23º Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental

I-074 – DETERMINAÇÃO DE CLOROFILA PELO MÉTODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO VISANDO O MONITORAMENTO DA EFICIÊNCIA
DO TRATAMENTO DE ÁGUAS PARA ABASTECIMENTO

Emília Kiyomi Kuroda(1)

Engenheira civil (Escola de Engenharia de São Carlos - Universidade de São Paulo, 1999), mestre em
Hidráulica e Saneamento (2002) e estudante de pós-graduação de Doutorado do Departamento de Hidráulica e
Saneamento da Escola de Engenharia de São Carlos - Universidade de São Paulo. Email:
ekkuroda@yahoo.com.br
André Cordeiro Alves dos Santos
Biólogo (Universidade de Santo Amaro, 1990), doutor em Ciências da Engenharia Ambiental na Escola de
Engenharia de São Carlos – USP (2003).
Lucy Aparecida Queiroz
Geografa (Faculdade ASSER de São Carlos, 1995), mestre em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente
(Centro Universitário de Araraquara, 2003) e técnica especializada em Química do Laboratório de
Biotoxicologia em Águas Continentais e Efluentes - BIOTACE. Departamento de Hidráulica e Saneamento da
Escola de Engenharia de São Carlos - Universidade de São Paulo.
Maria do Carmo Calijuri
professora titular do Departamento de Hidráulica e Saneamento da Escola de Engenharia de São Carlos -
Universidade de São Paulo.
Luiz Di Bernardo
professor titular do Departamento de Hidráulica e Saneamento da Escola de Engenharia de São Carlos -
Universidade de São Paulo.

Endereço(1): Departamento de Hidráulica e Saneamento, Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade

de São Paulo, Av. Trabalhador São-Carlense, no. 400, CEP : 13 566-570 ; São Carlos – SP, Fone : 55 16 – 273
95 28 ; Fax : 55 -16 – 273 95 50. Email: ekkuroda@yahoo.com.br

RESUMO
A concentração de clorofila-a é um parâmetro chave em diversos trabalhos limnológicos e de qualidade de
água. Este parâmetro é utilizado como indicador da biomassa de algas e, apesar do conteúdo de clorofila por
célula variar grandemente, conforme o estado fisiológico e a espécie, sua correlação com a densidade celular é
bem próxima. O objetivo do presente trabalho é estabelecer a metodologia mais adequada para extração e
determinação das concentrações de clorofila em amostras resultantes do monitoramento da eficiência de
sistemas de tratamento de água para abastecimento. Para tanto foram realizados diversos testes para
determinar o melhor solvente (Acetona, Etanol, Metanol e Clorofórmio-Metanol) o caminho ótico mais
indicado (1 e 10 cm) e o uso de MgCO3 na conservação das amostras. Os testes indicaram não existir
diferenças significativas nos dois caminhos óticos e no uso de MgCO3. Entre os quatro solventes testados o
Metanol foi considerado o mais eficiente, apesar de não existir diferenças estatísticas significativas entre os
solventes testados.

PALAVRAS-CHAVE: Concentração de clorofila, espectrofotometria, acetona, metanol, etanol, tratamento

de água, algas.

INTRODUÇÃO
Segundo DI BERNARDO (1995), a presença de algas e/ou cianobactérias em águas destinadas ao consumo
humano pode trazer efeitos diretos na qualidade da água, tais como:

9 aumento de matéria orgânica particulada;

9 aumento de substâncias orgânicas dissolvidas que podem conferir odor e sabor à água, ser
precursores da formação de compostos organo-clorados, apresentar toxicidade, incrementar a cor da
água, servir de substrato para o crescimento de bactérias na estação de tratamento e contribuir para
aumentar a corrosão;

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9 aumento do pH e de suas flutuações diárias;

9 diminuição do teor de oxigênio próximo ao sedimento podendo ocorrer liberação de sulfeto de

hidrogênio, amônia, ferro, manganês, fósforo entre outros.

