferentes accesiones conservadas en el banco de germoplasma de arveja. Estas

variedades poseen mejores características que las tradicionales en cuanto a

resistencia genética duradera a enfermedades prevalentes y su rendimiento y calidad

cumplen las expectativas del cliente y del mercado (Peralta, et al., 1998).

Estas variedades se clasifican de acuerdo a su hábito de crecimiento en tipo

enana-erecta y decumbente. En la primera categoría se tiene a las variedades INIAP

431 Andina y 432 Lojanita. En cuanto a las variedades decumbentes, han sido

lanzadas INIAP 433 Roxana, 434 Esmeralda, 435 Blanquita, y 436 Liliana (Peralta et

al., 2010a).

La variedad INIAP 436 Liliana presenta características destacables tales como:

ciclo medianamente precoz, buen vigor y carga, grano de tamaño grande, de color

crema y superficie lisa, con aptitud para la elaboración de harina y buen precio en el
 11

mercado (Peralta et al., 2010b). En la tabla 2.1 se exponen algunas características

adicionales de esta variedad.

Tabla 2.1. Características de la variedad INIAP 436 Liliana.

CARACTERÍSTICAS DESCRIPCIÓN
MORFOLÓGICAS
Hábito de Crecimiento Decumbente
Color de grano seco Crema
Altura de la planta (cm) 113,7
AGRONÓMICAS
Días a la floración 68
Días a la cosecha en verde 92
Días a la cosecha en seco 121
Rendimiento promedio en grano seco (kg/ha). 1688
Rendimiento promedio en vaina verde (kg/ha). 6673
DE CALIDAD
Contenido de proteína (base seca) 25,5%
Fuente: (Peralta et al., 2010b)

2.4. LA INDUCCIÓN DE MUTACIONES EN EL FITOMEJORAMIENTO

En un sentido amplio, las mutaciones son cambios en la información genética

almacenada en el ADN. De acuerdo a la extensión del material genético que es

afectado se pueden observar tres tipos de mutaciones: génicas, que abarcan

alteraciones en la secuencia de nucleótidos de un gen; cromosómicas estructurales,

que implican cambios en la estructura interna de los cromosomas, como deleciones,

duplicaciones, adiciones o translocaciones; y cromosómicas numéricas, que son

alteraciones en el número de los cromosomas propio de la especie (Oliva y Vidal,

2006; Jenkins, 1986; Prina, 1989). Las mutaciones son el origen primario de la

variabilidad genética y el control de la frecuencia y espectro de las mismas

 12

constituye una herramienta valiosa en el mejoramiento de las plantas cultivadas

(Prina et al., 2010).

Los mutágenos actúan induciendo una serie cambios en el ADN. El tipo y

frecuencia de estas alteraciones varían de acuerdo al agente, a las condiciones de

tratamiento, a la especie, al tipo de tejido y al momento del ciclo celular. Todas estas

modificaciones del ADN son reconocidas y reparadas por mecanismos enzimáticos.

Algunos de ellos revertirán totalmente el ADN dañado a su estado original, mientras

otros no harán una reparación perfecta, lo cual acarrea un cambio en el número y/o

secuencia de nucleótidos y, por ende, una mutación que se hereda a la progenie

(Prina, 1989).

Según Gaul, citado por Prina (1989), a mayor cambio fenotípico inducido, menor

vitalidad de los mutantes. La filosofía de la técnica de inducción de mutaciones es

cambiar una o pocas características conservando el fondo genético inicial.

2.4.1. Agentes Mutágenos

De acuerdo a su naturaleza, los agentes artificiales utilizados para producir

mutaciones se pueden clasificar en dos grandes grupos: físicos y químicos (Prina et

al., 2010).

2.4.1.1. Agentes Físicos

Son diferentes tipos de radiación, la cual se define como energía que se mueve

de un punto a otro punto en forma de ondas o partículas. Existen dos categorías de

radiación: la electromagnética y la corpuscular. La radiación electromagnética es

energía que viaja a través del vacío o un medio material en forma de ondas
 13

electromagnéticas. Sin embargo, estas ondas poseen también un comportamiento de

partículas, por lo cual se acepta que la energía se desplaza como paquetes llamados

fotones, que no poseen masa, viajan a la velocidad de la luz y pueden interactuar con

la materia para transferir una cantidad fija de energía (Mba et al., 2012).

En cuanto a la radiación corpuscular, está formada por partículas subatómicas

como electrones, protones, neutrones o partículas alfa (α), que viajan en forma de

chorros a diversas velocidades y poseen masa definida (Mba et al., 2012).

Las radiaciones también pueden clasificarse por su capacidad para producir iones

en radiaciones ionizantes y no ionizantes. Las primeras portan suficiente energía

como para remover al menos un electrón de un átomo o molécula. Las últimas no

poseen la cantidad de energía necesaria para modificar la estructura de aquellos, pero

si para excitar sus electrones, es decir, llevarlos a un nivel energético superior (Mba

et al., 2012).

Los rayos gamma forman parte del espectro electromagnético. Son emitidos por

elementos radiactivos o durante ciertas reacciones nucleares. Poseen longitudes de

onda menores a 10-12 m, una frecuencia de 1021 Hertz y energía por fotón de hasta

varios Megaelectronvoltios (MeV). Transportan una gran cantidad de energía y

tienen gran poder de penetración (Mba et al., 2012; Mba y Shu, 2012).

Una fuente de rayos gamma lo constituye el isótopo radiactivo Cobalto-60. No

está presente en la naturaleza y se lo obtiene mediante activación neutrónica del

isótopo Cobalto-59. Su vida media es de 5,261 años (Brown et al. 2004).

La cantidad de energía impartida por las radiaciones ionizantes por unidad de

masa se conoce como dosis absorbida. Su unidad en el Sistema Internacional de

 14

medidas es Julio/kilogramo (J kg-1) y su nombre especial es Gray (Gy). Un gray

significa la absorción de un Julio de energía en forma de radiación ionizante por un

kilogramo de materia (Basantes, 2010; Lagoda, 2012).

La radiación gamma produce ionización de macromoléculas y radiólisis del agua

lo cual genera radicales libres, principalmente hidroxilos, así como peróxido de

hidrógeno, que dañan todos los componentes de la célula incluyendo lípidos,

proteínas, ADN y ARN. A este proceso se conoce como estrés oxidativo. En el ADN

se producen principalmente roturas simples y dobles de la cadena, pérdida de bases y

desaminación de citosina o timina. La reparación enzimática de estas alteraciones

puede desembocar en mutaciones (Basantes, 2010; Lagoda, 2012; Curtis, 2012).

2.4.1.2. Agentes Químicos

A diferencia de las radiaciones ionizantes, que actúan sobre las moléculas en

forma indiscriminada, los mutágenos químicos suelen ser más específicos. Los que

más se han utilizado en fitomejoramiento son los agentes alquilantes, denominados

así por incorporar grupos alquilo a las macromoléculas. Se trata de compuestos

electrofílicos que reaccionan con átomos que tienen un par de electrones libres como

S, N y O, y de esta manera actúan sobre las bases y los grupo fosfatos del ADN y

también sobre las proteínas (Prina et al., 2010).

2.4.2. Variedades Mutantes de Plantas Cultivadas

Hasta el año 2009, más de 3000 variedades mutantes, pertenecientes a 170

especies diferentes de plantas cultivadas han sido liberadas (Burkart, 2009).

Maluszynski citado por Ahloowalia (2004) afirma que de las 2252 variedades

mutantes liberadas hasta el año 2000, el 70% se lanzaron directamente como nuevas
 15

variedades, producto de la multiplicación directa de una línea mutante seleccionada.

El 30% restante fue consecuencia de cruces con mutantes inducidos. El método más

frecuente para inducir la alteración en el genoma fue la radiación (89%). El uso de

agentes químicos fue raro. El 64% de las variedades cuya mutación fue inducida por

radiación fue tratado con rayos gamma. De las 2252 accesiones, el 75% se trata de

especies comestibles y el restante 25% son cultivos ornamentales.

2.4.3. Trabajos de Inducción de Mutaciones realizados en Arveja.

De acuerdo a la base de datos de variedades mutantes (MVD) de la FAO/IAEA

(2011), se han liberado 34 variedades de arveja, en cuyo desarrollo se ha utilizado

técnicas de inducción de mutaciones. Los atributos que se han mejorado en estas

variedades son: rendimiento, resistencia al acame, precocidad, contenido de proteína

y resistencia a estrés de tipo biótico. En aquellas que fueron obtenidas mediante

agentes físicos, se usaron rayos gamma y X en dosis que fluctuaron entre 100 a 500

Gy.

Entre las variedades de arveja registradas en la MVD, se debe mencionar la

búlgara “Sredetz”, obtenida a partir de líneas mutantes provenientes del cultivar

“Kubrat-3”. Las semillas de este cultivar recibieron un tratamiento combinado de

rayos gamma y metanosulfonato de etilo (EMS) a dosis que fluctuaron entre los 2,5 a

100 Gy en el caso de los rayos gamma; y entre los 0,1 y 0,05% de concentración con

respecto al EMS. Este cultivar presentó una buena resistencia a A. pisi (Mehandjiev

et al., 1999; Tomlekova, 2010).

 16

2.4.4. Aspectos a Considerar para Seleccionar una Técnica de Mutación

De acuerdo a Maluszynski et al. (2009) los parámetros que deben ser

considerados antes de seleccionar una técnica de mutación son los siguientes:

2.4.4.1. Objetivos del programa de mejoramiento

Estos pueden ser divididos en dos grupos. En el primero se encuentran aquellos

que buscan el mejoramiento de un carácter en particular dentro de una línea o

cultivar promisorio. En el segundo se encuentran los que pretenden generar nuevas

fuentes de genes no presentes en el germoplasma disponible, los cuales pueden ser

transferidos por medio de cruces a las líneas mejoradas.

2.4.4.2. El tipo de material a ser tratado

El objetivo de la inducción de mutaciones determina el tipo de material a ser

tratado. Para la obtención de nuevos cultivares mejorados, frecuentemente se han

empleado aquellos que ya han sido liberados, los mismos que son tratados con

agentes mutágenos para mejorar una o dos características que incrementen sus

valores agronómicos. Prina (1989) señala que es conveniente que el material

genético a tratar sea de buenas características generales y esté adaptado a la región.

