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REPUBLIQUE TUNISIENNE

UNIVERSITE DE JENDOUBA

INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE BEJA

MEMOIRE DE MASTERE

Pour l’obtention du diplôme de Mastère Professionnel

En Agro Ressources Fonctionnelles

Parcours : Culture Production Conservation

Analyse phytochimique et étude des activités antioxydantes


et antidiabétiques des feuilles de murier noir (Morus nigra L.) chez le rat

Soutenu le 25 Décembre 2015

Elaboré par: Mlle Emna BELHAJ SMAIL

Encadré par: Mr Abid OUERGHI

Mr Kais RTIBI

Devant le Jury composé de :

Mr Lamjed MARZOUKI Président

Mr Mondher MEJRI Examinateur

CE MASTERE EST FINANCE PAR LE PROJET EUROPEEN TEMPUS ARF 530234-TEMPUS-1-2012-1-FR-TEMPUS-JPCR

Année Universitaire 2014-2015


Le meilleur moyen de prévoir le futur, c’est de le créer. (Peter Drucker)
Remerciements

Au terme de ce labeur, je me fais devoir d’adresser le témoignage de mes gratitudes à tous ceux qui

ont contribué de prés ou de loin pour me permettre de mener mes taches à bonne fin.

Mes remerciements les plus sincères s’adressent tout d’abord à Mr Lamjed MARZOUKI, le

directeur de l’Institut Supérieur de Biotechnologie de Béja.

Mes reconnaissances s’adressent à mon encadreur Mr Abid OUERGHI, pour son encadrement

scientifique, son soutien moral et les efforts qu’il a déployé pour m’assister dans l’accomplissement

de ce projet.

Mes reconnaissances s’adressent également à Mr Kais RTIBI, pour sa disponibilité, sa gentillesse

et son aide tout au long de ce travail. Veuillez croire, Monsieur, à ma gratitude la plus distinguée.

Qu’ils trouvent ici l’expression de mes sincères remerciements. Tous mes vœux de bonheur et de

bonne santé.

Je tiens à remercier tout les membres de jury pour l’honneur qu’ils me font en acceptant de juger

mon modeste travail. Que les honorables membres du jury veuillent croire en mes remerciements anticipés

pour leur acceptation d’examiner ce travail.

Je tiens aussi à remercier amplement tous le cadre du Master spécialement Pr Hassan BACHA

président de l'Université de Jendouba et responsable du parcours, et Mr Issam CHARGUI pour la

formation de qualité qu’ils nous assurent. Je souhaite que le travail réalisé soit à l’hauteur de leurs

espérances.

J’exprime mon profond respect et mes infinies reconnaissances à Mme Yosra MENCHERI chef de

département Biotechnologie végétale à l’institut supérieur de Biotechnologie de Béja. Ainsi que tous

mes professeurs qui n’ont enseigné durant mes études à l’institut de biotechnologie de Béja.

Je remercie tous ceux qui, à travers un conseil judicieux ou un sourire s’insère, m’aident à avancer.
Dédicaces

A la mémoire de mes grands parents et mes chères Habiba et Saida.

Puisse Dieu les accueillir dans son infinie miséricorde.

A mes parents Mohamed Arbi et Radhia.

Que nulle dédicace ne peut exprimer mes sincères sentiments, pour leur patience illimitée, leur

encouragement continu, leur aide, en témoignage de mon profond amour et respect pour leurs grands

sacrifices.

A mes chères sœurs Asma et Ons.

A mes chers frères Oussema, Amine, Yosri et Abdellatif.

Pour leur grand amour et leur soutien qu’elles trouvent ici l’expression de ma haute gratitude. Avec

toute ma tendresse.

A mon cher Raed, qui a fait preuve d’une détermination et d’un courage gravés à jamais dans mon

cœur.

A mes amies d’enfance Emna et Emna.

A mes amies Zeineb, Chahnez, Sabrine, Maha et Nedia.

A mes adorables cousines Feiza et Chahrazed.

Je leur souhaite tout le succès…tout le bonheur.

Sans oublier tout les professeurs du primaire jusqu’à l’enseignement supérieur.

Je dédie ce travail
SOMMAIRE

Introduction .......................................................................................................................................................................... 1

Synthèse bibliographique ..................................................................................................................................................... 3

I. Diabete ........................................................................................................................................................................... 3

1. La glycémie .................................................................................................................................................................. 3
2. Le diabète ..................................................................................................................................................................... 3
2.1. Généralité.................................................................................................................................................................... 3
2.2. Le pancréas et l’insulino-sécrétion ............................................................................................................................. 4
2.2.1. L'insuline ...................................................................................................................................................................................... 4
2.2.2. Le glucagon .................................................................................................................................................................................. 5
2.2.3. La somatostatine........................................................................................................................................................................... 5
3. Diabète gestationnel...................................................................................................................................................... 5
4. Le diabète secondaire (spécifique)................................................................................................................................ 5

II. Le stress oxydant ........................................................................................................................................................... 5

1. Définition ...................................................................................................................................................................... 5
2. Les pro-oxydants .......................................................................................................................................................... 5
3. Systèmes de défense Antioxydant ................................................................................................................................ 7
3.1. Antioxydants enzymatiques ........................................................................................................................................ 7
3.1.1. Superoxide dismutase .............................................................................................................................................. 7
3.1.2. Catalase .................................................................................................................................................................... 7
3.2. Antioxydants non enzymatiques ................................................................................................................................. 7
3.2.1. Vitamine E ............................................................................................................................................................... 7
3.2.2. Vitamine C (acide ascorbique) ................................................................................................................................ 8
3.2.3 Glutathion ................................................................................................................................................................ 8

III. Diabete et stress oxydatif .............................................................................................................................................. 8

IV. Le murier noir ............................................................................................................................................................. 10

1. Etude botanique .......................................................................................................................................................... 10


1.1. Systématique ............................................................................................................................................................. 10
1.2. Description botanique ............................................................................................................................................... 11
2. Ecologie de l’arbre et répartition ................................................................................................................................ 11
3. Utilisation et composition chimique ........................................................................................................................... 11

Objectifs .............................................................................................................................................................................. 13

Matériel et methodes .......................................................................................................................................................... 14

I. Matériel ........................................................................................................................................................................ 14

1. Agents, réactifs et appareillage ................................................................................................................................... 14


1.1. Agents et réactifs ...................................................................................................................................................... 14
1.2. Appareillages ............................................................................................................................................................ 14
2. Matériel biologique ..................................................................................................................................................... 14
2.1. Matériel végétal ........................................................................................................................................................ 14
2.2. Animaux ................................................................................................................................................................... 14
II. Méthodes ...................................................................................................................................................................... 15

1. Préparation et utilisations de l’extrait Murier noir ...................................................................................................... 15


2. Dosage des polyphénols ............................................................................................................................................. 15
3. Dosage de l’activité antioxydante par la méthode du DPPH ...................................................................................... 16
4. Dosage de l’activité antioxydante par la méthode de l’ABTS .................................................................................... 17
5. Protocole expérimental ............................................................................................................................................... 17
5.1. Induction du diabète ................................................................................................................................................. 17
5.2. Choix des doses ........................................................................................................................................................ 17
5.3. Traitement des animaux et groupes expérimentaux .................................................................................................. 17
5.4. Sacrifice et prélèvement des échantillons ................................................................................................................. 18
6. Dosages biochimiques ................................................................................................................................................ 19
6.1. Détermination de la glycémie ................................................................................................................................... 19
6.2. Dosage des protéines ................................................................................................................................................ 19
6.3. Dosage du malondialdehyde (MDA) ........................................................................................................................ 19
6.4. Dosage du H2O2 ........................................................................................................................................................ 20
6.5. Détermination des groupes sulfhydriles .................................................................................................................... 20
6.6. Détermination de l’activité du superoxyde dismutase (SOD) ................................................................................... 21
6.7. Détermination de l’activité de la catalase (CAT)...................................................................................................... 21
7. Evaluation du bilan lipidique ...................................................................................................................................... 21
7.1. Dosage du cholestérol ................................................................................................................................................................... 21
7.2. Dosage de la triglycéride ............................................................................................................................................................... 22
8. Calculs statistiques ......................................................................................................................................................... 22

Résultat ................................................................................................................................................................................ 23

I. Etude phytochimique et activite antioxydante.......................................................................................................... 23

1. Détermination du teneur en polyphénols ..................................................................................................................... 23


2. Détermination de l’activité antioxydante par la methode du DPPH et de l’ABTS ...................................................... 23

II. Etude physiologique .................................................................................................................................................... 24

1. Effet de diabète et de l’MCMû Sur l’évolution pondérale et poids des organes ......................................................... 24
2. Effet de diabète et de l’MCMû sur la glycémie et le bilan lipidique .......................................................................... 25
3. Effet de diabète et de l’MCMû sur les pro-oxydants .................................................................................................. 26
3.1. Effet de diabète et de l’MCMû sur le taux des protéines et SH ................................................................................ 26
3.2. Effet de diabète et de l’MCMû sur les pro-oxydants (MDA, H2O2) ......................................................................... 28
4. Effet de diabète et de l’MCMû sur l’activité des enzymes antioxydants (SOD et CAT) ........................................... 29

Discussions .......................................................................................................................................................................... 30

Conclusion générale et perspectives .................................................................................................................................. 33

Références bibliographiques.............................................................................................................................................. 34
Liste des figures
Figure 1: Relation entre hyperglycémie et stress oxydant (Bonnefont-Rousselot.,2004) ..................... 8

Figure 2: Morus nigra.L (source: atlas des plantes de France. 1891et jardin-secrets) ....................... 10

Figure 3: Courbe d'etalonnage du dosage des polyphénols totaux ...................................................... 21

Figure 4: Dosage des polyphénols totaux au sein des extraits obtenus à diverses temperatures ........ 21

Figure 5: Effet d’un traitement sub-aigue (21 jours) par l’extrait total des feuilles de murier à des
doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de la diminution du poids corporel suite à
l’induction de diabète chez le rat. ........................................................................................................... 24

Figure 6: Effet d’un traitement subaigu (21 jours) par l’extrait total des feuilles de murier à des doses
croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de l’augmentation du niveau de glucose dans le sang
suite à l’induction de diabète chez le rat. .............................................................................................. 25

Figure 7: Effet d’un traitement sub-aigu (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des doses
croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de l’augmentation des niveaux du triglycérides (A) et
du cholestérol (B) suite à l’induction de diabète chez le rat.................................................................. 25

Figure 8: Effet d’un traitement sub-aigu (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des doses
croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis la diminution du taux des protéines aux niveaux
hépatique, rénal et pancréatique suite à l’induction de diabète chez le rat............................................. 27

Figure 9: Effet d’un traitement sub-aigu (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des doses
croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de la diminution des niveaux hépatique, rénal et
pancréatique des groupements -SH suite à l’induction de diabète chez le rat....................................... 27