Por decorrência dessas alterações, dificuldades diversas são introduzidas nos processos de tratamento de águas
para consumo humano, requerendo tratamentos específicos, o que implica em custos adicionais. Nesse
sentido, vários estudos em bancada e em instalação piloto têm sido realizados com o objetivo de avaliar a
eficiência de determinado processo ou mesmo tratamento, para águas contendo algas e/ou cianobactérias.
Nesses trabalhos experimentais, a concentração de pigmentos fotossintéticos é comumente utilizada para
estimar a biomassa fitoplanctônica presente nas águas e efluentes dos tratamentos devido à maior praticidade e
rapidez quando comparada à contagem por microscopia. Além disso, vale ressaltar que o exame qualitativo e
quantitativo de fitoplâncton por microscopia requer treinamento e pessoal especificamente qualificado para
sua execução, o que nem sempre é possível.

Clorofila-a é o pigmento fotossintético presente em todos os orgânismos fitoplanctônicos sejam eucarióticos

(algas) ou procarióticos (cianobactérias) e é utilizado como parâmetro de biomassa algal em diversos
trabalhos, tanto nos experimentais quanto nas caracterizações de ambientes aquáticos e monitoramento da
qualidade de água. Um dos problemas na determinação da clorofila-a é que este pigmento varia na célula
fitoplanctônica conforme o estado fisiológico e a espécie.

Sendo um parâmetro tão utilizado, várias propostas de metodologias de determinação da concentração de

clorofila-a foram propostas desde a década de 60. Estas metodologias diferem quanto ao modo de extração
(agitação, maceração, liofilização, sonificação e imersão), tipo de solvente (acetona 90%, etanol 80%, metanol
100%, clorofórmio-metanol 2:1 v/v, metanol e sulfeto de hidrogênio, entre outros) a frio/quente, separação
cromatográfica e análise (espectrofotometria e fluorimetria).

Nesse sentido, este trabalho faz parte do planejamento experimental para adoção de metodologias adequadas a
serem utilizadas para determinação da concentração de clorofila-a nas águas de estudo, preparadas por meio
de diluição de cultura de Microcystis spp. em água filtrada, nos efluentes dos processos envolvidos no sistema
de tratamento de água proposto, e em águas provenientes de ambientes eutrofizados.

MATERIAIS E MÉTODOS
As amostras utilizadas nos experimentos são provenientes de cultura de Microcytis spp, mantida no
laboratório do Departamento de Hidráulica e Saneamento da Escola de Engenharia de São Carlos,
Universidade de São Paulo.

A concentração de células de Microcystis spp. nas alíquotas do cultivo foi determinada através do método de
sedimentação de UTHERMOHL (1958) e a partir da concentração obtida, foram realizadas diluições em água
filtrada (sem cloração) da Estação de Tratamento de Água – ETA 2 de São Carlos, e posteriormente filtradas
em filtros de fibra de vidro tipo GF/C, com réplicas para cada solvente testado.

Nas amostras diluídas também foram determinadas as densidades de Microcystis spp. para conferência das
diluições.

Foram utilizados os seguintes métodos:

9 Acetona 90% a frio com maceração segundo descrito em ARAR (1997);
9 Metanol 100% a frio sem maceração (MARKER, 1972);
9 Etanol 80% a quente sem maceração (NUSH, 1980);
9 Clorofórmio-Metanol (2:1) a frio sem maceração (WOOD, 1985).

O volume final dos extratos, para todos os solventes, foi de 12 mL. Os extratos foram submetidos a
centrifugação (3000 rpm por 15 min) e a leitura no espectrofotômetro foi feito com o sobrenadante.

A fórmula utilizada para os três métodos foi à proposta por LORENZEN (1965), com a correção para
feopigmentos:

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1.000 × V
Clorofila − a(μ(μg−1 ) = P × (A 665 − A 750 ) × (equação 1)
S × PL

Onde:
P = Constante de proporcionalidade derivado do coeficiente molar de extinção (tabela 1);
A665 = Absorbância do extrato no comprimento de onda 665, corrigida com a absorbância do extrato
acidificado em 665;
A750 = Absorbância do extrato no comprimento de onda 750, corrigida com a absorbância do extrato
acidificado em 750;
V = Volume do extrato em mL;
S = Volume da amostra filtrada em mL;
PL = Comprimento ótico da cubeta.

