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TABLA DE CONTENIDOS
1. USO PREVISTO __________________________________________________________ 3
2. INTRODUCCIÓN _________________________________________________________ 3
8. RESULTADOS ___________________________________________________________ 8
9. LIMITACIONES __________________________________________________________ 8
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Manual IDK® Zonulin ELISA
1. USO PREVISTO
Este ELISA está destinado a la determinación cuantitativa de la zonulina en las heces. Sólo
para uso diagnóstico in vitro.
2. INTRODUCCIÓN
La zonulina es una nueva proteína humana análoga a la toxina zonula occludens derivada
de Vibrio cholerae que participa en estrechas uniones entre las células de la pared del tracto
digestivo. La zonulina se une a un receptor específico en la superficie del epitelio intestinal y
desencadena una cascada de eventos bioquímicos que induce un desmontaje de la unión
apretada y un subsiguiente aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal, permitiendo
que algunas sustancias pasen a través y activen las reacciones inmunitarias.
Con respecto a la diabetes tipo 1 autoinmune, en experimentos con ratas se pudo demostrar
que los niveles elevados de zonulina, así como el aumento de la permeabilidad intestinal,
preceden a la diabetes tipo 1. Por el contrario, la diabetes tipo 1 podría prevenirse mediante
la inhibición de la zonulina en experimentos con animales.
Además, se informó de que muchas personas que sufren de enfermedad celíaca también
sufren de otros trastornos autoinmunes. Se sugiere que el aumento de los niveles de
zonulina, son un factor que contribuye al desarrollo de la enfermedad celíaca y otros
trastornos autoinmunes como la diabetes insulino-dependiente, la esclerosis múltiple y la
artritis reumatoide.
3. MATERIAL SUMINISTRADO
Cat. N° Etiqueta Componentes del kit Cantidad
K 5600 PLATE PLATE Placa de microtitulación, pre-recubierta 12 x 8 pocillos
K 5600 WASHBUF WASHBUF Buffer de lavado concentrado, 10 x 2 x 100 ml
K 5600 DIL DIL Buffer de dilución concentrado, 2.5 x 2 x 100 ml
K 5600 TRACER TRACER Trazador concentrado, 100 x (biotinilada 1 x 300 μl
zonulin)
Conjugado concentrado, 100 x (estreptavidina
K 5600 CONJ CONJ 1 x 200 μl
marcada con peroxidasa)
STD Estándar, liofilizadas (Ver especificación de 4 x 5 viales
K 5600 STD
concentraciones)
K 5600 CTRL 1 CTRL 1 Control, liofilizado (Ver especificación de rango) 4 x 1 vial
K 5600 CTRL 2 CTRL 2 Control, liofilizado (Ver especificación de rango) 4 x 1 vial
SUB TMB substrato (Tetrametilbenzidina), listo para 1 x 15 ml
K 5600 SUB
usar
K 5600 STOP STOP Solución de parada ELISA, lista para usar 1 x 15 ml
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Manual IDK® Zonulin ELISA
Para reordenar componentes individuales, utilice el número de catálogo seguido de la etiqueta como
número de producto.
• Vortex
* Immundiagnostik AG recomienda el uso de agua ultra pura (agua tipo 1, ISO 3696), que está libre
de iones no disueltos y coloidales y moléculas orgánicas (libre de partículas > 0,2 μm) con una
conductividad eléctrica de 0,055 μS/cm a 25 °C (≥ 18,2 MΩ cm).
• Los reactivos con un volumen inferior a 100 μl deben centrifugarse antes de su uso para
evitar la pérdida de volumen.
• Preparación del buffer de dilución: El DIL (buffer de dilución concentrado) debe diluirse
con agua ultra pura 1:2.5 antes de usar (100 ml DIL + 150 ml de agua ultra pura), mezclar
bien. Los cristales pueden ocurrir debido a la alta concentración de sal en el concentrado.
Antes de la dilución, los cristales tienen que volverse a disolver en un baño de agua a 37 °C.
El DIL es estable a 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El buffer de
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Manual IDK® Zonulin ELISA
dilución (DIL diluido 1:2.5) se puede almacenar en un matraz cerrado a 2-8 °C durante 1
mes.
