UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

EVALUAR EL EFECTO DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO DE LOS GRANOS DE

KÉFIR Y EN LA PRODUCCIÓN DE KEFIRAN

Proyecto Especial
Avance

Autor
María Alejandra Morales Sánchez

Asesor
Felipe Salcedo Galán Ph.D.

Coasesor
Ariel Mauricio Vaca Bohórquez

Septiembre 2017
Bogotá D.C.
 Tabla de contenido
1. Objetivos .........................................................................................................................................2
1.1. Objetivo General ................................................................................................................2
1.1.1. Objetivos Específicos ...............................................................................................2
2. Introducción ...................................................................................................................................2
3. Metodología ....................................................................................................................................4
3.1. Cultivo madre.....................................................................................................................4
3.2. Evaluación de medios en el crecimiento de los granos de kéfir y producción de kefiran .5
3.2.1. Cultivo madre ...........................................................................................................5
3.2.2. Caracterización de medios ........................................................................................6
3.2.3. Cuantificación de azúcares y proteínas ....................................................................6
3.2.4. Producción de Kefiran ..............................................................................................7
3.3. Evaluación del tiempo de fermentación del medio en el crecimiento de los granos de
kéfir y la producción de Kefiran ........................................................................................7
3.3.1. Acidez total ...............................................................................................................7
3.3.2. Crecimiento de los granos de kéfir ...........................................................................7
3.3.3. Producción de Kefiran ..............................................................................................7
4. Resultados .......................................................................................................................................8
4.1. Cultivo madre.....................................................................................................................8
4.2. Evaluación de medios en el crecimiento de los granos de kéfir y producción de kefiran .8
4.2.1. Cultivo madre ...........................................................................................................8
4.2.2. Caracterización de medios ......................................................................................10
4.2.3. Cuantificación de azúcares y proteínas ..................................................................13
4.2.4. Producción de Kefiran ............................................................................................14
4.3. Evaluación del tiempo de fermentación del medio en el crecimiento de los granos de
kéfir y la producción de Kefiran ......................................................................................14
4.3.1. Acidez total .............................................................................................................14
4.3.2. Crecimiento de los granos de kéfir .........................................................................15
4.3.3. Producción de Kefiran ............................................................................................16
5. Conclusiones............................................................................................................................................ 17
Referencias ..................................................................................................................................................... 17

1
 1. Objetivos

1.1.Objetivo General

Evaluar el efecto de las condiciones de cultivo de los granos de kéfir en la producción de

kefiran.

1.1.1. Objetivos Específicos

• Evaluar el efecto del tipo de medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción
de Kefirán.
• Evaluar el efecto del tiempo de fermentación sobre el crecimiento de los granos de kéfir
y la producción de kefiran.

2. Introducción
El kefiran es un tipo de polisacárido microbial soluble en agua, que contiene cantidades aproximadamente
iguales de glucosa y galactosa. Este tiene ventajas sobre otros polisacáridos ya que tiene propiedades
antibacteriales, anti fúngicas y antitumorales. Sumado a esto, se puede destacar que el kefiran ayuda a
mejorar las propiedades viscosas y viscoelásticas a bajas temperaturas de bebidas lácteas fermentadas, así
como el yogurt, el queso, el kéfir o el kumis (Zajsek, Kolar, & Gorsek, Characterisation of the
expolysaccharide kefiran produced by lactic acid bacteria entrapped within kefir grains, 2011). Por lo
anterior, el kefiran se utiliza en la industria de alimentos como espesante, estabilizante, emulsificante,
agente gelificante, y puede tener influencia sobre el tiempo de percepción de su sabor en la boca del
consumidor (Enikeev, 2012). Su uso también hace presencia en la industria cosmética y la farmacéutica
(Zolfi, Faramarz, Mousavi, & Hashemi, 2015). Por su gran cantidad de usos y aplicaciones, es importante
poder aislar la mayor cantidad de este polisacárido de los granos de kéfir.
Los granos de kéfir son pequeños, gelatinosos, amarillentos e irregulares (Liu & Lin, 2000), y contienen
una compleja mezcla microbial simbiótica de bacterias ácido lácticas (Lactobacilos, Lactococcus,
Leuconostoc, Streptocuccus), bacterias ácido acéticas (Acetobacteria) y levaduras (Kluyveromyces,
Saccharomyces y Torula), incluidas en una matriz viscosa de proteínas polisacáridas (Enikeev, 2012).
Dicha matriz, contiene entre 30 y 50 bacterias y levaduras, sin embargo, esta cifra varía según el medio
de cultivo y el país de origen de los granos de kéfir (Rodríguez, Carvalho, & Schneedorf, 2005). La
bacteria ácido-láctica Lactobacilos Kefiranociens es la principal productora del exopolisacárido
descubierto por La Rivié en 1967 (Dailin, y otros, 2016) , kefiran.
Uno de los usos del kefiran que cuenta con un gran potencial a nivel industrial, es su implementación
como recubrimiento de frutas. La deshidratación y demás pérdidas nutricionales y de apariencia a las que
se enfrentan los alimentos, en especial las frutas, entre el momento de su recolección hasta su consumo
son muy significativas. En países desarrollados, la pérdida de cosecha de frutas está entre un 5 y un 25%,
mientras que, en países en desarrollo, este porcentaje alcanza valores entre el 20 y el 50% (Morales &
Robayo, 20015). Por ello, es que ha incrementado el uso de recubrimientos protectores de productos
alimenticios, con el fin de aumentar su vida útil.