Figure 10: Effet d’un traitement sub-aigue (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des doses
croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de l’augmentation des niveaux hépatique, rénal et
pancréatique du MDA et de H2O2 suite à l’induction de diabète chez le rat ....................................... 28

Figure 11: Effet d’un traitement aigue (23jours) par l’extrait des feuilles de murier (à des doses
croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de la déplétion de l’activité des enzymes antioxydants
(SOD et CAT) aux niveaux hépatique, rénal et pancréatique après induction de diabète chez le rat .... 29
Liste des tableaux

Tableau 1 : Classification botanique de Morus nigra L ..................................................................10

Tableau 2: Activité antioxydante par la méthode du DPPH et de l’ABTS ..........................................22

Tableau 3: Variation des poids des organes .....................................................................................23


Liste des abréviations

Allox: Alloxane
ABTS: 2,2-azinobis-éthylbenzothiazoline-6-sulphonate
CAT: Catalase
Db: Diabinile
DTNB: 5-5’-dithiobis2-nitrobenzoïque
DNID: Diabète non insulinodépendant
DID: Diabète insulinodépendant
DPPH: 2, 2-diphénylpicrylhydrasyl
EDTA: Acide Ethylène Diamine Tétra Acétique
EOA: Espèces oxygénées activées
ERO: Espèces réactives de l’oxygène
GSH : Glutathion peroxydase
HDL: High Density Lipoprotein
LDL: Low Density Lipoprotein
MCMû: Macération chaude de murier
MDA: Malonyldialdéhyde
NADH: Nicotinamide Adénine Dinucléotide
NADPH: Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate
NBT: Nitro blue Tetrazolium
NO: Nitric oxide
NOS: NOsynthase
(N-O): Nord-ouest
Na2CO3: carbonate de sodium
NaHCO3: bicarbonate de sodium
NADPH, H+: Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit
NO: monoxyde d’azote
OH.: Le radical hydroxyl
ONOO. : Peroxynitrite
O2- : anion superoxyde
OH- : ion hydroxyle
ONOOH: l’acide peroxynitreux
PBS: Phosphate Buffer Saline
ROS: Reactive oxygen species
ROO°: Radical peroxyl
SOD: Superoxyde dismutase
-SH: Groupement thiol
TBA: Thiobarbituric acid
TCA: Acide trichloroacétique
Introduction

Le diabète est une maladie chronique se caractérise par une accumulation de sucre dans le sang. Un
sujet diabétique ne peut pas utiliser l’insuline synthétisé correctement ou bien ne le produit pas d’une
manière suffisante. Cette maladie peut toucher des personnes de tout âge. On connait trois grands types
de diabète : Le diabète de type 1 qui est provoqué par une réaction auto-immune au cours de laquelle
les propres défenses de l’organisme attaquent les cellules bêta du pancréas qui produisent l’insuline.
L’organisme devient alors incapable de fabriquer l’insuline dont il a besoin. Les causes du diabète de
type 1 ne sont pas clairement établies.

Le diabète de type 2 est la forme la plus courante de la maladie. Il touche généralement les adultes. Il
est observé aussi chez les enfants et les adolescents. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2,
l’organisme est capable de produire de l’insuline, mais soit la quantité produite est insuffisante, soit
l’organisme ne réagit pas à l’action de l’insuline, ce qui entraîne une accumulation de glucose dans le
sang. Les personnes atteintes de diabète de type 2 n’ont pas besoin de doses quotidiennes d’insuline
pour survivre. De nombreuses personnes parviennent à gérer leur maladie grâce à une alimentation
saine et à davantage d’activité physique ou à des médicaments pris par voie orale.

Le diabète gestationnel apparaît généralement à un stade plus avancé de la grossesse pour les femmes
qui développent une résistance à l’insuline, souvent vers la 24ème semaine. Un diabète gestationnel non
maîtrisé peut avoir des conséquences graves à la fois pour la mère et le bébé. Pour mener une vie
normale et saine en présence de diabète la combinaison d’une thérapie spécifique et quotidienne, d’une
surveillance étroite, d’une alimentation saine et de la pratique régulière d’une activité physique est
obligatoire.

Lorsqu’on est jeunes et en bonne santé, nous neutralisons les EOR et pouvons limiter les dégâts.
Les antioxydants sont des molécules naturellement présentes dans les aliments qui neutralisent des
particules extrêmement agressives, qu’on appelle radicaux libres. Ces radicaux libres, qui sont
fabriqués à chaque instant par le simple fait de respirer ou de s’alimenter, sont capables
d’endommager tous les constituants du vivant. Il arrive que les radicaux libres débordent les défenses
antioxydantes. Dans les autres cas comme le cas des personnes diabétiques, Le stress oxydant qui est
le déséquilibre entre la production d’EOR, et la capacité à neutraliser ces composés toxiques avant
qu’ils occasionnent des dégâts. Suite à ce déséquilibre les membranes cellulaires sont oxydées, les
protéines dénaturées, l’ADN bombardé, bref, l’organisme vieillit. Depuis quelques années, il est
possible de mesurer ce stress particulier, par un bilan biologique.

Devant l’augmentation considérable du nombre de personnes diabétiques et les effets secondaires des
médicaments antidiabétiques, de nombreux chercheurs ont évalué l’action pharmacologique des
plantes traditionnelles et donc leur intérêt en médecine traditionnelle. Actuellement, plus de 400

1
Introduction

plantes traditionnelles utilisées pour le traitement du diabète sucré ont été enregistrées, mais seulement
un petit nombre d’entre elles ont subi un enregistrement scientifique et une évaluation médicale afin de
confirmer leurs efficacités.

La Tunisie, riche par sa biodiversité et son climat, est une plate-forme géographique très importante
qui mérite d’être explorée dans le domaine de la recherche de molécules hypoglycémiantes et/ ou
antioxydantes originaires de plantes qui ont pour longtemps servi à une grande tranche de population
comme moyen incontournable de médication. C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés à étudier
le murier noir (Morus nigra L.), arbre introduit, s’est propagé autour de la Méditerranée dès
l’Antiquité. Dans les pharmacopées traditionnelles, cet arbre est utilisé pour propriétés purgative et
vermifuge, le jus des mures était autrefois prescrit pour traiter les affections buccales. Les feuilles de
M. Nigra sont utilisées en pharmacie pour leurs propriétés astringentes. Il a des propriétés laxatives et
antipyrétiques. Une décoction de feuilles, de fleurs ou de la racine peut être prise en gargarisme pour
le diabète. Les infusions de feuilles prises avant les repas permettront de diminuer significativement la
glycosurie, voire même la disparition. Il pourra être aussi utilisé en gemmothérapie.

2
Synthèse bibliographique

I.Diabète
1. La glycémie
La glycémie est le paramètre central dans le diabète; c’est le taux de glucose dans le sang. Un bon
contrôle glycémique est basé sur un régime alimentaire équilibré et hypocalorique, l’exercice physique
et le traitement médicamenteux (Ménat., 2005).

2. Le diabète

2.1. Généralité
Le diabète est une maladie fréquente, connue depuis fort longtemps, très répandue en ce début de
XXIème siècle. C’est une pathologie chronique, caractérisée par une hyperglycémie. Lorsque la
glycémie dans le sang, mesurée à jeun, devient supérieure à 1,26 g par litre, la personne est considérée
comme diabétique. Cette maladie est incurable, mais peut néanmoins être traitée efficacement
(Buysschaert et al., 1998 ; Raccah., 2004).
Le diabète est un désordre du métabolisme lipidique, glucidique et protéique attribué à la production
diminuée de l'insuline ou à une résistance anormale à cette hormone qui entraîne une hausse du taux de
glucose.
On distingue plusieurs types de diabète :
Le diabète insulinodépendant (DID) ou diabète de type 1: Concerne le plus souvent les enfants,
mais il peut survenir à tout âge. Le diabète de type 1 est dû à une destruction auto-immune des cellules
insulino-sécrétrices dites cellules B jusqu'à 90% de leur quantité normale (causes auto-immunes ou
idiopathiques). Il est lié à un déficit en insuline. Cette réaction auto-immune survient sur un terrain de
susceptibilité génétique à la suite de facteurs déclenchant et peut être dépistée avant l’apparition de
l’hyperglycémie par des dosages sanguins d’auto-anticorps (Raccah., 2004; Calop et al., 2008).
Le diabète non insulinodépendant (DNID) ou diabète de type 2: résulte de la conjonction de
plusieurs gènes de susceptibilité, dont l’expression dépend de facteurs d’environnement, au premier
rang desquelles, la consommation excessive de graisses saturées et de sucres rapides, et la sédentarité.
Ce type de diabète débute généralement après l'âge de 40 ans et représente 90% de l'ensemble des cas
mondiaux. Il résulte de l'incapacité de l'organisme à réagir correctement à l'action de l'insuline.
L’insuline est soit basse ou soit élevée (insulinorésistance prédominante ou Insulinopénie
prédominante). L’insulino-déficience responsable de l’hyperglycémie du diabète de type 2 est
précédée par 10 ou 20ans, d’hypersécrétion insulinique (hyperinsulinisme) secondaire à une insulino-
résistance des tissus périphériques. L’anomalie métabolique fondamentale qui précède le DNID est
l’insulinorésistance (Raccah., 2004; Calop et al., 2008).

3
Synthèse bibliographique

En l'absence de traitement, Les personnes atteintes de diabète sont exposées à un risque de développer
divers problèmes de santé invalidants : polydipsie, polyurie, asthénie, polyphagie, amaigrissement ou
obésité, et des troubles de la conscience aboutissant à un coma mortel (Buysschaert et al., 1998).
Une glycémie en permanence élevée peut être à l’origine de maladies graves touchant le système
cardiovasculaire, les yeux, les reins et les nerfs. En outre, les personnes atteintes de diabète sont
davantage exposées aux infections. Le diabète se reconnaît par une élévation chronique de la
glycémie.
Le diabète est la cause principale de nouveau cas de cécité chez des adultes diabétiques entre 30 et
75ans. La mortalité imputable au diabète varie de 8,6 % de tous les décès d’adultes âgés entre 20 et
79ans dans la région Afrique à presque 15,8 % dans la région Pacifique occidental. Au moins la moitié
de toutes les personnes décédées du diabète avait moins de 60ans. Le diabète est une cause majeure de
mortalité à travers le monde. Les diabétiques au-delà de 65ans sont deux fois plus souvent hospitalisés
pour des problèmes liés au fonctionnement des reins que les personnes non atteintes. Dès lors, des
investissements dans la réduction de ce fardeau sont justifiés et nécessaires (ATLAS du DIABÈTE de
la FID 6e édition).