2.4.4.3. La frecuencia de mutación del gen responsable de un carácter

deseado

El conocimiento de la frecuencia natural de mutación del gen responsable de una

característica deseada es de gran ayuda en la elección de un agente mutágeno y su

dosis. Sin embargo, en la mayoría de los casos, esta información se desconoce. Se

debe tener presente que la frecuencia de mutaciones observadas en una especie, o en

 17

cultivares de una misma especie, difiere en forma marcada de la registrada en otra

especie o cultivar.

En cuanto a las interacciones alélicas, en forma general se acepta que la gran

mayoría de los alelos mutantes son de carácter recesivo (Gottschalk y Wolff citados

por Prina, 1989).

2.4.4.4. Efectos somáticos del tratamiento

Los principales efectos del tratamiento mutágeno que se deben esperar y medir

en la primera generación de plantas, o M1, son los siguientes:

1). Porcentaje de Germinación

De acuerdo a Gaul, citado por Prina (1989) las radiaciones ionizantes, incluso a

dosis muy altas, no afectan el porcentaje de germinación en la mayoría de las

especies y solamente serviría para medir la toxicidad de algunos mutágenos

químicos.

2). Altura de la primera hoja

La disminución de los valores de este parámetro constituye un índice del daño

fisiológico del tratamiento. Las mediciones se deben realizar una vez que la primera

hoja haya terminado su crecimiento.

Konzak y Favret, citados por Prina (1989), al realizar estudios en cebada,

consideran que la medida del crecimiento de la primera vaina foliar se correlaciona

mejor con otro tipo de efectos biológicos, como la letalidad del tratamiento, porque
 18

está directamente relacionado con la división celular y por ende con el daño

cromosómico.

3). Letalidad-sobrevivencia hasta la madurez

Se mide en condiciones de campo contabilizando el número de plantas que

producen semillas y que son capaces de pasar a la siguiente generación (Prina, 1989).

4). Mutaciones somáticas

Cuando el material tratado con el agente mutágeno es de carácter pluricelular,

como semillas o tejidos, las plantas resultantes son quiméricas. Esto se produce

porque el agente induce cambios de diferente magnitud en las distintas células del

embrión y en consecuencia, los tejidos que se originan a partir de estas células

tendrán diferentes genomas. Algunas mutaciones morfológicas en tejidos somáticos,

como los defectos clorofílicos, son fácilmente observables e ilustran la estructura

quimérica de una planta M1 (Maluszynski et al., 2009).

De acuerdo a Eriksson y Lindgren, citados por Prina (1989) la frecuencia de

sectores somáticos mutantes es recomendada como un indicador de las frecuencias

de mutaciones a esperar en la M2.

De acuerdo a los patrones de desarrollo ontogénico, estos sectores mutantes

clorofílicos se pueden observar como estrías longitudinales de color blanco, amarillo

o verde claro en el caso de monocotiledóneas, y como manchas redondeadas de esos

mismos colores en dicotiledóneas. Para medir este parámetro se tienen en cuenta los

sectores con esos cambios dentro de cada planta. En la cebada se realiza el recuento

en la cuarta, quinta y sexta hoja. Con fines prácticos se recomienda realizar este
 19

conteo en el campo expresando los resultados en función del número de plantas

(Prina, 1989).

2.4.5. Selección de la Dosis de Mutágeno a ser Aplicada

Las dosis escogidas para inducir mutaciones deberían ser relativamente bajas

para el mejoramiento de un material parental que posee características agronómicas

favorables. Esto porque el tratamiento mutagénico genera alteraciones en muchos

otros genes de cada célula y no solo en el locus deseado. Cuando las dosis aplicadas

son altas, se produce una alta frecuencia de mutaciones deseadas, pero

desafortunadamente, van acompañadas de cambios deletéreos que afectan

negativamente el valor agronómico de los mutantes selectos. Estos cambios pueden

ser: baja fertilidad, madurez tardía y susceptibilidad a situaciones de estrés (Prina,

1989).

La dosis de rayos gamma recomendada para programas de mejoramiento

mediante inducción de mutaciones en arveja es de 100 Gy. Se entiende por dosis

crítica u óptima a aquella dosis de mutágeno más allá de la cual los efectos somáticos

en la M1 son muy severos (Maluszynski et al., 2009).

De acuerdo al Foro para la Cooperación Nuclear en Asia (FNCA, por sus siglas

en inglés) (2004), para seleccionar la dosis de agente mutágeno adecuada, se debe

probar un rango amplio de dosis y medir la reducción resultante en variables como la

altura de plántulas, peso fresco o peso seco de las mismas. Se recomienda medir

estos parámetros unas dos o tres semanas después del tratamiento del material con

los agentes mutágenos. Una vez que se obtienen los resultados, se debe seleccionar

aquella dosis que produzca una reducción del 20%.

 20

En forma similar, Maluszynski et al. (2009) recomiendan realizar un ensayo en

el cual se evalúe el efecto de diferentes dosis de un agente mutágeno sobre la

emergencia y la altura de plántulas. Se deberían probar de 4 a 5 dosis del agente, más

un testigo, y realizar tres repeticiones. Las semillas tratadas se siembran en

recipientes plásticos rellenos hasta las tres terceras partes de su volumen con tierra de

jardín y se cubren con una capa de arena. Se debe realizar un riego acorde a las

necesidades del cultivo. Una vez que el número de plántulas emergidas en las

unidades experimentales del tratamiento control se estabilice, se procede a

contabilizar el número de plántulas emergidas en las otras unidades experimentales.

El promedio de las tres repeticiones del tratamiento control se debería considerar

como el 100% de emergencia. La reducción ocasionada por cada dosis se debe

calcular utilizando la siguiente fórmula:

ó (%) = 100 −

En cereales, la reducción en la altura de las plántulas puede ser evaluada cuando

la segunda hoja se ha desplegado en la mayoría de plántulas del tratamiento control.

En este momento se deben cortar las plántulas a nivel de la superficie y medir sus

alturas. El cálculo de la reducción de la altura de plántulas se realiza aplicando la

siguiente ecuación:

ó (%) = 100 −

Según Maluszynski et al. (2009), cualquier dosis que produzca una reducción

mayor al 30% en los parámetros de porcentaje de emergencia y altura de las

plántulas se considera muy alta para un programa de mejoramiento a gran escala con

mutantes.
 21

2.4.6. Manejo de la generación M1

Maluszynski, et al. (2009) recomiendan, en el caso de leguminosas, emplear de

5000 a 10000 semillas tratadas con el agente mutágeno para conformar la generación

M1. Éstas deben sembrarse en un terreno fértil, una sola semilla por punto. Es

preferible que el lote se encuentre aislado de otros cultivos de la misma especie.

Debe seguirse un buen manejo agronómico y efectuarse un control de plagas y

enfermedades oportuno.

De acuerdo a Prina (1989), existen tres tipos básicos de manejo para formar una

población M2 a partir de la población M1:

1) Manejo genealógico por progenie de espigas, panojas o ramas.

En el caso de la cebada, se cosechan las espigas principales de cada planta y se

siembran en el campo, colocando en forma contigua las espigas de una misma planta.

Este manejo permite diferenciar las mutantes inducidas por el tratamiento de

variantes de otro origen.

2) Manejo por conjunto o pool de una semilla por espiga, panoja o rama.

En este tipo de manejo se selecciona una semilla de cada una de las espigas

principales de la planta M1. Con estas se forma un pool que se siembra en el campo.

Considerando el desarrollo ontogénico, cada planta M2 provendría teóricamente de

células iniciales diferentes, por lo cual cualquier variación observada en estas plantas

se debería a eventos mutacionales distintos.

 22

3) Manejo en masa

Consiste en cosechar la M1 de cada tratamiento en conjunto, sembrando cada M2

en una sola parcela. Este manejo es solo aplicable cuando se dispone de una

estrategia de selección individual barata y de aplicación masiva. Tampoco permite

distinguir la variabilidad inducida de aquella preexistente.

Maluszynski et al. (2009) recomiendan, en el caso de leguminosas, cosechar

hasta 5 vainas por cada planta M1 y sembrar en forma de progenie de una planta por

surco. Se debe generar una población M2 de 50000 plantas.

2.4.7. Manejo de la Generación M2

El manejo agronómico de las plantas de esta generación debe ser el usualmente

aplicado para la especie cultivada. Es importante buscar cambios morfológicos y

fisiológicos en cada planta desde el estadio de plántulas hasta el momento de la

cosecha (Maluszynski et al., 2009).

En esta generación también es posible evaluar el efecto genético de la dosis

aplicada de mutágeno en base a la frecuencia de mutaciones puntuales. En la práctica

esto se lo realiza midiendo la frecuencia de plántulas con defectos clorofílicos en esta

generación, lo cual es fácil detectar dado que la plántula entera tiene el mismo color.

Este carácter puede entrar dentro de las siguientes tres categorías: albina (blanca, sin

pigmentos), xantha (amarilla, sin clorofila pero con carotenoides) y viridis (verde

claro, con menos cantidad de clorofila) (Prina, 1989).

La frecuencia de este tipo de mutaciones se calcula de acuerdo a la siguiente

fórmula:
 23

( ú ( + ℎ +" ) × 100)
=
$

En donde M es la frecuencia de mutación como porcentaje, N es el número de

todas las plántulas M2 analizadas para una dosis particular.

2.4.8. Efectividad y eficiencia mutagénica

De acuerdo a Konzak et al. citados por Dhulgande et al. (2011) la efectividad de

un mutágeno es una medida de la frecuencia de mutaciones inducidas por unidad de

agente utilizado. La eficiencia provee la proporción de mutaciones en relación con

otros efectos biológicos deletéreos asociados tales como letalidad, esterilidad del

polen y aberraciones cromosómicas.

 24

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. UBICACIÓN DEL LUGAR DE INVESTIGACIÓN

3.1.1. Ubicación Política

El proyecto se realizó en la Estación Experimental “Santa Catalina” (EESC) del

Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) y en el

Instituto Técnico Superior “Simón Rodríguez” (ITTSR). La primera se halla ubicada

en la parroquia Cutuglahua, del cantón Mejía, Provincia de Pichincha. El segundo se

halla ubicado en la parroquia Aláquez, del cantón Latacunga, Provincia de Cotopaxi.

Ambas localidades se hallan en la República del Ecuador.