O coeficiente molar de extinção é calculado a partir de uma curva de crescimento de amostras de clorofila
pura (padrão) em um solvente especifico. Os coeficientes de absorção para a Clorofila-a já foram muito
reportados em diversas publicações (LLOYD & TUCKER, 1988; EIJCKELHOFF & DEKKER, 1997;
PORRA, 2002).

Para o presente trabalho foram utilizadas as seguintes constantes:

Tabela 1: Constante de proporcionalidade utilizada no calculo da clorofila-a para cada solvente testado
Método Constante de Referência
Proporcionalidade (P)
Acetona 90% a frio 26,7 mg.cm.L-1 ARAR, 1997
Metanol 100% 29,6 mg.cm.L-1 MARKER, 1972
Clorofórmio-Metanol (2:1) 13,2 mg.cm.L-1 WOOD, 1985
Etanol 80% a quente 27,9 mg.cm.L-1 NUSH, 1980

As concentrações de clorofila-a obtidas foram analisadas:

9 através de correlação com os dados de densidade (células.mL-1) de Microcystis spp, para determinar
qual das metodologias representava melhor a densidade de células;
9 através de teste t (student) entre os testes para determinar se há diferença significativa entre os
métodos.

PRIMEIRO EXPERIMENTO
O primeiro teste foi preliminar para adequar as metodologias que seriam testadas. Foi realizado em réplica,
com extração em solução de acetona 90 % a frio, variando-se a densidade de Microcystis spp (estimada em
107 , 105 , 103 e 10 cél.mL-1, valores selecionados em função dos resultados obtidos em ensaios preliminares
de bancada dos processos testados), o volume da amostra a ser filtrada (30, 100, 500 e 1000 mL), a rotação
aplicada na centrifugação (500, 1000, 1500 e 3000 rpm) e o tempo de extração (2 e 12 h), baseadas nas
metodologias propostas por APHA (1999) – Método 10200 H, ARAR (1997), DOS SANTOS et.al. (2003) .

RESULTADOS DO PRIMEIRO EXPERIMENTO

Dos resultados obtidos no primeiro teste, observou-se que o volume mínimo necessário de amostra filtrada
para determinação de clorofila deve ser estabelecido em função da densidade de cianobactérias, no caso, de
Microcystis spp., tendo-se obtido resultados satisfatórios com volumes da ordem de 30; 500 e 1000 mL para
as águas com densidades de 107 , 105 e 103 cél/mL, respectivamente. Para a amostra com densidade estimada
de 10 cél/mL, o volume de 1000 mL foi insuficiente para detecção.

Em geral, a aplicação por 15 minutos, das rotações de 500, 1000 e 1500 rpm correspondentes a 50,3, 201,2 e
452,7 gravidades não foram suficientes para eliminar o efeito da turbidez na ocasião da leitura
espectrofotométrica, em função dos elevados valores de unidade de absorção - UA obtidos no comprimento de
onda de 750 nm. Os resultados obtidos com o tempo de extração de 2 h não foram satisfatórios, sendo

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recomendado o tempo mínimo de 12 h, e o máximo, de 24 h. Os valores calculados de clorofila apresentaram

significativas variações, tendo resultado para as águas com densidades de 107 , 105 e 103 cél/mL, valores da
ordem de 175; 30 e 2,5 μg/L, respectivamente.

SEGUNDO EXPERIMENTO
No segundo experimento foram utilizadas três densidades (101, 103 e 105 células de Microcystis spp/mL), e
três solventes, metanol, acetona e etanol, segundo as metodologias já citadas.

O objetivo deste segundo experimento foi testar o volume filtrado e a utilização de cubetas de caminho ótico
diferente (1 e 10 cm).

Na figura 1 é representada a estrutura do experimento 2. A hipótese a ser testada é que não há diferença
significativa entre os métodos e entre as leituras em cubetas de 1 e 10 cm.