2.2. Le pancréas et l’insulino-sécrétion

Bien que les apports de glucose soient très variables dans le temps, la glycémie reste toujours comprise
entre 0.7 et 1.2 g/l. Cette régulation est assurée par les sécrétions endocrines du pancréas qui pénètrent
dans le flot sanguin par la veine mésentérique. Le pancréas est une glande double, à la fois exocrine et
endocrine, située dans une anse du duodénum. Les sécrétions de l’insuline rejoignent la circulation
sanguine via le foie (Nelson et Cox., 2004).
Le pancréas sécrète plusieurs hormones :

2.2.1. L'insuline

Hormone peptidique synthétisée dans les glandulaires des îlots de langerhans ou cellules Bêta.
L’incapacité de ces cellules à produire suffisamment l’insuline, entraîne un diabète. Cette fragilité
intervienne dans les mécanismes qui conduisent à la destruction de la cellule bêta, sous l’effet d’agents
diabétogènes, comme l’Alloxane. Au niveau des cellules cibles, cette hormone facilite la pénétration
du glucose dans les cellules en augmentant la perméabilité de leur membrane via des récepteurs au
glucose exemple GLUT 4. Au niveau du foie, elle stimule la glycogénogenèse. La capacité, plus ou
moins grande, de l’insuline à favoriser l’utilisation du glucose par les tissus périphériques définit le
degré de sensibilité à l’insuline d’une personne (Malaisse et al., 1982 ; Oberley., 1988).

4
Synthèse bibliographique
2.2.2. Le glucagon

Cette hormone est connue depuis 1923 mais considérée comme antagoniste de l’insuline, et donc
hyperglycémiante Cette hormone agit en stimulant la glycogénolyse hépatique. Le glucagon est un
polypeptide de 29 acides aminés appartenant à la famille des sécrétines synthétisée par les cellules α.

2.2.3. La somatostatine

Cette hormone, synthétisée et sécrétée par de nombreuses cellules, exerce un contrôle inhibiteur sur la
sécrétion de nombreuses autres hormones pancréatiques, intestinales et hypophysaires. Dans le
pancréas, elle est synthétisée par les cellules γ dont le rôle est hyperglycémiant. Chez les mammifères,
l'organisme contrôle l'équilibre entre la consommation cellulaire du glucose et sa production endogène
hépatique et les apports exogènes. Les facteurs hormonaux comme l'insuline et le glucagon, des
neurotransmetteurs et autres molécules participent à la régulation du métabolisme glucidique afin de
maintenir l'homéostasie.

3. Diabète gestationnel
Cette forme de diabète est généralement transitoire et disparaît dans les semaines suivant
l’accouchement. Les femmes qui ont souffert du diabète gestationnel risquent davantage de développer
un diabète type 2 par la suite (Naylor et al., 1997).

4. Le diabète secondaire (spécifique)


Le diabète peut être secondaire à une pancréatopathie (pancréatite chronique ou aiguë, tumeur,
l’hémochromatose), à diverses endocrinopathies (phéochromocytomes, acromégalie, syndrome de
Cushing, hyperthyroïdie, tumeurs endocrines pancréatiques et digestives) à des dysfonctionnements
d’origine génétique des cellules β. Il peut être aussi à l’origine des médicaments, des composés
chimiques ou composés toxiques.

II. Le stress oxydant

1. Définition
Dans les systèmes biologiques, l’énergie nécessaire au fonctionnement cellulaire se fait de façon
aérobie en utilisant des réactions d’oxydoréduction. Ce qui nécessite l’utilisation des oxydants et des
réducteurs au cours de la chaine respiratoire de la mitochondrie.
2. Les pro-oxydants
Le stress oxydant est la conséquence d’un déséquilibre dans la production des radicaux libres. Ils
peuvent engendrer des dommages importants sur la structure et le métabolisme cellulaire en dégradant

5
Synthèse bibliographique

de nombreuses cibles : protéines, lipides et acide nucléiques. Les radicaux libres sont une forme
particulière d’espèces chimiques qui possèdent un électron célibataire (Wolin., 1996; Wassmann et al.,
2004; Wolin et al., 2005 ; Angelos et al., 2005).
Il existe, dans la cellule, des oxydants très puissants, qu’ils soient des radicaux libres ou non. Par
exemple, des oxydants chlorés (HOCl) qui sont libérés par les macrophages et ont une activité
bactéricide importante, le monoxyde d’azote (NO) est un radical libre qui est surtout réputé pour ses
propriétés physiologiques. Le NO interagit avec l’anion superoxyde pour donner le peroxynitrite,
composé extrêmement réactif et toxique. NO et peroxynitrite interagissent avec des protéines et
peuvent altérer leurs propriétés (Barouki, Morel., 2001).
La membrane plasmique et le réticulum endoplasmique sont les sièges principaux de libération
d’ERO. Le radical anion superoxyde O2• est la forme réduite de l'oxygène moléculaire par la réception
d'un électron, c'est le premier radical formé lors du transport des électrons au niveau de la Chaine
respiratoire.
La principale source est l'explosion oxydative des cellules phagocytaires entrées en contact avec des
antigènes ou des immun-complexes O2 + e- => O2•. L’anion superoxyde O2• joue un rôle très important
dans la génération d'autre radicaux libres tels que Le peroxyde d'hydrogène H2O2, le radical hydroxyle

OH, et l'oxygène singulet O2•. L’anion superoxide capable de réagir avec l'oxyde nitrique pour former
le peroxynitrite (ONOO–) qui est capable de donner par la suite des composes très toxiques comme le
radical hydroxyle et le dioxyde nitrique. ONOO– + H+ → •OH + NO2•
Le peroxyde d'hydrogène H2O2 n'a pas d'électrons non appariés et n'est donc pas un radical. A pH
physiologique, tout ion peroxyde formé va se protoner pour donner immédiatement du peroxyde
d'hydrogène. Au bilan, le peroxyde d'hydrogène est produit à partir du radical superoxyde en solution
aqueuse. Cet ion provoque la dismutation de l'eau pour former du peroxyde d'hydrogène. Cet ion
provoque la dismutation de l'eau pour former du peroxyde d'hydrogène et du dioxygène. Cette réaction
est catalysée par le superoxyde dismutase : 2O2• + 2H+ => H2O2 + O2. Le peroxyde d'hydrogène est un
produit plus stable que les produits qui lui donnent naissance, ainsi sa réactivité est moins importante.
La nature non ionique de cette molécule lui permet de traverser facilement les membranes cellulaires
et ainsi de diffuser très facilement d'où une possibilité d'action à distance. Malgré une réactivité moins
importante, le peroxyde d'hydrogène est un oxydant très puissant. Grâce à la myeloperoxydase des
polynucléaires neutrophiles, le peroxyde d'hydrogène est couplé à un ion chlorure pour donner
l'hypochlorite, un agent bactéricide (Halliwell., 1997; Stief., 2000).
D’autres molécules comme les hydroquinones se retrouvent sous forme de radicaux libres après leur
réaction avec le radical •OH. Elles sont ainsi susceptibles de diffuser dans la cellule et d’oxyder
d’autres molécules à distance, propageant ainsi une chaîne de réactions radicalaires (Beaudeux et
Vasson., 2001). Le radical hydroxyle •OH est le radical le plus dangereux dans l'organisme, il est
6
Synthèse bibliographique

formé de la réaction de l'anion superoxide avec l'hydrogène peroxyde O2 • + H2O2 →• OH + -OH + O2.
Ainsi la fission homolytique de la liaison O-O du peroxyde d'hydrogène donne deux radicaux
hydroxyles. (Vergely et al., 2003) Fe2+ + H2O2 => Fe3+ + •OH + -OH Le radical Hydroxyle réagit avec
les lipides, polypeptides, protéines, et ADN, spécifiquement la thiamine et la guanosine (Ashok et Ali.,
1999).

3. Systèmes de défense antioxydant


Les cellules possèdent des mécanismes de défense endogènes enzymatiques et non enzymatiques qui,
de manière générale, suffisent à renverser le stress oxydant, résultant du métabolisme aérobie, appelés
antioxydants. Un antioxydant peut être défini comme toute substance qui est capable, à concentration
relativement faible, d'entrer en compétition avec d'autre substrat oxydables et ainsi retarder ou
empêcher l'oxydation de ces substrats (Droge., 2002; Wassmann et al., 2004).

3.1. Antioxydants enzymatiques


3.1.1. Superoxyde dismutase

Superoxyde dismutase est la plus importante enzyme antioxydante dans la défense contre le stress
oxydatif trois espèces d'enzymes ont été distinguées ; la SOD contenant du cuivre et du zinc (Cu,
znsod), avec le cuivre comme catalyseur actif, du manganèse (mnsod), et le SOD contenant de fer
(fesod). Récemment, un nouveau superoxyde dismutase contenant du nickel (nisod), a été purifié à
partir de plusieurs espèces de Streptomyce (Anderson et al., 1997; Wuerges et al., 2004).

3.1.2. Catalase

La Catalase est une enzyme responsable de la détoxification du peroxyde d'hydrogène produit dans les
conditions physiologiques l'activité catalytique de la catalase est très élevée et estimé comme
200000/sec par site catalyseur (Ye-Shih et al., 2004; Niki et al., 2007). 2H2O2 → O2 + 2H2O

3.2. Antioxydants non enzymatiques


Certaines substances ont la propriété de piéger et de détruire les espèces réactives de l’oxygène. Il
s’agit de composés facilement oxydables présents dans le cytoplasme (glutathion, acide ascorbique) ou
dans les membranes cellulaires (alpha-tocophérol, caroténoïdes).

3.2.1. Vitamine E

Sous le terme vitamine E est regroupée la famille des tocophérols (α, β, δ, γ). Le caractère hydrophobe
de la vitamine E lui permet de s’insérer au sein des acides gras de la membrane cellulaire et des
lipoprotéines, où elle joue un rôle protecteur en empêchant la propagation de la peroxydation lipidique
induite par un stress oxydant.
7
Synthèse bibliographique
3.2.2. Vitamine C (acide ascorbique)

C’est l’un des principaux antioxydants hydrosolubles présent dans les fluides intra- et extracellulaires.
La vit C peut directement réagir avec des espèces réactives de l’oxygène comme HO• ou O2•. Elle peut
recycler l’α-tocophérol pour aider à prévenir l’oxydation des lipides (Vertuani et al., 2004).

3.2.3. Glutathion

Le glutathion est un tripeptide, dont les propriétés réductrices et nucléophiles jouent un rôle majeur
dans la protection contre les altérations oxydantes des lipides, des protéines et des acides nucléiques.
En situation de stress oxydant, son rôle protecteur et détoxifiant réside principalement dans sa fonction
de co-substrat des glutathion peroxydases. Mais il fait aussi l’objet d’interactions synergiques avec
d’autres composants du système de protection antioxydante tels que la vit C, la vit E et les
superoxydes dismutases (Gerard- Monnier et Chaudiere., 1996; El-massry et al.,2003).