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Hoy día, la mayor parte de los materiales que se utilizan como empaque se elaboran a partir de recursos
no renovables, así como el petróleo, que traen consigo perjuicios para el medio ambiente. Por ende, se ha
estado buscando un reemplazo a este tipo de empaques que cumplan con las preferencias del consumidor,
que pueda mantener la calidad y aumentar la vida útil del producto y, sumado a esto, que sea amigable
con el ambiente (Piermaria J. , Pinotti, García, & Abraham, 2009). Teniendo en cuenta lo anterior, se ha
fomentado la exploración de nuevos materiales biológicos, así como las películas comestibles y
biodegradables producidas a partir de recursos renovables (Zolfi, Faramarz, Mousavi, & Hashemi, 2015).
Materiales como los exopolisacáridos, como el kefiran o los biopoliésteres han sido foco de numerosos
estudios (Vijayendra & Shamala, 2014). Es importante mencionar que entre las propiedades de los
biopolímeros que más se destacan están su estabilidad térmica, su flexibilidad, sus propiedades de barrera
contra agua y vapor, su resistencia a químicos, entre otras (Gabor & Tita, 2012). En cuanto a la
implementación del kefiran como película, en estudios realizados con anterioridad, se ha podido
comprobar que estas tienen buenas propiedades de barrera al vapor de agua, sus propiedades no varían
significativamente a través del tiempo y son bastante estables (Piermaria J. , Pinotti, García, & Abraham,
2009) (Vaca & Óscar , 2013).
Por otro lado, se tiene registro de que en Colombia se producen aproximadamente 6.700 millones de litros
de leche en el año 2016 (Dinero, 2015), y que en el año 2006 se produjo aproximadamente 921.672
millones de litros de suero lácteo en el país (Klotz, 2014). El suero lácteo se produce a partir de la
coagulación de la leche y la separación de la cuajada en la elaboración de productos lácteos tales como el
queso o la caseína. Por ende, este subproducto puede contener hasta un 50% de los nutrientes de la leche
(proteínas, lactosa, vitaminas y sales) considerándolo un producto de un alto valor nutricional. Esta gran
concentración de proteínas conlleva a que el suero tenga una gran carga orgánica, y al ser desechado
genera un alto impacto ambiental (Parra Huertas, 2009). Hoy día este producto se utiliza como alimento
para cerdos y terneros o es lanzado a ríos y potreros, por un litro de suero se puede llegar a contaminar
hasta una tonelada de agua (Universidad Nacional de Comolombia, 2015), y como en Colombia no se
regula este tipo de desechos, se pueden producir problemas de contaminación en ríos y lagunas de ciertas
regiones lechereas del país (Universidad Nacional de Colombia, 2014). Por ello se busca la aplicación de
este subproducto en otros campos como sustrato microbiano (Klotz, 2014).
Algunos estudios han demostrado que el rendimiento del kefiran producido en un medio láctico es bastante
bajo (mg/L). Igualmente, se ha podido determinar que las condiciones de crecimiento, tales como la
temperatura, la composición del medio, el tiempo de incubación, pueden influenciar de manera
considerable en la producción del kefiran (Zajsek, Kolar, & Gorsek, Characterisation of the
expolysaccharide kefiran produced by lactic acid bacteria entrapped within kefir grains, 2011). Uno de
los factores ya evaluados es la fuente de carbono adecuada para el crecimiento celular, tales como la
glucosa, sacarosa, fructosa, xilosa y lactosa. Yokoi y Watanable (1992) encontraron que la lactosa es la
mejor fuente de carbono químicamente definida para la producción de kefiran. Igualmente, se evaluaron
los efectos del nitrógeno en la producción de este exopolisacárido así, Cheirsilp (2003) determinó que
cuanto mayor es la relación C/N, menor es la producción de kefiran. Por otro lado, los fosfatos son
compuestos inorgánicos que se utilizan para potenciar el crecimiento bacteriano, y aunque no se tiene
conocimiento del efecto de los fosfatos en el crecimiento de Lactobacilos Kefiranofaciens, y la producción
de kefirán, si se ha documentado el efecto sobre sepas bacterianas que producen otro tipo de polisacáridos.
De esta manera, Gunter y Oldoc (2005) pudieron evidenciar que el crecimiento celular, y la producción