La irradiación de las semillas de arveja se realizó en las instalaciones de la

Subsecretaría de Control, Investigación y Aplicaciones Nucleares del Ministerio de

Electricidad y Energía Renovable; las mismas que están ubicadas en la localidad

Aychapicho del cantón Mejía, Provincia de Pichincha.

3.1.2. Ubicación Geográfica

La Estación Experimental Santa Catalina se encuentra ubicada en la posición

geográfica 78° 33' 19,34" (O) y 0° 22' 8,81" (S) (INIAP, 2008).

El Instituto Agropecuario Simón Rodríguez está ubicado en la posición

geográfica 78° 37' 5,48" (O) y 0° 51' 57,44" (S).

3.1.3. Ubicación Ecológica

La Estación Experimental Santa Catalina se encuentra ubicada en la Zona de

Vida: Bosque Húmedo Montano (bh-M); a una altitud de 3057 msnm; temperatura
 25

promedio de 11.6°C; precipitación: 1400 mm anuales, vegetación: cultivos; humedad

relativa: 79% (INIAP, 2008).

El Instituto Agropecuario Simón Rodríguez se encuentra ubicado en la Zona de

Vida Bosque Seco Montano Bajo (bs-MB), a una altitud de 2775 msnm; temperatura

promedio de 14°C; precipitación: 500 mm anuales, vegetación: cultivos; humedad

relativa: 70% (INAMHI, 2004-2008).

3.2. MATERIALES

En la primera etapa del proyecto, correspondiente a las pruebas de Dosimetría, se

utilizaron los siguientes materiales: 2,5 kg de semillas de arveja de la variedad

INIAP 436 Liliana con un porcentaje de humedad del 12,75%, toallas de papel

absorbente reutilizable, etiquetas de cartón, bandejas plásticas de las siguientes

dimensiones: (53 x 38 x 8)cm, sustrato estéril (constituido por tierra, compost,

cascarilla de arroz, y piedra pómez en una proporción de 4:2:1:1 y esterilizado en una

autoclave a 121 ° C, durante 40 minutos), vasos plásticos desechables de 750 ml de

capacidad, sorbetes o pajillas, pedazos de tubos de PVC de 25cm de largo por 2,5cm

de diámetro y ligas de caucho.

Las sustancias químicas utilizadas fueron: solución de hipoclorito de sodio al

10% y agua destilada estéril.

Los equipos utilizados en esta etapa fueron: Irradiador J.L. Sheperd and

Associates Inc. Modelo 109-68, estufa y autoclave.

En la segunda etapa, correspondiente al desarrollo de la generación M1 se

emplearon los siguientes materiales: 11 kg de semilla de arveja de la variedad INIAP

 26

436 Liliana, productos fitosanitarios y herramientas agrícolas. En cuanto a equipos,

se utilizó el irradiador mencionado anteriormente.

En la tercera etapa, correspondiente al desarrollo de la generación M2 se

emplearon los siguientes materiales: 31 kg de semillas de arveja M2 cosechada a

partir de plantas M1, 2,5 kg de semillas no irradiadas, productos fitosanitarios, y

herramientas agrícolas.

Para la obtención de la fuente de inóculo de Ascochyta sp. se emplearon los

siguientes materiales: tijeras, pinzas, bolsas de papel, matraces, vasos de

precipitación, bisturís, mechero, pedazos de papel estéril, pedazos de papel

absorbente estéril, cajas Petri plásticas desechables, macetas plásticas de diferentes

tamaños, sustrato no estéril y semillas de arveja de la variedad INIAP 436 Liliana.

En cuanto a sustancias químicas, se utilizaron las siguientes: solución de

hipoclorito de sodio al 1%, agua destilada estéril, agar, dextrosa, harina de arveja y

fijador agrícola.

Con respecto a equipos, se emplearon: autoclave, cámara de flujo laminar,

agitador magnético con plataforma térmica, estufa y aerógrafo con compresor

eléctrico.

Para la inoculación de Ascochyta sp. en el campo se emplearon los siguientes

materiales: agua, fijador agrícola, bomba de mochila de 20 l de capacidad y equipo

de protección personal.

Para la evaluación de resistencia de plantas M3 a Ascochyta spp. se utilizaron:

semillas M3 descendientes de plantas M2 seleccionadas, semillas de la variedad

INIAP-436 Liliana, macetas de plástico de 20 cm de diámetro y sustrato. Con

 27

respecto a sustancias químicas se usó agua destilada y fijador Tween 20. En cuanto a

equipos se emplearon: aerógrafo con compresor eléctrico y cámara de humedad.

Adicionalmente se utilizaron cuadernos, esferográficos, lápices, cámara

fotográfica y computadores.

3.3. MÉTODOS

El presente proyecto de investigación contempló tres etapas:

3.3.1. Dosimetría:

El objetivo en esta etapa fue establecer la dosis óptima de rayos gamma para

inducir mutaciones en la variedad de arveja seleccionada. Se probaron 5 dosis de

radiación (0, 50, 100, 150 y 200 Gy), para lo cual se irradiaron 500 semillas (170 g)

por cada dosis en el irradiador marca J.L. Sheperd and Associates Inc., modelo 109-

68 (figura 3.1). Posteriormente, en el laboratorio de Fitopatología del PRONALEG-

GA, las semillas se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 10%,

en la cual se sumergieron durante 10 minutos, y después se enjuagaron con agua

destilada estéril tres veces.

Figura 3.1. Detalles del Irradiador utilizado en el proyecto

 28

Se destinaron 150 semillas por dosis para cada una de las pruebas que se

describen a continuación:

3.1.1.1. Prueba “Dinámica de Germinación”

Se realizaron tres repeticiones de esta prueba para cada dosis evaluada. Cada

repetición constó de 50 semillas. Estas se colocaron sobre toallas de papel

humedecido y se cubrieron con otra toalla, también húmeda. Todas las unidades

experimentales se mantuvieron a una temperatura de 20° Celsius dentro de una estufa

(figura 3.2). Una vez transcurridos nueve días desde el inicio de la prueba, se realizó

el conteo del número de semillas germinadas. Con la información obtenida se realizó

el análisis de varianza empleando el programa InfoStat (2012).

Figura 3.2. Prueba “Dinámica de Germinación”. A) Disposición de las

semillas de arveja sobre el papel de germinación y etiqueta identificando la
unidad experimental. B) Estufa en donde se mantuvieron las semillas de
arveja durante la prueba.

3.1.1.2. Prueba “Porcentaje de supervivencia”

En esta prueba se sembraron 50 semillas por cada repetición de cada dosis

evaluada. Se utilizaron bandejas plásticas con sustrato estéril (figura 3.3). El riego se

realizó con agua estéril hasta los 10 días después de la siembra con la finalidad de

que no exista mortalidad asociada a microorganismos presentes en el agua de riego

 29

durante la germinación y emergencia. Después se regó con el agua entubada

disponible en el invernadero. Una vez transcurridos 31 días, se procedió a

contabilizar el número de plantas que aún continuaban con su desarrollo. Con la

información recopilada se procedió a realizar el análisis de varianza y la prueba de

Tukey (α= 0,05) empleando el programa InfoStat (2012).

Figura 3.3. Bandejas plásticas con sustrato estéril en donde se sembraron

las diferentes unidades experimentales en la prueba “Porcentaje de
supervivencia”.

3.1.1.3. Prueba “Altura de plántulas”

Para esta prueba se tomaron 50 semillas por cada repetición para cada dosis. Se

colocó cada semilla sobre papel de germinación humedecido. Entre cada semilla se

colocó un sorbete plástico. El papel, junto con las semillas y los sorbetes se enrolló

alrededor de un tubo de PVC. Este paquete se sujetó con ligas de caucho y se ubicó

dentro de un vaso desechable plástico (figura 3.4).

 30

Figura 3.4. Prueba “Altura de plántulas”. A) Colocación de las

semillas en una unidad experimental de la prueba. B) Disposición final de
una unidad experimental.

Transcurridos 22 días desde el inicio de la prueba, se procedió medir la altura del

tallo de las plántulas desde su emergencia en la semilla hasta el punto de inserción

del segundo foliolo, como se indica en la figura 3.5.

Figura 3.5. Medida registrada en la prueba “Altura de plántula”.

Con los datos de la altura promedio de plántula por cada tratamiento, se procedió

a encontrar la correspondiente ecuación y curva de regresión. Para esto se empleó el

programa Microsoft Excel. Una vez determinada la ecuación, se procedió a calcular

 31

la dosis de radiación que ocasionaría el 30% de reducción en la altura promedio de la

plántula en relación al tamaño alcanzado por la misma en el tratamiento testigo.

3.3.2. Generación M1

Una vez determinada la dosis óptima de radiación a ser aplicada, se irradiaron

30000 semillas (10 kg) en el mismo irradiador empleado en la primera etapa del

proyecto. Estas semillas se sembraron en el Instituto Superior Agropecuario “Simón

Rodríguez”, ubicado en la parroquia Aláquez del cantón Latacunga, provincia de

Cotopaxi. También se sembraron 3000 semillas no irradiadas (1 kg), con lo cual se

conformaron dos poblaciones: población “Dosis óptima” y población “Testigo”. Se

sembró una semilla por punto, en surcos de 75 m de largo, a una distancia entre

surcos de 0,8 m y entre semillas de 0,1 m. La disposición de los surcos

correspondientes a la población “Testigo” entre los surcos de la población irradiada

se pueden observar en el Anexo A.

Una vez transcurridos 19 días a partir de la siembra, se realizó un muestreo

dentro de las poblaciones “Testigo” y “Dosis óptima”. En la primera se seleccionaron

dos surcos al azar (surco 5 y 17). En el caso de la segunda población, se

seleccionaron 5 surcos, también al azar (surco 11, 23, 28, 33, 38). En cada surco se

contabilizó el número de plantas emergidas. El número de semillas sembradas por

surco se estimó dividiendo el largo de cada surco para el espaciamiento entre puntos

de siembra.

A los 38 días de la siembra se seleccionaron al azar dos surcos dentro de la

población “Testigo” (surco 5 y 17) y dos dentro de la población “Dosis óptima”

(surco 21 y 37). Se evaluó la presencia de sectores somáticos mutantes a nivel del

 32

cuarto, quinto y sexto foliolo en las plantas presentes dentro de esos 4 surcos (Figura

3.6).

Figura 3.6. Foliolo que presenta sectores mutantes clorofílicos en forma de

tejido de diferente color al resto de la lámina foliar.