III. Diabète et stress oxydatif

Figure 1: Relation entre hyperglycémie et stress oxydant (Bonnefont-Rousselot., 2004)

Dans le diabète, il a été observé à la fois une augmentation de la production des radicaux libres et une
diminution des défenses antioxydantes, conduisant à une augmentation des marqueurs du stress
oxydant dans les différents tissus à la fois dans le cas de diabète expérimentale ou pour les patients
diabétiques, l'hyperglycémie induit une surproduction d'anion superoxyde , qui est l'une des espèces
réactives de l'oxygène qui peut endommager les cellules dans de nombreuse voies à travers le stress
oxydatif, en l'absence d'une compensation appropriée de la réponse des réseaux antioxydants

8
Synthèse bibliographique

endogènes des cellules, le système est débordé, entraînant un déséquilibre d'oxydoréduction, ce qui
aggrave encore la situation (Korshunov et al.,1997).
Les espèces réactives de l'oxygène généré lors de l'hyperglycémie causent principalement des
dommages de l'ADN, des protéines et des lipides. En plus il est évident que dans le diabète de type 2,
l'activation des voies de stress sensible par l'élévation du glucose et des acides gras conduit à deux
niveaux de résistance à l'insuline et une diminution de la sécrétion d'insuline et la dysfonction des
cellules B sécrétrice de l'insuline (Evans et al., 2003).
La fonction et l’activité des protéines peuvent être affectées par altération de leur structure complexe,
en particulier par oxydation. En effet, les protéines peuvent se fragmenter ou se dénaturer avec
altération de leurs structures primaires et secondaires. En général, les protéines oxydées sont inactives
et sont rendues vulnérables à l’action des protéases. Lors d’un stress oxydatif important, les cellules
sont incapables d’éliminer par protéolyse les protéines oxydées accumulées, ce qui conduit aux dégâts
protéiques observés dans le diabète. Les deux principaux marqueurs biologiques de l’oxydation des
protéines sont la formation de carbonyles protéinés et de groupes nitrotyrosines. Les carbonyles
protéinés sont formés lorsque les espèces réactives de l’oxygène attaquent les résidus d’acides aminés.
Les lipides, principalement les acides gras polyinsaturés, peuvent subir une attaque radicalaire, par le
radical hydroxyle (•OH), capable d’arracher un hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles
liaisons pour former un radical diène conjugué, oxydé en radical peroxyle. Une réaction en chaîne se
produit conduisant à la transformation du radical peroxyle, au contact d’un autre acide gras, en un
nouveau radical diène conjugué. Les radicaux diènes conjugués, sous l’action de l’oxygène, se
transforment en hydroperoxydes qui peuvent, soit être réduits et neutralisés par la glutathion
peroxydase, soit continuer à s’oxyder et à se fragmenter en aldéhydes, acides et alcanes volatiles
(Rémita., 2001).
Les principaux marqueurs de la peroxydation lipidique sont les substances réagissantes aux
malonaldéhyde/acide thiobarbiturique, les diènes conjugués, les hydroperoxydes lipidiques et les
isoprostanes. Cette attaque des lipides peut concerner aussi bien les phospholipides (PL) membranaires
que les lipoprotéines circulantes, avec des conséquences différentes. En effet, l’atteinte des PL
entraîne une modification de la fluidité membranaire, altère les systèmes de transfert d’ions, ainsi que
le fonctionnement de nombreux transporteurs, récepteurs et affecte les voies de transduction des
signaux. L’attaque des lipoprotéines circulantes, notamment des LDL, aboutit à leur oxydation, puis
leur captation par les macrophages pour donner des cellules spumeuses à la base du dépôt lipidique de
la plaque d’athérome (Breton et al., 2003; Favier., 2003; Peynet et al., 2005).
L'élévation de la concentration des métaux de transition comme celle du cuivre ou de fer joue un rôle
dans le stress oxydatif lies au diabète car ils catalysent la réaction de formation des radicaux libres.

9
Synthèse bibliographique

D’autre part, il y a une carence en zinc chez le diabétique, cet élément joue un rôle principale dans
l'activité de la SOD (Janet et al., 2005).
IV. Le mûrier noir

1. Etude botanique

Le mûrier noir (Morus nigra L.) Est un arbre fruitier originaire d’Asie occidentale introduit et s’est
propagé autour de la Méditerranée dès l’Antiquité, apprécié pour ses fruits et sa culture utilisé comme
arbre ornemental.

1.1. Systématique

Figure 2: Morus nigra L. (source: atlas des plantes de France et jardin-secrets)

Tableau 1 : Classification botanique de Morus nigra L.

Règne Plantea

Division Magnoliophyta

Classe Magnoliopsida

Ordre Urticales

Famille Moraceae

Genre Morus

Espèce Morus nigra L.

10
Synthèse bibliographique
1.2. Description botanique

Le mûrier est un arbre de taille moyenne, de croissance rapide (mûrier blanc) ou lente (mûrier noir).
Avec l’âge, son tronc devient noueux et remarquable. Ses feuilles caduques, dentées et
parfois lobées, cordiformes, renferment un suc laiteux. Le mûrier est le dernier arbre à se feuiller ;
aussi, est-il l’emblème de la sagesse et de la prudence car cette feuillaison tardive lui évite d’être
atteint par les gelées tardives.
C’est un arbre monoïque à une grande longévité, le mûrier noir peut vivre jusqu'à 120ans,
devenant noueux et très pittoresque avec l'âge. Le Tronc est court, rugueux, noirâtre. Les rameaux sont
gros, duveteux et dépourvus de bourgeon terminal en hiver.
Les feuilles sont caduques, alternes, polymorphes, souvent à la fois lobées et non lobées sur le même
arbre ou le même rameau, toujours dentées. Le Pétioles est court de 1à 3cm, renfermant un suc laiteux.
Les fleurs sont petites, unisexuées, et en épis les mâles se sont composés de 4 étamines,
en chatons courts, pendants et verdâtres à la base, les femelles sont en pseudo-épis verdâtres,
au milieu des pousses de l'année. La pollinisation est anémophile. Les Fruits sont de type
drupe entourée d'un périanthe charnu, de couleur rouge foncé presque noir, d'un goût sucré légèrement
acidulé et d'un parfum agréables. (Tela Botanica)

2. Ecologie de l’arbre et répartition


Le genre Morus, appartenant à la famille des Moracées, est composé d’une dizaine d’espèces
originaires des régions tempérées et chaudes de l’hémisphère Nord, principalement l’Extrême-Orient
(Mongolie, Chine, Corée…), l’Asie occidentale et l’Amérique du Nord Originaire. Il s’agit d’arbres
dont certains sont cultivés pour leurs fruits (les mûres) ou leurs feuilles, qui servent de nourriture au
ver à soie. Certaines espèces sont largement cultivées, notamment le mûrier blanc, naturalisé sur tous
les continents. Le mûrier pousse très bien sur la côte atlantique, et jusqu’en Alsace. Généralement, on
conseille de le planter dans la zone où pousse la vigne. Il supporte mal les embruns, mais résiste au
vent et tolère la pollution urbaine. Le murier noir est originaire d’Asie occidentale (sud du Caucase,
Arménie et Iran), introduit en Europe par les Grecs et les Romains pour ses fruits. (Source : World
Agroforestry Centre).

3. Utilisation et composition chimique


En raison de la valeur nutritive, le mûrier noir (Morus nigra L.) est consommé à la fois aussi frais et
transformés. Les constituants liés à la santé de mûrier sont les composés phénoliques totaux (l'acide
chlorogénique), les flavonoïdes (rutine), les anthocyanes (cyanidine-3-o-glucoside) et la capacité
antioxydante.
L’écorce et la racine du mûrier noir entraient dans la pharmacopée provençale traditionnelle comme
vermifuge et purgatif tandis que les sirops de fruits à base de mûres étaient employés contre les

11
Synthèse bibliographique

angines et les aphtes et les feuilles de mûrier sont aussi utilisées pour ses propriétés thérapeutiques
dans la pharmacopée traditionnelle (Source: Futura Science), Les feuilles de mûrier sont utilisées
depuis très longtemps pour leurs diverses propriétés et composants, au Japon notamment. Selon des
recherches scientifiques et tests entrepris, la feuille de mûrier est riche en calcium, magnésium,
potassium, sulfate, zinc, acide asparic, adénine, vitamines A, B1, B2, C et en acides aminés. Ils sont
également riches en :
- Fibres
- Flavonoïdes
Les flavonoïdes sont responsables de la couleur variée des fleurs et des fruits et représentent une
source importante d'antioxydants dans notre alimentation.
Ils forment une sous-classe des polyphénols.
- Les polyphénols qui prennent une importance croissante, notamment grâce à leurs effets bénéfiques
sur la santé. En effet, leur rôle d’antioxydants naturels suscite de plus en plus d'intérêt pour la
prévention et le traitement du cancer, des maladies inflammatoires, cardiovasculaires et neuro
dégénératives.
- Phytosterol naturels sont des analogues structuraux du cholestérol qui permettent, lorsqu'ils sont pris
avant les principaux repas de diminuer l'absorption du cholestérol alimentaire ce qui permet d'abaisser
d'environ 10 à 15 % le taux sanguin de LDL-cholestérol (mauvais cholestérol).
Il a également été rapporté que la feuille de mûrier contient du DNJ (Deoxynomycin), qui aide à
réduire le taux de sucre dans le sang. GABA (Gamma Amino Butyric Acid), qui contrôle l’équilibre de
la tension artérielle. (tisane-murier.simdif.com)
Il y a des études rapportant aussi les activités antioxydant (Choi et al., 2013), anticancéreux (Dat et
al., 2010), hypoglycémique (chung et al, 2013), anti-obésité (Tsuduki et al., 2013), antimicrobien
(Omidiran et al., 2012) et les activités de la vasodilatation. En outre, les composés chimiques de Morus
nigra L., y compris l'acide bétulinique, β -sitostérol et de germanicol, peuvent être responsables de
l'effet anti-inflammatoire (Xia et al., 2008). Les arbres sont assez résistants au vent avec quelques
cultivars utilisés comme brise-vent. (Source : World Agroforestry Centre).

12
Objectifs

L’inclinaison récente à travers le monde pour la consommation de composés naturels a extrêmement


augmenté l'importance de la qualité persistante de matières végétales. Par conséquent, il y a une
préoccupation scientifique escalade de l'impact de la répartition géographique des plantes sur leurs
constituants chimiques, caractéristiques physiques et activités biologiques. Le présent travail s’inscrit
dans le cadre de la valorisation de ressources végétales de la région du Nord-Ouest (N-O) de la Tunisie
aussi bien que la vérification scientifique de leurs effets empiriques. Cette étude s’intéresse au
l’activité antidiabétique et antioxydante de l’extrait de cet arbuste chez des rats sains et des rats rendus
diabétiques par l’alloxane. Pour réaliser cette étude nous nous sommes intéressés à :

 Etude phytochimique de l’extrait totale des feuilles de murier.