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de polisacáridos se limitaban por la ausencia de fosfatos. (Dailin, y otros, 2016). En un estudio realizado
respecto a la composición ideal para el crecimiento de granos de kéfir y producción de kefiran, se pudo
determinar que un buen medio para el crecimiento de los granos de kéfir es aquel que esté compuesto
(g/L) de una fuente de carbono como la lactosa (100) , fosfato dipotásico (2), acetato de sodio (5), sulfato
de manganeso (0,05), extracto de levadura (10), sulfato de magnesio (0,2) y citrato de triamonio (2)
(Dailin, y otros, 2016), obteniendo con este una producción de kefiran de 0,72 g/L.
Por otro lado, también se ha estudiado leche proveniente de distintas fuentes como medio de cultivo para
los granos, entre ellos la leche de vaca, de cabra y de oveja. Este estudio dejó como resultado que una tasa
mayor de crecimiento de los granos se presenta cuando el medio de cultivo es la leche de cabra.
Considerando que la leche de cabra contiene un nivel más bajo de lactosa que la leche de vaca y oveja, se
podría suponer que la glucosa y la galactosa pueden influir considerablemente en el incremento de masa
de los granos de kéfir (Montesanto, y otros, 2016). También se tiene registro de la comparación de medios
entre la leche y leche de soya. En dicho estudio, los granos de kéfir cultivados en la leche de soya
presentaron una tasa de crecimiento más baja que en la leche, aun estando la leche de soya enriquecida
con glucosa, lactosa y sacarosa (Liu & Lin, 2000). En el 2014 se realizó un estudio acerca de aumentar la
producción de biomasa de los granos de kéfir utilizando como medio de cultivo leche, para ello se
evaluaron distintas condiciones de cultivo como la temperatura, el tiempo de residencia, la velocidad de
agitación y suplementos del medio. Se evaluaron dos tipos de leche, leche convencional y leche orgánico,
difiriendo entre ellas la cantidad de grasas, proteínas. Como resultado, se obtuvo que las condiciones
óptimas de cultivo se dan utilizando como medio la leche orgánica, inoculando los granos a una
temperatura de 25°C, durante 24 horas y con una tasa de agitación de 125rpm. La leche orgánica tiene
mayor concentración de proteínas, lactosa y sólidos no grasos (Pop, y otros, 2014). Aunque se han hecho
numerosas comparaciones entre posibles medios de cultivo para los granos de kéfir, no se tiene registro
conocido de la comparación entre el suero lácteo y la leche como medio de cultivo y su influencia en la
producción de kefiran.
Finalmente, es importante mencionar que la reacción de fermentación ácido-láctica del medio llega en un
punto al equilibrio, estado donde las concentraciones de las sustancias involucradas en el sistema no
cambian. Sin embargo, cualquier cambio que ocurra en las condiciones de la reacción perturbará el
equilibrio. Las concentraciones se pueden cambiar al agregar o quitar una de las sustancias. Al alterar la
concentración, la presión o la temperatura, la velocidad de la reacción no será igual. El principio de Le
Châtelier permite determinar la dirección en la que se debe desplazar el equilibrio para que disminuya la
perturbación (Timberlake & Timberlake, 2008). Aunque anteriormente se han realizado estudios a cerca
de la influencia del tiempo de fermentación de los granos en su crecimiento y en la producción de kefiran,
no se ha reportado el estudio del avance de la reacción que ocurre durante la fermentación ácido-láctica.
3. Metodología

3.1. Cultivo Madre

Primero, se realiza la inoculación de 16,26 gramos de granos de kéfir en leche a 25°C, agitación constante
de 130 rpm y un tiempo de fermentación de 24 horas. Es importante mencionar que el medio se prepara a
partir de leche Klim y agua, teniendo en cuenta una relación de peso de los granos con su medio de 1:6.
Igualmente, la concentración de leche es de 0,13 g de leche en polvo/ml de medio. Este cultivo se lleva a

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cabo con el fin de definir las condiciones específicas de cultivo tales como la cantidad de agua con la que
se lavan los granos y el tiempo de secado en papel absorbente. Igualmente se pretende obtener una cantidad
considerable (50 gramos) de granos para proceder a evaluar la influencia de la composición del medio en
su crecimiento.
3.2. Evaluación de medios en el crecimiento de los granos de kéfir y producción de kefiran
A partir del cultivo madre realizado anteriormente, se toman cuatro muestras con el fin evaluar el
crecimiento de los granos utilizando como sustrato suero lácteo. Las muestras tomadas se inocularán en
distintos medios para tener un buen punto de comparación. Ya que uno de los fines del proyecto es evaluar
el crecimiento de los granos de kéfir utilizando como sustrato suero lácteo, este será uno de los medios a
utilizar. Como punto de comparación las otras tres muestras se cultivan en leche y en dos medios
sintéticos. La composición de dichos medios se basa tanto en datos de estudios que se han realizado
anteriormente, como en la concentración de lactosa que posee el suero lácteo y la leche. Se pretende tomar
como referencia la lactosa, ya que es el principal carbohidrato del que se tiene conocimiento, es el
indispensable para el crecimiento de los granos. Para tener un buen control, se realiza una caracterización
de medios en cuanto a nivel de azúcares, y a cantidad de proteínas. La inoculación de los granos se lleva
a cabo en un baño shaker a 130 rpm, 25°C y tiempo de fermentación de 24 horas. Los granos filtrados y
secados se pesan para tener un registro diario del aumento de su masa. Esta etapa se realiza por 17 días.
3.2.1. Caracterización de medios
El suero lácteo para la inoculación de los granos de kéfir se obtuvo por medio de la coagulación de la
leche con ayuda de una pastilla de cuajo, este proceso se realiza a 35°C.
Para realizar una cuantificación de medios, se realiza la cuantificación de lactosa, glucosa y galactosa en
el suero lácteo y la leche. Para ello, se utiliza la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) con un
detector de índice refractivo, el cual es especialmente efectivo para el análisis de analitos con poca o sin
absorción UV, así como los azúcares dietarios a analizar (Troiano & Denaro). Para poder realizar este
procedimiento, primero se debe realizar una curva de calibración con puntos de concentraciones conocidas
de cada uno de los azúcares a analizar. Posteriormente, para evaluar los medios, se toma 1 mL de muestra
y se diluye con agua hasta 100 mL.
Tabla 1 Parámetros del método HPLC. (Agilent Technologies Company, 2001)

