Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
1996
PROCEDIMIENTO RECUENTO DE Revisión: 2
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Fecha revisión:
11.07.2008
Sección Microbiología Página 1 de 15
PRT-712.04-034
de Alimentos
1. OBJETIVO
Detectar el número de unidades formadoras de colonias de Clostridium perfringens en
alimentos.
3. FUNDAMENTO
El fundamento del método se basa en las características bioquímicas de este microorganismo. El
medio contiene sulfitos y sales de Fe, dado que el Clostridium perfringens es capaz de reducir
los sulfitos a sulfuro y en presencia de Fe se forma Sulfuro ferroso y por tanto las colonias de
Clostridium perfringens las veremos de color negro, además precipita la lecitina de la yema de
huevo, por lo que se observa un halo de precipitación alrededor de la colonia.
4. REFERENCIAS
4.1 Food and Drug Administration "Bacteriological Analytical Manual online, enero 2001,
carpeta 16.
5. TERMINOLOGÍA
No Aplica
Fecha emisión:
1996
PROCEDIMIENTO RECUENTO DE Revisión: 2
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Fecha revisión:
11.07.2008
Sección Microbiología Página 2 de 15
PRT-712.04-034
de Alimentos
6.3 Equipos
6.3.1 Estufa de incubación regulada a 35 ± 1º C
6.3.2 Baño termorregulado a 47± 2º C
6.3.3 Refrigerador 4 a 8 ° C
7. DESARROLLO
7.1 Recepción de la muestra en el laboratorio 339
7.1.1 Recibir la dilución 10-1 de la muestra procesada en el laboratorio de Recepción de
muestras según PRT–712.01-002 “Procedimiento Procesamiento de las muestras de
alimentos y agua para análisis microbiológico”
7.1.2 Anotar en el cuaderno de inscripción de muestras del laboratorio, la clave, N° de
muestra asignado por CISP, fecha y naturaleza de la muestra.
7.1.3 En el caso de muestras de brotes de ETA, anotar la información adicional que se
disponga, si la hay.
7.1.4 Mantener la dilución de la muestra refrigerada mientras se prepara el material, si no
está dispuesto para comenzar la siembra.
7.1.5 El período transcurrido entre la preparación del homogeneizado de la muestra y la
siembra no debe superar los 20 minutos.
7.2.4.5 Colocar un sobre de Anaerogen, recién sacado del sobre protector en un costado de la
jarra y utilizar según instrucciones del fabricante.
7.2.4.6 Tapar la jarra cuidadosamente, debe quedar hermética.
7.2.5 Incubación
7.2.5.1 Incubar a 35º C ± 1° C por 24 horas.
7.2.5.2 En caso de no haber desarrollo (presencia de colonias negras) o son muy pequeñas,
incubar por 24 horas más en anaerobiosis.
7.2.5.3 Una vez concluido el período de incubación, sacar las jarras de la estufa.
7.2.5.4 Dejar un rato a temperatura ambiente.
7.2.5.5 Comprobar que el indicador de anaerobiosis esté virado de incoloro a rosado.
7.2.5.6 Abrir la jarra y sacar cuidadosamente las placas.
7.2.5.7 Ordenarlas de acuerdo al número de la muestra y a las diluciones realizadas.
7.3 Lectura
7.3.1 Recuento presuntivo de células viables de C. perfringens
7.3.1.1 Seleccionar las placas que contienen entre 20 y 200 colonias.
7.3.1.2 Las colonias de C. perfringens en medio yema de huevo son negras con 2 a 4 mm
de zona blanca opaca al rededor de la colonia como resultado de la actividad de la
lecitinasa.
7.3.1.3 Registrar las lecturas hoja de registro de análisis del laboratorio RG-712.00-080.
7.3.1.4 Calcular el recuento presuntivo aplicando la fórmula que aparece a continuación:
7.3.1.5 En caso de no tener colonias aisladas, tomar con asa una porción del cultivo
inocular en Caldo tioglicolato previamente calentado en agua a ebullición por 20
minutos y enfriado rápidamente en agua fría antes de inocular, para ello después de
cumplido el tiempo de ebullición para eliminar el oxígeno disuelto, trasladar
rápidamente los tubos y enfriar en agua de grifo. Asegurar cerrar las tapas de los
tubos.
Fecha emisión:
1996
PROCEDIMIENTO RECUENTO DE Revisión: 2
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Fecha revisión:
11.07.2008
Sección Microbiología Página 6 de 15
PRT-712.04-034
de Alimentos
7.5.1.3 Del caldo de esporulación realizar Gram y examine la presencia de esporas. Mantener
a 4° C si nuevas pruebas se requieren.
7.5.1.4 Anotar los resultados en hoja de registro RG-712.00-080.
Se deben cumplir todas estas pruebas para confirmar las colonias en estudio como C.
perfringens
8. REGISTROS
9. TABLA DE MODIFICACIONES
10. ANEXOS
Anexo N° 1: Preparación de medios de cultivo.
Anexo N° 2: Preparación de reactivos
Anexo N°3: Hoja de Registro Informe Recuento Clostridium perfringens en Alimentos RG-
712.00-080.
Anexo N° 4: Hoja de Registro batería bioquímica de cepa control positivo y cepa control
negativo C. perfringens, RG-712.00-100.
Anexo N° 5: Hoja de Registro Control Esterilidad Medios de Cultivo Laboratorio 339, RG-
712.00-098
Fecha emisión:
1996
PROCEDIMIENTO RECUENTO DE Revisión: 2
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Fecha revisión:
11.07.2008
Sección Microbiología Página 14 de 15
PRT-712.04-034
de Alimentos
ANEXO N ° 1- PRT-712.04-034
PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO
Disolver todos los ingredientes excepto el agar y ajuste pH a 7.4± 0,2.Añada el agar y caliente
con agitación hasta disolver completamente. Dispensar 9 mL en tubos de 16 x 125 mm.
Autoclave 15 minutos a 121° C. Antes de su uso, caliente en baño de agua o vapor por 10
minutos. Añada 1 mL de solución estéril al 10% de carbohidrato a los 9 mL de base.
Caldo esporulación
Fórmula:
Polipeptona 15 g
Extracto levadura 3g
Almidón soluble 3g
Mg SO4 0,1 g
Tioglicolato de sodio 1g
Na2 HPO4 11 g
Agua destilada 1L
Ajuste pH a 7,8 ± 0,1. Dispense porciones de 15 mL en tubos de 20 x 150 mm con tapa rosca.
Autoclave 15 minutos a 121° C.
Fecha emisión:
1996
PROCEDIMIENTO RECUENTO DE Revisión: 2
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Fecha revisión:
11.07.2008
Sección Microbiología Página 15 de 15
PRT-712.04-034
de Alimentos
ANEXO N° 2- PRT-712.04-034
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
C. Reactivo Naphthol
α – Naphthol 1g
Acido acético 200 mL
Para preparar ácido acético 5 N, añada 28,75 mL de ácido acético glacial a 71,25 mL de agua
destilada.
Para el test añadir 0,1 a 0,5 mL de de reactivo A y B o C a un medio líquido o semisólido. El
desarrollo de un color rojo–violeta con reactivo A y B o color naranjo con reactivo A y C indica
que el nitrato ha sido reducido. A veces el color resultante de reactivo A y B puede palidecer o
desaparecer dentro de pocos minutos, por tanto registre la reacción tan pronto como aparezca el
color, si no se produce desarrollo de color añadir una pequeña cantidad de zinc en polvo. Si se
desarrollo color, significa que el nitrato no ha sido reducido.