 Détermination de l’activité antioxydante in vitro et in vivo.
 Etude de l’effet antidiabétique chez le rat.

13
Matériel et méthodes

I. Matériel
1. Agents, réactifs et appareillage

1.1. Agents et réactifs

Butylhydroxytoluène (BHT), acide trichloroacétique (TCA), trishydroxyméthylamino-méthane (Tris),


acide thiobarbiturique (TBA), 5,5'-Dithiobis-(2-acide nitrobenzoique) (DTNB), acide chlorhydrique
(HCL), réactif de Folin-Ciocalteu, sérum de veau, acide ascorbique, sulfasalazine, méthanol, EDTA,
bicarbonate de sodium (Na2CO3), chlorure de sodium (NaCl), ovalbumine; proviennent de Sigma®.
Les réactifs utilisés sont les suivants :
Tampon Tris-NaCl (50mm, pH7,4) pour l’homogénéisation des organes, Tampon phosphate (50mm,
pH10,2) pour le dosage de la SOD, Tampon phosphate (50 mm, pH7) pour le dosage de la CAT,
Solution physiologique (NaCl 9%°).

1.2. Appareillages

 Spectrophotomètre visible de paillasse de type JENWAY Genova


 Centrifugeuse de type Allegra 64 R, BECKMAN COULTER
 Homogénéisateur de type potter
 Mixeur de type Waring commercial Blender
 Balance de précision Denver série S-603 (précision 0.001 g et max = 600 g)
 Vortex de type Nahita
 Agitateur magnétique chauffant Isotemp
 Bain-marie
 pH mètre
 Etuve de type Roucaire

2. Matériel biologique
2.1. Matériel végétal

Les feuilles de mûrier noir (Morus nigra L.) sont récoltées de la région de Béja plus précisément la
région de Djebel Menchar Béja nord de dont l’altitude 287 mètres, la latitude est 36°43‘59"N, et la
longitude est 9°19‘0"E. La récolte est réalisée au mois du Juin.

2.2. Animaux

Les études ont été réalisées sur des rats Wistar (SIPHAT, TN), mâles de poids moyen 200 ± 50 g et
âgés d’environ 20semaines. Les animaux ont été logés pendant 1 mois dans l’animalerie du laboratoire

14
Matériel et méthodes

afin de les adapter aux nouvelles conditions environnementales afin d’acquérir un nombre d’animaux
suffisant à notre étude. Les animaux ont été élevés dans une animalerie dans des conditions
standardisées. En effet, Les animaux ont été placés dans des cages en polycarbonate (à raison de 3par
cage maximum). Ils ont libre accès à l’eau et à l’alimentation standard pour rongeurs (BADR, Utique, TN).
La température de l’animalerie est maintenue à 22 ± 2°C, Le degré d’hygrométrie est fixé à 80 ± 2%. Les
rats sont soumis à une stricte alternance jour/nuit de 12h/12h à l’aide d’un régulateur automatique de
photopériode. De cette façon, les animaux sont à l’abri de toute perturbation de leur rythme circadien.
Avant d’entamer toute expérience, les rats sont pesés et répartis en six groupes de 10 rats. Les cages
sont en polypropylène munis d’un grillage en acier inoxydable et d’un biberon en plastique.
Tous les animaux reçoivent un régime alimentaire équilibré et standardisé sous forme de bouchons.
Pendant la période d’adaptation et durant l’expérience, l’alimentation et l’eau (administrée à l’aide de
biberons) sont fournies ad-libitum.
Nous avons pris la précaution de manipuler nos animaux quotidiennement, à la même heure, afin
d’éviter tout stress le jour du sacrifice. En effet, d’après Loybert et al., (1997), les rats manipulés
chaque jour présentent des teneurs en corticostérone plasmatique et surrénalienne plus faibles que
celles des animaux non manipulés.

II. Méthodes
1. Préparation et utilisations de l’extrait murier noir
Après avoir séparé les tiges des feuilles, ces dernières ont été séchées dans l’air libre pendant 72heures
à l’obscurité. Ensuite, la matière sèche a été rigoureusement broyée dans un mixeur électrique. La
poudre ainsi obtenue sera ultérieurement utilisée pour la préparation de l’extrait.
L’extrait de murier (MCMû) a été préparé par une macération chaude. Le mode opératoire peut être
résumé comme suit; on ajoute 10g de poudre dans 200 ml d’eau distillée et on laisse porter l’ensemble
sous agitation magnétique à 40°C durant 24heures. On filtre l’homogénat sous pression. Et on
centrifuge le filtrat à une vitesse de 10.000g à 4°C pendant 10minutes.
Le surnageant a été récupéré dans des tubes en verre à l’abri de la lumière pour éviter les phénomènes
d’oxydation et de dégradation des molécules bioactives. L’extrait sera utilisé pour le traitement des
animaux.

2. Dosage des polyphénols


La concentration des extraits en polyphénols totaux est estimée par spectrophotométrie moyennement
le réactif de Folin-ciocalteu qui est une solution d'acide contenant des ions complexes polymériques
issus d'un mélange de phosphotungstate et de phosphomolybdate (Singleton et Rossi., 1965). En
effet le caractère réducteur des composés phénoliques et leurs complexassions possible avec les

15
Matériel et méthodes

métaux lourds contenus dans l'agent oxydant conduisent à la formation de complexes colorés bleu qui
absorbent dans le visible à la longueur d'onde λ = 760nm.
Ce dosage est une estimation rapide de la teneur en poly phénols totaux (Skerget et al., 2005). En
effet, 25µL de l'extrait éthanolique sont mélangés à 125µL de réactif de Folin-ciocalteu, 2mL d'eau
distillée et finalement 375µL de carbonate de calcium (Na2CO3) à 10%. Le mélange est incubé
pendant 2h à une température de 37°C à l'obscurité. La mesure de la densité optique est réalisé contre
un blanc constitué de {25µL d'éthanol, 125µL de réactif de Folin-ciocalteu, de 2mL d'eau distillée et
375µL de carbonate de sodium (10%)}.
Cette méthode permet d'avoir une approximation de la teneur de l'extrait en phénols qui sera exprimé
par rapport à un composé de référence (acide gallique). La gamme d'étalon est préparée avec l'acide
gallique comme suit:
A partir des solutions d’acide gallique (S1 = 10µg/ml, S2 = 5µg/ml, S3 = 2,5µg/ml, S4 = 1,25µg/ml,
S5 = 0,625µg/ml et S6 = 0,3125µg/ml) préparées dans un mélange (50/50) d'eau et d'éthanol, On
prélève 25μL de chaque solution et on l'introduit dans des tubes numérotés respectivement (T1, T2,
T3, T4, T5 et T6), puis on ajoute à chaque tube et dans l'ordre 125μL de réactif de Folin, 2mL d'eau
distillée, après 5 minutes de repos, on additionne 375μL de carbonate de sodium (10%), et on
maintient le système à 37°C pour une incubation durant 2heures. On mesure la densité optique de
chaque étalon contre le même blanc: {25µL d'éthanol, 125µL de réactif de Folin-ciocalteu, de 2mL
d'eau distillée et 375µL de carbonate de sodium (10%)} à la longueur d'onde λ = 760nm.

3. Dosage de l’activité antioxydante par la méthode du DPPH


Le DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrtazyl) est un radical synthétique présentant, à l’état oxydé, une
intense coloration violette. La couche électronique de ce radical est saturée en contact d’antioxydants,
ce qui explique la disparation de sa coloration. Cette décoloration explique le pouvoir de l’extrait de
la plante à piéger ce radical qu’on peut détecter par spectrophotométrie.
 2.5mg de DPPH dans 10ml de méthanol est préparée à l’avance (au moins 1-2heures).
Stabiliser la densité optique à une longueur d’onde égale à 0.72nm.
 Un aliquote de 1ml de l’extrait de concentration initiale 50mg/ml à différentes concentrations
(25mg/ml, 12,5mg/ml, 6,25mg/ml, 3,125mg/ml, 1,6mg/ml, 0,8mg/ml, 0,4mg/ml) a été
mélangé avec 25µl d’une solution de DPPH. Après une agitation vigoureuse. L’absorbance a
été mesurée à 517nm.
Pour chaque concentration, le test a été répété trois fois. L’activité antiradicalaire a été estimée en
pourcentage d’inhibition moyennant la formule suivante:
PI = (DO témoin - DO extrait / DO témoin) ×100
PI: Pourcentage d’inhibition.
16
Matériel et méthodes

DO témoin: absorbance du témoin négatif.


DO extrait : absorbance de la solution de l’extrait.

4. Dosage de l’activité antioxydante par la méthode de l’ABTS


La méthode de radicale ABTS est l'un des tests les plus utilisés pour la détermination de la
concentration des radicaux libres. Il est basé sur la neutralisation d'un radical-cation résultant de la
mono électronique oxydation du chromophore synthétique 2,2'- azino-bis (3 - éthylbenzothiazoline -6-
sulfonique acide) ABTS. Cette réaction est suivie par spectrophotométrie par la variation de spectre
d'absorption (Jiri et al., 2010).
Le radical cation ABTS est généré en mélangeant à volume égal une solution de 3mM de persulfate de
potassium K2S2O8 et une solution stock d'ABTS à 8mM, le tout est conservé à l'abri de la lumière et à
la température ambiante durant 16 h avant utilisation (Awika et al., 2004). La solution obtenue est
diluée avec du tampon phosphate (0,2M, pH7,4) contenant 150mM de NaCl pour obtenir une
absorbance de 1,5 à 734nm. 2,9ml de cette solution fraichement préparée sont ajoutés à 0,1ml d'extrait
et la lecture est faite à 734nm après 30min pour chaque série d'analyses. L’acide ascorbique est utilisé
comme standard. (Ba C et al., 2010).
Le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule suivante:
Pourcentage inhibition (%) = [(Abs témoin - Abs blanc)] / (Abs témoin)] x 100
Abs témoin: l'absorbance du radical ABTS+ méthanol.
Abs blanc: l'absorbance de l'échantillon ABTS radical + Extrait / standard (Adeolu A et al.,2008).

5. Protocole expérimental
5.1. Induction du diabète

L’induction du diabète a été effectuée par la technique d’alloxane. Ce dernier provoque la destruction
des cellules pancréatiques notamment les cellules β, ce qui induit une insulinopénie et une
hyperglycémie grave.

5.2. Choix des doses

Les doses utilisées ont été choisi en se basant sur la bibliographie (100mg/kg, 250mg/kg et 500mg/kg
de PC/jours durant 21jours).