Como se ha mencionado anteriormente, la elección de los medios sintéticos se hace a partir de la

concentración de lactosa en la leche y el suero; y en los resultados obtenidos en estudios realizados

5
anteriormente (Dailin, y otros, 2016). Por otro lado, se realiza un control de pH de los medios para observar
si la naturaleza ácida o alcalina tiene algún efecto en el crecimiento de los granos de kéfir.
Tabla 2. Concentración de los medios sintéticos (Dailin, y otros, 2016).

Adicionalmente, se realiza la cuantificación de proteínas de los medios por medio del método Bradford. Para
realizar este procedimiento primero se debe preparar el reactivo de Bradford. Seguido a esto, para realizar
la curva de calibración se deben preparar soluciones que contengan albúmina bovina de composiciones
conocidas. Posteriormente se preparan las muestras a diluir. Finalmente, se agregan 3mL de reactivo de
Bradford a cada muestra y se lee su absorbancia a 595 nm. Cabe resaltar que se evalúa la concentración
de proteínas en general, entre las que se encuentran proteínas solubles, caseínas y otras sustancias
nitrogenadas (García Arellano & Vázquez Duhalt, 1998).
3.2.2. Cuantificación de azúcares y proteínas
Durante la evaluación de la influencia del medio en el crecimiento de los granos de kéfir y la producción de kefiran,
se hace un monitoreo del cultivo. No solo se pesan todos los días, sino que también se realiza una caracterización
periódica en cuanto a azúcares y proteínas del kéfir producto de la fermentación de la leche con los granos. Para la
cuantificación de azúcares se utiliza el método HPLC, y para las proteínas se lleva a cabo el método Bradford,
ambos descritos anteriormente.

3.2.3. Producción de Kefiran

Adicional a la evaluación de los medios y su influencia en el aumento de masa de los granos de kéfir, se
pretende evaluar su influencia en la producción de kefiran. Los granos de cada muestra son aislados
teniendo en cuenta el procedimiento propuesto en una ‘Guía de aislamiento de Kefiran ‘ (Vaca Bohórquez,
2017). En dicho procedimiento consta de cuatro etapas principales, en la primera etapa, los granos de kéfir
pasan por un proceso de dilución basado en agitación y calor, en la segunda etapa se precipitan los
elementos no solubles tales como proteínas y lípidos, en la tercera etapa se procede a precipitar el kefiran
por etanol frío y en la etapa final, se realiza un refinamiento de este.
Igualmente, una muestra del kefiran obtenido se somete a su degradación mediante un análisis
termogravimétrico (TGA) para identificar el porcentaje de humedad y la temperatura de degradación del
polímero. Así poder identificar la cantidad de kefiran final producido.

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 Tabla 3 Metodología TGA.

3.3. Evaluación del tiempo de fermentación del medio en el crecimiento de los granos de kéfir y
la producción de kefiran

3.3.1. Acidez total

Para evaluar el efecto del tiempo de residencia en el crecimiento de los granos de kéfir y la producción de
kefiran, se evalúa primero el avance de la reacción con respecto al tiempo. Para ello, al ser una reacción
de fermentación, el avance se puede estudiar por medio del cambio del pH. Por consiguiente, se espera
que la reacción llegue al equilibrio en un tiempo a determinar.