Figura 1: Estrutura do experimento 2, três amostras de 10, 103 e 105 células de Microcystis spp. mL-1,
utilização de três solventes (etanol, metanol e acetona) e leitura em espectrofotometria com leitura em
cubetas com caminho ótico diferente (1 e 10 cm).

RESULTADOS DO SEGUNDO EXPERIMENTO

Os resultados das concentrações de clorofila-a obtidas no experimento dois, para os dois comprimentos óticos,
podem ser observadas na tabela 2

Tabela 2: Densidade de células de Microcystis spp e concentrações de clorofila-a determinadas pelos

métodos da Acetona 90%, Metanol 100% e Etanol 80% a quente, com leitura em cubetas com
comprimento ótico de 1 e 10 cm.

Densidade de
Células Acetona Etanol Metanol
cel.mL-1 mg.L-1 mg.L-1 mg.L-1
PL 1 cm 10 cm 1 cm 10 cm 1 cm 10 cm
1.4 x105 16.02 16.22 23.02 24.62 24.42 22.83
2.9 x103 0.50 0.42 2.27 2.88 2.41 2.05
7.6 x101 0.22 0.23 1.63 1.50 1.73 1.00

O teste t de Student aplicado aos valores de clorofila-a obtidos em cubetas de 1 cm e em de 10 cm, nos três
tratamentos, indicou não haver diferença entre as concentrações obtidas (P= 0,434 para nível de confiança de
0,05).

As concentrações de clorofila-a obtidas pelos três métodos são muito semelhantes, e os menores valores
observados correspondem à extração com acetona a frio.

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As maiores concentrações médias foram observadas com a utilização da extração com metanol. Comparando-
se os resultados, as concentrações obtidas com Etanol e Acetona foram respectivamente, 6% e 41 % menores
em relação aos obtidos com Metanol.

O teste t (student) aplicado aos valores de clorofila-a não indicou diferenças significativas para os três
métodos testados.

Os três métodos tiveram grande correlação com as concentrações de células de cianobactérias (figura 2).

25

20
Clorofila-a (ug/L)

15

10

0
1.0.E+01 1.0.E+02 1.0.E+03 1.0.E+04 1.0.E+05 1.0.E+06

Nº cél/mL
Acetona Etanol Metanol
R2 = 1.000 R2 = 1.000 R2 = 1.000

Figura 2: Curvas de concentrações de clorofila em relação a densidade de células de Microcystis spp. nos
três métodos Acetona, Etanol e Metanol e respectivos índices de correlação.

Em função da constatação de que o pequeno número de amostras e a grande diferença na densidade de

Microcystis spp favoreceram as correlações obtidas entre as densidades de células de Microcystis spp e de
clorofila-a., planejou-se o terceiro experimento.

TERCEIRO EXPERIMENTO
No terceiro experimento foi testado um maior número de concentrações com menor diferença entre elas para
tentar definir o melhor solvente entre acetona, etanol e metanol.

A estrutura do experimento três pode ser observada na figura 3.

Figura 3: Estrutura do experimento 3, seis amostras de células de Microcystis spp. mL- e a utilização de
três solventes (etanol, metanol e acetona).

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RESULTADO DO TERCEIRO EXPERIMENTO

O terceiro experimento indicou grande semelhança entre as concentrações de clorofila-a obtidas nos três
métodos, com os três diferentes solventes (figura 4).

1000.000
132.02
120.77
130.87
100.000
Clorofila (ug/L)

10.000

1.78 2.07 2.07 2.25

1.18 1.28
1.000
0.44
0.25 0.30 0.32
0.22 0.24
0.10 0.11
0.100

0.010
2.8.E+01 5.5.E+01 4.2.E+02 1.0.E+04 1.9.E+04 5.3.E+05

Metanol 0.25 0.44 1.78 2.07 132.02

Etanol 0.10 0.22 0.30 1.18 2.07 120.77
Acetona 0.11 0.24 0.32 1.28 2.25 130.87

Nº cél/mL
Metanol Etanol Acetona

Figura 4: Concentrações de Clorofila-a obtidas nos três métodos de determinação (metanol, etanol e
acetona), em relação às densidades de células de Microcytsis spp.).