5.3. Traitement des animaux et groupes expérimentaux

Le protocole expérimental adopté pour cette étude repose sur l’administration, par gavage, à des rats
préalablement adaptées aux conditions stables de l’animalerie l’extrait total des feuilles du murier. Les
rats reçoivent l’extrait par gavage qui se fait quotidiennement à la même heure entre 9heures et

17
Matériel et méthodes

10heures du matin durant 21jours. L’administration par gavage de l’extrait est réalisée à l’aide d’une
sonde introduite directement dans l’œsophage de l’animal jusqu'à l’estomac.

Six lots de rats sont utilisés dans ce travail :


Allox + Allox + Allox +
Contrôle Alloxane Allox+Db
MCMû 100 MCMû 250 MCMû 500

Induction H2O Allox Allox Allox Allox Allox


du Diabète

Traitement Mûrier (100 Mûrier (250 Mûrier (500 Diabinile


aigu (21 H2O H2O mg/kg, PC, mg/kg, PC, mg/kg, PC,
jours) 09h:00 p.o.) p.o.) p.o.) (5mg/kg)

21èmeJour Sacrifice, Récupération du Sang et Prélèvement Des Organes (foie, rein et pancréas)

5.4. Sacrifice et prélèvement des échantillons

Le jour du sacrifice, après 21jours de traitement les rats sont décapités sans anesthésie préalable entre
9 heures et 10heures du matin afin d’éviter toute variation du rythme nycthéméral (Seggie et al.,
1974). En fait, nos rats sont privés d’alimentation et d’eau 18heures avant le sacrifice afin de détecter
toute variation de la glycémie (Abdollahi et al., 1974).
Prélèvement des échantillons sanguins
Immédiatement après la décapitation, le sang artério-veineux du cou des animaux des différents
groupes expérimentaux a été prélevé dans des tubes à hémolyse contenant: de l’Acide Ethylène
Diamine Tétra Acétique (EDTA) pour le dosage des paramètres hématologiques.
Prélèvement des échantillons tissulaires
Après le sacrifice, une laparotomie a été effectuée pour prélever le foie, le rein et le pancréas. Ces
organes ont été immédiatement plongés dans le sérum physiologique (0,9%) maintenu à 2°C, afin
d’arrêter toute activité catabolique.
Les organes prélevés ont été ensuite pesés à l’aide d’une balance de précision (0,001g), afin de
déterminer le poids absolu. Un fragment de 0,4g de chaque organe est prélevé, homogénéisés dans 4ml
de PBS (phosphate Buffer Saline, pH=7,4) et broyés à l’aide d’un mortier. On procède ensuite à une
centrifugation à 3000g. Le surnageant ainsi obtenu est fractionné en aliquotes dans des tubes
eppendorfs et conservé à -80°C. Il a servi aux dosages des différents paramètres du stress oxydant et
au dosage des protéines tissulaires.

18
Matériel et méthodes
6. Dosages biochimiques
6.1. Détermination de la glycémie

Le dosage du glucose est effectué le même jour du sacrifice à l’aide d’un kit fourni par les laboratoires
Biomagreb. Ce paramètre a été déterminé par une méthode enzymatique. Le glucose présent dans
l’échantillon donne, selon les réactions couplées décrites ci-dessous, le quinonéimine qui est un
complexe coloré en rose et quantifiable par spectrophotométrie à 505nm.
Glucose oxydase
Glucose + O2 + H2O Acide gluconique + H2O2

Peroxydase
2H2O2 + 4 Amino-antipyrine + Phénol Quinonéimine + 4H2O

On prend 10µl de la solution standard on les ajoute à 1 ml du réactif contenu dans des tubes à essais.
Le tube blanc ne contient qu’un ml du réactif. Les préparations sont mélangées et incubées pendant
30minutes à température ambiante. L’absorbance du standard et des échantillons est lue à 505nm, le
complexe coloré est stable pendant 30minutes. Les valeurs de la glycémie sont calculées grâce à un
standard dont la concentration est de 1g/l contre un blanc qui sert à régler le zéro du
spectrophotomètre.

6.2. Dosage des protéines

Le dosage des protéines est basé sur la méthode de Bradford (1976). Il s’agit d’une méthode
colorimétrique dans laquelle un colorant: le bleu de comassie G250, de couleur brune en milieu acide
(absorption à 465 nm) devient bleu en se fixant quantitativement aux protéines (absorption à 595 nm).
L’étalonnage se fait en diluant 100 fois une protéine pure : le BSA (Sérum Albumine Bovine) en
solution de concentration 50g/L, les concentrations allant de 0 à 100 µg. Après avoir tracé la courbe
d’étalonnage (DO en fonction de la quantité de protéines en µg), la concentration en protéines des
échantillons est déterminée en rapportant les DO sur la courbe d’étalonnage. La concentration en
protéines est exprimée en mg/ml.

6.3. Dosage du malondialdehyde (MDA)

Ce dosage consiste à faire réagir la substance réactive d’acide thiobarbiturique (TBA) avec l’un des
produits finaux de la péroxydation lipidique: le malondialdehyde (MDA). En effet, le MDA réagit à
chaud et dans un milieu acide avec deux molécules de TBA permettant ainsi d’évaluer la quantité de
MDA présente dans ce mélange réactionnel par formation d’un composé de coloration rose qui est
d’autant plus foncée que la quantité de MDA est importante. Cette méthode nécessite une modification
au niveau plasmatique et érythrocytaire (TCA 28% au niveau du plasma et des érythrocytes au lieu de

19
Matériel et méthodes

20 % pour les échantillons tissulaires). Les étapes du protocole expérimental sont résumées dans les
tableaux suivants :
 Agitation et centrifugation à 1000g pendant 10 minutes.
 Incubation à 80°C pendant 10 minutes.
L’absorbance est mesurée à 530 nm. Elle est directement proportionnelle à la quantité de MDA
présente dans le milieu réactionnel. Cette mesure permet d’évaluer l’ampleur de la peroxydation
lipidique au niveau des membranes cellulaires. En ce qui concerne le tube blanc, il subit les mêmes
étapes, mais sans aucune substance qui réagit avec le TBA. La concentration «C» de MDA est
exprimée en nmol MDA/mg de protéines.
Cette concentration est calculée suivant la loi de Beer-Lambert : (DO= Σ .C.L).
D.O.  106
C= (nmol MDA/mg protéines)
∑ L X

∑: coefficient d’extinction molaire de MDA = 1,56  10 5 M-1cm-1.


L: longueur du trajet optique = 1cm
X: Concentration du surnagent en protéines (mg/ml)

6.4. Dosage du H2O2

Le dosage du peroxyde d’hydrogène (H2O2) a été réalisé selon la méthode de Dingeon et al. (1975). En
présence du phénol et de H2O2 et d’une peroxydase le 4-Amino-antipyrine présent dans le milieu
réactionnel se transforment en Quinoneimine de couleur rose détectée à 505 nm. Le calcul a été réalisé
en se référant à un courbe étalon dressé à partir d’une série de solutions standard de peroxyde
d’hydrogène.

6.5. Détermination des groupes sulfhydriles

La plupart des protéines possèdent des groupements thiols (-SH) qui réagissent très facilement avec les
espèces oxygénées activées. Ce test est réalisé selon la méthode d’Ellman (1959). En bref, 50µl de
l’échantillon hépatique ou rénale sont suspendus dans 1ml de tampon contenant tris base et EDTA. Le
mélange est vortexé et l’absorbance est déterminée à 412 nm. C’est la valeur A1. Puis, 20µl DTNB
sont ajoutés. Après incubation pendant 15 minutes à température ambiante, une nouvelle valeur
d’absorbance est déterminée à 412nm. C’est la valeur A2. Le tube blanc contient du DTNB seulement
c'est-à-dire 1050µl du tampon et 20µl DTNB. La valeur d’absorbance du blanc est la valeur B.
La quantité des groupes thiols est déterminée par la formule suivante :
│A2 – A1- B│*1.57

20
Matériel et méthodes
6.6. Détermination de l’activité du superoxyde dismutase (SOD)

Le rôle de la SOD est d’accélérer la dismutation du radical superoxyde toxique produit dans les
processus oxydatifs, en peroxyde d’hydrogène et en molécule d’oxygène. La méthode
spectrophotométrique utilisée permet une mesure de l’activité de la SOD de manière indirecte, en utilisant
le système épinephrine / adénochrome (Misra et Fridovich., 1972). Lorsqu’il y a présence d’une activité
de SOD dans la solution, cette dernière va accepter les électrons et l’oxydation de la catalase est
réduite. Ce dosage consiste à ajouter à un volume de 1,965 ml de tampon, 5µl d’échantillon et 10µl de
catalase. L’absorbance initiale est mesurée à 480 nm, c’est la densité optique du blanc. Ensuite, on
ajoute 20 µl de l’épinephrine et la densité optique est mesurée à un intervalle d’une minute pendant
4mn. SOD
2O 2- H2O2 + O2
Unité SOD/mg de protéines = [(Absorbance témoin / Absorbance échantillon) -1]

6.7. Détermination de l’activité de la catalase (CAT)

Le principe de cette méthode est basé sur l’utilisation du H2O2 comme substrat qui sera dégradé en H2O et
O2. Le peroxyde d’hydrogène est réduit en eau et en O2 par la catalase. Le principe de cette méthode
est basé sur l’utilisation du H2O2 comme substrat qui sera dégradé en H2O et O2 (Aebi., 1984).
Brièvement, l’activité de l’enzyme est évaluée en suivant au spectrophotomètre à 240 nm, la
décomposition de l’eau oxygénée par l’enzyme. Ainsi, la diminution progressive de la densité optique
correspond à la décomposition de H2O2 par la CAT. L’activité de la CAT est exprimée en (nmol
H2O2/min/mg protéines). Catalase
2H2O2 2 H2O + O2
L’activité de la catalase s’exprime en fonction du temps et de la concentration en protéines de
l’échantillon (nmol de Catalase/min/mg de protéines)

7. Evaluation du bilan lipidique

7.1. Dosage du cholestérol

Le cholestérol est mesuré après hydrolyse enzymatique puis oxydation. L’indicateur quinonéimine est
formé à partir du peroxyde d’hydrogène et du 4-antipyrine en présence de phénol et de peroxydase. La
détermination enzymatique est selon les réactions suivantes :
Cholestérol estérase
Esters de cholestérol + H2O Cholestérol+Acides gras

Cholestérol oxydase
Cholestérol + O2 Cholestène- 4-one - 3 + H2O2

Peroxydase
H2O2 + Phénol + Amino- 4 – antipyrine Quinoneimine rose

21
Matériel et méthodes

La quantité de quinonéimine formée est proportionnelle à la concentration de cholestérol.