Para evaluar el cambio de pH, se toma una muestra de medio cada media hora durante 6 horas y se mide
el respectivo pH. Posteriormente, para determinar la acidez total durante la reacción, se divide el cultivo
disponible en 6 muestras y se inoculan, usando como sustrato leche. Cada hora, durante 6 horas, se toma
una muestra de 10mL de un Erlenmeyer distinto, se mide el pH inicial y se procede a titular con NaOH
0.2M. Durante la titulación se mide el pH, cada 0.5mL de NaOH consumidos. Este procedimiento se
realiza hasta que el alícuota alcance un pH de aproximadamente 7. Finalmente se halla la acidez con
respecto al tiempo.
0.2 𝑚𝑜𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑁𝑎𝑂𝐻 ( ) = 𝑚𝑜𝑙 𝑂𝐻 − = 𝑚𝑜𝑙 𝐻 +
1000 𝑚𝐿 𝑁𝑎𝑂𝐻

3.3.2. Crecimiento de los granos de kéfir

Después de determinar el tiempo requerido para obtener un pH estable, se procede a realizar un

seguimiento de cuatro muestras de granos de kéfir. Las muestras son inoculadas utilizando como sustrato
leche, con una agitación de 130 rpm y una temperatura de 25°C. Para las dos primeras muestras, se utiliza
un el tiempo de fermentación determinado por el avance de la reacción, el cual fue obtenido por medio
del seguimiento de acidez total del medio. Las últimas muestras se inoculan con el tiempo de residencia
que se utiliza comúnmente, 24 horas. Así se realiza un seguimiento del crecimiento de los granos con
respecto al tiempo de fermentación del medio.

3.3.3. Producción de Kefiran

Finalmente, se pretende determinar si el tiempo de fermentación del medio tiene influencia en la

producción de kefiran. Para ello se procede a realizar su aislamiento por medio del procedimiento
propuesto en una ‘Guía de aislamiento de Kefiran ‘ (Vaca Bohórquez, 2017). Posterior al aislamiento y
liofilización del polímero, se realiza un análisis termogravimétrico (TGA) para identificar el porcentaje
de humedad y así poder identificar la cantidad de kefiran final producido.

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 4. Resultados

4.1.Cultivo madre

El cultivo madre alcanzó una masa de granos de kéfir de 45.59 g al cabo de 4 semanas de cultivo, a
continuación, se presenta una gráfica del registro del peso de los granos por semana. Se muestra por
semana para tener un lapso considerable y poder comparar de manera efectiva.

Figura 1. Crecimiento por semanas de los granos de kéfir [g]

En la Figura 1 se puede evidenciar que el crecimiento de los granos depende del tamaño de los mismos.
Viendo el crecimiento que se dio entre las últimas tres semanas se puede evidenciar que a medida que los
granos adquieren una mayor masa, su crecimiento es mayor. Sin embargo, en la primera semana se obtuvo
un crecimiento bastante significativo, contradiciendo la hipótesis ya mencionada. Este crecimiento
significativo se pudo haber presentado por errores en las mediciones. Al lavar los granos en agua destilada,
no se retiraba completamente el residuo del kéfir. Igualmente, el tiempo de secado fue corto, y como
consecuencia, se tenía exceso de humedad presente en los granos.

Ya que al finalizar se obtuvo un total de 47,59 g de granos de kéfir, estos se dividen en cinco muestras,
cuatro para realizar el análisis de la influencia del medio, y uno como reserva, un segundo cultivo madre.

4.2. Evaluación de medios en el crecimiento de los granos de kéfir y producción de kefiran

Para proceder a evaluar los medios, primero se debe definir la composición de lactosa de los medios
sintéticos, los cuales serán un punto de referencia en cuento a este componente. Para ello, se debe
cuantificar la lactosa en ambos medios ya definidos, el suero lácteo y la leche.
4.2.1. Caracterización de medios
Al realizar una primera evaluación de los medios, se obtuvo las siguientes concentraciones de azúcares:
Tabla 4. Cuantificación de azúcares para la Leche Tabla 5. Cuantificación de azúcares para el suero

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Se debe tener en cuenta que el suero evaluado fue hecho a partir de leche entera Alquería y una pastilla
de cuajo. Teniendo dichos resultados y tomando en cuenta las diluciones que se realizaron, finalmente se
obtiene para la leche una concentración de lactosa de 53,82 g/L y de galactosa de 1,62 g/L, y para el suero
se obtuvo una concentración de lactosa de 53,82 g/L y de galactosa de 1,57 g/L. Con estos resultados se
puede proceder a seleccionar los medios sintéticos. Como se ha mencionado anteriormente, uno de los
medios sintéticos se enriquece con la misma concentración de lactosa de la leche, y otro con la misma
concentración de lactosa del suero.
El suero lácteo se consumió por completo al cabo del día 9 de cultivo. Así que tuvo que reemplazarse el
medio, esta vez se obtuvo a partir de leche cruda de vaca, a este medio también se le realizó la prueba de
cuantificación de azúcares.
Tabla 6. Composición segundo medio de suero lácteo

Teniendo en cuenta las disoluciones realizadas para el análisis, en este suero se tiene una concentración
de lactosa de 237.,510592 g/L y de galactosa de 5,223485 g/L. Viendo la composición de este suero, se
puede observar que tiene una mayor concentración de lactosa, que el anteriormente producido.
En cuanto al control del pH, en la tabla que se presenta a continuación, se muestra el pH de cada uno de
los medios a evaluar.
Tabla 7. Control de pH de los medios

Por otro lado, se realiza la cuantificación de proteínas en los medios, para ello se realiza una curva de
albúmina bovina. Comparando con la literatura, se puede decir que la curva es confiable.