A los 136 días después de la siembra, se realizó la medición del porcentaje de

plantas sobrevivientes hasta la madurez. Dentro de la población “Dosis óptima” se

generó una muestra de 100 plantas al azar. Igual procedimiento se realizó en la

población “Testigo”. Se contabilizó el número de plantas que produjeron vainas con

semillas, es decir, plantas capaces de pasar a la siguiente generación.

La cosecha de las plantas se realizó a los 145 días. Para esto se tomaron 8 vainas

del tallo principal de cada planta de la población “Dosis óptima”. Cada vaina se

colocó en una bolsa separada, con lo cual se obtuvieron 8 conjuntos de vainas.

Debido a que existieron plantas en las que se pudo recolectar una solo una vaina, o

dos, cada conjunto tuvo diferentes números de vainas.

Con la finalidad de estimar el número de plantas M1 cosechadas, se realizó un

muestreo de las vainas de aquella bolsa en la que, con certeza, se recolectó una vaina

de cada planta cosechada. El tamaño de la muestra se calculó aplicando la fórmula

 33

para una población infinita (Farinha, 2010), porque no se conocía con exactitud el

número de vainas. Tal fórmula se expone a continuación:

% & (1 − )
= &

Donde n es el tamaño de la muestra, z es el valor de z tabular de acuerdo al nivel

de confianza determinado, p es la proporción esperada y e es el error máximo

permitido. Se decidió realizar el cálculo con un nivel de confianza del 95%, lo cual

determinó un valor de z de 1,96. El valor utilizado para la proporción esperada fue de

0,5. Finalmente, el valor para e fue del 5%, es decir, 0,05. Aplicando la fórmula

descrita se obtuvo el valor redondeado de 384 vainas. Se seleccionó al azar ese

número de vainas, se registró el número de semillas presentes en cada una y se

calculó el valor promedio de granos por vaina.

Se realizó la trilla de las vainas y se pesó cada bolsa. Para conocer la cantidad de

semillas presentes en cada uno de los conjuntos, se calculó el peso promedio de 100

semillas tomadas al azar. Se realizaron tres repeticiones por cada conjunto. Con esos

datos se aplicó la siguiente fórmula:

Peso en gramos del conjunto

Número de semillas en el conjunto = × 100
Peso promedio de 100 semillas (g)

Una vez conocido el número de semillas presentes en el conjunto del cual se

extrajo la muestra de vainas, se dividió este valor para el promedio de semillas por

vaina, obteniéndose el número aproximado de plantas cosechadas.

Con la información concerniente al número de semillas presentes en cada

conjunto, se formaron dos grupos formados por cuatro conjuntos. Cada grupo
 34

contuvo más de 50000 semillas y posteriormente se sembraron en dos diferentes

localidades.

3.3.3. Generación M2

Las localidades en donde se realizó la siembra de los grupos de semillas fueron

el ITSSR y la EESC. En el primero la siembra se realizó el día 26 de septiembre del

2012 y dos días después en la EESC. El espaciamiento entre surcos y plantas fue el

mismo empleado en la generación M1. En ambas localidades, entre los surcos de la

población “Dosis óptima” se sembraron surcos con semillas de arveja de la variedad

Liliana provenientes de plantas no irradiadas, como población “Testigo”. En el

ITTSR hubo 5 surcos de esa población y en la EESC fueron 3. La distribución de

esos surcos entre la población “Dosis óptima” se puede observar en los Anexos B y

C.

3.3.3.1. Localidad 1. Instituto Técnico Superior “Simón Rodríguez”

A los 21 días de la siembra se realizó la medición de los porcentajes de

emergencia de de las poblaciones “Dosis óptima” y “Testigo”. En el caso de la

primera se seleccionaron 10 surcos al azar y se contabilizó el número de plantas

emergidas. Igual procedimiento se llevó a cabo en los surcos de la población

“Testigo”. Se calculó el número de semillas sembradas en cada surco considerando

su longitud y el espaciamiento entre puntos de siembra dentro de cada surco. Se

estableció la correspondiente relación entre el número de plantas emergidas y el

número de semillas sembradas para obtener el porcentaje de emergencia.

Para la evaluación de la variable “Frecuencia de mutaciones clorofílicas” dentro

de cada población se contabilizó el número de plántulas que entran dentro de la

categoría albina (blancas, sin clorofila), xantha (amarilla, sin clorofila pero con
 35

carotenoides) y viridis (verde claro, menor contenido de clorofila). Con esta

información se aplicó la siguiente fórmula (Maluszynski et al., 2009):

(número de plantulas mutantes (albina + xantha + viridis) × 100)

M=
N

En donde:

M = frecuencia de mutación como porcentaje.

N = número de todas las plántulas M2 analizadas para una dosis particular.

Para calcular la cantidad total de plántulas M2 evaluadas dentro de la población,

se promedió el número de plántulas presentes dentro de los surcos muestreados y a

este valor se le multiplicó el número total de surcos sembrados.

A los 62 días después de la siembra, ocurrió una fuerte granizada, tras la cual las

plantas quedaron severamente lastimadas (figura 3.7). Transcurridos seis días

después de este evento, se aplicó un fertilizante foliar (Rosasol 20-20-20 más

oligoelementos a la dosis recomendada por el fabricante) con el objetivo de que las

plantas se recuperen.
 36

Figura 3.7. Granizada caída el día 27 de noviembre de 2012 en el ITTSR. A)

Vista del terreno. B) Daño a las plantas.

Afortunadamente, y debido a la capacidad de la variedad de arveja utilizada para

emitir nuevos tallos secundarios, las plantas se recuperaron, aunque el tamaño de las

mismas se redujo notablemente, en comparación con las plantas que se desarrollaban

en la EESC.

A los 106 días después de la siembra, cuando las plantas se encontraban en plena

floración, se realizó la inoculación de las poblaciones “Dosis óptima” y “Testigo”

con una solución de esporas de Ascochyta sp. provenientes de un aislamiento

obtenido en esta misma localidad. La concentración empleada fue de 106 conidias ml-
1
. La inoculación se realizó empleando una bomba de mochila de 20l de capacidad. A

la solución se le añadió un fijador agrícola a una dosis de 1ml por cada litro. Las

plantas fueron inoculadas en las últimas horas de la tarde.

3.3.3.2. Localidad 2. Estación Experimental “Santa Catalina”

A los 23 días de la siembra se realizó la medición de los porcentajes de

emergencia y las frecuencias de mutación de las poblaciones en estudio. Dentro de la

población “Dosis óptima” se seleccionaron al azar 10 surcos y se contabilizó el

número de plantas emergidas. Se realizó lo mismo con los surcos de la población

 37

“Testigo” Se estimó el número de semillas sembradas de la forma aplicada para la

localidad 1 e igual procedimiento se siguió para la obtención del porcentaje de

emergencia.

Una vez conocidos los porcentajes de emergencia de las dos poblaciones en las

dos localidades se realizó el análisis de varianza para conocer si existía alguna

diferencia significativa entre los datos obtenidos. A los porcentajes se les aplicó la

transformación raíz cuadrada del arcoseno antes de realizar el ADEVA, cuya fórmula

es la siguiente (McDonald, 2009):

?@
>= √

La medición de la frecuencia de mutaciones dentro de las poblaciones, así como

el cálculo del número de plántulas de la población “Dosis óptima” se la efectuó de la

manera indicada para la localidad 1.

La inoculación se realizó 96 días después de la siembra, cuando las plantas se

encontraban en etapa de floración, con una solución de esporas de Ascochyta sp.

proveniente de un aislamiento obtenido en la EESC (figura 3.8). La concentración de

la solución, así como el procedimiento realizado y los equipos ocupados fueron los

mismos que los empleados en la localidad 1.

 38

Figura 3.8. Inoculación en campo de Ascochyta sp.

3.3.4. Obtención de la fuente de inóculo de Ascochyta sp.

En la generación M1 fue posible observar en el campo, en el ITSSR, numerosas

plantas con síntomas de infección por hongos del “Complejo Ascochyta”. Con la

finalidad de obtener la fuente de inóculo para probar la resistencia de la generación

M2, se recolectaron muestras de foliolos, tallos y vainas con síntomas y signos de la

enfermedad. Las muestras se llevaron al laboratorio de Fitopatología del

PRONALEG-GA en donde se realizó el siguiente procedimiento:

Se tomaron fragmentos de tallos y pedúnculos de 4 cm de largo con lesiones. Se

sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 1% de concentración y se

enjuagaron tres veces con agua destilada. Se secaron con papel toalla estéril, y con

un bisturí se cortaron pedazos pequeños de tejido infectado junto con una porción

sana. Estos pedazos se sembraron en cajas Petri plásticas de 9 cm de diámetro con

agar-arveja (40 g de harina de arveja, 20 g de dextrosa y 20 g de agar en un litro de

agua destilada) y se incubaron a 23ºC durante 21 días.

A partir de las colonias desarrolladas en las cajas se realizó un repiqueo

extrayendo un pedazo circular de 5 mm de diámetro de medio de cultivo del borde

 39

las colonias en donde se observó crecimiento activo. Estos pedazos se sembraron en

nuevas cajas con el mismo medio de cultivo y se incubaron a 23ºC durante 21 días.

Una vez que las colonias se desarrollaron, se colocó 10 ml de agua destilada

estéril en cada caja, se raspó con un asa la colonia y la solución resultante se filtró a

través de una doble capa de gasa. Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de

esta solución hasta la concentración de 10-4. En nuevas cajas Petri con medio agar-

arveja se colocó 1 ml de la última solución, se esparció con un triangulo de vidrio

previamente flameado y se incubó a 23ºC durante 5 días. Transcurrido este tiempo se

trasladó una sola colonia proveniente de una conidia a una nueva caja Petri con el

mismo medio, obteniéndose el cultivo monospórico.

En el laboratorio de Fitopatología del PRONALEG-GA se mantuvo un

aislamiento de Ascochyta sp. recolectado en el mes de enero de 2012 a partir de

plantas de arveja enfermas sembradas en la EESC. Para refrescar este aislamiento, se

siguió el siguiente procedimiento: se colocó 10 ml de agua destilada no estéril en la

caja Petri, se raspó con un asa de platino y la solución de conidias se filtró a través de

una doble capa de gasa de algodón. Se determinó la concentración de conidias con un

hematocímetro y se la ajustó a 105 conidias ml-1.