7.2. Dosage du triglycéride

Les triglycérides sont déterminés selon les réactions suivantes :

Lipase
Triglycérides Glycérol + Acides gras

Glycérokinase, Mg ++
Gylcérol + ATP Glycérol -3-P + ADP

Glycérol-3- Phosphate oxydase


Glycérol-3-Phosphate + O2 H2O2 + Dihydroxyacétone-P

Peroxydase
H2O2 + Amino-4-Antipyrine + chloro-4-phénol Quinone rose +H2O

8. Calculs statistiques
Les résultats expérimentaux sont présentés sous forme de moyenne ± écart type à la moyenne SEM.
Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel statistique STATISTICA 6 et comparées par le
test-t de Student. La différence est considérée significative lorsque la valeur de p ≤ 0,05.

22
Résultats

I. Etude phytochimique et activité antioxydante


1. Détermination du teneur en polyphénols totaux
Dans une première étape, nous avons réalisé le traçage du courbe étalon de l'absorbance à 765nm en
fonction de la concentration de l'acide gallique (Figure 3). La courbe obtenue est une droite linéaire
qui passe par l'origine (D.O = 0,119C - 0,001) et avec un fort coefficient de corrélation (R2 = 0,990)
L'examen de la figure 4, montre que les teneurs en polyphénols totaux obtenus pour les quatre
températures étudiées sont différents, la quantité la plus importante est obtenue pour la température
T= 40°C (0,128 ±0,017mg Eq A.G/g; M.S). Cette quantité est très faible par comparaison avec celle
extraite de la plante d’artichaut (Cynara scolymus L.) par macération et avec utilisation de l'eau
comme solvant d'extraction (Mahmoudi et al., 2013). L'extraction à la température (T = 40°C)
semble être la meilleure méthode d’extraction des polyphénols que les autres températures étudiées
(T1 = 25°C : 0,054 ± 0,0042mg Eq A.G/g M.S) ; (T3 = 50°C : 0,088 ± 0,009mg Eq A.G/g M.S) ;
(T4 = 60°C : 0,091 ± 0,009mg Eq A.G/g M.S) et (T5 = 80°C : 0,059 ± 0,012mg Eq A.G/g M.S).
Généralement, l'extraction des polyphénols est longue et exige des solvants organiques qui sont très
chers et dangereux pour la santé (Garcia-Salas et al., 2010).

2. Détermination de l’activité antioxydante par la méthode du DPPH et de l’ABTS


La détermination de l’activité antioxydante par deux méthodes révèle que l’extrait aqueux des feuilles
de murier de la provenance de Béja possède une activité antioxydante proche de celle de l’acide
ascorbique (Tableau 2).

23
Résultats
Tableau 2: Activité antioxydante par la méthode du DPPH et de l’ABTS

Activité antioxydante Activité antioxydante


(DPPH, EC50 en mg/ml) (ABTS, EC50 en mg/ml)
Extrait aqueux 23,46 ± 2,54 19,63 ± 2,72
Extrait éthanolique 9,13 ± 0,53 8,71 ± 1,16
Extrait méthanolique 19,00 ± 3,11 15,31 ± 2,17
Acide ascorbique 1,12 ± 0,04 1,73 ± 0,12

II. Etude physiologique


1. Effet de diabète et de l’MCMû Sur l’évolution pondérale et poids des organes
D’après les résultats obtenus, nous avons enregistré un gain pondéral régulier chez les rats normaux
témoins (1). Par contre, chez les rats diabétiques (2), nous avons noté une diminution considérable. Le
prétraitement des animaux par l’MCMû a prouvé une correction dose-dépendante du poids corporel
(Figure 5).

Figure 5: Effet d’un traitement sub-aigue (21 jours) par l’extrait total des feuilles de murier
à des doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de la diminution du poids
corporel suite à l’induction de diabète chez le rat.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).

L’étude de la variation des poids des organes après l’induction du diabète par l’alloxane chez les rats a
montré une réduction significative du poids du foie, des reins et du pancréas. Ces changements ont été
corrigés suite à un traitement des animaux par l’MCMû durant 21 jours. Cette correction se fait d’une
façon dose-dépendante.
24
Résultats
Tableau 3: Variation du poids des organes

Foie (g) Rein (g) Pancreas (g)


Control 8,32 ± 1,03 1,13 ± 0,05 0,76 ± 0,06
Alloxan 6,10 ± 0,45* 0,83 ± 0,02* 0,60 ± 0,10*
Allox + MCMû-100 7,65 ± 0,56*# 0,86 ± 0,04# 0,60 ± 0,05#
Allox + MCMû-250 7,82 ± 0,37# 0,99 ± 0,03# 0,81 ± 0,11#
Allox + MCMû-500 9,04 ± 0,91# 1,10 ± 0,12# 0,83 ± 0,2#
Allox + Db 8,03 ± 0,55* 0,94 ± 0,3# 0,72 ± 0,06#
Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).

2. Effet de diabète et de l’MCMû sur la glycémie et le bilan lipidique


Le diabète provoque une augmentation du taux de glucose dans le sang (Figure 6). Le traitement sub-
aigu par l’extrait des feuilles de murier à la dose (500 mg/kg, PC) protège contre l’hyperglycémie de
manière significative. Cette protection est dépendante de la dose.

Figure 6: Effet d’un traitement subaigu (21 jours) par l’extrait total des feuilles de murier à
des doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de l’augmentation du niveau de
glucose dans le sang suite à l’induction de Diabète chez le rat.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).

25
Résultats

Les résultats présentés au niveau des figures A et B montrent que l’induction du diabète provoque une
perturbation du bilan lipidique (Figure 7). Le traitement sub-aigu par l’extrait des feuilles de murier à
des doses croissantes permet de rétablir ces paramètres à leur niveau de base et entraine une
protection dose-dépendante contre tous ces changement.

Figure 7: Effet d’un traitement sub-aigu (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des
doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de l’augmentation des niveaux du
triglycérides (A) et du cholestérol (B) suite à l’induction de diabète chez le rat.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).

3. Effet de diabète et de l’MCMû sur les pro-oxydants

3.1. Effet de diabète et de l’MCMû sur le taux des protéines et des groupements -SH

L’induction du diabète chez le rat entraine l’installation d’un stress oxydatif caractérisé par une
diminution du taux de protéines au niveau des organes (Figure 8). Le traitement sub-aigu par l’extrait
des feuilles de murier à des doses croissantes protège contre l’altération des protéines. Cette protection
se fait d’une manière dose-dépendante.

26
Résultats

Figure 8: Effet d’un traitement sub-aigu (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des
doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis la diminution du taux des protéines
aux niveaux hépatique, rénal et pancréatique suite à l’induction de diabète chez le rat.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).
Le diabète provoque un état de stress oxydant qui se manifeste par une diminution du taux des
groupements –SH (Figure 9). Le traitement sub-aigu par l’extrait des feuilles entraine une
augmentation dose-dépendante de ces groupements.

Figure 9: Effet d’un traitement sub-aigu (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des
doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de la diminution des niveaux
hépatique, rénal et pancréatique des groupements -SH suite à l’induction de diabète chez le
rat.
Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).

27
Résultats
3.2. Effet de diabète et de l’MCMû sur les pro-oxydants (MDA, H2O2)

L’induction du diabète provoque un état de stress oxydant qui se manifeste par une augmentation du
taux de MDA principale marqueur de peroxydation lipidique et la production de H2O2, (Figure 10). Le
traitement sub-aigu par l’extrait des feuilles de murier induit une diminution dose-dépendante de ces
paramètres.

Figure 10: Effet d’un traitement sub-aigue (21 jours) par l’extrait des feuilles de murier à des
doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de l’augmentation des niveaux
hépatique, rénal et pancréatique du MDA et de H2O2 suite à l’induction de diabète chez le
rat.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).

28
Résultats
4. Effet de diabète et de l’ MCMû sur l’activité des enzymes antioxydants (SOD et CAT)
Les résultats présentés au niveau des figures A et B montrent que l’induction d’MCM provoque la
déplétion de l’activité des enzymes antioxydants à savoir la SOD et la CAT aux niveaux rénal,
pancréatique et hépatique (figure 11). Le traitement sub-aigu par l’extrait des feuilles de murier permet
de rétablir ces changements. Cette protection se fait d’une manière dose-dépendante.

0
Figure 11: Effet d’un traitement aigue (23jours) par l’extrait des feuilles de murier (à des
doses croissantes (100, 250 et 500 mg/kg, PC) vis-à-vis de la déplétion de l’activité des
enzymes antioxydants (SOD et CAT) aux niveaux hépatique, rénal et pancréatique après
induction de diabète chez le rat.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n=10). *: p<0.05, La différence est significative
comparativement aux rats témoins (H2O) #: p<0.05, La différence est significative comparativement
aux rats diabétiques (Allox).

29
Discussion

La médecine traditionnelle basée sur des connaissances, compétences et pratiques propres à une
culture a utilisées plusieurs plantes médicinales pour maintenir les êtres humains en bonne santé ainsi
que pour prévenir, diagnostiquer, traiter et guérir des maladies mentales et physiques, dont le diabète
qui est une maladie chronique apparaît lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline ou
l’organisme n’utilise pas correctement l’insuline qu’il produit ce qui induit une hyperglycémie. Grâce
à sa teneur élevé en composé phénolique le murier est utilisé dans la médicine traditionnelle pour le
traitement de certaines affections chroniques notamment le diabète.
1. Etude phytochimique et activité antioxydante

Les polyphénols constituent les principes actifs de nombreuses plantes médicinales. On les trouve,
d’une manière générale, dans toutes les plantes vasculaires, où ils peuvent être localisés dans divers
organes : racines, tiges, bois, feuilles, fleurs et fruit.