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 Figura 2. Curva estándar de Albúmina Bovina para la primera aplicación del método Bradford

Ya que el valor del coeficiente de determinación es muy cercano a 1, se puede decir que la ecuación se
ajusta bien al modelo. Lo anterior aseguraría una estimación buena de las proteínas presentes en los medios
a estudiar.
El método Bradford es bastante sensible y ya que la leche es rica en proteínas, la absorbancia de este
medio no pudo ser leído por espectrofotometría. Por lo anterior, se toma el valor de la concentración de
proteínas en la leche de la literatura, esta es de 32 gramos de proteína por litro de leche (Milk Facts, s.f.).
Los resultados de la cuantificación de los medios se presentan de manera general en la siguiente figura.

Figura 3. Cuantificación de proteínas en la leche y el suero lácteo

4.2.2. Cuantificación de azúcares y proteínas

La evaluación de la composición del medio se llevó a cabo durante 18 días. Durante este tiempo, se realiza
un monitoreo de azúcares y proteínas periódicamente.

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 Tabla 8. Presentación de resultados de la cuantificación de azúcares y proteínas en los medios fermentados

Observando lo resultados, en cuanto al crecimiento de los granos y la concentración de azúcar presente en

el kéfir obtenido después de la fermentación del medio, utilizando como sustrato leche, se puede observar
que, en muchos de los casos, la concentración de lactosa es mayor después del proceso de cultivo,
comparada a la lactosa en el medio. Este resultado no es consistente, ya que una de las principales fuentes
de alimentación de los granos es la lactosa. La presencia de este error se pudo haber dado durante la toma
de muestras para realizar el proceso de HPLC ya que, las puntas de la micropipeta no se cambiaron, o los
beaker utilizados para realizar la disolución estaban contaminados. Otra de las posibles fuentes de error
reside en contaminación de la jeringa y el equipo del micro filtrado, por el cual debe pasar la muestra antes
de ser analizada. Sin embargo, se percibe que los análisis de los días 1,9 y 11 si se encontraron en un rango
aceptable, en comparación a la lactosa de la leche. Sin embargo, los resultados de estos días indican que
a medida que el grano incrementa su tamaño, el consumo de lactosa es menor. Aunque este resultado no
es muy coherente, se podría sugerir la hipótesis de que la lactosa no es el más importante para tener en
cuenta durante el crecimiento de los granos.
Por otro lado, los resultados para el suero se dividen en dos partes ya que, durante el crecimiento, se realizó
un cambio en el medio. La primera muestra de suero se realizó a partir de leche entera Alquería, la segunda
pertenece al cuajo de leche cruda de vaca. Se hizo cuantificación de azúcares de ambos medios con el fin
de tener más precisión en el análisis del consumo de carbohidratos por parte de los granos de kéfir.
Por su parte, los resultados de los granos cultivados con este medio no muestran una influencia positiva
del uso del suero como sustrato en el cultivo del kéfir. El incremento que presentaron los granos en cuanto
su peso fue negativo, una posible explicación podría ser que el medio logra un tipo de alimentación a
partir de los granos. En cuanto al consumo de lactosa, a simple vista se puede ver que los resultados no
son coherentes ya que el kéfir obtenido no puede tener una concentración mayor de lactosa que el medio
original. En los primeros días se puede ver que la galactosa disminuyó, los cual podría indicar que este
carbohidrato podría jugar un papel importante en los granos de kéfir. Observando estos resultados, se
podría decir que el peso de los granos no tiene relación con la cantidad de lactosa consumida por el medio.