Después se inocularon plantas de arveja de la variedad INIAP-436 Liliana de 30

días de edad, sembradas en macetas plásticas sobre sustrato no estéril que se

desarrollaron bajo condiciones de invernadero. Una vez transcurrida una semana a

partir de la inoculación, se extrajeron tallos y foliolos con síntomas y signos de la

enfermedad. Se aplicó el procedimiento realizado con las muestras provenientes del

ITSSR para obtener el cultivo monospórico.

 40

Una vez obtenidos los cultivos monospóricos provenientes tanto del ITSSR

como de la EESC, se los incubó a 23°C en una estufa, durante 25 días. Después se

realizó el incremento de la fuente de inóculo, es así que a partir de las cajas Petri que

contuvieron los monospóricos, se extrajeron 5 pedazos circulares de 1 cm2 por cada

aislamiento, los cuales se sembraron en nuevas cajas con medio agar-arveja. Se

incubaron en iguales condiciones a las descritas anteriormente durante 25 días.

A partir de estas 10 cajas Petri, 5 correspondientes al aislamiento proveniente del

ITSSR y 5 provenientes del aislamiento de la EESC, se incrementó la fuente de

inóculo hasta 125 cajas Petri para cada aislamiento. Para esto, con un asa de platino

se raspó los bordes de cada colonia y se sembraron las conidias adheridas al asa en

cajas Petri plásticas con medio agar-arveja aplicando la técnica de estriado. Estas

cajas se incubaron a 20°C y un fotoperiodo de 12 horas durante 30 días.

Una vez que se desarrollaron las colonias, se aplicó el procedimiento descrito por

Castellanos et al. (2011) para la inoculación en campo del agente causal de

Ascoquitosis en frijol. Para esto se colocó el medio de cultivo proveniente de las

cajas Petri, con el hongo en desarrollo, en el vaso de una licuadora. Se añadió agua

corriente y se licúo hasta lograr una solución homogénea. Se determinó la

concentración de conidias con el hematocímetro y se la ajusto a 106 conidias ml-1.

3.3.4. Identificación de plantas M2 resistente a Ascochyta spp.

En la primera localidad, correspondiente al ITSSR, la evaluación de la reacción

de las plantas a Ascochyta spp. se realizó una vez transcurridos 25 días después de la

inoculación. Se empleó la escala utilizada por Zhang et al. (2003) para evaluar la

severidad de la infección causada por Ascochyta spp. (tabla 3.1). Se seleccionaron

aquellas plantas cuya calificación dentro de la escala propuesta fue de 0 a 3.

 41

Tabla 3.1. Escala utilizada para evaluar la severidad de la infección causada

por Ascochyta spp.

VALOR SIGNIFICADO
0 Sin síntomas
1 Pocas manchas pequeñas en hojas
2 Menos del 10% de la superficie de la planta cubierta por
lesiones, pero sin síntomas en los tallos.
3 Numerosas manchas necróticas y pocas lesiones grandes en
hojas y tallos que cubren menos del 50% de la superficie de la
planta.
4 Lesiones grandes y coalescentes en hojas y tallos que cubren
más del 50% del área de la planta aún viva.
5 Lesiones grandes y coalescentes en hojas, lesiones en forma
de anillo alrededor de los tallos, planta marchitándose y
muriendo.
Fuente: Zhang et al. (2003)

Dado que las condiciones climáticas en el ITSSR durante las semanas que

siguieron a la inoculación fueron secas, y por lo tanto adversas para el desarrollo de

la enfermedad, se consideró la posibilidad de que las plantas seleccionadas en verdad

no fueran resistentes, sino mas bien se tratase de que el hongo no tuvo la oportunidad

para desarrollarse. Unido a esto, en las semanas que siguieron a la evaluación, se

presentaron abundantes precipitaciones, por lo cual se efectuó una segunda

evaluación 21 días después de la primera.

En la EESC la evaluación se llevó a cabo a los 21 días después de la inoculación.

Debido a que las condiciones climáticas también fueron secas en esta localidad, la

evaluación se realizó a nivel del tercio inferior de las plantas, en donde las

condiciones de humedad fueron óptimas para el desarrollo del patógeno. De igual

forma a lo ocurrido en la primera localidad, las semanas subsiguientes a la

evaluación se presentaron precipitaciones, por lo cual se realizó una segunda

calificación 25 días después de la primera.

 42

3.3.5. Cálculo de la efectividad y la eficiencia del tratamiento mutagénico.

La fórmula aplicada para calcular la efectividad de un agente mutágeno físico fue

la empleada por Konzak et al. y citada por Wani (2009), la cual es:

Frecuencia de mutación
Efectividad (agente físico) =
Dosis del mutágeno (Krad)

En cuanto a la eficiencia de un agente mutágeno, la fórmula que se utilizó para

obtenerla fue la siguiente (Konzak et al. citado por Wani 2009):

Frecuencia de mutación
Eficiencia =
% de plantas que no llegan a producir semilla (letalidad)

3.3.6. Siembra, desarrollo y evaluación de la resistencia de plantas M3 bajo

condiciones de invernadero.

Se seleccionaron 2 plantas de la generación M2 de la población “Dosis óptima”

cuya calificación para la severidad de la enfermedad fue 3 en la escala utilizada (los

números de identificación de estas plantas fueron el 1 y el 4 respectivamente). De

estas plantas se obtuvieron 16 semillas (15 provenientes de la planta 1 y solo una

semilla proveniente de la planta 4), las cuales se sembraron en macetas plásticas de

20cm de diámetro con sustrato. También se sembraron 5 semillas de la variedad

Liliana como testigos. Estas plantas se desarrollaron en el invernadero del

PRONALEG-GA.

Después de 35 días de la siembra, las plantas fueron inoculadas con una solución

de conidias de Ascochyta sp. aisladas a partir de plantas enfermas M2 que crecieron

en la EESC. La concentración de la solución fue de 5 x 104 conidias ml-1 y contuvo

0,05% de Tween 20. La inoculación se realizó con un pulverizador y compresor

eléctrico. Se dejaron a las plantas secar durante media hora y después se las ubicó
 43

dentro de una cámara de humedad durante 72 horas. Una vez transcurrido ese

tiempo, las plantas se ubicaron sobre mesas dentro del invernadero mencionado.

Una semana después de la inoculación se realizó la evaluación de la severidad de

la enfermedad, a nivel del quinto, sexto y séptimo foliolo para lo cual se empleó la

siguiente escala (Tivoli et al. citados por Onfroy et al. 1999):

Tabla 3.2. Escala para medir la severidad de la infección causada por

especies del “Complejo Ascochyta”

Valor Significado
0 Sin lesión
1 Pocas manchas dispersas
2 Numerosas manchas
3 10 a 15% del área foliar necrótica
4 50% del área foliar necrótica o deshidratada
5 100% del área foliar necrótica o deshidratada
Fuente: Tivoli et al. citados por Onfroy et al. (1999).

Se consideraron como plantas resistentes aquellas cuya calificación fue de 2 o

menos. Se realizaron dos evaluaciones adicionales, mediando tres y cuatro días entre

cada evaluación subsiguiente.

 44

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. ETAPA 1: DOSIMETRÍA

4.1.1. Prueba “Dinámica de germinación”

En esta prueba no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos,

por lo tanto, las dosis de radiación aplicadas no influenciaron la capacidad de

germinación de las semillas, lo cual coincide con los resultados hallados por Çiftçi et

al. (2006) al irradiar semillas secas de arveja de cuatro cultivares a 4 diferentes dosis

(60, 100, 140 y 180 Gy) más un tratamiento testigo. En este trabajo se encontró que

la germinación de semillas de arveja fue independiente de la dosis de rayos gamma

aplicada y fue afectada principalmente por la capacidad de germinación de los

genotipos. En forma similar, Kon et al. (2007) encontraron, al estudiar la

radiosensibilidad de Vigna sesquipedalis, que las diferentes dosis de radiación

aplicadas (300, 400, 600 y 800 Gy) no tuvieron efecto en los porcentajes de

germinación de las semillas de esa leguminosa. También Borzouei et al. (2010)

reportaron que al irradiar semillas de trigo a dosis de 100, 200, 300 y 400 Gy, los

porcentajes de germinación no fueron significativamente afectados por las diferentes

dosis de radiación. En la tabla 4.1 se expone el análisis de varianza realizado con los

datos observados. En el cuadro 4.1 se pueden observar los porcentajes de

germinación así como el número promedio de semillas germinadas por dosis

aplicada.
 45

Tabla 4.1. Análisis de varianza de la prueba “Dinámica de germinación”.

Fuentes de Grados de Suma de Cuadrados F

variación libertad cuadrados medios
Total 14 15,73
Dosis 4 5,07 1,27 0,96ns
Repetición 2 0,13 0,07 0,05ns
Error 8 10,53 1,32

Cuadro 4.1. Porcentajes de germinación y número promedio de semillas

germinadas por cada dosis de radiación aplicada.

120
100% 98,67% 98,67% 97,33%
Porcentaje de germinación

100 96,67%

80

60 Porcentaje de
48,33 50 49,33 49,33 48,67 Germinación
40 Número promedio de
semillas germinadas
20

0
0 50 100 150 200
Dosis de radiación (Gy)

4.1.2. Prueba “Porcentaje de supervivencia”

Después de realizar el análisis de varianza de los datos obtenidos en esta prueba,

se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos (tabla 4.2). Tras

realizar la prueba de Tukey (tabla 4.3), se observó que el tratamiento de 200 Gy fue

significativamente diferente a los otros y la reducción observada a esta dosis en el

número de plántulas supervivientes fue del 25,17% (cuadro 4.2). Este resultado

coincide con lo reportado por Mejri et al. (2012), quienes, al irradiar semillas de haba

con rayos gamma a dosis que fluctuaron entre 50 a 700 Gy, observaron que las

plántulas exhibían un alto nivel de mortalidad a dosis superiores a los 200 Gy.
 46

Bolbhat et al. (2012) también encontraron que al irradiar con rayos gamma semillas

de la leguminosa Macrotyloma uniflorum. a dosis entre los 100 y 400 Gy, el

porcentaje de supervivencia a los 45 días después de la siembra disminuyó conforme

se incrementó la dosis, observándose una reducción significativa en el tratamiento de

400 Gy.

Cuadro 4.2. Número promedio de plantas supervivientes, porcentaje de

supervivencia y porcentaje de reducción con respecto al tratamiento testigo,
observados para cada dosis de radiación gamma aplicada.