In vitro, les poly phénols présentent des activités antioxydantes, antivirales, anti-inflammatoires et
anticancéreuses. Ces activités sont attribuées en partie à la capacité de ces composés à réduire les
radicaux libres tels que les radicaux hydroxyles (HO•), mais aussi à leur affinité pour une grande
variété de protéines dont certains enzymes et récepteurs. Les teneurs en polyphénols totaux obtenus
pour les quatre températures étudiées sont différent, la quantité la plus importante est obtenue pour la
température T= 40°C (0,128 ±0,017mg Eq A.G/g;M.S). Cette quantité est très faible par comparaison
avec celle extraite de la plante d’artichaut (Cynara scolymus L.) par macération et avec utilisation de
l'eau comme solvant d'extraction (Mahmoudi et al., 2013). L'extraction à la température (T = 40°C)
semble être la meilleure méthode d’extraction des polyphénols que les autres températures étudiées (T1
= 25°C : 0,054 ± 0,0042mg Eq A.G/g M.S) ; (T3 = 50°C : 0,088 ± 0,009mg Eq A.G/g M.S) ; (T4 =
60°C : 0,091 ± 0,009mg Eq A.G/g M.S) et (T5 = 80°C : 0,059 ± 0,012mg Eq A.G/g M.S).
Généralement, l'extraction des polyphénols est longue et exige des solvants organiques qui sont très
chers et dangereux pour la santé (Garcia-Salas et al., 2010).
Nous avons déterminé l’activité antioxydante et l’étude phytochimique de l’extrait total des feuilles de
murier. La présence des composés phénoliques dans les feuilles du murier a été rapportée par plusieurs
auteurs (Turgut et al., 2015; Engmann et al., 2014; Song et al., 2009 ; Abbas et al., 2014). En effet, les
feuilles sont riche en acides phénoliques, groupe de substances phytochimiques et ayant des activités
antioxydantes (Al-Mustafa et al., 2008 ; Wang et al., 2010) Les acides phénoliques ont un pouvoir
antibactérien plus puissant par rapport à celui des flavonoïdes. Les feuilles connue par leur activité
antioxydante (Araujo et al., 2015 ; Abbas et al., 2014 ; Iqbal et al., 2012) et pouvant être utilisée dans
le domaine médicinal. Elles ont une activité hypoglycémique (Abd El-Mawla et al., 2011 ; Volpato et
al., 2011).

30
Discussion

2. Effet de diabète et de l’MCMû sur l’évolution pondérale et poids des organes


Dans la présente étude, nous nous sommes intéressées au poids des organes ainsi qu’à l’évolution
pondérale des rats diabétiques. Dans ce cadre, le traitement des animaux par une dose unique
d’alloxane (150mg/kg) a provoqué l’induction du diabète et la perturbation du poids et par la suite une
réduction du poids des organes (foie, rein et pancréas).
Nos résultats après le traitement avec l’extrait de murier (MCMû) montrent que l’MCMû à doses
croissantes, entraine une élévation dose-dépendante du poids des rats testés et de ses organes. Dans ce
cadre, plusieurs études ont démontré que l’extrait de murier a un effet sur la prise pondérale (de
Queiroz et al., 2012).
3. Effet de diabète et de l’MCMû sur la glycémie et le bilan lipidique
De nouvelles stratégies de prévention ou de traitement du diabète de type 2 peuvent être définies sur la
base de l’inhibition de l’absorption des nutriments. Il est évident, que de nouveaux agents capables
d’inhiber l’absorption intestinale de glucose peuvent avoir un impact important sur l’efficacité du
traitement du diabète de type 2 (Kwon., 2007).
Nos résultats montrent que l’MCMû à doses croissantes, entraine une réduction dose-dépendante de
taux du glucose, du cholestérol et des triglycérides au niveau plasmatique. Dans ce cadre, plusieurs
études ont démontré l’effet anti-hyperglycémiant ou antidiabétique et l’effet hypocholestérolémiant de
l’extrait de murier noir (Taguchi et al., 2015; Volpato ., 2011; Araujo et al., 2015).
En effet, les polyphénols ont un effet régulateur sur l’absorption intestinale de glucose (Johnston,
2005). D’autres polyphénols comme ceux présents dans le thé vert (epigallo-catechine gallate (EGCG)
et epicatechine gallate (ECG) diminuent le transport intestinal du glucose probablement par une
inhibition compétitive du SGLT1 (Kobayashi., 2000). Dans son étude, Johnston suggère que les
flavonoïdes glycosides inhibent le transport actif du glucose tandis que les aglycones inhibent le
transport facilité du glucose chez les cellules intestinale Caco-2 (Johnston., 2005).
D’autres études suggèrent que les flavonoïdes inhibent le transport facilité du glucose effectué par le
transporteur GLUT2 situé à la membrane apicale des entérocytes (Kwon., 2007).
En effet, l’augmentation du bilan lipidique (Cholestérol et TG) et la glycémie au niveau plasmatique
montre une affection hépatique, rénale et pancréatique expliquant l’altération de leur fonction et la
diminution de leur poids et l’augmentation des pro-oxydants (MDA, H2O2 et SH) et la déplétion de
l’activité des enzymes antioxydants (SOD et CAT).
4. Effet de diabète et de l’MCMû sur les pro-oxydants

Le traitement des animaux par une dose unique d’alloxane (150mg/kg) a provoqué l’induction du
diabète et l’installation d’un stress oxydatif caractérisé par une augmentation de la production de
MDA et la génération de H2O2. Ces perturbations sont associé à une diminution du taux des protéines

31
Discussion

indiquant leur oxydation principalement au niveau des groupements –SH. Cet effet de l'extrait total
des feuilles de murier noir pourrait être attribué à la propriété antioxydante et à la capacité à piéger les
radicaux libres et les espèces réactives de l'oxygène, réduisant ainsi les dommages oxydatifs.
Nos résultats sont en accord avec beaucoup de travaux qui ont été réalisé dans ce cadre (Solayman
et al., 2015, Khattak et Rahman, 2015)
5. Effet de diabète et de l’MCMû sur l’activité des enzymes antioxydants (SOD et CAT)
Nos résultats ont montré une diminution au niveau de l’activité des enzymes antioxydants SOD et
catalase, suite à induction du diabète par l’alloxane (150mg/Kg).
Une correction dose-dépendante s’est produite après le traitement avec l’extrait de murier noir
(MCMû). Il est fort probable que les polyphénols de murier noir stimulent l’activité des enzymes
antioxydants contre le stress oxydatif.
Nos résultats sont conforme avec de nombreux travaux antérieurs qui montrent que l’extrait de murier
à un effet protecteur au stress oxydatif (Turgut et al., 2015 ; Volpato et al., 2011).

32
Conclusion et Perspectives

De nos jours, un grand nombre de plantes aromatiques et médicinales possède des propriétés
biologiques très importantes qui trouvent de nombreuses applications dans divers domaines à savoir en
médecine, pharmacie, cosmétologie et l’agriculture. Ce regain d’intérêt vient d’une part du fait que les
plantes médicinales représentent une source inépuisable de substances bioactives, et d’autre part les
effets secondaires induits par les médicaments inquiètent les utilisateurs qui se retournent vers des
soins moins agressifs pour l’organisme.

En Tunisie, la médecine traditionnelle est largement répandue et tient une place majeure dans le
traitement des pathologies chroniques. Grace à sa richesse en composés phénolique, le murier est
utilisée dans le traitement de certaines affections notamment le diabète.

A la fin de ce travail, nous pouvons conclure que l’extrait aqueux des feuilles de murier est doué d’une
activité antidiabétique remarquable. En effet, cet extrait permet de diminuer l’hyperglycémie sub-
aigue (21 jours) provoquée par l’alloxane. Cet effet est accompagné par la régulation de tous les
changements associés au diabète (Evolution pondérale, poids des organes, perturbations des
paramètres sanguins et stress oxydant).

L’ensemble de ces résultats obtenus in vitro et in vivo ne constitue qu’une première étape dans la
recherche de substances d'origine naturelle biologiquement active.

 Il serait intéressant de déterminer les principes actifs et les mécanismes d’actions exactes.
 Il serait intéressant d’introduire cette plante dans des produits alimentaires pour les diabétiques
essentiellement et dans d’autres produits aux personnes à risque pour agir d’une façon
préventive.
 Il serait également très intéressant de valoriser ce type de plantes médicinales par la fabrication
de gélules contenant ainsi les principes actifs de cette activité.

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Résumé
Le diabète est une maladie fréquente dans le monde entier. Il est traité par l’insuline et les
antidiabétiques oraux qui peuvent causer des effets secondaires plus au moins graves. En effet, il est
évident, que de nouveaux agents capables d’inhiber l’absorption intestinale de glucose peuvent avoir
un impact important sur l’efficacité du traitement du diabète. Dans ce cadre, nous nous sommes
intéressés à l’étude de la composition chimique de l’extrait aqueux des feuilles de murier noir et de
tester son rôle protecteur vis-à-vis de l'hyperglycémie et de la toxicité induites par l'intoxication
alloxanique. Les analyses phytochimiques ont montré la richesse des feuilles de murier noir en
acides phénoliques, flavonoïdes et tannins. In vivo, le traitement des rats par le murier noir protège
contre l'hyperglycémie induite par l'administration de l'alloxane. Nos résultats ont également montré
que cet extrait végétal protège contre le dysfonctionnement rénal, hépatique et pancréatique
provoqué par l'intoxication alloxanique.

Mots clés : Morus nigra, foie, pancréas, reins, glucose, alloxane

Abstract
Diabetes is a very common disease in the world. It is treated by insulin and oral antidiabetic agents
that can cause serious side effects. It is obvious that new agent able of inhibiting intestinal
absorption of glucose may have a significant impact on the effectiveness of diabetes treatment. In
this context, we are interested in the study of the chemical composition of the aqueous extract of
black mulberry leaves and test its protective role hyperglycemia and toxicity induced by intoxication
alloxanic. Phytochemical analysis showed the richness of black mulberry leaves in phenolic acids,
flavonoids and tannins. In vivo pretreatment of rats black mulberry protects against induced
hyperglycemia by the administration of alloxan. Our results have also shown that this plant extract
protects against renal hepatic and pancreatic dysfunction caused by alloxan poisoning.

Keywords: Morus nigra, liver, pancreas, kidney, glucose, alloxan

‫ملخص‬
‫مرض السكري هو مرض شائع في جميع أنحاء العالم و يتم عالجه باألنسولين واألدوية التي تأخذ عن طريق الفم التي يمكن أن تتسبب في‬
‫آثار جانبية خطيرة ومن الواضح أن هناك عوامل جديدة قادرة على تثبيت امتصاص األمعاء للغلوكوز قد يكون لها تأثير كبير على فعالية‬
‫ ويهدف هذا العمل إلى تقييم التأثير المضاد لمرض السكر من قبل موريس نيجرا ونحن مهتمون في دراسة التكوين‬.‫عالج هذا المرض‬
‫الكيميائي للمستخلص المائي من أوراق شجرة التوت األسود واختبار تأثيرها الخافض لسكر الدم الحاد وشبه المزمن الناجم عن الجلوكوز‬
‫ كما أظهرت النتائج التي‬.‫ الفالفونويد وحمض الطنطاليك‬،‫واآللوكسان وتشير التحليالت الكيميائية النباتية إلى وجود األحماض الفينولية‬
‫أجرينها في معالجة الفئران عن طريق المستخلص المائي من أوراق شجرة التوت األسود بانخفاض كبير في ارتفاع مستوى السكر في الدم‬
. ‫وتصحيح كل التغييرات المرتبطة به وبهذا نؤكد التأثير الوقائي لهذا المستخلص‬

‫ اآللوكسان‬, ‫ الكلى غلوكوز‬,‫ المعثكلة‬, ‫ الكبد‬, ‫ موريس نيجرا‬: ‫المفتاح الكلمات‬