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Aunque los resultados obtenidos en cuanto al consumo de lactosa son coherentes, ya que se esta se
consume, los resultados en cuanto a su crecimiento tienen inconsistencias. Los granos consumen azúcares,
pero su crecimiento es nulo.
Ya que se conoce el contenido proteínico tanto de la leche, como del suero, se puede evidenciar que si
existe consumo de proteínas. Sin embargo, no se tiene un patrón con el que se pueda identificar una
relación entre el crecimiento de los granos y la cantidad de proteína consumida por los granos. Igualmente,
la contaminación del medio pudo haber alterado los resultados.
En cuanto al primer medio sintético se realizó HPLC para verificar la composición de lactosa en ese medio.
A continuación, se presenta la concentración de carbohidratos de dicho medio. La concentración de lactosa
en el medio es de 293,2634 g/L. Para los datos que se obtuvieron, a simple vista se puede ver una
inconsistencia respecto al consumo de galactosa porque, aunque este medio sintético no presenta en su
composición galactosa, el kéfir obtenido si alcanza los primeros días evaluados a presentar dicho
compuesto en su composición. Por otro lado, al observar el contenido de lactosa al pasar de los días,
exceptuando uno de los datos, el del día 11, se percibe que el consumo de lactosa va creciendo a medida
que pasa el tiempo y los granos adquieren mayor masa.
Al realizar HPLC del siguiente medio sintético, se obtuvo una concentración de lactosa de 329,538 g/L.
Durante el seguimiento del consumo de azúcares y proteínas, se tiene que el consumo de lactosa es
significativo ya que se puede observar claramente el consumo de lactosa. El cambio que se presenta del
día 9 al 11 se pudo deber a al cambio de medio, ya que el medio sintético preparado fue consumido por
completo y, se tuvo que preparar nuevamente. Igualmente se evidencia que en las muestras de algunos
días la presencia de galactosa. Igualmente, en la evaluación de este medio se puede ver que se llega a
cumplir la hipótesis que se tiene a cerca del tamaño de los granos y su consumo de lactosa, entre más masa
tengan los granos, mayor lactosa consumen.
Ya que, en todas las muestras, en algunas ocasiones se presenta la presencia de galactosa sin estar presente
en el medio, se podría pensar que esta se sintetiza durante la fermentación del medio de cultivo. Sin
embargo, esto no se puede afirmar. Por otro lado, con los resultados obtenidos hasta el momento se podría
afirmar que la lactosa si es importante en el crecimiento de los granos, pero no es el único componente
que estos necesitan para su crecimiento. Cabe resaltar que los días escogidos no fueron en lapsos iguales
por disponibilidad de equipos.
Los resultados para el análisis de las proteínas puede que no sean confiables ya que las muestras se
alcanzaron a contaminar. A simple vista se podían apreciar partes blancas sobrenadantes en el kéfir, sobre
todo en las primeras muestras. Igualmente, como se puede apreciar en los resultados, la carga proteica de
los medios no sigue un patrón específico, por lo cual no se puede concluir de manera exitosa.
Al completar 17 días de cultivo de los granos de kéfir se evidencia que, aunque el suero presenta mayor
concentración de lactosa respecto a la leche, es el medio en el que menos crecen los granos. Lo anterior
da un indicio de que la lactosa es un compuesto importante para el crecimiento del kéfir, pero no el único
que permite su crecimiento. Al utilizar como sustrato el suero, los granos no presentan un aumento en su
masa, sino que presentan un decrecimiento, lo cual puede indicar la falta de una proteína importante en su
crecimiento. Por otro lado, al utilizar la leche como medio de cultivo, se ve un crecimiento alto respecto

12
a los demás medios comparados, seguido por el segundo medio sintético, el cual tiene una concentración
de lactosa similar a la del suero.

Figura 4. Crecimiento de granos de kéfir después de 17 días de cultivo

utilizando como sustrato leche, suero y dos medios sintéticos

4.2.3. Producción de Kefiran

Al finalizar el procedimiento de aislamiento de los granos se obtiene, como se esperaría teniendo en
cuenta el crecimiento de los granos, una mayor cantidad de kefiran de aquellos que se inocularon en leche.
Así mismo, la menor cantidad de kefiran se obtuvo al utilizar como medio de cultivo el suero. Para
determinar con mayor exactitud el kefiran producido, se procede a liofilizar las muestras del kéfir y
realizar un análisis termogravimétrico.

Figura 5. Porcentaje de kefiran liofilizado por gramo de granos Figura 6. Kefiran producido al cabo de 17 días de cultivo de los
de kéfir granos de kéfir utilizando como sustrato leche, suero y dos
medios sintéticos

Al finalizar el proceso, se compara la cantidad de kefiran obtenido por gramo de granos de kéfir. Como
se puede observar, aunque los granos que crecieron en presencia de suero no presentaron un crecimiento
significativo, por gramo de granos se obtiene la mayor cantidad de kefiran (2.13%). Por otro lado, la menor
cantidad de kefiran, por gramo de kéfir se obtiene al utilizar como sustrato cualquier medio sintético, en
especial en aquel que tiene la concentración de lactosa similar al de la leche.
Adicionalmente, gracias al análisis termogravimétrico (TGA) se puede identificar las regiones de
evaporación del polímero procedente de los granos de kéfir inoculados con los diferentes medios. A

13
continuación, se muestran los resultados obtenidos, donde se representan el cambio del peso de la muestra
de kefiran con respecto al aumento de la temperatura. En los termogramas se logran identificar dos
regiones de pérdida de masa, la primera corresponde a la evaporación del agua, y la segunda a la
degradación del polímero. Estas temperaturas corresponden a los intervalos de 50 a 100°C y 275 a 350°C,
respectivamente.

Figura 7. Cambio de peso del kefiran con respecto a la temperatura

4.3. Evaluación del tiempo de fermentación del medio en el crecimiento de los granos de kéfir y
la producción de Kefiran
4.3.1. Acidez total

La reacción de fermentación de la leche puede ser determinada por el cambio de pH respecto al tiempo.
Para el caso a evaluar, se tiene un pH inicial de 7, el cual pertenece al de la leche, y a medida que el medio
se fermenta y las bacterias se alimentan, el pH disminuye. Se evalúa dicho cambio del pH, cada media
hora durante seis horas con el fin de encontrar el tiempo en el que la reacción llega al equilibrio y se
detiene el proceso de crecimiento de los granos de kéfir.