98% 97,3%
100 94,7% 93,3%
Porcentaje de
90 supervivencia
Porcentaje de supervivencia

80 73,3% Número promedio de

plantas supervivientes
70
Porcentaje de reducción
60
49 49 47
50 47

40 37

30 25,2%

20

10 3,4% 4,8%
0% 0,7%
0
0 50 100 150 200
Dosis de radiación (Gy)

Tabla 4.2. Análisis de varianza para la variable “Porcentaje de

supervivencia”.

Fuentes de Grados de Suma de Cuadrados F

Variación Libertad Cuadrados medios
Total 14 355,33
Dosis 4 314,67 78,67 22,06**
Repetición 2 12,13 6,07 1,70ns
Error 8 28,53 3,57
 47

Tabla 4.3. Prueba de Tukey (α= 0,05) para las medias halladas en la
evaluación de la variable “Porcentaje de supervivencia”.

Dosis (Gy) Medias

0 49,00 A
50 48,67 A
100 47,33 A
150 46,67 A
200 36,67 B

4.1.3. Prueba “Altura de plántula”

En esta prueba se observó que la altura promedio de las plántulas se redujo por

cada incremento en las dosis de rayos gamma (tabla 4.4). Estos resultados coinciden

con lo reportado por varios autores en trabajos realizados con diferentes especies,

tales como arveja (Çiftçi et al. 2006), soya (Menten et al., 1984), fréjol (Tulman

Neto et al., 1984) Vigna sesquipedalis (Kon et al., 2007), garbanzo (Talebi y Talebi,

2012) y trigo (Borzouei et al., 2010). Preuss y Britt (2003) mencionan que el signo

de daño de aparición más frecuente en plántulas provenientes de semillas irradiadas

con rayos gamma es la reducción en la altura de las mismas. Cuando el ADN de una

célula vegetal es dañado, se activa un mecanismo de transducción de señal que

ocasiona una detención del ciclo celular. Esta detención tiene como finalidad la

reparación enzimática del ADN. Una vez que se ha efectuado la reparación, el ciclo

celular continúa. En el caso de embriones de Arabidopsis thaliana, la detención en

ciclo celular ocurre en la fase G2, antes de la mitosis.

Evans (1965) menciona que en los meristemas de plantas irradiadas se presentan

tres tipos de cambios citológicos: retraso en el ciclo celular, formación de

aberraciones cromosómicas y pérdida de la capacidad proliferativa debido a una

diferenciación temprana o a muerte celular. Se sugiere que este último cambio es el

 48

principal responsable de la reducción en el crecimiento inducido por la exposición a

dosis subletales de radiación.

Tabla 4.4. Valores promedio de la altura de las plántulas hasta el punto de

inserción del segundo foliolo para cada dosis de radiación gamma aplicada.

DOSIS (Gy) ALTURA

PROMEDIO (cm)
0 11,11
50 9,77
100 8,54
150 4,66
200 3,51

Figura 4.1. Disminución en la altura de las plántulas en relación al

incremento en la dosis de radiación a las que fueron expuestas las semillas.
Las plántulas de la derecha corresponden al tratamiento testigo, hacia la
izquierda se ubican los otros tratamientos en orden creciente de dosis de
radiación.
 49

Figura 4.2. Plántulas correspondientes a cada tratamiento en las que se

observa la reducción en la altura de la plántula (las flechas señalan el punto
de inserción del segundo foliolo).

Cuadro 4.3. Curva y ecuación de regresión realizada a partir de los datos

expuestos en el tabla 4.4.

12 -6 3 2
11,11 y = 2x10 x - 0,0005x + 0,0043x + 10,988
9,60 2
R =0,9737
10
8,54 Altura promedio
Altura de plántula (cm)

de plántula
8
Curva de
4,66 regresión
6

4 3,51

0
0 50 100 150 200
Dosis de radiación (Gy)

Para la determinación de la dosis óptima de radiación gamma a la cual exponer

las semillas de arveja, se decidió considerar solo la información proveniente de la

última prueba, porque, si bien en la prueba “Porcentaje de supervivencia”, la dosis de

200 Gy produjo una reducción en la supervivencia menor al 30%, y por lo cual se

podía pensar que la dosis adecuada para la inducción de mutaciones debía ser mayor,
 50

las plántulas de este tratamiento presentaban severas deformidades morfológicas y

disminución en el tamaño de las plántulas que evidenciaron el fuerte daño al ADN

(figura 4.3). Este daño hubiese comprometido fuertemente la supervivencia de las

plantas al desarrollarse bajo condiciones ambientales no controladas en el campo,

reduciendo notablemente la cantidad de plantas M1 a partir de las cuales se genere

una población M2.

Figura 4.3. Plántulas correspondientes a las dosis de 150 y 200 Gy en

donde se observan la reducción en el crecimiento de las mismas.

Dado que la altura promedio de las plántulas en el tratamiento testigo fue de

11,11 cm, la dosis buscada fue aquella que produzca una reducción del 30% en ese

valor, es decir, 7,78 cm. Con los datos de la tabla 4.4 se realizó el análisis de

regresión y se calculó la siguiente ecuación:

> = 2 × 10?I J
0,0005 &
0,0043 10,988

El valor del coeficiente de determinación R2 fue 0,9737, el cuál, por acercarse al

valor de 1, implica que la línea de regresión describe con bastante precisión el

comportamiento de la variable altura promedio de las plántulas en relación al

aumento en la dosis de radiación (cuadro 4.3).

 51

Una vez resuelta la ecuación cúbica, se encontró que la dosis óptima de radiación

es de 119,66 Gy, valor que se redondeó a 120 Gy. De acuerdo a diversos trabajos,

para inducir mutaciones en semillas de arveja con rayos gamma, el rango de dosis

recomendadas se ubica entre los 100 a 150 Gy (Jaranowski y Micke, 1985;

Maluszynski et al., 2009).

4.2. ETAPA 2: GENERACIÓN M1

4.2.1. Porcentaje de emergencia

Se encontraron diferencias entre los porcentajes de emergencia observados en la

población “Testigo” y en la población “Dosis óptima”. En el primer caso, al evaluar

los 1500 puntos de siembra presentes en los dos surcos muestreados se

contabilizaron 975 plantas emergidas, lo cual representa una emergencia del 65%. En

el segundo, al evaluar los 3750 puntos de siembra presentes en los 5 surcos

muestreados, se contabilizaron 1178 plantas, lo cual corresponde a una emergencia

del 31,4% (figura 4.4).

Tal diferencia entre los porcentajes de emergencia de las poblaciones “Testigo” y

“Dosis óptima” podría atribuirse a la suma de los efectos de la irradiación más la

presencia en el suelo de factores como plagas y enfermedades que impiden que todas

las plántulas lleguen a emerger. Gómez et al. (1984), al irradiar con rayos gamma

semillas de arveja de las variedades “Amarilla” y “Alderman”, cultivadas en el Perú,

con dosis de 140 y 180 Gy, observaron que en el campo los porcentajes de

emergencia de las poblaciones irradiadas se redujeron con respecto al porcentaje de

emergencia de la población no irradiada. Esta reducción se incrementó conforme

aumentó la dosis. En el caso de la variedad “Amarilla”, los porcentajes de

emergencia para las dosis de 0, 140 y 180 Gy fueron del 80%, 45,9% y 30,5%,
 52

respectivamente, la cual es una reacción similar a la encontrada en la presente

investigación.

Figura 4.4. Diferencia entre los porcentajes de germinación de un surco de

la población “Dosis óptima” (izquierda) y población “Testigo” (derecha).

4.2.2. Porcentaje de plantas con sectores somáticos mutantes (quimeras)

Dentro de la población “Testigo”, de las 964 plantas evaluadas ninguna presentó

sectores mutantes clorofílicos. En cuanto a la población “Dosis óptima”, de las 579

plantas evaluadas, 529 presentaron sectores mutantes clorofílicos a nivel del cuarto

foliolo, 412 a nivel del quinto foliolo y 235 a nivel del sexto foliolo (Figura 4.5).

Cabe mencionar que en estas últimas plantas, todos los foliolos inferiores

presentaban sectores deficientes en clorofila. En la tabla 4.5 se exponen los

porcentajes correspondientes a estos valores.

 53

Tabla 4.5. Porcentaje de plantas con sectores somáticos mutantes

(quimeras) a nivel del cuarto, quinto y sexto foliolo.

Porcentaje que
Número de plantas con
representa en relación
N° de foliolo mutaciones clorofílicas
al total de plantas
en ese foliolo
evaluadas
4to 529 91,36
5to 412 71,16
6to 226 39,03

La síntesis de proteínas esenciales para la fotosíntesis esta codificada por ADN

presente tanto en el núcleo como en los cloroplastos. Las clorofilas se sintetizan en

una ruta bioquímica regulada por tales genes (Taiz y Zeiger, 2006). Por lo tanto, la

aparición de sectores mutantes clorofílicos es un indicio del daño causado por la

radiación al aparato fotosintético de las células. Además ilustra el quimerismo de la

generación M1. (Prina, 1989; Maluszinsky et al., 2009).

Al analizar la tabla 4.5, se observa que los sectores mutantes clorofílicos se

perdieron conforme las plantas fueron creciendo, reduciéndose el porcentaje de

plantas con sectores deficientes en clorofila si se considera un foliolo superior, y por

lo tanto más joven. Esto se puede explicar mediante los procesos de “deriva” y

“selección diplóntica” (Van Harten, 1998; Balkema 1971).

Balkema (1971) al investigar el quimerismo en Arabidopsis thaliana y

Helianthus annus llegó a la conclusión que la pérdida de sectores quiméricos estaba

relacionada con el desarrollo propio de la planta. Los sectores quiméricos se originan

a partir de células iniciales presentes en el ápice de la planta y las cuales persisten

durante todo el ciclo vegetativo. Factores ambientales, tales como la temperatura y el

fotoperiodo influyen en la estabilidad de esas células iniciales. Si una de estas pierde

su posición inicial, no la vuelve a recuperar y el sector se pierde. Esta pérdida se da

 54

al azar y es independiente del genotipo de las células presentes en los sectores

quiméricos.