• Todos los demás reactivos de prueba están listos para usar. Los reactivos de ensayo son
estables hasta la fecha de caducidad (ver etiqueta del empaque del test) cuando se
almacenan a 2-8 °C.
Heces fecales:
4 días a temperatura ambiente (15-30 °C) así como 3 meses a -20 °C.
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Manual IDK® Zonulin ELISA
Por favor, siga las instrucciones para la preparación de muestras de heces utilizando el
SAS como sigue:
B) Llenar el tubo de muestra vacío con 0,75 ml de buffer de dilución antes de usarlo con
la muestra. Importante: Deje que el buffer de extracción alcance la temperatura ambiente.
C) Desenrosque el tubo (parte amarilla del tapón) para abrirlo. Inserte la varilla medidora
de color amarilla en la muestra. La parte inferior de la varilla de medición tiene muescas
que necesitan ser cubiertas completamente con las heces después de insertarlo en la
muestra. Coloque la varilla medidora en el tubo. Al volver a colocar la palanca en el tubo,
el exceso de material se retirará, dejando 15 mg de muestra para diluir. Atornille
firmemente para cerrar el tubo.
D) Agite bien el tubo hasta que no queden muestras de heces en las muescas.
Importante: Por favor, asegúrese de que tiene una suspensión máxima homogénea
después de agitar. Especialmente con muestras más sólidas, empapar la muestra en el
tubo con tampón durante ~ 10 minutos mejora el resultado.
F) Desenroscar con cuidado la tapa completa del tubo incluyendo el anillo azul más la
varilla de nivel. Deseche la tapa y la varilla de medición. Asegúrese de que el sedimento
no se disperse de nuevo.
Preparación de la muestra
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Manual IDK® Zonulin ELISA
Procedimiento de prueba
Antes de usar, permita que todos los reactivos y muestras lleguen a la temperatura ambiente
(15-30 °C) y mezcle bien.
Tome tantas tiras de microtitulación (PLATE) como sea necesario desde el kit. Almacene las
tiras no utilizadas en el envase cerrado de aluminio a 2-8 °C. Las tiras son estables hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
Para los procesadores ELISA automatizados, el protocolo dado puede necesitar ser
ajustado de acuerdo a las características específicas de la plataforma automatizada
respectiva. Para más información, póngase en contacto con su proveedor o con
Immundiagnostik AG.
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Manual IDK® Zonulin ELISA
microtitulación invertida debe ser golpeada firmemente sobre papel absorbente para
eliminar el exceso de solución.
7. Añadir 100 μl de sustrato TMB (SUB) en cada pocillo
8. Incubar durante 10-20 minutos a temperatura ambiente (15-30 °C) *.
Añadir 100 μl de solución de parada ELISA (STOP) y mezclar brevemente en el
9.
lector ELISA usando la opción de agitación.
Determinar la absorción inmediatamente con un lector de ELISA a 450 nm frente
a 620 nm (o 690 nm) como referencia. Si no hay longitud de onda de referencia
10. disponible, lea sólo a 450 nm. Si la extinción de una muestra o una norma supera el
rango del fotómetro, la absorción debe medirse inmediatamente a 405 nm frente a
620 nm como referencia.
* La intensidad del cambio de color es sensible a la temperatura. Se recomienda observar el
cambio de color y detener la reacción tras una buena diferenciación.
8. RESULTADOS
Los siguientes algoritmos se pueden utilizar alternativamente para calcular los resultados.
Se recomienda utilizar el "algoritmo de 4 parámetros".
1. Algoritmo de 4 parámetros
Se recomienda utilizar una ordenada lineal para la densidad óptica y una abscisa logarítmica
para la concentración. Cuando se utiliza una abscisa logarítmica, se debe especificar el
patrón cero con un valor menor que 1 (por ejemplo, 0,001).
Se recomienda una ordenada lineal para la densidad óptica y una abscisa lineal para la
concentración.
3. Algoritmo de spline
Se recomienda una ordenada lineal para la densidad óptica y una abscisa lineal para la
concentración.
Muestras de heces
Los niveles de zonulina obtenidos de las muestras de heces deben multiplicarse con el
factor de dilución de 50.