Figura 8. Cambio del pH del medio con respecto al tiempo

14
Como se esperaba, la fermentación del medio por parte de los granos de kéfir se lleva a cabo en
aproximadamente cuatro horas. Para corroborar dicho resultado, se realiza el seguimiento de la acidez
total del medio fermentado durante 24 horas, teniendo en cuenta el tiempo disponible para realizar las
respectivas mediciones.

Figura 9. Acidez total del kéfir con respecto al tiempo

Al observar la acidez total que se registró durante 24 horas, se puede evidenciar que la cantidad de H+
llega a un equilibrio en aproximadamente 5 horas. Con lo anterior, se empieza a realizar el estudio del
crecimiento de granos de kéfir con diferentes tiempos de fermentación. Se escoge pues, un tiempo 3 4
horas, para tener un mayor control, y el tiempo que se utiliza comúnmente, 24 horas. De cada uno de los
tiempos evaluados se realiza una réplica.
4.3.2. Crecimiento de los granos de kéfir

La evaluación del tiempo de fermentación del medio se realiza después de 15 días de la inoculación de los
granos de kéfir. Como se ha mencionado previamente en la metodología, se hizo el seguimiento de dos
muestras, la primera, con el tiempo de fermentación estipulado por la prueba anterior, y la restante
utilizando el tiempo de fermentación común. Se realiza una réplica de cada caso. Los resultados obtenidos
se muestran a continuación,

Figura 10. Incremento del peso de los granos de kéfir después de 15 días de cultivo

15
Se hace evidente que los granos cuyo tiempo de fermentación es de 4 horas, tienen un mayor incremento
de peso, alrededor de un 56% mayor. Ya que la reacción llega al equilibrio en un punto determinado, el
cual fue estimado de 5 horas aproximadamente, se podría decir que después de dicho punto, los granos
dejan de fermentar el medio y, por ende, su crecimiento se estanca. A medida que se realiza un cambio de
medio más frecuente, los granos tienen a su disposición más nutrientes para crecer, evitando la
interrupción de su crecimiento.
4.3.3. Producción de Kefiran

Se realiza l aislamiento de kefiran, seguido de su liofilización y finalmente una prueba de TGA para
determinar la cantidad de kefiran libre de humedad que se obtiene con cada muestra.

Figura 11. Producción final de kefiran al cabo de 15 días de cultivo Figura 12. Porcentaje de kefiran por gramo de granos de kéfir
de los granos de kéfir

Al final del procedimiento, se obtiene que, para 4 horas de fermentación del medio, en 15 días la
producción de kefiran llega en promedio a 2,15 g, mientras que para un tiempo de fermentación de 24
horas se obtiene aproximadamente, 1,28 g de kefiran. Lo anterior demuestra que con el cambio el medio
de cultivo cada 4 horas se puede llegar a obtener hasta un 60% más de kefiran que cambiándolo
diariamente.

Con respecto a la cantidad de kefiran que se puede obtener por cada gramo de granos de kéfir, se puede
decir que, utilizando leche como sustrato, este valor oscila entre el 2 y el 3%.

Finalmente se realiza el análisis termogravimétrico, el cual permite obtener una noción de la calidad del
polímero que se obtuvo el mismo comportamiento de las curvas, donde se pueden observar dos regiones
de pérdida de masa significativa, una correspondiente a la evaporación del agua, entre 50 a 100°C, y la
otra perteneciente a la degradación del polímero, entre 275 a 350°C.

16
 Figura 13. Cambio de peso del kefiran con respecto a la temperatura

5. Conclusiones

• Gracias a la cuantificación de azúcares durante el proceso de fermentación, se pudo determinar

que la lactosa no es el único componente que influye en el crecimiento de los granos de kéfir
y la producción de kefiran.
• Se logró evidenciar que el suero no es un medio que beneficie la producción de kefiran, aunque
es rico en lactosa y otras proteínas.
• Se pudo determinar la duración de la reacción de fermentación ácido-láctica que se lleva a cabo
entre los granos de kéfir y la leche.
• Al poder evaluar la acidez total con pesos diferentes de muestras, se pudo tener un indicio de
la dependencia de la cantidad de granos en la acidez del medio.
• Al evaluar el tiempo de fermentación del medio, se pudo observar que el tiempo que permite
un buen crecimiento de los granos, y una buena producción de kefiran oscila entre las 4 y 6
horas. Siguiendo el principio de Le Châtelier, al aumentar la ‘concentración’ de reactivos en la
reacción en equilibrio, el equilibrio se desplaza aumentando el crecimiento de los granos de
kéfir.
• En cuanto a la cantidad de kefiran obtenido, se puede estimar que, utilizando leche como
sustrato, su obtención puede variar entre un 2 y 3% por gramo de granos de kéfir.

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