En cuanto a la “selección diplóntica”, se refiere a la competencia entre tejidos

con distinta constitución genética dentro de un mismo soma. Uno de estos tejidos

puede tener una mejor aptitud para reproducirse y competir y por lo tanto desplaza y

reemplaza a los otros tejidos. Por lo general los sectores mutantes, al acarrear

alteraciones genéticas, pueden estar en desventaja competitiva y, en consecuencia,

desaparecer (Prina et al. 2012). Balkema (1971) solo encontró evidencia de

“selección diplóntica” en los casos en que existen varios meristemas potenciales, de

los cuales solo unos pocos pueden desarrollarse. Esto sucede durante la formación de

yemas axilares y adventicias.

Figura 4.5. Foliolos con sectores mutantes clorofílicos.

 55

Figura 4.6. Plantas de la población “Dosis óptima” que han perdido los
sectores mutantes clorofílicos al proseguir el desarrollo.

4.2.3. Porcentaje de plantas sobrevivientes hasta la madurez-Letalidad

En la población “Testigo”, de las 100 plantas seleccionadas al azar, todas

presentaron vainas con semillas. Es decir, el 100%. En cuanto a la población “Dosis

óptima”, de las 100 plantas evaluadas, 87 presentaron vainas con semillas, mientras

que 13 plantas presentaron vainas vacías, y por lo tanto eran incapaces de pasar a la

siguiente generación.

Las radiaciones ionizantes ocasionan roturas de doble cadena en la molécula de

ADN. Estas lesiones son de extrema gravedad, y las células disponen de dos

mecanismos principales para repararlas. Estos son: la unión de extremos no

homólogos y la recombinación homóloga. La primera consiste en la unión directa de

los extremos de las dos cadenas rotas, sin emplear como guía otra molécula de ADN

con secuencia homóloga, Es un mecanismo propenso a errores, que se acompaña

frecuentemente por adiciones, deleciones e inversiones de segmentos de ADN. Es

 56

también la principal vía para reparar este tipo de lesión en organismos eucariotas

superiores como las plantas y mamíferos (Osakabe et al., 2012)

La reparación del ADN a través de la recombinación homóloga consiste en la

unión de los bordes de la ruptura utilizando otra molécula de ADN con secuencia

homóloga o similar como plantilla. Esto es necesario porque este proceso se inicia

con la resección de segmentos de ADN de la molécula rota, lo cual produciría

pérdida de la información genética almacenada en los segmentos eliminados. Para

recuperar esa información, la secuencia de la otra molécula de ADN sirve como guía

durante la síntesis de las nuevas cadenas. Durante este proceso puede producirse

intercambio entre segmentos de las dos moléculas participantes, lo cual podría

alterar, aunque en forma mínima, la secuencia inicial presente en el ADN reparado

(Osakabe et al., 2012).

Según Demchenko y Avrutskaya (1979) la esterilidad que se observa en la M1 es

producto de la alta frecuencia de recombinación en células mitóticas, como resultado

de los procesos de reparación de los daños ocasionado por el agente mutágeno. Esta

alta frecuencia evita el normal progreso de la célula en meiosis. Los disturbios en la

formación de la sinapsis y quiasmas característicos de la meiosis en la generación M1

parecen estar relacionados con anormalidades en el mecanismo molecular del

entrecruzamiento cromosómico (crossing-over).

Ekberg (1969) encontró en cebada (Hordeum vulgare) que la exposición a

radiaciones ionizantes produce aberraciones cromosómicas como translocaciones e

inversiones, las cuales conllevan a reordenamientos cromosómicos y ocasionan

disturbios durante la meiosis.

 57

Si se considera el hecho de que las células de las plantas utilizan la unión de

extremos no homólogos como principal vía para la reparación de roturas de doble

cadena de la molécula de ADN, y esta vía es propensa a producir adiciones,

deleciones e inversiones de segmentos de ADN y por lo tanto, producir mutaciones,

es posible suponer que en cierto números de plantas estas mutaciones afectan genes

que codifican la síntesis de enzimas necesarias para que la meiosis se lleve a cabo, lo

cual produce finalmente esterilidad en tales plantas.

Bleuyard et al. (2004) mencionan que plantas mutantes estériles de Arabidopsis

thaliana presentan una síntesis deficiente de la proteína AtRad50 la cual interviene

en los procesos de recombinación homóloga, reparación de ADN y meiosis. La

observación citológica de la meiosis masculina en esas plantas mostró que en

ausencia de tal proteína los cromosomas homólogos no se alinean, no se produce la

sinapsis, ni el entrecruzamiento. Finalmente este tipo de mutación lleva a la pérdida

de los cromosomas.

4.2.4. Número de plantas cosechadas y conformación de los grupos de

semillas M2.

Una vez procesados los datos obtenidos a partir de la muestra de 384 vainas

tomadas de la bolsa con mayor cantidad de vainas, se encontró que el número

promedio de semillas por vainas fue de 3,51 con una desviación estándar de 1,24. El

peso de cada conjunto de semillas, el peso promedio de 100 semillas dentro de cada

conjunto, y el número aproximado de semillas por conjunto se muestran en la tabla

4.6.
 58

Tabla 4.6. Número aproximado de semillas en cada uno de los conjuntos

obtenidos en la cosecha de las plantas M1.

Número Peso en gramos de 100 semillas Número

Peso en Peso
de Repetición Repetición Repetición aprox. de
gramos promedio
conjunto 1 2 3 semillas
1 5400 28,41 30,47 28,84 29,24 18468
2 4200 29,47 29,56 28,57 29,20 14384
3 4400 29,13 28,75 29,10 28,99 15176
4 3800 29,01 29,53 29,18 29,24 12996
5 3600 28,52 29,41 29,37 29,10 12371
6 3450 29,81 30,84 29,55 30,07 11475
7 3200 29,20 28,60 30,23 29,34 10905
8 3300 29,07 29,33 27,56 28,65 11517

En base al número aproximado de semillas presentes en el conjunto 1 se calculó

el aproximado de plantas cosechadas, dividiéndolo para el número promedio de

semillas por vaina. El valor obtenido fue de 5260 plantas.

Se formaron 2 grupos combinando cuatro conjuntos en cada uno, con una

cantidad superior a 50000 semillas. En el primer grupo se unieron las semillas de los

conjuntos 1, 5, 7 y 8, dando un total aproximado de 53261. En el segundo grupo se

sumaron las semillas de los conjuntos 2, 3, 4 y 6 para dar un aproximado total de

54031 granos. El primero se sembró en el ITSSR y el segundo en la EESC.

4.3. ETAPA 3: GENERACIÓN M2

4.3.1. Porcentaje de emergencia

En el ITTSR al evaluar dentro de la población “testigo” los 4500 puntos de

siembra presentes en los 5 surcos muestreados, se encontró un total de 2577 plantas

emergidas, lo cual corresponde a un 57,26% de emergencia. En la población “Dosis

óptima”, al evaluar los 9000 puntos de siembra presentes en los 10 surcos

muestreados, se encontró un total de 4747 plantas emergidas, lo cual corresponde a

una emergencia del 52,74%.

 59

En la EESC, dentro de la población “testigo”, de los 2967 puntos de siembra

evaluados presentes dentro de los tres surcos muestreados, se encontró un total de

1317 plantas emergidas, lo cual corresponde a un 44,39% de emergencia. Con

respecto a la Población “Dosis óptima”, al evaluar los 9986 puntos de siembra

presentes en los 10 surcos muestreados, se encontraron 5806 plantas emergidas, lo

cual corresponde a un 58,73% de emergencia.

Cuadro 4.4. Porcentajes de emergencia en la Etapa 3 de las poblaciones

“Dosis óptima” y “Testigo” en el ITSSR y la EESC.

70
57,26% 58,73%
60 52,74%
44,39%
50
Porcentaje

40
30 Dosis óptima

20 Testigo

10
0
ITSSR EESC
Localidades

En el cuadro 4.4 es posible observar que en el ITSSR la diferencia entre la

emergencia de la población “Dosis óptima y la población “Testigo” es pequeña,

siendo la primera inferior a la segunda. En la EESC los resultados fueron inversos

siendo la emergencia en la población “Dosis óptima” mayor que en la población

“Testigo”. El análisis de varianza realizado con los datos transformados reveló que

no existieron diferencias significativas entre las observaciones realizadas (tabla 4.7),

por lo cual se puede afirmar que no hubo efecto de la radiación gamma sobre los

porcentajes de emergencia de la generación M2.

 60

Tabla 4.7. Análisis de varianza de la emergencia observada en las

poblaciones “Testigo” y “Dosis óptima” en las localidades ITSSR y EESC.

Fuentes de Grados de Suma de Cuadrados F

Variación Libertad Cuadrados medios
Total 3 41,29
Población 1 7,97 7,97 0,27ns
Localidad 1 3,88 3,88 0,13ns
Error 1 29,44 29,44

4.3.2. Frecuencias de mutaciones clorofílicas de cada población

En el ITSSR al evaluar la población “Dosis óptima” se encontraron 8 plantas

correspondientes a la categoría albina (figura 4.7), 2 plantas correspondientes a la

categoría xantha (figura 4.8), y 55 correspondientes a la categoría viridis (figura 4.9),

lo cual suma un total de 65 plantas mutantes clorofílicas. En base al muestreo

realizado para obtener los porcentajes de emergencia, se encontró que en promedio

en cada surco se desarrollaban 475 plantas. Se multiplicó este número por la cantidad

de surcos de la población “Dosis óptima”, obteniéndose un estimado de 28975

plantas. Aplicando la fórmula para hallar la frecuencia de mutación sugerida por

Maluszynski et al (2009), el valor de esta variable fue de 0,22%. En la población

“Testigo” presente en esta localidad no se halló ninguna plántula con mutaciones

clorofílicas.
 61

Figura 4.7. Plántula albina.

Figura 4.8. Plántula xantha.

Figura 4.9. Plántula viridis.

 62

En la EESC, dentro de la población “Dosis óptima”, se encontraron 16 plantas

albinas, 4 xanthas y 44 viridis, lo cual totaliza 64 plantas mutantes clorofílicas. El

número promedio de plántulas por cada surco fue de 581 plantas. Multiplicando este

valor por el número de surcos de esta población, se halló un número estimado de

29631 plántulas. Con estos datos, al realizar el cálculo de la frecuencia de mutación

se obtuvo el valor de 0,22%. En la población “Testigo” no se halló ninguna planta

mutante clorofílica.