Novamente as concentrações obtidas foram maiores no método do Metanol. Estas concentrações foram, na
média, 9% maiores que as obtidas no método do Etanol e 1% maiores que as obtidas pelo método da acetona.

A diferença entre os métodos é maior para menores densidades de Microcystis spp. Enquanto as diferenças
chegam a 108% e 125% para acetona e etanol, respectivamente, em relação ao Metanol nas menores
concentrações (<102 células.mL-1) é somente de 3% e 5% na concentração de 105.

O teste t (student), comparando os métodos dois a dois, para variâncias semelhantes e com nível de decisão
alfa de 0,01, também não indicou diferença entre os métodos testados.

A correlação com a densidade de células, foi novamente muito próxima para os três métodos testados, com
diferenças somente próximas a quarta casa decimal (figura 5).

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140

120

100
Clorofila (ug/L)

80

60

40

20

0
1.0.E+01 1.0.E+02 1.0.E+03 1.0.E+04 1.0.E+05 1.0.E+06

Nº cé l/mL
Metanol Etanol Acetona
R2 = 0.9994 R2 = 0.9995 R2 = 0.9995

Figura 5: Curvas de concentrações de clorofila em relação a densidade de células de Microcystis spp. nos
três métodos Acetona, Etanol e Metanol e respectivos índices de correlação.

QUARTO EXPERIMENTO
No quarto experimento, além dos métodos já testados nos outros experimentos foi acrescentado um quarto
método, Clorofórmio-Metanol. Foram testadas, novamente seis concentrações.

A estrutura do experimento pode ser observada na figura 6.

Figura 6: Estrutura do experimento 4, seis amostras de células de Microcystis spp. mL- e a utilização de
quatro solventes (etanol, metanol, clorofórmio-metanol e acetona).

RESULTADO DO QUARTO EXPERIMENTO

O resultado do quarto experimento mostrou novamente uma grande similaridade entre os métodos, as
concentrações obtidas no método do Metanol, foram superiores que os outros três métodos, nas menores
concentrações de células (<104 células.mL-1), nas maiores concentrações o método do etanol produziu maiores
valores de clorofila-a (figura 7).

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1000.000

100.000 42.0350.78
32.57
6.42 13.20
4.95
10.000
Clorofila (ug/L)

1.38 2.37 5.03

1.48
0.84 1.40 1.87
0.74 1.07 1.34
0.270.62 0.80
1.000 0.52 0.56 0.55
0.28

0.100

0.010
7.8.E+01 9.9.E+02 9.8.E+03 2.4.E+04 4.5.E+04 1.9.E+05

Metanol 0.52 0.74 1.48 2.37 5.03 42.03

Etanol 0.28 0.56 0.84 1.40 6.42 50.78
Acetona 0.27 1.07 0.80 1.34 1.87 32.57
Clorof-metanol 0.62 0.55 1.38 4.95 13.20

Nº cél/mL

Metanol Etanol Acetona Clorof-metanol

Figura 7: Concentrações de Clorofila-a obtidas nos quatro métodos de determinação (metanol,

clorofórmio-metanol, etanol e acetona), em relação a densidades de células de Microcytsis spp.

As concentrações médias obtidas foram maiores para o método do etanol. As concentrações obtidas nos outros
métodos foram 13%, 37% e 63% menores para o metanol, acetona e clorofórmio-metanol respectivamente.

O teste t (student) também não indicou diferenças significativas entre os quatro métodos testados.

A correlação com os dados de concentração de células, apesar de terem valor de R2 menores são muito
significativos. As maiores correlações foram observadas com os dados de Clorofila-a obtidos pelos métodos
que usam como solvente Etanol e Metanol (figura 9).