En caso de que se utilice otro factor de dilución, multiplique el resultado obtenido con el
factor de dilución utilizado.
9. LIMITACIONES
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Las muestras con concentraciones por encima del rango de medición (ver definición más
adelante) deben ser diluidas y re-ensayadas. Por favor considere esta mayor dilución al
calcular los resultados.
Las muestras de control deben ser analizadas con cada prueba. Los resultados, generados
a partir del análisis de muestras de control, deben ser evaluados para su aceptabilidad
usando métodos estadísticos apropiados. Los resultados para las muestras de pacientes
pueden no ser válidos si dentro del mismo ensayo uno o más valores de la muestra de
control de calidad están fuera de los límites aceptables.
Rango de referencia
Intra-Ensayo (n = 24)
Inter-Ensayo (n=16)
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2 162.9 13.9
Sensibilidad analítica
Recuperación de la dilución
12. PRECAUCIONES
• Todos los reactivos del paquete del kit son sólo para uso diagnóstico in vitro.
• Los materiales humanos utilizados en los componentes del kit fueron probados y resultaron
negativos para el VIH, Hepatitis B y Hepatitis C. Sin embargo, por razones de seguridad,
todos los componentes del kit deben ser tratados como potencialmente infecciosos.
• Los reactivos del kit contienen azida sódica o Proclin como bactericidas. Azida de sodio y
Proclin son tóxicos. Los sustratos para las reacciones enzimáticas de color son tóxicos y
carcinógenos. Evite el contacto con la piel o las membranas mucosas.
• La solución de parada consiste en ácido sulfúrico diluido, un ácido fuerte. Aunque diluido,
todavía debe ser manejado con cuidado. Puede causar quemaduras y debe manejarse con
guantes, protección para los ojos y ropa protectora apropiada. Cualquier derrame debe ser
limpiado inmediatamente con abundante cantidad de agua. No respirar el vapor y evitar la
inhalación.
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Manual IDK® Zonulin ELISA
• Los reactivos no deben usarse más allá de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta
del kit.
15. REFERENCIAS
1. Fasano, A, T No, W Wang, S Uzzau, I Berti, A Tommasini, y S E Goldblum. 2000.
"Zonulina, un modulador recientemente descubierto de la permeabilidad intestinal y su
expresión en la enfermedad celíaca." Lancet 355 (9214) (29 de abril): 1518-9. Doi:
10.1016 / S0140-6736 (00) 02169-3.
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Manual IDK® Zonulin ELISA
3. Fasano, A. 2001. "Zonulina Intestinal: Sesame Abierto!" Gut 49 (2) (Agosto): 159-62.
6. Watts, Tammara, Irene Berti, Anna Sapone, Tania Gerarduzzi, Tarcisio No, Ronald Zielke
y Alessio Fasano. 2005. "El papel del modulador de la unión estrecha intestinal Zonulin
en la patogénesis de la diabetes tipo I en las ratas diabéticas propensas a BB".
Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América
102 (8) (22 de febrero): 2916- 21. Doi: 10.1073 / pnas.0500178102.
7. De Magistris, María Teresa. 2006. "Zonula Occludens Toxin as New Promising Adjuvant
for Mucosal Vaccines." Vacuna 24 Supl 2 (12 de abril): S2-60-1.
8. Sapone, Anna, Laura de Magistris, Michelle Pietzak, María G Clemente, Amit Tripathi,
Francesco Cucca, Rosanna Lampis, et al. 2006. "La regulación positiva de la zonulina
está asociada con una mayor permeabilidad intestinal en sujetos con diabetes tipo 1 y
sus familiares". Diabetes 55 (5) (1 de mayo): 1443-9. Doi: 55/5/1443 [pii].
9. Thomas, Karen E, Anna Sapone, Alessio Fasano y Stefanie N Vogel. 2006. "La
estimulación de la gliadina de la expresión génica inflamatoria de los macrófagos murinos
y la permeabilidad intestinal dependen de MyD88: papel de la respuesta inmune innata
en la enfermedad celíaca" Journal of Immunology (Baltimore, Maryland, 1950) 176 (4) (15
de febrero) 2512 - 21.
Símbolos usados:
Atención 12