En ambas localidades la frecuencia de mutaciones clorofílicas fue la misma y se

puede generalizar que, de cada 455 plantas M2, un individuo tuvo mutaciones en los

loci que codifican para la síntesis de clorofila. La frecuencia encontrada, de 0,22%,

es similar a las observadas en el trabajo de Gómez et al. (1984) al irradiar semillas de

arveja de las variedades “Amarilla” y “Alderman”, de amplia aceptación en el Perú,

con dosis de rayos gamma de 140 y 180 Gy. En la M2 hallaron frecuencias de

mutaciones clorofílicas entre 0,20 y 0,35%.

En contraste a los resultados mencionados, Dhulgande et al. (2010) reportaron

frecuencias de mutaciones clorofílicas de hasta el 6,27% al irradiar semillas de arveja

de las variedades indias DDR-53 y DMR-55 con rayos gamma a dosis de 50, 70 y

100 Gy. Esta diferencia en la respuesta podría ser causada por la presencia de genes

epistáticos los cuales modifican la expresión de un gen mutante (Koornneef, 2002).

El origen de plantas con deficiencias clorofílicas se debe principalmente a

mutaciones en genes que codifican para la síntesis de pigmentos fotosintéticos

(Dhulgande et al. 2010). Es necesario señalar que otros genes que determinan

atributos de interés agronómico pueden mutar con menor frecuencia que aquellos que

controlan la elaboración de clorofila (Maluszinsky et al. 2009).

 63

4.3.3. Efectividad y eficiencia del tratamiento mutagénico.

Conocidos los valores de la frecuencia de mutaciones clorofílicas y la letalidad

del tratamiento mutagénico en la generación M1, fue posible calcular los valores de

la efectividad y eficiencia en base a la fórmula mencionada en el capítulo 3. El valor

de efectividad del agente mutágeno para la dosis aplicada fue de 0,0018. Para

interpretar este valor es necesario considerar la definición de la unidad Gray, dada

por Lagoda (2012) y mencionada en el capítulo 2. En base a esa definición se puede

afirmar que por cada Julio absorbido en forma de rayos gamma por un kilogramo de

semillas de arveja, se produjo 0,0018 mutantes clorofílicos por cada 100 plantas de la

generación M2.

Al comparar la efectividad del tratamiento mutagénico aplicado en esta

investigación con la observada en el trabajo de Dhulgande et al. (2010), que encontró

valores de 0,0627 en la variedad DDR-53 y 0,0601 en la DMR-55 para una dosis de

rayos gamma de 100 Gy, es notable la diferencia, lo cual lleva a conjeturar que

posiblemente la variedad Liliana posee una radiosensibilidad menor que las

variedades indias empleadas en esa investigación.

El valor hallado para la eficiencia fue de 0,0169, el cual se puede interpretar

como la inducción de 0,0169 mutaciones clorofílicas en la generación M2 por cada

planta estéril encontrada en la M1. Dhulgande et al. (2010) obtuvieron los valores de

0,33 y 0,35 para las dos variedades citadas en el párrafo anterior para la dosis de 100

Gy. Estos valores son sustancialmente superiores al encontrado en la presente

investigación.
 64

4.3.4. Identificación de plantas M2 resistentes a Ascochyta spp.

4.3.4.1. Localidad ITSSR

Al realizar la primera evaluación se seleccionaron 15 plantas cuya calificación

fue de 3 o menos de acuerdo a la escala utilizada. En la segunda evaluación, y debido

a que se presentaron abundantes precipitaciones en la zona, las plantas seleccionadas

tuvieron calificaciones de 4 y 5, lo cual corresponde a plantas susceptibles, y por lo

tanto fueron eliminadas (figura 4.10).

Figura 4.10. Plantas M2 con ataque severo por Ascochyta spp. en el ITSSR.

4.3.4.2. Localidad EESC

En la primera evaluación se seleccionaron 66 plantas con reacción de 3 o menor

de acuerdo a la escala utilizada. Al igual que en la primera localidad, después de la

evaluación se presentaron precipitaciones, por lo cual se efectúo una segunda

evaluación, en la cual se seleccionaron 2 plantas con una calificación de 3 (figura

4.11). Estas plantas se cosecharon y sus semillas se sembraron en macetas bajo

 65

condiciones de invernadero con la finalidad de evaluar la resistencia de estas plantas

a Ascochyta spp.

Figura 4.11. Plantas M2 con calificación 3 dentro de la escala utilizada para

evaluar la severidad de la infección por Ascochyta spp. A) Planta 1. B)
Planta 4.

4.4. GENERACIÓN M3

De las 15 semillas provenientes de la planta M2 seleccionada cuyo número de

identificación fue el 1, solo se desarrollaron 9. En cuanto a la semilla proveniente de

la planta número 4, también se desarrolló. Transcurridos 7 días posteriores a la

inoculación, durante la primera evaluación, todas las plantas presentaban síntomas

iniciales de infección por parte de Ascochyta spp. sin poder observarse diferencias

entre las plantas testigo y las plantas M3. Transcurrida una semana, durante la tercera

evaluación, todas las plantas presentaron una calificación de 5, es decir, susceptibles

(figuras 4.12 y 4.13).

 66

Figura 4.12. Foliolo de planta M3 con calificación 5 dentro de la escala

utilizada.

Figura 4.13. Plantas M3 mostrando una severa infección por Ascochyta sp.

Hillstrand y Auld, citados por Bretag et al. (2006) señalan que, al evaluar la

resistencia de plantas de arveja a P. pinodella en condiciones de campo existe mayor

posibilidad de clasificar como resistentes a genotipos que no lo son, en comparación

con evaluaciones realizadas bajo invernadero, debido a que las condiciones en este
 67

último ambiente son más favorables para el desarrollo del patógeno y existe menor

probabilidad de escape.

En base a la anterior premisa se puede afirmar que las dos plantas M2

seleccionadas fueron en realidad escapes, y por lo tanto, su progenie, que se

desarrolló en invernadero bajo condiciones controladas y favorables para la

enfermedad, no fue resistente.

La resistencia en arveja a los hongos del “Complejo Ascochyta” es una

característica sumamente compleja, por las siguientes razones: primero, la resistencia

a cada una de las tres especies de hongos parece estar controlada por diferentes genes

(Skolko et al., citados por Bretag et al., 2006), por lo cual las variedades resistentes a

un patógeno pueden ser susceptibles a los otros. Adicionalmente, para cada patógeno

la resistencia a nivel foliar, del tallo y radicular probablemente están bajo un control

genético diferente (Wark y Sakar et al. citados por Bretag et al. 2006). También

existen razas dentro de cada especie de patógeno causante de Ascoquitosis, y muy

probablemente, genes específicos para la resistencia a cada raza (Matthews, citado

por Bretag et al. 2006).

En segundo lugar, en diferentes estudios realizados en con el fin de identificar

genes relacionados con la resistencia a M. pinodes, se ha determinado que esta es una

característica poligénica, de herencia cuantitativa (Timmerman-Vaughan et al., 2002;

Wroth, citado por Bretag et al. 2006).

La imposibilidad para generar genotipos con algún grado de resistencia a los

hongos del “Complejo Ascochyta” se debió a los siguientes factores: la naturaleza

poligénica y sumamente compleja de la resistencia a este complejo, por lo cual, la

 68

probabilidad de un cambio simultáneo en todos los genes involucrados es

extremadamente baja.

Además, el tipo de lesiones causadas por el agente mutágeno utilizado. Los rayos

gamma ocasionan principalmente aberraciones cromosómicas, cuya consecuencia

visible es la aparición de plantas estériles en la generación M1. Este daño disminuye

la cantidad de mutaciones que pasan a la generación M2, lo cual se observa como una

baja frecuencia de mutaciones clorofílicas. En comparación, los agentes químicos,

que producen principalmente mutaciones génicas, (alteraciones puntuales en la

secuencia de nucleótidos), que logran pasar el filtro de la meiosis y se expresan en la

siguiente generación, producen mayores frecuencias de mutaciones clorofílicas

(Prina, 1989).Precisamente, en este estudio, se evidenció una frecuencia de

mutaciones baja.

También, la inducción de mutaciones es una técnica que está fuertemente ligada

al azar (Pabón, 2011), por lo tanto, los cambios inducidos no se pueden determinar

previamente, el fitomejorador solo puede aumentar las probabilidades de mutaciones

mediante la utilización de dosis más altas de agente mutágeno, combinación de

agentes o mayor número de individuos tratados. Todas estas estrategias no son

garantía de generar mutaciones útiles.

Debido a las razones enunciadas, se concluye que la inducción de mutaciones

con rayos gamma a la dosis empleada y con el genotipo utilizado, no fue una

estrategia efectiva para generar resistencia a Ascoquitosis, dada la cantidad de

factores involucrados en la expresión de tal característica.

 69

V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. CONCLUSIONES

• La dosis óptima para inducir mutaciones en la variedad INIAP 436 Liliana

fue de 120 Gy. Esta dosis de rayos gamma produciría una disminución del

30% en la altura de plántulas, comparándola con un tratamiento testigo, sin

exposición a radiación.

• Los efectos somáticos observados en la generación M1 consistieron en la

reducción en los porcentajes de emergencia, aparecimiento de plantas

quiméricas con sectores mutantes clorofílicos y presencia de plantas maduras

estériles.

• La frecuencia de mutaciones clorofílicas observada en la generación M2 fue

del 0,22%, siendo una frecuencia baja, lo cual repercutió en una reducida

efectividad y eficiencia mutagénica.

• No fue posible inducir mutaciones que confieran resistencia a la variedad de

arveja INIAP 436 Liliana para Ascochyta spp. mediante el uso de rayos

gamma a la dosis de 120 Gy debido que esta característica es poligénica y a la

naturaleza azarosa de la técnica de inducción de mutaciones.

5.2. RECOMENDACIONES

• Investigar las frecuencias de mutaciones clorofílicas, las efectividades y las

eficiencias mutagénicas que se pueden obtener en la generación M2

empleando otros genotipos de arveja, así como agentes mutágenos químicos y

su combinación con agentes físicos para determinar una combinación de

factores que permitan maximizar la oportunidad de obtener mutaciones útiles

 70

no solo relacionadas a resistencia a enfermedades sino también a parámetros

productivos o nutricionales.

• Determinar el o los agentes causales de Ascoquitosis presentes en las

regiones productoras de arveja en el Ecuador.

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