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60

50

40
Clorofila (ug/L)

30

20

10

0
1.0.E+01 1.0.E+02 1.0.E+03 1.0.E+04 1.0.E+05 1.0.E+06

Nº cé l/mL
Metanol Etanol Acetona Clorofmetanol
R2 = 0.9792 R2 = 0.9749 R2 = 0.9549 R2 = 0.9600

Figura 8: Curvas de concentrações de clorofila em relação a densidade de células de Microcystis spp. nos
quatro métodos testados: Acetona, Etanol, Metanol e Metanol-Clorofórmio e respectivos índices de
correlação.

QUINTO EXPERIMENTO
No quinto experimento foi testada a adição de MgCO3, segundo ASFA (1999) e STRICLAND & PARSON,
(1972) esta adição impede a degradação da Clorofila e a formação de produtos da degradação como
feopigmentos e clorofilide que podem levar a uma subestimação das concentrações de clorofila.

Para tanto foram utilizadas as mesmas concentrações do experimento 4 e utilizou-se como solvente somente o
Metanol, que nos testes anteriores foi o que extraiu mais clorofila.

A estrutura do experimento 5 pode ser observada na figura 9.

Figura 9: Estrutura do experimento 5, seis amostras de células de Microcystis spp. mL- e a utilização de
Metanol como solvente, com e sem a adição de MgCO3.

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RESULTADO DO QUINTO EXPERIMENTO

As concentrações de clorofila sem a adição de MgCO3 foram 15% maiores do que aquelas obtidas com a
adição.

Não há diferenças significativas entre os dois métodos segundo os resultados do teste t (p > 0,01) e da
correlação linear entre os valores obtidos (Figura 10)

40

35
3
Clorofila ( g/L) - Metanol + MgCO

30

25

20

15

10

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
R2 = 0.9661 Clorofila ( μg/L) - Me tanol

Figura 10: Correlação linear entre as concentrações de Clorofila-a obtidas com e sem a adição de
MgCO3 e extraídas com Metanol.

DISCUSSÃO
As metodologias para determinação da concentração de clorofila a sempre estiveram sujeitas a diversas
críticas. Essas discussões metodológicas incluem desde o tipo de filtro utilizado na obtenção das amostras, até
o real significado da presença de feofitina em ambientes aquáticos (RAI, 1980).

Entretanto, dados confiáveis, muitas vezes, são difíceis de serem conseguidos, em virtude da grande
quantidade de interferentes (RAI, 1980). O uso da quantificação de clorofila como estimativa de biomassa é
muito criticado, pois o conteúdo de clorofila pode variar conforme a espécie e estado fisiológico da célula
(SAKSHAUG, 1981). Mesmo com todos os possíveis erros associados à concentração de clorofila,
correlações entre contagens de células do fitoplâncton e concentrações de clorofila têm-se mostrado
surpreendentemente próximas (NUSH, 1980).

Neste trabalho os erros associados ao estado fisiológico e a composição taxonômica são minimizados pois
teve-se o cuidado de utilizar culturas com o predomínio de cianobactérias (Microcystis spp) e amostras
retiradas no mesmo período de crescimento.

Outra dificuldade refere-se ao fato de que na maioria das vezes, a determinação das concentrações de clorofila
é feita com coeficientes de extinção adotados de outros trabalhos publicados.

A escolha de solvente é uma das discussões mais antigas na determinação de clorofila. Os primeiros métodos
espectrofotométricos indicam a acetona como o solvente para amostras de clorofila (STRICKLAND &
PARSONS, 1968 E LORENZEN, 1967). O uso da acetona é indicado como padrão no Standart Methods
(ASFA, 1999), e na EPA (Environmental Protection Agency) norte americana (ARAR, 1997).

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Porém vários autores discutem a eficiência de extração da clorofila pela acetona (HOLM-HANSEN &
RIEMANN, 1978; MOED & HALLEGRAEFF, 1978, MARKER et al, 1980), em função da dificuldade de
provocar a lise das células.

Neste trabalho a acetona produziu concentrações menores que o metanol e o etanol em todos os experimentos
o que pode indicar uma menor eficiência na extração de pigmentos. Apesar dos testes estatísticos indicarem
não haver diferença significativa entre os métodos.

O uso do Metanol foi proposto inicialmente, para o fitoplâncton, por MARKER (1972), e hoje é considerado
uma boa alternativa a acetona na extração de pigmentos fotossintetizantes. Vários trabalhos reportam ser o
Metanol mais eficiente que a acetona na extração de pigmentos (SARTORY & GLOBBELAAR, 1984;
SIMON & HELLIWELL, 1998).

Os resultados encontrados parecem concordar que o metanol é o solvente mais eficiente na extração de
clorofila-a, pois na maioria das amostras foi este solvente que produziu as maiores concentrações.

O método do Etanol 80% a quente foi indicado por NUSH (1980) como uma alternativa ao metanol, por sua
menor toxicidade. Neste trabalho os resultados indicam que o uso do Etanol é equivalente ao do metanol com
concentrações muito próximas.

Os resultados obtidos nos experimentos realizados não confirmaram a constatação feita por WOOD (1985) e
LLOYD & TUCKER (1988) de que o uso de Clorofórmio-Metanol (2:1) é mais eficiente que a acetona e o
metanol na extração de clorofila-a. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o clorofórmio-metanol
pode ser mais eficiente que a acetona, porém ele produziu concentrações inferiores à aquelas encontradas com
o uso do metanol.

O teste do uso do MgCO3 para impedir a degradação da clorofila, concluiu que não há influência positiva na
amostras para o tempo de conservação utilizado, como já havia sido indicado em outros trabalhos (MARKER
et al, 1980; LLOYD & TUCKER, 1988).

Segundo DOS SANTOS et al (2003) a escolha do melhor método para a determinação da clorofila-a depende
de vários fatores: a) a exatidão da análise; b) as facilidades de aplicação (infra-estrutura e aspectos
financeiros), c) comparação com outros trabalhos e d) adequação aos objetivos da pesquisa.

O objetivo deste trabalho é determinar o melhor método para a determinação de clorofila-a, para o
monitoramento da eficiência de sistema de tratamento de água. Nestas condições o método escolhido deve
cumprir certos critérios:

a) eficiência na extração: pois comumente ira se trabalhar com amostras com baixas concentrações de
células/mL.
b) rapidez e facilidade: durante a realização de alguns experimentos a determinação deverá ser feita no campo,
onde o uso de alguns equipamentos é dificultado.
c) toxicidade e preço: como deverão ser feitas muitas amostras em cada experimento, o tempo de exposição
aos reagentes e o preço unitário das amostras deverão ser levados em conta.

Apesar da grande similaridade entre as concentrações obtidas nos quatro métodos, suas grandes correlações
com as densidades de células de Microcytis spp. e de não ter sido encontrada diferenças estatísticas
significativas, os resultados obtidos até o momento indicam que o solvente que melhor se adequa a todos
critérios a serem considerados é o metanol 100%.

CONCLUSÕES
9 Não foram encontradas diferenças significativas entre o uso de cubetas de 1 cm e 10 cm de caminho
ótico para os três métodos testados.

9 Não foram encontrados diferenças estatísticas significativas entre os métodos da acetona 90%,
metanol 100%, etanol 80% a quente e Clorofórmio-metanol (2:1).

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9 Todos os métodos testados tiveram grande correlação (R2>0,9) com as densidades de células de
Micricytis spp.

9 O método do metanol 100% foi mas eficiente (produziu concentrações maiores), se comparado aos
outros métodos testados, principalmente nas amostras com menores densidades de células (<104
celulas/mL).

9 O uso de MgCO3 não produziu diferenças significativas nas concentrações de clorofila-a obtidas.

9 Apesar da grande similaridade entre as concentrações obtidas nos quatro métodos, suas grandes
correlações com as densidades de células de Microcytis spp. e de não ter sido encontrada diferenças
estatísticas significativas, os resultados obtidos até o momento indicam que o solvente que melhor se
adequa a todos critérios a serem considerados é o metanol 100%.

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